Προστατευτική επίδραση της πανδουρατίνης Α στην επαγόμενη από σισπλατίνη απόπτωση των ανθρώπινων νεφρικών εγγύς σωληναριακών κυττάρων και στην οξεία νεφρική βλάβη σε ποντίκια

edmund.chen@wecistanche.com

Ιστορικό:Η σισπλατίνη είναι αποτελεσματική χημειοθεραπεία αλλά η κύρια παρενέργεια της είναι οξείανεφρική βλάβη, περιορίζει τη χρήση του. Το Pandurate A, μια βιοδραστική ένωση που εκχυλίζεται από το Boesenbergia rotunda, εμφανίζει διάφορες βιολογικές δραστηριότητες, όπως αντιοξειδωτικά αποτελέσματα. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τη νεφροπροστατευτική δράση της πανδουράτης Α στην επαγόμενη από σισπλατίνηνεφρική βλάβη.Μέθοδοι: Διερευνήσαμε την επίδραση της πανδουράτης Α στην τοξικότητα της σισπλατίνης τόσο σε ποντίκια όσο και σε καλλιέργειες ανθρώπινων νεφρικών κυττάρων χρησιμοποιώντας κύτταρα RPTEC/TERT1. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πανδουράτη Α βελτιώνει την επαγόμενη από τη σισπλατίνη νεφρική τοξικότητα τόσο σε ποντίκια όσο και σε κύτταρα RPTEC/TERT1 μειώνοντας την απόπτωση. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή (IP) ένεση σισπλατίνης (20 mg/kg σωματικού βάρους (BW)) παρουσίασαννεφρώντραυματισμός σωληναρίων και βλάβηνεφρική λειτουργίαόπως φαίνεται από την ιστολογική εξέταση και την αυξημένη κρεατινίνη ορού. Η συγχορήγηση του pandurate A (50 mg/kg Σ.Β.) από το στόμα βελτιώθηκενεφρική λειτουργίακαι βελτιώθηκενεφρώντραυματισμός των σωληναρίων της σισπλατίνης με αναστολή της ενεργοποίησης της εξωκυτταρικής ρυθμιζόμενης με σήμα κινάσης (ERK) 1/2 και της κασπάσης 3. Σε ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα νεφρού, απόπτωση των κυττάρων που προκαλείται από τη σισπλατίνη με την ενεργοποίηση προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (ERK1/2 και κασπάση 3), και μείωση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης (Bcl-2). Αυτές οι επιδράσεις βελτιώθηκαν σημαντικά με τη συν-θεραπεία με την παντουράτη Α. Είναι ενδιαφέρον ότι η παντουράτη Α δεν άλλαξε την ενδοκυτταρική συσσώρευση της σισπλατίνης. Δεν άλλαξε την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης ούτε σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινου παχέος εντέρου ούτε σε μη μικροκυτταρικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη υπογραμμίζει ότι η πανδουράτη Α έχει πιθανή προστατευτική επίδραση στη νεφροτοξικότητα της σισπλατίνης.

Λέξεις-κλειδιά:χημειοθεραπεία? οξεία νεφρική βλάβη? πανδουρατίνη Α; ανθρώπινο νεφρικό εγγύς σωληνάριο? αντι-απόπτωση? νεφρών; νεφρό

