Ειδική για τον ιστό έκφραση του υποδοχέα SARS-CoV-2, το ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2, σε μοντέλα ποντικιών της χρόνιας νεφρικής νόσου
Mar 22, 2022
Από τον Ιανουάριο του 2020, η νόσος του κοροναϊού 2019 (COVID-19), που προκαλείται από το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS-CoV-2), αποτελεί παγκόσμιο πρόβλημα δημόσιας υγείας. Η λοίμωξη SARS-CoV-2 εγκαθίσταται όταν η ιική πρωτεΐνη S δεσμεύεται στο ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 (ACE2) και εισέρχεται στο κύτταρο1,2. Επομένως, η αυξημένη έκφραση ACE2 σε όργανα που αποτελούν πιθανούς στόχους του SARS-CoV-2 μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο μόλυνσης από COVID- 19. Το ACE2 είναι ένα ένζυμο που παίζει σημαντικό ρόλο στο σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης (RAS), όπου μετατρέπει την αγγειοτενσίνη (Ang) II σε Ang1-7 και αποτελεί συστατικό του ACE2-Ang{{21 }}Άξονας υποδοχέα MAS3. Ασκεί επίσης μια προστατευτική δράση οργάνων εξουδετερώνοντας τη δραστηριότητα του άξονα του υποδοχέα ACE-Ang II-αγγειοτενσίνης τύπου 1 (AT1)4–7. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι το ACE2 μεταβάλλει τα ειδικά για τον ιστό πρότυπα έκφρασης του υπό διάφορες συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών παθήσεων, του σακχαρώδους διαβήτη (ΣΔ) καινεφρικές παθήσεις 8–11. Η πνευμονική έκφραση του ACE2, η οποία είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη μόλυνση από SARS-CoV-2, μειώνεται στο σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες12. Μια άλλη αναφορά δείχνει ότι η έκφραση ACE2 είναι υψηλότερη στους ηλικιωμένους άνδρες13. Στο Τμήμα Ιατρικής Επιστήμης και Καρδιονεφρικής Ιατρικής, Μεταπτυχιακή Σχολή Ιατρικής του Πανεπιστημίου της Yokohama City, Fukuura 3-9, Kanazawa-ku, Yokohama 236‑0004, Ιαπωνία. 2 Πρόγραμμα Καρδιαγγειακών και Μεταβολικών Διαταραχών, Ιατρική Σχολή Duke-NUS, Σιγκαπούρη, Σιγκαπούρη. 3 Department of Medicine, Mount Sinai Beth Israel, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ. 4 Τμήμα Μοριακής Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Yokohama City Graduate School of Medicine, Yokohama, Ιαπωνία. 5 Τμήμα Ωτορινολαρυγγολογίας, Χειρουργικής Κεφαλής και Τραχήλου, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Yokohama City, Yokohama, Ιαπωνία. 6Εσωτερική Ιατρική, Οδοντιατρικό Πανεπιστήμιο Kanagawa.
Λέξεις-κλειδιά;Νεφρική Νόσος; νεφρά; νεφρικό ACE2; νεφρικοί ιστοί? ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ
Επιπλέον, η ρινική και διακλαδική έκφραση του ACE2 είναι υψηλότερη στους ενήλικες από ότι στα παιδιά14. Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, λίγες μελέτες έχουν εξετάσει πώς η πνευμονική έκφραση του ACE2 μεταβάλλεται σε άλλες ασθένειες. Ασθενείς με χρόνιαΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) διατρέχουν κίνδυνο σοβαρής νόσου COVID-19, αλλά δεν υπάρχουν ενδείξεις αυξημένου επιπολασμού του COVID-19 σε ασθενείς με ΧΝΝ15–21. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι το ACE2 απαιτείται για τη μόλυνση από COVID-19, αυτά τα ευρήματα μπορεί να υποδηλώνουν ότι η πνευμονική έκφραση του ACE2 δεν ενισχύεται σε ασθενείς με ΧΝΝ. Συγκεκριμένα, η κυτταρική έκφραση ACE2 πιθανώς σχετίζεται με την ευαισθησία στον κίνδυνο μόλυνσης από τον SARS-CoV, ο οποίος σχετίζεται με τον SARS-CoV-222. Το γεγονός ότι τα παιδιά με χαμηλή έκφραση ACE2 είναι λιγότερο ευαίσθητα στον COVID-19 από τους ενήλικες23 υποστηρίζει επίσης αυτές τις υποθέσεις. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε πειράματα για να εξετάσουμε τις αλλαγές στην πνευμονική έκφραση ACE2 σε δύο τύπους ποντικών μοντέλου ΧΝΝ: επαγόμενα από αδενίνη (δηλ. ποντίκια αδενίνης) και επαγόμενα από αριστολοχικό οξύ (ΑΑ) (δηλαδή ποντίκια ΑΑ) για την αντιμετώπιση αυτής της υπόθεσης. Η σχέση της έκφρασης ACE2 με αναστολείς RAS έχει επίσης διερευνηθεί. Μέχρι στιγμής, η χρήση αναστολέων RAS έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του ACE2 οργάνου σε ορισμένες περιπτώσεις24-27. Πρόσφατες επιδημιολογικές έρευνες έχουν δείξει ότι η χρήση αναστολέων RAS δεν αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης COVID-1928–30. Επιπλέον, η έκφραση του ACE2 στους πνεύμονες δεν ενισχύθηκε όταν χορηγήθηκαν αναστολείς RAS σε φυσιολογικά ποντίκια31. Ωστόσο, δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με τις επιδράσεις των αναστολέων RAS στην πνευμονική έκφραση του ACE2 στο πλαίσιο της ΧΝΝ. αυτό το σημείο είναι απαραίτητο για τη μελλοντική διαχείριση του COVID-19 και των συνεπειών του. Εδώ, διερευνήσαμε τις αλλαγές στην πνευμονική έκφραση ACE2 λόγω θεραπείας με αναστολέα RAS σε ποντικούς μοντέλου ΧΝΝ.
ΑποτελέσματαΤα ποντίκια μοντέλου ΧΝΝ που προκαλούνται από αδενίνη εμφάνισαν σημαντική απώλεια βάρους, μείωση της νεφρικής λειτουργίας και αυξημένη αρτηριακή πίεση (ΑΠ), σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Το βασικό σωματικό βάρος (BW) και η συστολική ΑΠ ήταν πανομοιότυπα μεταξύ των ομάδων ελέγχου και αδενίνης. Το BW αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου στην ομάδα ελέγχου, ενώ μειώθηκε στην ομάδα της αδενίνης. αυτό το κέρδος BW ήταν σημαντικά διαφορετικό μεταξύ των ομάδων (Εικ. 1Α). Η συστολική ΑΠ ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα αδενίνης, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 1Β). Στις 2 εβδομάδες, η απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα αδενίνης, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (ποντίκια αδενίνης 41.{4}}±8,3 ug/ημέρα έναντι ελέγχου 13,6±1,7 ug/ημέρα, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
Η έκφραση του ACE2 στους νεφρούς μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια τύπου CKD που προκλήθηκαν από αδενίνη, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ η έκφραση του ACE2 στους πνεύμονες δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων.Η νεφρική ιστολογία έδειξε ετερογενή διεύρυνση και ατροφία των σωληναρίων, καθώς και κυτταρική διήθηση στονεφρώνδιάμεσο, σε ποντίκια αδενίνης. Η χρώση ACE2 παρατηρήθηκε κυρίως στα εγγύς σωληνάρια και στις δύο ομάδες, αλλά ο βαθμός χρώσης μειώθηκε στην ομάδα αδενίνης (Εικ. 2Α). Τα επίπεδα πρωτεΐνης ACE2 στονεφρά(εκτιμάται με ανάλυση western blotting) έδειξε σημαντική μείωση στην ομάδα αδενίνης, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τόσο στις 2 όσο και στις 4 εβδομάδες (2 εβδομάδες: ποντίκια αδενίνης 0.55±0.{{ 9}}4 έναντι ελέγχου 1.00±0,10, Σ<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">νεφρικό ACE2Η έκφραση mRNA έδειξε σημαντική μείωση στην ομάδα αδενίνης στις 2 εβδομάδες (ποντίκια αδενίνης 0.61±0.04 έναντι ελέγχου 1.00±0.03, P.