Παρεμβολή των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από το Cistanche Tubulosa με την ανάλυση MTT

1. Εισαγωγή

Το παρασιτικό φυτόCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaeοικογένεια) διανέμεται ευρέως σε χώρες της Βόρειας Αφρικής, Αραβικές και Ασιατικές [1]. Το πηγάζει απόC. tubulosaκαιC. deserticolaείναι σημαντικά στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική, αφού έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της ανικανότητας, της στειρότητας, της οσφυϊκής μοίρας και της δυσκοιλιότητας λόγω αδράνειας του παχέος εντέρου [2]. Επιπλέον, το αιθανολικό εκχύλισμα τουC. tubulosaέχει αποδειχθεί ότι έχει σημαντική προστατευτική δράση έναντι της εγκεφαλικής υποξίας σε ποντίκια [3].

Τα ενδοθηλιακά κύτταρα παίζουν καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση της υποξικής πνευμονικής υπέρτασης. Η ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά EA.hy926 είναι σημαντικά παρόμοια με τα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της μελέτης μας για την αντιυποξική επίδραση του αιθανολικού εκχυλίσματος C. tubulosa στα ενδοθηλιακά κύτταρα EA.hy926, παρατηρήσαμε ότι το 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ){{7 }},5-δοκιμασία βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT), η οποία χρησιμοποιείται συνήθως για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε μελέτες κυτταροτοξικότητας και κυτταροστατικής δραστηριότητας, δημιούργησε αντικρουόμενα αποτελέσματα δείχνοντας αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων EA.hy926 μετά τη θεραπεία.

Η ακριβής αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό πιθανών κυτταροτοξικών ή κυτταροπροστατευτικών επιδράσεων ενός φαρμακευτικού παράγοντα. Επομένως, διερευνήσαμε ποια συστατικά υπάρχουν στο αιθανολικό εκχύλισμα C. tubulosa μπορεί να είναι υπεύθυνα για τα αντικρουόμενα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με τον προσδιορισμό MTT. Απομονώσαμε δύο κύριεςφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs)από αιθανολικό εκχύλισμα C. tubulosa,εχινακοσίδη (εφεξής ένωση 1) και ακτεοσίδη (εφεξής ένωση 2). Προσδιορίσαμε την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα των κυττάρων EA.hy926 χρησιμοποιώντας μια ποικιλία μεθόδων. Επιπλέον, για να διευκρινίσουμε περαιτέρω ποιος υποκαταστάτης των ενώσεων 1 και 2 μπορεί να είναι υπεύθυνος για τα αντιφατικά αποτελέσματα, δοκιμάσαμε τις αγλυκόνες τους, το καφεϊκό οξύ (εφεξής ένωση 3) και την 3,4-διυδροξυφαινυλαιθανόλη (εφεξής ένωση 4), σε ΕΑ .hy926 βιωσιμότητα κυττάρων χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR INBITITING APOPTOSIS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Ταυτοποίηση Ενώσεων

Οι δομές των δύο ενώσεων που απομονώθηκαν απόΑιθανολικό εκχύλισμα C. tubulosaταυτοποιήθηκαν με αναλύσεις πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και φασματομετρίας μάζας (MS), όπως φαίνεται στο σχήμα 1. Η ένωση 1 αναγνωρίστηκε ως εχινακοσίδη σε σύγκριση με προηγουμένως αναφερθέντα NMR (Πίνακας 1) και MS (m/z 785 [M−H ]− ) δεδομένα [4]. Τα φάσματα NMR της ένωσης 2 ήταν πολύ παρόμοια με εκείνα της ένωσης 1, εκτός από την απουσία μιας -D-γλυκοπυρανοσυλικής ομάδας (Πίνακας 1). Η ένωση 2 (m/z 623 [M−H]− ) ταυτοποιήθηκε ωςακτεοσίδη[5]. Είναι σημαντικό ότι και οι δύο ενώσεις έχουν την ίδια αγλυκόνη, η οποία περιλαμβάνει καφεϊκό οξύ (ένωση 3) και 3,4-διυδροξυφαινυλαιθανόλη (ένωση 4).