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η νεφροτοξικότητα που προκαλείται από φάρμακα είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στο κλινικό περιβάλλον, επειδή η χρήση νεφροτοξικών φαρμάκων είναι συχνά αναπόφευκτη. Η νεφροτοξικότητα μπορεί να οριστεί από νεφρικές βλάβες συμπεριλαμβανομένης της σπειραματικής βλάβης και της σωληναριακής βλάβης που οδηγεί σε έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας.1) Συνήθη φάρμακα που σχετίζονται μενεφρική βλάβηείναι αντιφλεγμονώδη, αντιβιοτικά και χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, όπως η σισπλατίνη.2–4) Η σισπλατίνη είναι ένα ευρέως φάσματος χημειοθεραπευτικό φάρμακο υψηλής δραστικότητας.5) Ωστόσο, περίπου ένας στους τρεις ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με σισπλατίνη πάσχει από νεφροτοξικότητα6,7). και ηλεκτρολυτική ανισορροπία.8,9) Η νεφροτοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη χαρακτηρίζεται από τραυματισμό εγγύς σωληνάριο, αγγειακή βλάβη και φλεγμονή.4) Η συσσώρευση σισπλατίνης στα νεφρικά κύτταρα επάγει πολλαπλές οδούς που προάγουν τον κυτταρικό θάνατο. Το αντιδραστικό είδος οξυγόνου (ROS) έχει αναγνωριστεί ως βασικός μεσολαβητής στη νεφροτοξικότητα της σισπλατίνης.10,11) Επιπλέον, το ROS επάγει νεφροτοξικότητα μέσω ενεργοποίησης πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνο (MAPKs).10,12,13) ​​Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η σισπλατίνη η ίδια μπορεί να διεγείρει άμεσα την εξωκυτταρική κινάση που ρυθμίζεται με σήμα (ERK) 1/2 (μέλος των MAPKs) τόσο in vitro όσο και in vivo. 14,15)

Ορισμένα φυτοχημικά βελτιώνουν τη νεφροτοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη αναστέλλοντας τη συσσώρευση και την απόπτωση των ROS.16–18) Παρόλο που έχουν αναφερθεί νεφροπροστατευτικές επιδράσεις αυτών των φυτοχημικών σε προκλινικές μελέτες, δεν υπάρχουν ακόμη εγκεκριμένα φάρμακα από φυτοχημικά για την ανασκόπηση της νεφροτοξικότητας της σισπλατίνης9 (1). ) Η τρέχουσα κλινική πρακτική παρέχει μόνο υποστηρικτικές θεραπείες για την ανάκτηση της νεφρικής λειτουργίας.20) Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να είναι σημαντική η αναζήτηση αποτελεσματικών παραγόντων για την πρόληψη ή τη θεραπεία της νεφροτοξικότητας που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Το Pandurate A είναι ένα ενδιαφέρον φυτοχημικό. Είναι μια χαλκόνη κυκλοεξανόλης που απομονώθηκε από το Boesenbergia rotunda, ένα φυτό που χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή ιατρική και στα τρόφιμα.21) Η πανδουρατίνη Α έχει αποδειχθεί ότι προλαμβάνει ή θεραπεύει το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή και τη μεταβολική νόσο.22,23) Τραυματισμός των εγγύς νεφρικών σωληναρίων που προκαλείται από Η σισπλατίνη προκαλείται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω αυξημένου οξειδωτικού στρες και φλεγμονής.11) Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση της πανδουρικής Α στην τοξικότητα της σισπλατίνης τόσο σε ζώα όσο και σε κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιώντας κύτταρα RPTEC/TERT1. Δοκιμάσαμε επίσης εάν η ταυτόχρονη θεραπεία με pandurate A επηρεάζει την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Χημικά Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT),  2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), cisplatin, and compound C (AMP-activated protein kinase (AMPK) inhibitor) were purchased from Sigma-Aldrich (MO, U.S.A.).  3 H-1-Methyl-4-phenylpyridinium (3 H-MPP+) was purchased from PerkinElmer, Inc. (Bangkok, Thailand). Annexin V- fluorescein isothiocyanate (FITC) apoptosis detection kit was purchased from BD Biosciences (CA, U.S.A.). Primary antibodies for p-ERK1/2 (Cat. No. 9102S), ERK1/2 (Cat. No.  9101S), Bcl-2 (Cat. No. 2872T), caspase-3 (Cat. No. 9662S),  glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Cat.  No. 2118S), p-AMPKα (Cat. No.2531S), AMPKα (Cat. No.  5832S), Bax (Cat. No. 5023) and β-actin (Cat. No. 4970T)  antibodies were obtained from Cell Signaling (MA, U.S.A.)  and anti-neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)  antibody (Cat. No. STCSC-515876) was purchased from Santa  Cruz Biotechnology (CA, U.S.A.). Pandurate A >Το 98 τοις εκατό καθαρότητας που προσδιορίστηκε με HPLC απομονώθηκε από το Boesenbergia rotunda όπως περιγράφηκε προηγουμένως από την ομάδα μας.24) Τα ριζώματα του Boesenbergia rotunda συλλέχθηκαν από το Kanchanaburi, Ταϊλάνδη. Το φυτό αναγνωρίστηκε από τον Tuanta Sematong. Το δείγμα κουπονιού (αρ. BKF 68909) έχει κατατεθεί στο Forest Herbarium, Royal Forestry Department, Bangkok.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Των ζώωνΑρσενικά ποντίκια C57BL/6 (ηλικίας 8-εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Nomura Siam International Co., Ltd. (Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη). Το πρωτόκολλο φροντίδας και χρήσης των ζώων αριθ. Τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε φαγητό και νερό. Μετά από μία εβδομάδα εγκλιματισμού, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία και έλαβαν θεραπείες ως εξής: φυσιολογικό ορό με μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή (IP) ένεση την ημέρα 4 (ομάδα ελέγχου). pandurate A (50 mg/kg σωματικού βάρους (BW)) με καθετηριασμό από το στόμα για 7 ημέρες (ομάδα pandurate A). σισπλατίνη (20 mg/kg ΣΒ) με μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση την ημέρα 4 (ομάδα σισπλατίνης). πανδουράτη Α (50 mg/kg ΣΒ/ημέρα) με καθετηριασμό από το στόμα για 7 ημέρες και σισπλατίνη (20 mg/kg ΣΒ) με μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση την ημέρα 4 (ομάδα συν-θεραπείας). Την ημέρα 7, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με θειοπεντάλη νατριούχο. Τραβήχτηκε αίμα και φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 3000 μ.μ. Τα υπερκείμενα που συλλέχθηκαν διατηρήθηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι τηννεφρική λειτουργίαμετρήθηκε.Νεφράσυλλέχθηκαν για τη μέτρηση πρωτεϊνικών εκφράσεων και ιστοπαθολογικές μελέτες.

