Αξιολόγηση της εντερικής μεταφοράς ενός εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδη από το Cistanche Deserticola σε όλο το μοντέλο κυτταρικής μονοστοιβάδας Caco-2

Εισαγωγή

Η κυτταρική σειρά Caco-2, η οποία προήλθε από αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου ανθρώπου, παρουσιάζει χαρακτηριστικά που μοιάζουν με εντεροκύτταρα. Υπό κανονικές συνθήκες, τα κύτταρα Caco-2 διαφοροποιούνται αυθόρμητα από τα ώριμα κύτταρα και σχηματίζουν ανέπαφες μονοστοιβάδες. Τα γειτονικά κύτταρα προσκολλώνται μέσω σφιχτών συνδέσεων που σχηματίζονται στην κορυφαία πλευρά της μονοστοιβάδας, η οποία μπορεί να διακρίνει την παθητικήκαι μετέφερε ενεργά φάρμακα σε όλη την επιθηλιακή στιβάδα. Λόγω της μορφολογικής και βιοχημικής ομοιότητας με τα φυσιολογικά εντεροκύτταρα, οι μονοστοιβάδες κυττάρων Caco-2 χρησιμεύουν ως ένα καλά αποδεκτό in vitro μοντέλο για τη μελέτη του δυναμικού εντερικής απορρόφησης και των χαρακτηριστικών μεταφοράς των φαρμάκων.

Σε αντίθεση με τα χημικά, τα φυτικά εκχυλίσματα (PE) είναι μείγματα των οποίων η βιολογική δραστηριότητα και τα ενεργά συστατικά συχνά δεν είναι καλά αναγνωρισμένα. Επιπλέον, οι ιδιότητες εντερικής μεταφοράς του PE, σε αντίθεση με τις ιδιότητες των συστατικών του, σχετίζονται στενά με την κλινική χρήση. Οι μετρήσεις ροής για ένα δοκιμαστικό δείγμα σε μια μονοστιβάδα κυττάρου Caco-2 συνήθως περιλαμβάνουν χημικές μεθόδους, όπως HPLC, LC/MS, κ.λπ. Αν και αυτές οι μέθοδοι είναι ισχυρά εργαλεία, είναι πολύπλοκες, χρονοβόρες, δαπανηρές και περιστασιακά απαιτούν εξελιγμένο εξοπλισμό. Το πιο σημαντικό, ούτε ένα μόνο στοιχείο ούτε ένα μειοψηφικό στοιχείο μπορεί να αντικατοπτρίζει την ΠΕ στο σύνολό της. Επομένως, πρέπει να καθιερωθεί μια νέα προσέγγιση ανεξάρτητη από τον προσδιορισμό των συστατικών για τον εντοπισμό και την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς του PE.

Το Cistanche deserticola YC Ma (CD), ένα ολοπαρασιτικό φυτό, είναι ένα κοινό παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο που χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας, της αδυναμίας του σώματος και της δυσκοιλιότητας, και αυτές οι χρήσεις έχουν καταγραφεί επίσημα στην Κινεζική Φαρμακοποιία.Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs), συμπεριλαμβανομένων των εχινακοσίδης (EC), ακτεοζίτης (AC) και ισοακτεοσίδης (IS), κ.λπ., είναι μια κατηγορία πολυφαινολικών ενώσεων. Θεωρούνται ένα από τα κύρια βιοενεργά συστατικά του είδους Cistanche. Φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η βιοδραστικότητα των PhGs είναι ποικίλη και περιλαμβάνει αντιοξειδωτική, αντι-κόπωση, ηπατοπροστατευτική, ανοσοτροποποιητική, αντιφλεγμονώδη και νευροπροστατευτική δράση. Ωστόσο, τα χαρακτηριστικά εντερικής μεταφοράς των PhGs δεν έχουν διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την εντερική διαπερατότητα ενός εκχυλίσματος πλούσιου σε PhG (PRE) από CD ως ολοκληρωμένο σύστημα και τη διαπερατότητα τριών κύριων PhGs (AC, IS και EC) σε διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το PRE μεταφέρεται κυρίως μέσω κακώς απορροφούμενης παθητικής διάχυσης σε μια βαθμίδα συγκέντρωσης χωρίς εκροή, η οποία παρέχει τη φαρμακοκινητική βάση για την κλινική εφαρμογή των PhGs σε CD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>Το 98%) αγοράστηκαν από τη Must Biotechnology Co. (Chengdu, Κίνα). Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM), ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) και τα μη απαραίτητα αμινοξέα (NEAA) παρήχθησαν από την Gibco BRL (Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). 6-πλάκες καλά TranswellTM (εμβαδόν ανάπτυξης μεμβράνης εισαγωγής 4,67 cm2) ελήφθησαν από την Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, ΜΑ, ΗΠΑ). Το κολλαγόνο ουράς αρουραίου ελήφθη από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Όλα τα αντιδραστήρια και τα χημικά για την ανάλυση HPLC ήταν αναλυτικής ποιότητας.