2.2. Δοκιμασίες βιωσιμότητας κυττάρων

Οι αναλύσεις MTT και CCK{{0}} χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της επίδρασης των ενώσεων 1-4 στη βιωσιμότητα των κυττάρων EA.hy926. Η ανάλυση MTT έδειξε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων EA.hy926 αυξήθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία με 25 και 50 μΜ ενώσεις 1, 2 ή 3 (166,3% και 174,1% για την ένωση 1, 205,8% και 224,3% για την ένωση 2, και 164,8% και 189,6% για την ένωση 3, αντίστοιχα, ρ < 0,05) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, η μορφολογική επιθεώρηση των κυττάρων προσδιόρισε ότι η επεξεργασία με 50 μΜ ένωση 1, 2 ή 3 αύξησε τον σχηματισμό μωβ κρυστάλλων φορμαζάνης, οι οποίοι αποτελούν άμεση ένδειξη της αναλογίας των ζωντανών κυττάρων (Εικόνα 3). Αντίθετα, η ανάλυση CCK-8 πρότεινε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία με 12,5, 25 και 50 μΜ ένωση 1, 2 ή 3 (75,5%, 45,1% και 43,7% για την ένωση 1, 85,5% 51,8% και 34,3% για την ένωση 2, και 64,5%, 48,2% και 36,4% για την ένωση 3, αντίστοιχα, ρ < 0,05), σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2Β). Η ένωση 4 δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων ούτε στον προσδιορισμό ΜΤΤ ούτε στη δοκιμασία CCK-8. Η ασυμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με τις δύο δοκιμασίες υποδηλώνει ότι μία από τις δύο αναλύσεις μπορεί να μην αντικατοπτρίζει με ακρίβεια τα αποτελέσματα των ενώσεων 1 και 2 στη βιωσιμότητα των κυττάρων EA.hy926.

2.3. Εκτίμηση Απόπτωσης από τον Hoechst

Το Staining Hoechst 33342 είναι μια διαπερατή από κύτταρα χρώση DNA που διεγείρεται από το υπεριώδες φως και εκπέμπει μπλε φθορισμό στα 460 έως 490 nm. Η συμπυκνωμένη χρωματίνη των αποπτωτικών κυττάρων χρωματίζεται πιο έντονα από τη χρωματίνη των φυσιολογικών κυττάρων [6]. Ενώ τα κύτταρα ελέγχου εμφάνισαν ομοιόμορφα διασπαρμένη χρωματίνη, φυσιολογικά οργανίδια και άθικτες κυτταρικές μεμβράνες, τα κύτταρα που επωάστηκαν με 50 μΜ ενώσεις 1, 2 ή 3 για 48 ώρες έδειξαν την τυπική χρώση των αποπτωτικών κυττάρων (Εικόνα 4Α). Αντίθετα, η έκθεση των κυττάρων σε 50 μΜ της ένωσης 4 δεν αύξησε τον αριθμό των αποπτωτικών πυρήνων σε σύγκριση με τη θεραπεία ελέγχου.