Προσδιορισμός Νεφρικής Λειτουργίας και Ιστολογική ΕξέτασηΗ νεφρική λειτουργία προσδιορίστηκε με μέτρηση κρεατινίνης ορού χρησιμοποιώντας Stanbio Creatinine Liquicolor (NY, ΗΠΑ) και αναλυτή χημείας αίματος, Licenza (Ρώμη, Ιταλία). Για να εξετάσει τη νεφρική σωληναριακή βλάβη που προκαλείται από τη σισπλατίνη, ποντίκινεφράσταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. ονεφρόΟι φέτες χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η&Ε) φωτογραφήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός. Το ποσοστό της σωληναριακής βλάβης χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της νεφρικής σωληναριακής βλάβης: 0=χωρίς σωληναριακή βλάβη 1=<10%; 2="10–25%;" 3="26–50%;" 4="51–75%;"  5="">75 τοις εκατό. Οι διαφάνειες βαθμολογήθηκαν τυφλά από έναν παθολόγο. Η μέση βαθμολογία για κάθε ομάδα ζώων υπολογίστηκε μετρώντας 10 διαφορετικά πεδία μιας διαφάνειας.

Κυτταρικές ΓραμμέςΚύτταρα RPTEC/TERT1, καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου (HCT116) και μη μικροκυτταρικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Α549) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (VA, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα RPTEC/TERT1 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες τροποποιημένο μέσο Dulbecco's Eagle's medium/F-12 (DMEM/F12) όπως περιγράφηκε προηγουμένως.25) Τα κύτταρα HCT116 και A549 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM/F12 και RPMI1640, αντίστοιχα, συμπληρωμένα με αντιβιοτικά πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης και 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό Ο2.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων και ανάλυση κυτταρικής απόπτωσηςΗ βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με έκθεση των κυττάρων RPTEC/TERT1 σε 0.5 mg/mL αντιδραστήριο ΜΤΤ για 1 ώρα στους 37 βαθμούς C. Τα αντιδραστήρια απομακρύνθηκαν, το άλας φορμαζάνης που σχηματίστηκε διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και ανιχνεύθηκε με Αναγνώστης μικροπλάκας EnVision σε απορρόφηση 570nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναφέρθηκε ως ποσοστό ελέγχου. Αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (χρησιμοποιήθηκε ανάλυση χρώσης PI για τον προσδιορισμό της κυτταρικής απόπτωσης. Εν συντομία, τα κύτταρα RPTEC/TERT1 αποσπάστηκαν με 0,25 τοις εκατό θρυψίνη-αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA). Τα κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν με Annexin V-FITC και PI στο σκοτάδι 4 βαθμούς για 15 λεπτά ακολουθούμενο από δύο φορές πλύση με ρυθμιστικό δέσμευσης Τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής και εκφράστηκαν ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων.