<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Τα ποντίκια μοντέλου ΧΝΝ που προκλήθηκαν από ΑΑ εμφάνισαν σημαντική απώλεια βάρους και μείωση της νεφρικής λειτουργίας, σε σύγκριση με την ομάδα του φορέα, ενώ η ΑΠ δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων.Το αρχικό BW και η συστολική ΑΠ ήταν πανομοιότυπα μεταξύ των ομάδων φορέα και ΑΑ. Το BW αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου στην ομάδα οχημάτων, ενώ μειώθηκε στην ομάδα ΑΑ. αυτό το κέρδος BW ήταν σημαντικά διαφορετικό μεταξύ των ομάδων (Εικ. 3Α). Ωστόσο, δεν υπήρχε διαφορά στη συστολική ΑΠ μεταξύ των ομάδων (Εικ. 3Β). Σε σύγκριση με την ομάδα οχημάτων, υπήρξαν σημαντικές βελτιώσεις των επιπέδων κρεατινίνης και BUN στο πλάσμα, καθώς και απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα, στην ομάδα ΑΑ (κρεατινίνη: ποντίκια ΑΑ 0.40±{{6} }.03 mg/dL έναντι φορέα 0,14±0,01 mg/dL, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
Η έκφραση του ACE2 στους νεφρούς μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια με μοντέλο CKD που προκλήθηκαν από AA, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ενώ τα επίπεδα της πνευμονικής πρωτεΐνης ACE2 δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων. Η νεφρική ιστολογική ανάλυση έδειξε σωληναριακή ατροφία και κυτταρική διήθηση στονεφρώνδιάμεσο στην ομάδα ΑΑ. Η χρώση ACE2 παρατηρήθηκε κυρίως στα εγγύς σωληνάρια και στις δύο ομάδες, αλλά ο βαθμός χρώσης μειώθηκε στην ομάδα ΑΑ (Εικ. 4Α). Τα επίπεδα πρωτεΐνης ACE2 στονεφράπαρουσίασε σημαντική μείωση στην ομάδα ΑΑ, σε σύγκριση με την ομάδα οχημάτων (ποντίκια ΑΑ {{0}}.22±0.03 έναντι οχήματος 1.00±0.08, P.<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">νεφρικό ACE2Η έκφραση mRNA μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα ΑΑ (ποντίκια ΑΑ {{0}}.30±0,02 έναντι φορέα 1.00±0,06, P.<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
Παρατηρήθηκε χρώση ACE2 σε κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου 2 (Εικ. 4Β) και δεν υπήρχε διαφορά στο επίπεδο της πνευμονικής πρωτεΐνης ACE2 μεταξύ των ομάδων (Εικ. 4D). Η έκφραση του mRNA του ACE2 στους πνεύμονες ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα ΑΑ από ό,τι στην ομάδα φορέα (ποντίκια ΑΑ 0.76±0.04 έναντι φορέα 1.{11} }±0,04, Π<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Η ολμεσαρτάνη εξασθένησε τις βελτιώσεις της ΑΠ και την απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα και τη μείωση της απώλειας βάρους σε ποντικούς τύπου ΧΝΝ που προκαλούνται από αδενίνη.Η θεραπεία με ολμεσαρτάνη μείωσε την απώλεια βάρους σε ποντικούς αδενίνης (Εικ. 5Α). Η θεραπεία με ολμεσαρτάνη μείωσε επίσης σημαντικά τη συστολική ΑΠ τόσο στην ομάδα ελέγχου όσο και στην ομάδα αδενίνης (ποντίκια αδενίνης 131,5±0,4 mmHg έναντι ελέγχου 121,2±0,7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Η ολμεσαρτάνη δεν επηρέασε την έκφραση του ACE2.Στις ομάδες ελέγχου και αδενίνης, ούτε τα επίπεδα έκφρασης mRNA ούτε πρωτεΐνης του ACE2 στο νεφρό μεταβλήθηκαν με θεραπεία με ολμεσαρτάνη (Εικ. 6Α, Γ). Δεν υπήρξαν αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης πνευμονικού mRNA ACE2 ή πρωτεΐνης μεταξύ των ομάδων ελέγχου και αδενίνης (Εικ. 6Β, Δ). Δεν υπήρχε επίσης σημαντική διαφορά στη δραστηριότητα του ACE2 στο πλάσμα (Εικ. 6Ε). Εξετάστηκε επίσης η έκφραση του mRNA του ACE2 στην ανώτερη αναπνευστική οδό (φάρυγγας), αλλά δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα S1).