Προετοιμασία PRE από CD

Το ξηρανθέν στον αέρα υλικό CD κονιοποιήθηκε και εκχυλίστηκε με διήθηση με 70% αιθανόλη. Το πλούσιο σε PhG κλάσμα παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως και εκχυλίστηκε με κορεσμένη σε νερό η-βουτυλική αλκοόλη. Το υγρό εκχυλίσματος συμπυκνώθηκε και ξηράνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση. Η φασματοφωτομετρία μακροπορώδους ρητίνης-UV μέτρησε περιεκτικότητα σε PhG 78,4%. Το τελικό δείγμα αντιπροσώπευε μια απόδοση 1,75% πρώτης ύλης κατά ξηρό βάρος. Το ληφθέν δείγμα αποθηκεύτηκε στους -20 βαθμούς μέχρι περαιτέρω χρήση.

Προσδιορισμός AC, IS και EC με HPLC

Ένα σύστημα HPLC Shimadzu εξοπλισμένο με λογισμικό διαλύματος LC χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των περιεχομένων των AC, IS και EC σε PRE. Χρησιμοποιήθηκε στήλη Intersil C18 αντίστροφης φάσης (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κινητές φάσεις ήταν ακετονιτρίλιο και νερό που περιείχε 0.1% φωσφορικό οξύ (ν/ν) με βαθμιδωτή έκλουση (Πίνακας 1) με ρυθμό ροής 1,0 ml/min. Ο ανιχνευτής φασματοφωτόμετρο UV ρυθμίστηκε στα 334 nm. Για να προσδιορίσουμε με ακρίβεια τη ροή AC και IS, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο ανίχνευσης φθορισμού HPLC (HPLC-FLD). Μετά από μια δομική ανάλυση και σάρωση μήκους κύματος φθορισμού (τα δεδομένα δεν φαίνονται), λάβαμε τις βέλτιστες συνθήκες ανίχνευσης φθορισμού για AC (π.χ.: 338 nm, Em: 448 nm) και IS (π.χ: 320 nm, Em: 434 nm).