2.4. Κυτταρομετρική Ανάλυση Ροής Αποπτωτικών Κυττάρων

Ο προσδιορισμός διπλής χρώσης αννεξίνης V-FITC/PI αναγνωρίζει τα αποπτωτικά κύτταρα με τη σύνδεση υψηλής συγγένειας της αννεξίνης V-FITC με τη φωσφατιδυλοσερίνη, η οποία εξωτερικεύεται σε κύτταρα που υφίστανται απόπτωση [7]. Σε αυτόν τον προσδιορισμό, τα βιώσιμα κύτταρα δεν συνδέονται ούτε με την αννεξίνη V ούτε με το PI και επομένως δεν χρωματίζονται (κάτω αριστερό τεταρτημόριο), τα πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα χρωματίζονται πράσινα από τη δέσμευση της αννεξίνης V-FITC (κάτω δεξί τεταρτημόριο) και τα όψιμα αποπτωτικά κύτταρα χρωματίζονται με πράσινο και κόκκινο χρώμα με τη δέσμευση της αννεξίνης V-FITC σε φωσφατιδυλοσερίνη και PI σε νεκρωτικά κύτταρα, αντίστοιχα (άνω δεξιό τεταρτημόριο). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, τα κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΜ ενώσεις 1, 2 ή 3 για 48 ώρες, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε από 3,74% (κύτταρα ελέγχου) σε 10,32%, 12,95% και 11,30%, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, η ένωση 4 δεν αύξησε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων EA.hy926.

Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τη δοκιμασία CCK-8 και με τη χρώση Hoechst 33342, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι οι ενώσεις 1, 2 και 3 προκάλεσαν απόπτωση σε κύτταρα EA.hy926. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων EA.hy926 που παρατηρήθηκε με τον προσδιορισμό ΜΤΤ μετά από θεραπεία με τις ενώσεις 1-3 αντιπροσώπευε ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Συζήτηση

Το 1983, ο Mosmann ανέπτυξε μια χρωματομετρική ανάλυση μικροπλάκας MTT για τη μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας [8]. Αυτή η απλή δοκιμασία, και οι τροποποιήσεις της, χρησιμοποιούνται πλέον ευρέως σε εργαστήρια κυτταρικής βιολογίας σε όλο τον κόσμο. Μελέτες κλασματοποίησης σε κύτταρα θηλαστικών έδειξαν ότι ο μειωμένος συμπαράγοντας νουκλεοτιδίου πυριδίνης, NADH, είναι υπεύθυνος για την περισσότερη μείωση του ΜΤΤ. Αυτό υποστηρίχθηκε από μελέτες που χρησιμοποιούν ολόκληρα κύτταρα [9]. Επομένως, η μείωση του ΜΤΤ σχετίζεται με μεταβολικά ενεργά κύτταρα και δεν συνδέεται μόνο με τη μιτοχονδριακή αναπνοή αλλά και με το κυτταρόπλασμα και τις μη μιτοχονδριακές μεμβράνες, συμπεριλαμβανομένου του διαμερίσματος ενδοσωμάτων/λυσοσώματος και της πλασματικής μεμβράνης [10]. Το καθαρό θετικό φορτίο στο μόριο ΜΤΤ είναι ο πρωταρχικός παράγοντας για την κυτταρική του πρόσληψη μέσω του δυναμικού της πλασματικής μεμβράνης.

Συγκεκριμένα, η ανάλυση ΜΤΤ μπορεί περιστασιακά να μην αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την πραγματική επίδραση που έχει μια ελεγχόμενη ένωση σε συγκεκριμένα κύτταρα. Ωστόσο, οι χημικές δομές ή ομάδες που μπορεί να προκαλέσουν αντικρουόμενα αποτελέσματα στον προσδιορισμό MTT δεν έχουν εντοπιστεί. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάλυση MTT θα μπορούσε να υποτιμήσει την αντιπολλαπλασιαστική δράση της (−)-επιγαλλοκατεχίνης-3-γαλλικής, της πιο άφθονης πολυφαινόλης στο πράσινο τσάι [11]. Σε μελέτες που χρησιμοποιούν τη δοκιμασία MTT για την ανίχνευση χημειοευαισθησίας όγκου, αντικαρκινικοί χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, όπως η επιρουβικίνη, η πακλιταξέλη, η ντοσεταξέλη και η μεσυλική ιματινίμπη (Gleevec), έδειξαν αυξημένη κυτταρική βιωσιμότητα [12,13]. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι ορισμένα φυτικά εκχυλίσματα και οξειδοαναγωγικά δραστικές πολυφαινόλες θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον προσδιορισμό ΜΤΤ καθώς μειώνουν άμεσα το άλας τετραζολίου ΜΤΤ απουσία κυττάρων [14].