Εκτίμηση Ενδοκυτταρικής Συσσώρευσης ROSΤα επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν με δοκιμασία DCFH-DA. Τα κύτταρα RPTEC/TERT1 επωάστηκαν με 10 μΜ DCFH-DA και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Στη συνέχεια, η χρωστική DCFH-DA αφαιρέθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS μετρήθηκε σε μήκη κύματος 485 και 530 nm για διέγερση και εκπομπή, αντίστοιχα. Η ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS αναφέρεται ως ποσοστό της έντασης του φθορισμού σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Ανάλυση συσσώρευσης πλατίναςΗ συσσωρευμένη πλατίνα μετρήθηκε τόσο σε χωνευμένα κύτταρα RPTEC/TERT1 όσο και σε ποντίκιανεφράαπό φασματόμετρο UNICAM 989 QZ AA (Geleen, Ολλανδία). Δέκα μικρολίτρα Triton X-100 1 τοις εκατό και 400 uL νιτρικού οξέος 1 τοις εκατό προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 100 μL. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν για τουλάχιστον 1 ώρα. Πριν από την ανίχνευση πλατίνας, κάθε δείγμα αραιώθηκε 10:1 με 1 τοις εκατό νιτρικό οξύ. Η συγκέντρωση πλατίνας υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση μιας πρότυπης καμπύλης πλατίνας που παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας 2,5 mg/mL σισπλατίνης αραιωμένης σε νιτρικό οξύ 1 τοις εκατό. Η πλατίνα υπολογίστηκε ως ng/αριθμός κυττάρων ή ng/νεφρόβάρος.

Δοκιμασία πρόσληψης 3H-MMP*Η πρόσληψη 3H-MPP συν στα κύτταρα RPTEC/TERT1 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την προηγούμενη μέθοδο μας.25) Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με θερμό ρυθμιστικό μεταφοράς και επωάστηκαν περαιτέρω για 20 λεπτά. Οι μονοστοιβάδες κυττάρων επωάστηκαν με Η-ΜΡΡ συν (10 ηΜ) και ακολούθησε έκπλυση με παγωμένο ρυθμιστικό μεταφοράς. Τα δείγματα συλλέχθηκαν και μετρήθηκε η ραδιενεργός δράση του H-MPP plus χρησιμοποιώντας έναν μετρητή υγρού σπινθηρισμού.

Ανάλυση Western BlottingΟι εκφράσεις πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας. 26) Εκχυλίστηκαν πρωτεΐνες από ποντίκινεφρόκαι τα κύτταρα RPTEC/TERT1 φυγοκεντρήθηκαν στις 12000 rpm για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από κύτταρα και ιστό μετουσιώθηκαν και διαχωρίστηκαν με 10-12 τοις εκατό ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και ακολούθησε 1 ώρα αποκλεισμός μη ειδικής πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας μη λιπαρό ξηρό γάλα (5 τοις εκατό). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα. Η ένταση της πρωτεϊνικής έκφρασης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας υπόστρωμα HRP χημειοφωταύγειας και ποσοτικοποιήθηκε με λογισμικό ImageJ.