Η αναλυτική μέθοδος HPLC επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα χαρακτηριστικά απόδοσης: σταθερότητα, γραμμικότητα, ευαισθησία, ακρίβεια (μεταβλητότητα εντός και εντός της ημέρας) και ακρίβεια. Οι αναλυόμενες ουσίες στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς αποθηκεύτηκαν στους 25 βαθμούς στο σκοτάδι για 24 ώρες και μετρήθηκε η σταθερότητά τους. Οι αναλυόμενες ουσίες ήταν πολύ σταθερές παρουσία βιταμίνης C (0,4%) επειδή οι τιμές σχετικής τυπικής απόκλισης (RSD) στις περιοχές κορυφής ήταν < 3,5%. Η εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης, ο συντελεστής συσχέτισης, το εύρος γραμμικότητας, το LOD και το LOQ για AC, IS και EC φαίνονται στον Πίνακα 2. Τα LOD (18–30 nM) και τα LOQ (60–100 nM) Οι τιμές δείχνουν ότι οι μέθοδοι HPLC-FLD και HPLC-UV είναι εξαιρετικά ευαίσθητες. Οι τιμές RSD που εκφράζουν την ακρίβεια της μεθόδου ήταν όλες < 2% για μεταβλητότητα εντός και εντός της ημέρας, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια. Για αξιολόγηση ανάκτησης, AC, IS και EC προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς για να δώσουν τρία (υψηλά, μεσαία και χαμηλά) επίπεδα συγκέντρωσης. Οι τιμές ανάκτησης της μεθόδου για τις αναλυόμενες ουσίες συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Οι μέσες ανακτήσεις κυμαίνονταν από 90,0% έως 96,4%, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια. Συμπερασματικά, οι καθιερωμένες μέθοδοι HPLC είναι ικανοποιητικές όσον αφορά τη γραμμικότητα, την ευαισθησία, την ακρίβεια και την ακρίβεια για τον ποσοτικό προσδιορισμό των AC, IS και EC στο buffer μεταφοράς.

Προσδιορισμός PRE με σύστημα βιοπροσδιορισμού

Η βιοδοκιμασία (ολική αντιοξειδωτική ικανότητα) βασίστηκε στον προσδιορισμό FRAP (μειωτική/αντιοξειδωτική ισχύς σιδήρου) που περιγράψαμε προηγουμένως [16] και επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα και την ακρίβεια (μεταβλητότητα εντός και εντός της ημέρας). Η γραμμικότητα της μεθόδου βιοδοκιμασίας προσδιορίστηκε με βάση τις καμπύλες βαθμονόμησης. Το εύρος συγκέντρωσης της γραμμικότητας ήταν 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Η ακρίβεια της καθιερωμένης μεθόδου βιοδοκιμασίας προσδιορίστηκε ως προς τη μεταβλητότητα εντός και εντός της ημέρας για μια ανάλυση του PRE (10,0 ug/ml). Η ενδοημερήσια επαναληψιμότητα της μεθόδου προσδιορίστηκε με βάση πέντε διαδοχικούς προσδιορισμούς την ίδια ημέρα. Η επαναληψιμότητα μεταξύ των ημερών μετρήθηκε με βάση πέντε διαδοχικούς προσδιορισμούς σε τρεις διαφορετικές ημέρες. Οι τιμές RSD για την ακρίβεια της μεθόδου ήταν 1,014% και 4,72% για μεταβλητότητα εντός και εντός της ημέρας, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια. Έτσι, η καθιερωμένη μέθοδος βιοδοκιμασίας είναι ικανοποιητική όσον αφορά τη γραμμικότητα, την ακρίβεια και την ακρίβεια για τον ποσοτικό προσδιορισμό του PRE σε ένα buffer μεταφοράς.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα Caco{{0}} καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς και 95% σχετική υγρασία σε ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 και ένα μέσο αποτελούμενο από DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-γλουταμίνη, πενικιλίνη (100 U/ml) και στρεπτομυκίνη (100 ug/ml). Το μέσο άλλαζε κάθε δεύτερη μέρα κατά την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλαστικές φιάλες 75-cm2 και συλλέγονταν κάθε 3-5 ημέρες με 0,05% EDTA-θρυψίνη. Για τα πειράματα μεταφοράς, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1x105 κύτταρα/cm2 σε ένθετα Transwell επικαλυμμένα με κολλαγόνο. Περίπου 21 ημέρες μετά τη σπορά, οι μονοστιβάδες χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα μεταφοράς. Η ακεραιότητά τους προσδιορίστηκε με μέτρηση της δια-επιθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης (TEER) στις μονοστοιβάδες με ένα EVOM εξοπλισμένο με ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., ΗΠΑ). Οι τιμές TEER της μονοστοιβάδας κελιών Caco-2 πρέπει να υπερβαίνουν τα 500 O∙cm2.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΚΑΤΑΠΡΑΚΤΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΤΙΚΟ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Πειράματα μεταφοράς