ΣυζήτησηΗ πανδημία του COVID{0}} είχε βαθύ αντίκτυπο παγκοσμίως. Για τα ηλικιωμένα άτομα και τα άτομα με συννοσηρότητες, οι πληροφορίες σχετικά με τον κίνδυνο μόλυνσης και τη σοβαρότητα του COVID-19 αποτελούν κρίσιμη σημασία. Έχουν γίνει πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες του COVID-19 παγκοσμίως, οι οποίες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με ΧΝΝ είναι πιο πιθανό να αναπτύξουν σοβαρό COVID-1917, αλλά η νοσηρότητα του COVID-19 μπορεί να μην είναι αυξημένη σε ασθενείς με ΧΝΝ15–21. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα πολλών μετα-αναλύσεων αποκάλυψαν ότι ο επιπολασμός της ΧΝΝ ήταν 1,7–5,2 τοις εκατό σε ασθενείς με COVID-1915–17,21. Επιπλέον, μια ανάλυση 5.700 ασθενών με COVID-19 στο New
Η περιοχή της Υόρκης έδειξε ότι το 8,5 τοις εκατό είχε υποκείμενανεφρική νόσο 19. Δεδομένου ότι ο εκτιμώμενος επιπολασμός της ΧΝΝ είναι 9,1 τοις εκατό παγκοσμίως18 και περίπου 15 τοις εκατό στις Ηνωμένες Πολιτείες20, ο κίνδυνος μόλυνσης από SARS-CoV-2 ενδέχεται να μην αυξηθεί σε σχέση με την παρουσία ΧΝΝ. Το ACE2 παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του COVID-191,2. Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης ACE2 στα κύτταρα των αεραγωγών σχετίζεται με τον κίνδυνο μόλυνσης από τον SARS-CoV, έναν παρόμοιο κορονοϊό με τον αιτιολογικό παράγοντα του COVID-1922. Επειδή το COVID-19 είναι μια ασθένεια του αναπνευστικού, η έκφραση του ACE2 στους πνεύμονες είναι ένα σημαντικό συστατικό της μετάδοσης της νόσου. Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι η έλλειψη αύξησης της πνευμονικής έκφρασης ACE2 στη ΧΝΝ συνδέεται με την απουσία αυξημένης νοσηρότητας από COVID-19. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι τα παιδιά με χαμηλή έκφραση ACE2 είναι λιγότερο ευαίσθητα στον COVID-19 από τους ενήλικες. Χρησιμοποιήσαμε δύο τύπους ποντικών μοντέλου ΧΝΝ στα πειράματά μας για να εξετάσουμε αλλαγές στην πνευμονική έκφραση του ACE2 σε σχέση με την παθογένεση της ΧΝΝ. Η ΧΝΝ που προκαλείται από αδενίνη είναι ένα αντιπροσωπευτικό ζωικό μοντέλο νόσου32. Η υπερβολική χορήγηση αδενίνης μπορεί να προκαλέσει ΧΝΝ προκαλώνταςνεφρώνσωληναριακή απόφραξη και εκφύλιση, καθώς καινεφρώνδιάμεση ίνωση, λόγω της εναπόθεσης 2-8 διυδροξυαδενίνης32,33. Αντίθετα, η ΧΝΝ που προκαλείται από ΑΑ προκαλείται από την πρόκληση ίνωσης από τη σωληναριακή βλάβη που προκαλείται από την ΑΑ34. Αυτά τα δύο μοντέλα επιλέχθηκαν επειδή η ΑΠ έχει αποδειχθεί ότι αυξάνεται στο μοντέλο ΧΝΝ που προκαλείται από αδενίνη35, ενώ δεν αυξάνεται στο μοντέλο ΧΝΝ που προκαλείται από ΑΑ36. Συγκεκριμένα, η υπέρταση είναι μια συχνή επιπλοκή που παρατηρείται σε ασθενείς με ΧΝΝ. υποθέσαμε ότι θα ήταν χρήσιμο να διερευνηθεί εάν η παρουσία ή η απουσία υπέρτασης επηρεάζει την πνευμονική έκφραση του ACE2 στην παθογένεση της ΧΝΝ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ηνεφρικό ACE2Τα επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν και στα δύο μοντέλα ΧΝΝ. Σε ποντικούς αδενίνης, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα mRNA στις 4 εβδομάδες, αλλά υπήρξε μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης. Ένας από τους λόγους αυτής της ασυμφωνίας μπορεί να είναι η εμπλοκή της μεταφραστικής καταστολής. Lambert DW, et al. έδειξε ότι το miR-421 κατέστειλε τη μετάφραση της πρωτεΐνης ACE2 χωρίς να επηρεάσει τα επίπεδα μεταγραφής ACE237. Μια άλλη μελέτη έδειξε επίσης ότι το miR του ορού-421 ήταν αυξημένο σε ασθενείς με ΧΝΝ ή υπέρταση38,39. Έτσι, στην ομάδα ποντικών αδενίνης με μεγαλύτερη περίοδο ΧΝΝ και υπέρτασης (4 εβδομάδες), miR-421