Στατιστική ανάλυσηΤα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας τα posthoc τεστ Tukey (GraphPad Prism 8.0). Μια σημασία θεωρείται όταν η τιμή p είναι μικρότερη από 0.05.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η Panduratin A Βελτιώνει τον Οξύ Νεφρό που προκαλείται από ΣισπλατίνηΤραυματισμός Ερευνήσαμε την επίδραση της πανδουράτης Α σενεφρική βλάβηπροκαλείται από σισπλατίνη σε ποντίκια. Παρατηρήσαμε για πρώτη φορά τη γενική τοξικότητα μετρώντας την αλλαγή σωματικού βάρους σε ποντίκια μετά από θεραπεία με φυσιολογικό ορό, πανδουράτη Α (50 mg/kg ΣΒ), σισπλατίνη (20 mg/kg ΣΒ) και σισπλατίνη (20 mg/kg ΣΒ) και πανδουράτη Α (50 mg/kg ΣΒ). Βρέθηκε ένα σημαντικά μειωμένο σωματικό βάρος στα ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη. Η απώλεια σωματικού βάρους μετριάστηκε με συν-θεραπεία με πανδουράτη Α (Εικ. 1Α). Σε σύγκριση με τον έλεγχο,νεφρική λειτουργίατο οποίο μετρήθηκε με το επίπεδο κρεατινίνης ορού έδειξε ότι μόνο το pandurate Α που έλαβαν ποντίκια δεν άλλαξε το επίπεδο κρεατινίνης ορού. ενώ τα ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα κρεατινίνης ορού, υποδεικνύοντας μειωμένη νεφρική λειτουργία. Το επίπεδο κρεατινίνης ορού κατά τη συγχορήγηση του pandurate A ήταν σημαντικά μειωμένο σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη (Εικ. 1Β). Επιπλέον, η συσσώρευση πλατίνας στονεφρόΟ ιστός δεν ήταν σημαντικά διαφορετικός στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μόνο με σισπλατίνη σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν ταυτόχρονα σισπλατίνη και πανδουράτη Α (Εικ. 1C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η πανδουράτη Α δεν επηρέασε την περιεκτικότητα σε σισπλατίνη στον νεφρικό ιστό. ονεφράπου ελήφθη από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με φορέα ή πανδουράτη Α μόνο δεν εμφάνισαν σημαντικές παθολογικές αλλαγές. Ωστόσο, τα ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη εμφάνισαν μεγαλύτερη σωληναριακή βλάβη σε σύγκριση με τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα, όπως φαίνεται από την αύξηση στον εκφυλισμό και την απολέπιση, το σχηματισμό εκμαγείων, τη διήθηση μονοπύρηνων κυττάρων, την καρυομεγαλία, τη διασωληναριακή αιμορραγία και τη διαστολή. Αυτές οι παθολογικές αλλαγές μετριάστηκαν σημαντικά με τη συγχορήγηση της πανδουράτης Α (Εικ. 2Α, Πίνακας 1). Προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης NGAL (ένας βιοδείκτης νεφροτοξικότητας) και ERK1/2 και διασπασμένης κασπάσης 3 (προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες). Η μελέτη μας έδειξε ότι τα ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη αύξησαν σημαντικά την έκφραση του NGAL, του p-ERK1/2 και της σχισμένης κασπάσης 3 σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με όχημα. Η ταυτόχρονη θεραπεία με pandurate A μείωσε σημαντικά αυτές τις πρωτεΐνες που προκλήθηκαν από τη θεραπεία με σισπλατίνη (Εικ. 2Β).

Το Pandurate A αποτρέπει την επαγόμενη από τη σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα νεφρού αναστέλλοντας τις αποπτωτικές οδούς σηματοδότησηςΗ σισπλατίνη (50 μΜ) σημαίνει σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων RPTEC/TERT1 μετά από επώαση 72 ωρών. Είναι ενδιαφέρον ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με pandurate A (1 και 5 μM) αύξησε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ.