Η ανάγκη διαλυτοποίησης των κρυστάλλων φορμαζάνης ΜΤΤ πριν από τη φασματοφωτομετρική ανάλυση σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών και η εγγενής φύση του τελικού σημείου της αντίδρασης περιορίζουν τη χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ σε ορισμένες εφαρμογές. Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη αναλόγων τετραζολίου στα οποία τα τμήματα φαινυλίου ήταν διακοσμημένα με αρνητικά φορτισμένες σουλφονικές ομάδες, όπως 2,3-δις-(2-μεθοξυ-4-νιτρο- 5- σουλφοφαινυλ)-2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξανιλίδιο (XTT), ένα αρνητικά φορτισμένο εσωτερικό άλας [15] και 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5-(3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ)-2-(4-σουλφοφαινυλ)-2Η-τετραζόλιο (MTS), ένα ασθενώς όξινο εσωτερικό άλας που σχετίζεται στενά με το MTT [16] . Αυτές οι τροποποιήσεις είχαν ως αποτέλεσμα την παραγωγή προϊόντων φορμαζάνης διαλυτών στο μέσο καλλιέργειας που εξάλειψαν την απαίτηση ενός σταδίου διαλυτοποίησης πριν από την ποσοτικοποίηση. Αντίστοιχα, καθώς το αυξημένο αρνητικό φορτίο σε αυτά τα μόρια μείωσε την ικανότητά τους να κινούνται στις κυτταρικές μεμβράνες [17], οι ενδιάμεσοι δέκτες ηλεκτρονίων (IEA), όπως η 1-μεθοξυ-5-μεθυλοθειική μεθυλφαιναζίνη ({{25 }}μεθοξυ PMS) απαιτήθηκαν για τη διευκόλυνση της μείωσης της χρωστικής τετραζόλης ή για την ενίσχυση του ρυθμού μείωσης.

Πιο πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια νέα γενιά υδατοδιαλυτών αλάτων τετραζολίου, των οποίων το WST-1 είναι το πρωτότυπο [18]. Το WST-1, ένα αρνητικά φορτισμένο δισουλφονωμένο εσωτερικό άλας που περιέχει ένα υπόλειμμα ιωδίου, είναι πιο σταθερό από το XTT και το MTS παρουσία 1-μεθοξυ PMS, είναι υποχρεωτικό IEA. Αυτό οδήγησε στην εμπορία του WST-1/{1-μεθοξυ PMS ως ένα βολικό κιτ πολλαπλασιασμού κυττάρων μεμονωμένων αντιδραστηρίων. Αρκετά άλλα άλατα τετραζολίου στη σειρά WST έχουν αναπτυχθεί, το πιο χρήσιμο από τα οποία ίσως είναι το WST-8 [19]. Το WST-8 φαίνεται να έχει πολύ παρόμοιες ιδιότητες κυτταρικής αναγωγής με το WST-1 και διατίθεται στην αγορά ανεξάρτητα ως ανάλυση CCK-8. Το WST{12}} είναι αδιαπέραστο από τα κύτταρα και επομένως μειώνεται εξωκυτταρικά, μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων από το ενδοκυτταρικό NADH στο WST-8 μέσω της πλασματικής μεμβράνης με τη μεσολάβηση 1-μεθοξυ PMS. Αν και η μείωση του MTT και του WST-8/1-μεθοξυ PMS καθοδηγείται από το ενδοκυτταρικό NADH, η πηγή του NADH φαίνεται να διαφέρει σε αυτές τις δύο μεθόδους. Η μείωση του WST-8/1-μεθοξυ PMS εξαρτάται περισσότερο από τη σαΐτα μηλικού/ασπαρτικού που συνδέει τον κύκλο του μιτοχονδριακού τρικαρβοξυλικού οξέος-NADH με τον εξωμιτοχονδριακό χώρο [20].