μπορεί να αυξηθεί και να κατασταλεί η μετάφραση πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα μια ασυμφωνία μεταξύ της έκφρασης mRNA και πρωτεΐνης. Τα επίπεδα της πνευμονικής πρωτεΐνης ACE2 δεν διέφεραν και στα δύο μοντέλα ΧΝΝ σε σύγκριση με τους μάρτυρες και τους φορείς. Αν και είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η έκφραση του πνευμονικού mRNA του ACE2 μειώθηκε στο μοντέλο ΧΝΝ που προκαλείται από ΑΑ, τα ευρήματά μας ήταν πιο αξιοσημείωτα επειδή δεν βρήκαμε διαφορά στα επίπεδα πνευμονικής πρωτεΐνης ACE2, τα οποία επηρεάζουν άμεσα τη μόλυνση από SARS-CoV-2. Επιπλέον, η δραστηριότητα του ACE2 στο πλάσμα δεν διέφερε και στα δύο μοντέλα ΧΝΝ σε σύγκριση με τους μάρτυρες και τα οχήματα. Το διαλυτό ACE2 στο πλάσμα θεωρείται ότι διασπάται και απελευθερώνεται από τα κύτταρα των ιστών. Η αυξημένη δραστηριότητα του ACE2 στο πλάσμα έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με αύξηση της απελευθέρωσης της πρωτεΐνης ACE2 από τους ιστούς, υποδηλώνοντας μείωση της πρωτεΐνης ACE2 στους ιστούς40. Έτσι, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ότι η δραστηριότητα του ACE2 στο πλάσμα δεν άλλαξε στην κατάσταση ΧΝΝ δείχνουν ότι η απελευθέρωση της πρωτεΐνης ACE2 που εκφράζεται στους ιστούς δεν αλλάζει στην κατάσταση ΧΝΝ, γεγονός που υποστηρίζει τα ευρήματα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ACE2 στους ιστούς είναι αμετάβλητη σε το πλαίσιο της ΧΝΝ. Η σχέση μεταξύ του COVID-19 και των αναστολέων RAS αποτελεί συνεχή εστίαση των ερευνητικών συζητήσεων. Προηγούμενες μελέτες σε ζώα έδειξαν ότι οι αναστολείς RAS ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση του ACE2 των ιστών, γεγονός που οδήγησε σε φόβους ότι η χρήση αναστολέων RAS μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο μόλυνσης από SARS-CoV-2. Ωστόσο, η χρήση αναστολέων RAS σε αυτές τις προηγούμενες μελέτες οδήγησε μόνο σε ανοδική ρύθμιση του ACE2 του ιστού υπό συγκεκριμένες παθολογικές καταστάσεις24,27. αυτή η ανοδική ρύθμιση δεν ξεπέρασε το κανονικό εύρος. Μια άλλη μελέτη που εξετάζει την πνευμονική καινεφρικό ACE2Η έκφραση σε φυσιολογικά ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς RAS δεν παρουσίασε αύξηση, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου31. Από την άλλη πλευρά, υπήρξε μια αναφορά ότι οι αναστολείς RAS όπως η καντεσαρτάνη και η καπτοπρίλη αύξησαν την πνευμονική έκφραση του ACE2 σε φυσιολογικούς αρουραίους41. Στην κλινική πράξη του πραγματικού κόσμου, ορισμένες επιδημιολογικές μελέτες σχετικά με τη χρήση αναστολέων RAS σε ασθενείς με COVID-19 έχουν δείξει ότι η χρήση αυτών των φαρμάκων δεν αυξάνει τον κίνδυνο για COVID-1928–30. Ωστόσο, η επίδραση των αναστολέων RAS στην πνευμονική έκφραση του ACE2 εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενη. Καμία προηγούμενη μελέτη δεν είχε εξετάσει τις επιδράσεις των αναστολέων του RAS στην πνευμονική έκφραση του ACE2 στο πλαίσιο της ΧΝΝ, αν και οι αναστολείς RAS είναι απαραίτητοι για τη θεραπεία ασθενών με ΧΝΝ. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε για την αντιμετώπιση αυτού του κενού στη βιβλιογραφία. Για να μοντελοποιήσουμε πιο στενά την κλινική πρακτική του πραγματικού κόσμου, χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο ΧΝΝ που προκαλείται από αδενίνη, το οποίο εμφανίζει ταυτόχρονη υπέρταση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χορήγηση ολμεσαρτάνης, ενός αναστολέα του RAS, δεν ενίσχυσε την πνευμονική έκφραση του ACE2, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Επιπλέον, η έκφραση του ACE2 mRNA στην ανώτερη αναπνευστική οδό, ο αρχικός στόχος της λοίμωξης SARS-CoV-2, δεν ενισχύθηκε ως απόκριση στη θεραπεία με ολμεσαρτάνη.Νεφρικό ACE2Τα επίπεδα πρωτεΐνης μειώθηκαν στο μοντέλο ΧΝΝ. η χορήγηση ολμεσαρτάνης δεν αύξησε τα επίπεδα νεφρικής πρωτεΐνης ACE2 στους ποντικούς ελέγχου και αδενίνης. Η έλλειψη αποκατάστασης στο νεφρικό ACE2 σε ποντίκια αδενίνης που έλαβαν ολμεσαρτάνη μπορεί να οφείλεται στη χρήση διαφορετικού μοντέλου ΧΝΝ, σε σύγκριση με προηγούμενη μελέτη27, καθώς και στη σχετικά μικρή διάρκεια της θεραπείας με αναστολείς υποδοχέων αγγειοτενσίνης25,27. Ωστόσο, η θεραπεία με ολμεσαρτάνη βελτίωσε αρκετές παραμέτρους νεφρικής ανεπάρκειας, συμπεριλαμβανομένης της απέκκρισης λευκωματίνης στα ούρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τη συνεχή χρήση αναστολέων RAS σε ασθενείς με COVID-19 που έχουν ΧΝΝ.