3Α). Η προστατευτική δράση της πανδουρατίνης Α έναντι της κυτταροτοξικότητας της σισπλατίνης επιβεβαιώθηκε με τη μέτρηση της κυτταρικής απόπτωσης. Όπως αναμενόταν, η έκθεση των κυττάρων σε 50 μΜ σισπλατίνη για 48 ώρες αύξησε σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων RPTEC/TERT1. Αυτή η επίδραση εξασθενήθηκε από την πανδουράτη Α (Εικ. 3Β). Εξετάσαμε εάν η επίδραση του pandurate A στην τοξικότητα της σισπλατίνης απαιτούσε ενεργοποίηση της AMPK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η έκφραση πρωτεΐνης της ρ-ΑΜΡΚ, μιας δραστικής μορφής ΑΜΡΚ, αυξήθηκε από την πανδουράτη Α ενώ μειώθηκε από τη σισπλατίνη. Επιπροσθέτως, προσδιορίστηκε η προστατευτική δράση της πανδουράτης Α υπό αναστολή ΑΜΡΚ. Είναι ενδιαφέρον ότι η επώαση των κυττάρων με 10 μΜ ένωση C, έναν αναστολέα της ΑΜΡΚ, δεν μείωσε την προστατευτική επίδραση της πανδουράτης Α στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η προστατευτική δράση της πανδουράτης Α μπορεί να προκαλείται από μηχανισμούς ανεξάρτητους από την AMPK. Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση του pandurate A σε ορισμένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην απόπτωση των κυττάρων που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, η σισπλατίνη αύξησε σημαντικά τις προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες p-ERK1/2 και διέσπασε την κασπάση 3. Η σισπλατίνη μείωσε την έκφραση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. Η ταυτόχρονη θεραπεία με pandurate A αντέστρεψε την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών. Δεδομένου ότι το ROS είναι ένας κύριος παράγοντας που εμπλέκεται στην απόπτωση των νεφρικών κυττάρων που προκαλείται από τη σισπλατίνη, 11,27) προσδιορίσαμε την επίδραση της πανδουρατίνης Α στη συσσώρευση ROS λόγω της σισπλατίνης. Η σισπλατίνη αύξησε σημαντικά τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS. Είναι ενδιαφέρον ότι η πανδουρατίνη Α μείωσε σημαντικά τη συσσώρευση ROS που προκαλείται από τη σισπλατίνη.

Η πανδουρατίνη Α δεν επηρεάζει την κυτταρική συσσώρευση της σισπλατίνης OCT2μεσολαβεί στη μεταφορά της σισπλατίνης στα ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα του νεφρού.289 Για να εξετάσουμε την πιθανότητα συσσώρευσης σισπλατίνης A που μειώνει την πανδουρατίνη Α, μετρήσαμε τη λειτουργία μεταφοράς του OCT2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επώαση κυττάρων με 5 μΜ πανδουρατίνη Α για 10 λεπτά και 24 ώρες δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική συσσώρευση Η-1-μεθυλ-4-φαινυλοπυριδίνιου (H-MPP συν), ενός υποστρώματος του OCT2. Στη συνέχεια, επιβεβαιώθηκε η επίδραση της πανδουρατίνης Α στην κυτταρική συσσώρευση της σισπλατίνης. Η πανδουρατίνη Α δεν είχε σημαντική επίδραση στη συσσώρευση πλατίνας στα ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα (Εικ. 5).

Η προστατευτική δράση της πανδουρατίνης Α δεν επηρεάζει την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνηςΠροσδιορίστηκε η επίδραση της πανδουρατίνης Α στην τοξικότητα της σισπλατίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η βιωσιμότητα των κυττάρων HCT116 και A549 που είναι κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και του πνεύμονα, αντίστοιχα, μειώθηκε σημαντικά 72 ώρες μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη (50μuM). Η ταυτόχρονη θεραπεία με πανδουρατίνη Α (5μM) δεν μείωσε την κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης. Είναι ενδιαφέρον ότι η πανδουρατίνη Α από μόνη της μείωσε επίσης το