Η μονοστιβάδα πλύθηκε με ρυθμιστικό μεταφοράς (ρυθμιστικό διάλυμα Ρ που περιέχει 10 mM HEPES, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 10 mM γλυκόζη, 3 mM CaCl2 και 145 mM NaCl, ρΗ 7,4) και στη συνέχεια προεπωάστηκε για 20 λεπτά στους 37 βαθμούς. Μετά την απομάκρυνση του ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς, προστέθηκε φρέσκο ​​ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς που περιείχε δείγματα δοκιμής στον κορυφαίο θάλαμο (1,5 ml) σε μελέτες κατεύθυνσης ΑΡ προς βασικοπλευρικές (BL) ή στον θάλαμο BL (2,5 ml) σε μελέτες κατεύθυνσης BL σε ΑΡ. Για προσδιορισμούς AC, IS και EC χρησιμοποιώντας HPLC, ένα κλάσμα (300 μΙ) αφαιρέθηκε από κάθε θάλαμο δέκτη σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (30, 60, 90 και 120 λεπτά). Ο θάλαμος του δέκτη αναπληρώθηκε με τον ίδιο όγκο φρέσκου προθερμασμένου (37 μοιρών) ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς μετά από κάθε δειγματοληψία. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς για περαιτέρω χρήση. Για τον προσδιορισμό PRE με χρήση βιοπροσδιορισμού, ελήφθησαν μόνο τα δείγματα στα 120 λεπτά. Λόγω της αστάθειας των PRE, AC, IS και EC, προστέθηκε 0,4% (w/v) βιταμίνη C για τη σταθεροποίηση των δειγμάτων για τον προσδιορισμό των περιεχομένων AC, IS και EC με HPLC και τα δείγματα για τη βιοδοκιμασία PRE ήταν αναλύθηκε αμέσως μετά τη δειγματοληψία. Υπολογίστηκε η τιμή του συντελεστή φαινομενικής διαπερατότητας (Papp ή 'Papp) κάθε δείγματος.

Ανάλυση δεδομένων

Οι τιμές Papp στις κατευθύνσεις AP BL ή BLAP των AC, IS και EC υπολογίστηκαν με βάση την ακόλουθη εξίσωση: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), όπου Papp είναι ο συντελεστής φαινομενικής διαπερατότητας (cm/s) που προσδιορίζεται με HPLC. (4Q/4t) είναι ο ρυθμός εμφάνισης της ελεγχόμενης ένωσης (AC, IS ή EC) στην πλευρά του δέκτη (μmol/s). A είναι η επιφάνεια του ενθέτου (cm2). Το C0 είναι η αρχική συγκέντρωση της δοκιμαστικής ένωσης στην πλευρά του δότη (μmol/ml). Συγκεκριμένα, η μονάδα μάζας «ug» χρησιμοποιήθηκε αντί για «μmol» κατά τον υπολογισμό των τιμών «Papp». Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

Αποτελέσματα

Σύνθεση AC, IS και EC σε PRE από CD

Επειδή το AC, το IS και το EC θεωρούνται τα κύρια βιοενεργάPhGs του είδους Cistanche, αναλύσαμε το περιεχόμενό τους σε PRE μέσω HPLC-UV. Το αντιπροσωπευτικό χρωματογράφημα φαίνεται στο Σχήμα 1. Η αναγνώριση αυτών των συστατικών βασίστηκε στη σύγκριση των χρόνων κατακράτησης και του φάσματος υπεριώδους ακτινοβολίας με αυτά των αυθεντικών προτύπων σε μήκος κύματος 334 nm. Τα περιεχόμενα AC, IS και EC στο PRE ήταν 26,60%, 1,84% και 32,83%, αντίστοιχα. Έτσι, αυτές οι τρεις ενώσεις αντιπροσωπεύουν το 61,27% του PRE. Επιπλέον, τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιεκτικότητα σε PhG στο PRE είναι 78,4%. Επομένως, τα AC, IS και EC αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% των PhGs στο PRE.