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ
Αυτή η μελέτη είχε ορισμένους περιορισμούς. Πρώτον, εξέτασε μόνο αλλαγές στην πνευμονική έκφραση του ACE2 σε ποντίκια μοντέλου ΧΝΝ, ενώ δεν διερεύνησε άμεσα τη μόλυνση από SARS-CoV-2. Δεύτερον, παρατηρήσαμε τα ποντίκια αδενίνης για 4 εβδομάδες και τα ποντίκια ΑΑ για 8 εβδομάδες σε αυτή τη μελέτη, αλλά τα αποτελέσματα μπορεί να είναι διαφορετικά σε μεγαλύτερη περίοδο παρατήρησης. Τρίτον, η έκφραση του ACE2 στους πνεύμονες μπορεί να διαφέρει μεταξύ ποντικών και ανθρώπων. Τέταρτον, σε ασθενείς με ΧΝΝ, η σοβαρότητα του COVID-19 είναι πιθανό να είναι μεγαλύτερη, αλλά δεν μπορούμε να αναφερθούμε στον υποκείμενο μηχανισμό βαρύτητας. Πέμπτον, δεν είναι μόνο το επίπεδο έκφρασης του πνευμονικού ACE2 που καθορίζει την ευαισθησία στον COVID-19 αλλά μπορεί επίσης να επηρεαστεί από πολλούς άλλους παράγοντες. Συμπερασματικά, δεν βρήκαμε καμία αλλαγή στην έκφραση της πνευμονικής πρωτεΐνης ACE2 σε ποντικούς μοντέλου ΧΝΝ, ανεξάρτητα από την κατάσταση υπέρτασης. Επιπλέον, η χρήση της θεραπείας με αναστολέα υποδοχέα αγγειοτενσίνης σε ποντικούς μοντέλου ΧΝΝ δεν αύξησε την πνευμονική έκφραση του ACE2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την υπόθεση ότι ο κίνδυνος νοσηρότητας του COVID-19 μπορεί να μην είναι αυξημένος σε ασθενείς με ΧΝΝ λόγω της σταθερής τους πνευμονικής έκφρασης ACE2. Τα ευρήματα παρέχουν επίσης σημαντικές βασικές επιστημονικές αποδείξεις ότι οι αναστολείς RAS μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ασφάλεια στη θεραπεία ασθενών με COVID-19 που έχουν ΧΝΝ.
Υλικό και μέθοδοι Των ζώων.Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη χρήση πειραματόζωων. Όλα τα πειράματα σε ζώα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Μελετών Ζώων του Πανεπιστημίου της Γιοκοχάμα (Αριθμός έγκρισης: FA{{{{1{12}}}}}), τα οποία ήταν σε συμμόρφωση με τις οδηγίες ARRIVE. Καταβλήθηκαν προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιήθηκαν και να εξασφαλιστεί η ελάχιστη ταλαιπωρία. Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε ελεγχόμενο περιβάλλον με 12-h κύκλο φωτός-σκότους σε θερμοκρασία 25 βαθμών. Τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Ποντίκια CKD μοντέλου. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αρσενικά ποντίκια C57BL/6 J 8-9-εβδομάδων, μετά από εγκλιματισμό 1-εβδομάδων σε όλες τις ομάδες. Στο πείραμα αδενίνης, τα ποντίκια τράφηκαν με δίαιτα αναμεμειγμένη με 0.2 τοις εκατό αδενίνη (0.2 τοις εκατό αδενίνη συν 0.3 τοις εκατό NaCl, 3,6 kcal/g, CE{{ 18}}· CLEA, Τόκιο, Ιαπωνία· ομάδα αδενίνης) ή μια τυπική δίαιτα (0,3 τοις εκατό NaCl, 3,6 kcal/g, CE-2· CLEA· ομάδα ελέγχου) για 2 ή 4 εβδομάδες. Στο πείραμα ΑΑ, τα ποντίκια έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή ένεση με ΑΑ (3 mg/kg) δύο φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες, ακολουθούμενη από περίοδο ανάρρωσης 4- εβδομάδας. στην ομάδα του οχήματος εγχύθηκε φορέας (75 τοις εκατό διμεθυλοσουλφοξείδιο). Στο πείραμα θεραπείας με ολμεσαρτάνη, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις πειραματικές ομάδες: (1) ομάδα ελέγχου. (2) ομάδα αδενίνης, που τρέφονταν με δίαιτα αναμεμειγμένη με 0,2 τοις εκατό αδενίνη. (3) ομάδα ελέγχου-ολμεσαρτάνης, κατεργασμένη με τον ανταγωνιστή του υποδοχέα ΑΤ1 ολμεσαρτάνη σε πόσιμο νερό (4 mg/kg/ημέρα, Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία). και (4) ομάδα αδενίνης-ολμεσαρτάνης, η οποία δόσεις είναι ίδιες με εκείνες στις ομάδες 2 και 3.