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η παρούσα μελέτη αποκαλύπτει ότι η πανδουρατίνη Α μειώνει τη νεφροτοξικότητα της σισ-πλατίνης χωρίς να βλάπτει την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και των μη μικροκυτταρικών καρκινικών γραμμών του πνεύμονα. Δείξαμε ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με πανδουρατίνη Α μειώνει την οξεία αγωγήνεφρική βλάβησε ποντίκια που προκαλείται από σισπλατίνη. Αν και η παρούσα μελέτη δείχνει την προστατευτική επίδραση στην επαγόμενη από τη σισπλατίνηνεφρική βλάβη,ο πρωταρχικός στόχος της πανδουρατίνης Α δεν έχει προσδιοριστεί. Η πανδουρατίνη Α θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την AMPK σε νεφρικά εγγύς σωληναριακά κύτταρα (Εικ. 3) και σε άλλους κυτταρικούς τύπους.30-2) Φαίνεται απίθανο ότι η προστατευτική δράση της πανδουρατίνης Α απαιτεί ενεργοποίηση της AMPK καθώς τα στοιχεία έδειξαν ότι η αναστολή της AMPK με χρήση χημικών αναστολέων δεν άλλαξε την προστατευτική δράση του Pandu-rating A. Η Panduratin A βελτίωσε τη νεφρική λειτουργία, όπως φαίνεται από τη μειωμένη κρεατινίνη ορού. Η μειωμένη νεφρική λειτουργία με σισπλατίνη συσχετίζεται με τραυματισμούς των νεφρικών σωληναρίων όπως εκφύλιση, σχηματισμός γύψου αυλού, αιμορραγία και διαστολή. Τα αποτελέσματα τραυματισμού του νεφρικού σωληνίσκου συσχετίστηκαν καλά με τα δεδομένα μας που δείχνουν την επαγωγή έκφρασης NGAL σενεφρόιστού ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη. Επιπλέον, αυτά τα στοιχεία υποστηρίζονται από την προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι η NGAL εκφράζεται σημαντικά σε νεφρικά σωληνάρια μετά από οξείανεφρική βλάβηπου προκαλείται από τη σισπλατίνη. 3) Είναι ενδιαφέρον ότι η συν-θεραπεία των ποντικών με πανδουρατίνη Α εξασθενούσε τον τραυματισμό των νεφρικών σωληναρίων που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Η ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι η σισπλατίνη αύξησε τη διήθηση των μονοπύρηνων κυττάρων και αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε από την πανδουρατίνη Α. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η πανδουρατίνη Α, η οποία είχε προηγουμένως δειχθεί ως αντιφλεγμονώδης, 24,3435) μπορεί να μετριάσει τη φλεγμονώδη δράση της σισπλατίνης στον νεφρικό ιστό. Η ενεργοποίηση της MAPK θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο.2415) Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η σισπλατίνη διεγείρει την ενεργοποίηση του ERK1/2 και της κασπάσης 3. Οι εκφράσεις αυτών των πρωτεϊνών εξασθενήθηκαν από την πανδουρατίνη Α.