Συνολικές αντιοξειδωτικές ικανότητες των PRE, AC, IS και EC

Μελέτες τουαντιοξειδωτική δράση των PhGsαπό CD έχουν αναφερθεί και τα AC, IS και EC αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% των PhGs στο PRE. Έτσι, οι συνολικές αντιοξειδωτικές ικανότητες των PRE, AC, IS και EC προσδιορίστηκαν και εκφράστηκαν χρησιμοποιώντας τις τιμές FRAP (× 10-6 mmol). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, όταν η τιμή FRAP ήταν 8 × 10-6 mmol, οι τελικές συγκεντρώσεις των PRE, AC, IS και EC ήταν 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml και 4,89 ug. /ml, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα αυτών των τεσσάρων δειγμάτων κατατάχθηκε ως εξής: AC > EC > PRE > IS. Η βιοδραστικότητα του PRE αποδίδεται στις ομάδες δραστικών συστατικών του (AIG). Για περίπου το 60% του PRE, το AC και το EC έδειξαν ισχυρότερη συνολική αντιοξειδωτική δράση από το PRE και το IS. Επειδή το IS (1,84%) αποτελεί ένα πολύ μικρό κλάσμα του PRE, άλλα συστατικά, όπως το ασθενώς αντιοξειδωτικό IS, είναι επίσης σαφώς ενεργά στο PRE. Παραδόξως, η συνολική αντιοξειδωτική δράση διέφερε σχεδόν 7- φορές μεταξύ του AC και του ισομερούς του IS, υποδεικνύοντας ότι όχι μόνο ο αριθμός των φαινολικών υδροξυλομάδων αλλά και η θέση των φαινολικών υδροξυλομάδων στο μόριο επηρέασαν την αντιοξειδωτική δράση .

Επικύρωση των μονοστιβάδων Caco-2

Για την επικύρωση του συστήματος μονοστοιβάδας κυττάρου Caco-2, οι τιμές Papp της προπρανολόλης (ένας δείκτης που μεταφέρεται καλά) και του κίτρινου Lucifer (ένας δείκτης κακώς μεταφερόμενος) από το AP στο BL κατά μήκος των μονοστιβάδων Caco-2 προσδιορίζεται ως 1,51 × 10–5 cm/s και 2,8 × 10–7 cm/s, αντίστοιχα, και αυτές οι τιμές συμφωνούν με εκείνες που δημοσιεύτηκαν σε προηγούμενες αναφορές. Ο προσδιορισμός δραστηριότητας αλκαλικής φωσφατάσης επιβεβαίωσε επίσης ότι οι μονοστοιβάδες κυττάρων Caco{11}} ήταν ποιοτικά συγκρίσιμες με το επιθήλιο του λεπτού εντέρου.

Η διαπερατότητα των AC, IS και EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), ενώ αυτά των φαρμάκων με κακή απορρόφηση ήταν χαμηλά (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Η διαπερατότητα του PRE