Μέτρηση ΑΠ.Η συστολική ΑΠ μετρήθηκε με τη μέθοδο tail-cuf (BP-Monitor MK-2000· Muromachi Kikai Co., Τόκιο, Ιαπωνία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως42,43. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν μεταξύ 9:00 και 14:00 ωρών. Πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 10 μετρήσεις σε κάθε ποντίκι και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση.Ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο.Το ολικό RNA εξήχθη από τον πνεύμονα,νεφρώνκαι ιστός φάρυγγα χρησιμοποιώντας ISOGEN (Nippon Gene, Τόκιο, Ιαπωνία). Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το SuperScript III First-Strand System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ABI PRISM 7000. Τα προϊόντα αντίστροφης μεταγραφής επωάστηκαν με TaqMan PCR Master Mix και έναν προσαρμοσμένο ανιχνευτή TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως44,45. Χρησιμοποιήθηκε ο ακόλουθος ανιχνευτής TaqMan: ACE2 (Mn01159003_m1). Τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν σε αυτά του 18S rRNA.
Ανάλυση Western blotting.Η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε με στύπωμα western χρησιμοποιώντας ομογενοποιήματα ιστού, όπως περιγράφηκε προηγουμένως45,46. Εν συντομία, ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνης παρασκευάστηκε από ιστούς με ρυθμιστικό δείγματος που περιέχει δωδεκυλοθειικό νάτριο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης κάθε δείγματος μετρήθηκε με NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), χρησιμοποιώντας ως πρότυπο αλβουμίνη βόειου ορού. Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης από κάθε δείγμα ιστού (ιστός πνεύμονα: 24 ug, ιστός νεφρού: 10 ug) κλασματοποιήθηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 5–20 τοις εκατό (Atto, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου χρησιμοποιώντας το iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά που περιείχε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα για ACE2 (Ab108252 1:500 [πνεύμονας] ή 1:1000 [νεφρός], Abcam, Cambridge, MA, ΗΠΑ) και -ακτίνη (Α{{16} }:10.000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ). Οι μεμβράνες πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι θέσεις των αντιδράσεων αντισώματος-αντιγόνου οπτικοποιήθηκαν με υπόστρωμα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Οι εικόνες αναλύθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ACE2 στον πνεύμονα καινεφρικούς ιστούςΣε κανονικά ποντίκια, πραγματοποιήθηκε επιπλέον στύπωμα Western στην ίδια μεμβράνη (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Η ποσότητα της πρωτεΐνης που περιγράφηκε κλασματώθηκε σε πηκτώματα ((A) πνεύμονας: 24/10/1 ug, νεφρός: 24/10/1 ug, (B) πνεύμονας: 24/12 ug , νεφρός: 0,2/0,15/0,1 μg); χρησιμοποιήθηκε το ίδιο πρωτογενές αντίσωμα για το ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, ΗΠΑ). Για να εξεταστεί η ειδικότητα του αντισώματος, χρησιμοποιήθηκε ένα πεπτίδιο εκλεκτικού αποκλεισμού ACE (ab198988). Το στύπωμα Western έδειξε μια μοναδική ζώνη πρωτεΐνης, η οποία καταργήθηκε από ένα πεπτίδιο εκλεκτικού αποκλεισμού ACE (Συμπληρωματικό Σχήμα S3).