Έχουν αναφερθεί πολλαπλές οδοί που συμβάλλουν στη νεφροτοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη (συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής). Τα κύτταρα RPTEC/TERT1 έχουν προταθεί ως μοντέλο νεφρικών κυττάρων για τοξικότητες που προκαλούνται από ξενοβιοτικά.36 Η πανδουρατίνη Α παρουσιάζει προστατευτική δράση σε σχέση με την κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης, όπως φαίνεται από τη μείωση της απόπτωσης των κυττάρων RPTEC/TERT1. Οι μηχανισμοί τοξικότητας της σισπλατίνης στα εγγύς νεφρικά σωληναριακά κύτταρα είναι πολύπλοκοι. Η ενεργοποίηση του ERK1/2 και της κασπάσης 3 και η μείωση του Bcl-2 έχουν εμπλακεί στην απόπτωση των νεφρικών κυττάρων λόγω σισπλατίνης.373) Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η σισπλατίνη αυξάνει την έκφραση του p-ERK1/2 και της διασπασμένης κασπάσης 3 και μειώνει την έκφραση Bcl-2. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η πανδουρατίνη Α καταστέλλει τις επαγόμενες από τη σισπλατίνη αποπτωτικές πρωτεΐνες σηματοδότησης, το p-ERK1/2 και τη διασπασμένη κασπάση 3 και διατηρεί την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη. Bcl-2. Εκτός από την ενεργοποίηση του ERK1/2 και της κασπάσης 3, η αυξημένη ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS είναι ένας βασικός παράγοντας στην απόπτωση των νεφρικών κυττάρων λόγω σισπλατίνης.139 Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η πανδουρατίνη Α προστατεύει από την οξειδωτική βλάβη στα ηπατοκύτταρα μειώνοντας τον ενδοκυτταρικό σχηματισμό ROS που προκαλείται από αντιδραστική ενδιάμεσα.4 Η μείωση της συσσώρευσης ROS μετά από θεραπεία με πανδουρατίνη Α θα μπορούσε να προκληθεί είτε από την αναστολή της παραγωγής ROS είτε από την αύξηση της αντίδρασης σάρωσης ROS. Αναφέραμε ότι η πανδουρατίνη Α αύξησε το επίπεδο γλουταθειόνης, ένα μόριο που δεσμεύει το ROS, το οποίο μπορεί να μειώσει τη συσσώρευση ROS στον νεφρικό ιστό (βλ. συμπληρωματικά υλικά). Ωστόσο, δεν αποκλείουμε άλλους μηχανισμούς να εμπλέκονται στη μείωση των ROS. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η πανδουρατίνη Α μειώνει την ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS, η οποία συμβάλλει στην προστατευτική δράση της πανδουρατίνης Α. Το ενδοκυτταρικό επίπεδο της σισπλατίνης είναι ο πρωταρχικός παράγοντας που επηρεάζει τη σοβαρότητα της επαγόμενης από τη σισπλατίνη τοξικότητας. Νεφρικοί μεταφορείς όπως OCT2, μεταφορείς χαλκού και μεταφορέας εξώθησης πολλαπλών φαρμάκων και τοξινών-1 (MATE1) έχει αναφερθεί ότι συμβάλλουν στη μεταφορά σισπλατίνης.4) Ωστόσο, η μεταφορά της σισπλατίνης στα εγγύς νεφρικά σωληναριακά κύτταρα μεσολαβείται κυρίως από το OCT2. Η αναστολή των OCTs έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τη νεφρική τοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη τόσο σε καλλιεργημένα νεφρικά κύτταρα όσο και σε ζώα. Η τοξικότητα της σισπλατίνης δεν προκαλείται από τη μείωση της μεταφοράς ή της συσσώρευσης της σισπλατίνης.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Η πανδουρατίνη Α εμφανίζει αντιπροστατευτικά αποτελέσματα μέσω της αναστολής της απόπτωσης των νεφρικών κυττάρων. Εάν η πανδουρατίνη Α ανέστειλε επίσης την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, θα μείωνε την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας. Επομένως, εξετάσαμε εάν η πανδουρατίνη Α μειώνει την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης. Είναι σημαντικό ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με Pandu-βαθμολόγησης Α δεν αλλάζει την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης είτε σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είτε σε μη μικροκυτταρικά κύτταρα πνεύμονα. Επιπλέον, η ίδια η πανδουρατίνη Α είναι τοξική και για τις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επίδραση της πανδουρατίνης Α είναι επιλεκτική, επηρεάζοντας διαφορετικά τα φυσιολογικά νεφρικά και τα καρκινικά κύτταρα. Αν και η παν-διάρκεια Α μπορεί να είναι καλός παράγοντας για την πρόληψη της επαγόμενης από τη σισπλατίνη νεφροτοξικότητας, οι πληροφορίες σχετικά με τις φαρμακολογικές επιδράσεις της πανδουρατίνης Α υπό κλινικά σχετικές με το μοντέλο ξενομοσχεύματος θα πρέπει να διερευνηθούν στο μέλλον.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Η παρούσα μελέτη μας έδειξε ότι η πανδουρατίνη Α παρέχει μια αξιοσημείωτη προστατευτική επίδραση στη νεφροτοξικότητα της σισπλατίνης μειώνοντας το οξειδωτικό στρες και αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του ERK1/2 και της κασπάσης 3. Η προστατευτική δράση της πανδουρατίνης Α δεν άλλαξε την αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης στα καρκινικά κύτταρα. Παρόλο που η παρεμπόδιση ορισμένων ζημιογόνων συμβάντων μπορεί να έχει μόνο μερική αντιπροστατευτική δράση, η πανδουρατίνη Α μπορεί να είναι ένας καλός υποψήφιος παράγοντας για την ανακούφιση της νεφροτοξικότητας της σισπλατίνης επειδή μειώνει την τοξικότητα της σισπλατίνης μέσω πολλαπλών μηχανισμών.