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του PRE οφείλεται τουλάχιστον στο 61,27% του AIG από το PRE. Έτσι, αξιολογήσαμε το TR του PRE με βάση την καμπύλη συγκέντρωσης-αποτελέσματος της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και υπολογίσαμε τις τιμές «Papp» ώστε να αντικατοπτρίζουν τα χαρακτηριστικά μεταφοράς του PRE. Οι τιμές «Papp» του PRE για το AP!BL και το BL!AP ήταν (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s και (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι αυτή η ένωση ήταν ελάχιστα διαπερατή. Επιπλέον, η εκροή ή η ενεργή μεταφορά δεν ήταν εμφανής επειδή η αναλογία «Papp BL προς AP / «Papp AP προς BL για PRE ήταν 1,45. Επιπλέον, η αμφίδρομη TR του PRE αυξήθηκε γραμμικά μεταξύ περίπου 300 και 900 ug/ml (Εικ. 5). Η έλλειψη κατευθυντικής προτίμησης των αποτελεσμάτων υποδηλώνει ότι η παθητική διάχυση είναι ο κύριος μηχανισμός μεταφοράς του PRE.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Συζήτηση

Σε σύγκριση με τα φαρμακευτικά προϊόντα υψηλής καθαρότητας, το ΡΕ είναι γενικά μείγματα που αποτελούνται από εκατοντάδες συστατικά με ευρέως διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Ως εκ τούτου, το PE ασκεί συστηματική, πολλαπλών στόχων και πολυκαναλική συνεργιστική δράση λόγω του πολύπλοκου AIG τους [21], το οποίο εμποδίζει την ανάλυση των χαρακτηριστικών μεταφοράς του PE. Για να αξιολογήσουν τις ιδιότητες μεταφοράς του PE πιο επιστημονικά, ορισμένοι ερευνητές έχουν εντοπίσει πολλαπλά συστατικά, αντί για ένα μόνο συστατικό, στο PE [22-24]. Ωστόσο, ένας περιορισμένος αριθμός στοιχείων δεν μπορεί να αντικατοπτρίζει το PE στο σύνολό του. Ωστόσο, ο προσδιορισμός όλων των συστατικών στο PE είναι αδύνατος. Επιπλέον, εάν διάφορα εξαρτήματα στο PE εμφανίζουν εντελώς διαφορετικά χαρακτηριστικά μεταφοράς, τα ολιστικά χαρακτηριστικά μεταφοράς του PE θα είναι δύσκολο να εντοπιστούν.

Στη δεκαετία του 1990, χρησιμοποιήθηκαν συστήματα βιοδοκιμών για την αξιολόγηση της TR των αντιμικροβιακών παραγόντων [25]. Μέχρι το 2005, ο Eguchi και οι συνεργάτες του [26] είχαν αξιολογήσει την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος καρότου χρησιμοποιώντας μέσα BL από διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. αυτή η προσέγγιση είναι πιο κατάλληλη για να αντικατοπτρίζει καταστάσεις in vivo.

Με βάση μια προηγούμενη αναφορά για τη δραστηριότητα των PhGs και τα αποτελέσματά μας (Εικ. 2), το TR του AIG στο PRE μπορεί να αξιολογηθεί προσδιορίζοντας τη συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του μέσου στο θάλαμο δέκτη. Μετά τα πειράματα μεταφοράς, διαπιστώσαμε ότι το TR του PRE ήταν παρόμοιο και προς τις δύο κατευθύνσεις, και αυτή η μεταφορά ήταν ακόρεστη και ελάχιστα απορροφημένη ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s) και δεν το έκανε καθόλου. υποδεικνύουν εκροή, υποδηλώνοντας ότι η παθητική διάχυση σε μια βαθμίδα συγκέντρωσης είναι ο κύριος μηχανισμός μεταφοράς του PRE (Εικ. 5). Επιπλέον, τα χαρακτηριστικά μεταφοράς του PRE είναι σύμφωνα με εκείνα των AC, IS και EC, των αποτελεσματικών συστατικών που εμφανίζουν αντιοξειδωτική δράση στο PRE (Εικ. 4 και Πίνακας 4). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν αναμενόμενο και έδειξε ότι το παρόν σύστημα βιοπροσδιορισμού είναι κατάλληλο και αξιόπιστο για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς του AIG σε PRE σε διαφοροποιημένα κύτταρα Caco{10}}.