Ανοσοϊστοχημική ανάλυση.Πνεύμονας καινεφρώνιστοί από ποντίκια σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Τομές πάχους τεσσάρων μικρομέτρων αποκηρώθηκαν και επανυδατώθηκαν. Η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε με θέρμανση μικροκυμάτων. Οι τομές αποκλείστηκαν για να μειωθεί η δραστηριότητα της ενδογενούς βιοτίνης χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο αποκλεισμού υπεροξειδάσης (Dako, Carpinteria, CA, USA) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 60 λεπτά με 10 τοις εκατό κανονικό ορό κατσίκας σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ACE2 αραιωμένο σε 1:500 (Ab15348, Abcam). Για να εξεταστεί η εξειδίκευση του αντισώματος, η ανοσοχρώση εξετάστηκε επίσης με την παράλειψη του πρωτογενούς Ab και με τη χρήση ενός ACE{11}}επιλεκτικού πεπτιδίου αποκλεισμού (ab15352). χρώση ACE2 στον πνεύμονα καινεφρικό ιστόΠαρατηρήθηκε s, το οποίο δεν παρατηρήθηκε όταν το αντίσωμα προαπορροφήθηκε με ένα ACE2-επιλεκτικό πεπτίδιο αποκλεισμού (ab15352) ή παράλειψη του αντισώματος ACE2. (Συμπληρωματικό Σχήμα S4).
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ
Βιοχημική ανάλυση.Μετά από εισπνοή αναισθησίας με ισοφλουράνιο 5 τοις εκατό, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος με καρδιακή παρακέντηση σε κατάσταση σίτισης με καρδιακές παρακεντήσεις. Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν ανθρωπίνως μετά από αναισθησία. Δείγματα ολικού αίματος φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία) στους 4 βαθμούς για 10 λεπτά για να διαχωριστεί το πλάσμα. Τα δείγματα πλάσματος που προέκυψαν αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι τη χρήση. Τα επίπεδα κρεατινίνης πλάσματος, BUN, κρεατινίνης ούρων και λευκωματίνης ούρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αυτοαναλυτή Hitachi 7180 (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία).
Δραστηριότητα ACE2 στο πλάσμα.Η δραστηριότητα ACE2 μετρήθηκε από την TechnoPro R&D Company (Τόκιο, Ιαπωνία) χρησιμοποιώντας το κιτ ανάλυσης δραστηριότητας ACE2 (SensoLyte 390) σε θερμοκρασία 27 βαθμών . Τα δείγματα αραιώθηκαν 1:10 χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης που παρέχεται με το κιτ δοκιμασίας δραστηριότητας ACE2. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε 384-πλάκες φρεατίων. Δείγματα πλάσματος, μόνο ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης (υπόβαθρο) ή 4-μεθυλ-κουμαρίνη-7-αμίδιο (0,16–5 μΜ) ως πρότυπο αναφοράς προστέθηκαν σε μια πλάκα αντίδρασης OptiPlate-384 F στους 10 μL/πηγάδι. Δέκα, διάλυμα υποστρώματος ACE2 (0,05 mM 4-μεθυλοκουμαρυλ-7-αμίδιο/Dnp σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης) προστέθηκαν στα 10 μL/φρεάτιο. Μετά την αντίδραση, η ένταση φθορισμού (Ex/ Em{=330 nm/390 nm) μετρήθηκε σε διαστήματα 5-λεπτών για 3 ώρες χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας EnSpire (PerkinElmer, Waltham, MA, ΗΠΑ). Η ένταση φθορισμού των δειγμάτων σε κάθε χρονικό σημείο υπολογίστηκε από την ένταση φθορισμού των δειγμάτων. Η κλίση κάθε δείγματος (RFU/min) προσδιορίστηκε από μια γραμμική προσέγγιση του οικοπέδου κατά την περίοδο από 30 έως 90 λεπτά μετά την έναρξη της μέτρησης.
Στατιστική ανάλυση.Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Οι διαφορές αναλύθηκαν ως εξής. Διεξήχθη αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης, ακολουθούμενη από Bonferroni post hoc ανάλυση, για τον προσδιορισμό των διαφορών με την πάροδο του χρόνου μεταξύ των ομάδων αδενίνης και ελέγχου (Εικ. 1, 2), ΑΑ και ομάδων φορέων (Εικ. 3Α, Β) ή αδενίνης και ολμεσαρτάνης ομάδες (Εικ. 5, 6 και S1). Χρησιμοποιήθηκαν μη ζευγαρωμένες δοκιμές t για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ ποντικών ΑΑ και φορέα (Εικ. 3C-F, 4). Τιμές P<0.05 were="" considered="" statistically="">