Σε αντίθεση με την κανονική τιμή Papp, η οποία χρησιμοποιείται συνήθως για να αντικατοπτρίζει τη μεταφορά μιας μεμονωμένης ένωσης, η «τιμή Papp που λαμβάνεται από το TR με βάση την καμπύλη συγκέντρωσης-επίδρασης μπορεί όχι μόνο να αντικατοπτρίζει τα συστατικά που διεισδύουν σε μονοστιβάδες με ανέπαφη δομή, αλλά περιλαμβάνουν επίσης άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τη δραστηριότητα στόχο, όπως οι μεταβολίτες των συστατικών, τα χημικά αποικοδομημένα προϊόντα, ακόμη και ορισμένες κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα Caco-2 ως απόκριση σε διέγερση που μπορεί να επηρεάσει τη βιοδραστικότητα στόχο. Έτσι, ο πολλαπλός παράγοντας που αναφέρεται παραπάνω, και όχι μόνο τα μεταφερόμενα άθικτα στοιχεία, καθορίζει την τιμή «Papp». Επομένως, το «Papp μπορεί να συσχετίζεται πιο ισχυρά με καταστάσεις in vivo από την κανονική τιμή Papp. Σε αυτή τη μελέτη, διευκρινίσαμε την παθητικά διάχυτη και ελάχιστα απορροφούμενη φύση του PRE με βάση την «τιμή Papp» του και αυτή η φύση μπορεί να σχετίζεται με την υψηλή δόση και τη μακρά περίοδο κλινικής θεραπείας του CD. Ωστόσο, αυτά τα ευρήματα θα παρέχουν πιο συστηματική καθοδήγηση για τους κλινικούς γιατρούς στην εφαρμογή του CD όταν έχουν εντοπιστεί μόνο τα χαρακτηριστικά μεταφοράς των περισσότερων AIG σε CD, όχι μόνο PhGs.

Ωστόσο, το επιλεγμένο στοιχείο βιοδραστικότητας πρέπει να είναι επαρκώς ευαίσθητο ώστε να ανιχνεύεται στο μέσο του θαλάμου δέκτη, γεγονός που αποτελεί πρόκληση για τη δημιουργία ενός συστήματος βιοδοκιμών για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς του PE. Επιπλέον, η βιοδραστικότητα θα πρέπει επίσης να εξαρτάται από όσο το δυνατόν περισσότερα συστατικά. Στη μελέτη μας, ο προσδιορισμός ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας ήταν καταλληλότερος από αρκετές άλλες μεθόδους (Σχήμα S1). Αλλά ακόμα κι έτσι, η δοκιμασία μας μπορεί να ανιχνεύσει το TR του PRE μόνο στα 120 λεπτά.

Συλλογικά, η παρούσα μελέτη καθιέρωσε ένα νέο σύστημα βιοπροσδιορισμού για την αξιολόγηση της εντερικής διαπερατότητας του PRE σε διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. Τα ληφθέντα αποτελέσματα έδειξαν ότι μια κακώς απορροφούμενη παθητική διάχυση σε μια βαθμίδα συγκέντρωσης χωρίς εκροή είναι ο κύριος μηχανισμός μεταφοράς του PRE (Εικ. 5), ο οποίος παρέχει τη φαρμακοκινητική βάση για την κλινική εφαρμογή των PhGs σε CD. Είναι εφικτή η χρήση ενός νέου συστήματος βιοδοκιμών για την αξιολόγηση του TR και επομένως τον υπολογισμό των «τιμών Ppp για την αξιολόγηση της ιδιότητας εντερικής μεταφοράς του AIG σε PEs. Αυτή η προσέγγιση μπορεί επίσης να είναι κατάλληλη για άλλα PE δεδομένης της κατάλληλης βιοδραστικότητας.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%