Σε προκαταρκτικά πειράματα, επιβεβαιώσαμε ότι οι ενώσεις 1, 2, 3 και 4 δεν μπορούσαν να μειώσουν άμεσα το άλας τετραζολίου ΜΤΤ (δεν φαίνεται). Στην παρούσα μελέτη, η άμεση επίδραση των ίδιων των ενώσεων στο αντιδραστήριο εξαλείφθηκε με προσεκτικό πλύσιμο των μικροπλακών με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) προτού προστεθεί διάλυμα MTT ή CCK-8, όπως υποδεικνύεται στα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που προέκυψαν χρησιμοποιώντας τις δύο μεθόδους ήταν ακόμα αντιφατικά (Εικόνα 2). Όπως αναμενόταν, η επώαση των κυττάρων με τις ενώσεις 1, 2 και 3 αύξησε τη μείωση του άλατος τετραζολίου σε μωβ φορμαζάνη, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 3), υποδηλώνοντας ότι η απλή μείωση του άλατος τετραζολίου παρουσία μιας συγκεκριμένης ένωσης δεν αρκεί για να κριθεί η ικανότητα της ένωσης να παρεμβαίνει στον προσδιορισμό ΜΤΤ.

Για να προσδιοριστεί εάν οι ενώσεις 1, 2, 3 και 4 θα μπορούσαν να προκαλέσουν απόπτωση σε κύτταρα EA.hy926, αξιολογήθηκαν κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές και εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης. Σε συνέπεια με τη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας που παρατηρήθηκε με τον προσδιορισμό CCK-8, τα αποτελέσματα της χρώσης Hoechst και της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC/PI πρότειναν ότι η αναστολή ανάπτυξης που παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία με την ένωση 1, 2 και 3 ήταν οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, στην απόπτωση των κυττάρων EA.hy926. Τα αποτελέσματά μας υποστήριξαν επίσης την ιδέα ότι η ομάδα καφευλίου που υπάρχει και στις δύο ενώσεις 1 και 2 ήταν υπεύθυνη για τα αντιφατικά αποτελέσματα που ελήφθησαν με τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Παρόμοια με τα ευρήματά μας, το Rottlerin, ένα ισχυρό άνοιγμα διαύλων καλίου μεγάλης αγωγιμότητας, δεν έδειξε αντιδραστικότητα προς το MTT in vitro. Ωστόσο, ενίσχυσε έντονα τον σχηματισμό κρυστάλλων φορμαζάνης μέσα στα κύτταρα, ένα αποτέλεσμα που βρισκόταν σε εμφανή σύγκρουση με την αναστολή Rottlerin του NF-κB και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό που παρατηρήθηκε με ανάλυση της ενσωμάτωσης [3H]-θυμιδίνης στο DNA [21]. Ο μηχανισμός με τον οποίο το Rottlerin ενίσχυσε τη μείωση του MTT αποδόθηκε στο μιτοχονδριακό αποτέλεσμα αποσύνδεσης [22]. Το Rottlerin έχει μια ομάδα υποκαταστάτη κινναμοϋλικού οξέος. Σε σύγκριση με το κινναμοϋλικό οξύ, η ένωση 3 διαθέτει δύο επιπλέον υδροξυλικά υπολείμματα, τα οποία βρίσκονται στα C-3 και C-4. Ως εκ τούτου, εικάζουμε ότι ο μηχανισμός με τον οποίο οι ενώσεις 1 και 2 προκαλούν αντικρουόμενα αποτελέσματα στον προσδιορισμό ΜΤΤ μπορεί επίσης να σχετίζεται με τα μιτοχονδριακά αποτελέσματα αποσύνδεσής τους. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, απαιτούνται συγκριτικές μελέτες μεταξύ των ενώσεων 1 και 2 και ενός χημικού αποσυνδέτη, όπως η τριφθοροκαρβονυλοκυανιδική φαινυλυδραζόνη (FCCP).

 NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Πειραματικό Τμήμα

3.1. Αντιδραστήρια και Χημικά

Η ένωση 3 (καφεϊκό οξύ-σκόνη, καθαρότητα=98,6%) αγοράστηκε από την Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα). Η ένωση 4 (3,4-διυδροξυφαινυλαιθανόλη-έλαιο, καθαρότητα=98.5%) ελήφθη από την Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα). ΜΤΤ και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Η ανάλυση CCK{11}} αγοράστηκε από την Dojin Laboratories (Κουμαμότο, Ιαπωνία). Τα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Hoechst 33342 και αννεξίνης V-FITC/PI αγοράστηκαν από το Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Κίνα).

3.2. Φυτική ύλη

C. tubulosaμίσχοι συλλέχθηκαν από την επαρχία Yutian, την αυτόνομη περιοχή Xinjiang Uygur, Κίνα. Δείγματα κουπονιών κατατέθηκαν στο Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Κίνα) και επικυρώθηκαν από τον Yi Zhang από το Πανεπιστήμιο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής του Chengdu (Chengdu, Κίνα).

3.3. Εξαγωγή και Απομόνωση Φυτικού Υλικού

Στελέχη C. tubulosa που ξηράνθηκαν στον αέρα (0.6 kg) κονιοποιήθηκαν και εκχυλίστηκαν με 50% αιθανόλη για 2 ώρες στους 70 βαθμούς. Μετά την απομάκρυνση του διαλύτη υπό μειωμένη πίεση, το αιθανολικό εκχύλισμα (212,5 g) διαλύθηκε και εναιωρήθηκε σε νερό (2 L) και εκχυλίστηκε με η-βουτανόλη (2 L χ 3). Το εκχύλισμα η-βουτανόλης (110 g) χρωματογραφήθηκε σε στήλη πολυαμιδίου και εκλούστηκε με αιθανόλη/νερό (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) παράγοντας πέντε κλάσματα (Α-Ε) . Το κλάσμα Β (65 g) κλασματώθηκε σε στήλη ODS. έκλουση με αιθανόλη: νερό (1:9) διαχωρισμένη ένωση 1 (3 g). Το κλάσμα D (10,5 g) κλασματώθηκε σε στήλη ODS. έκλουση με αιθανόλη/νερό (1:4) διαχωρισμένη ένωση 2 (1 g).

Τα φάσματα NMR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker Avance 600 σε CD3OD με Τετραμεθυλσιλάνιο (TMS) ως εσωτερικό πρότυπο. Τα φάσματα μάζας πραγματοποιήθηκαν σε φασματόμετρο μάζας BioTOF-Q.

3.4. Κυτταρικής καλλιέργειας

Οι κυτταρικές γραμμές EA.hy926 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% (ο/ο) εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% (ν/ν) πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη σε ένα υγροποιημένο περιβάλλον με 5% CO2 στους 37 βαθμούς.

3.5. Βιωσιμότητα κυττάρων

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τις αναλύσεις MTT και CCK{{0}}. Οι ενώσεις 1 και 2, και οι αγλυκόνες τους, καφεϊκό οξύ (3) και 3,4-διυδροξυφαινυλαιθανόλη (4) διαλύθηκαν σε DMSO έως την τελική συγκέντρωση DMSO < 0,1% (ο/ο) σε μέσα καλλιέργειας.

Κύτταρα EA.hy926 σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων σε 4 χ 103 κύτταρα/φρεάτιο. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 6,25-50 μΜ ένωση 1, 2, 3 ή 4 για 24 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Δείγματα (10 μL) μητρικού διαλύματος ΜΤΤ (5 mg·mL−1) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιείχε 100 μL μέσου και επωάστηκαν με κύτταρα για 4 ώρες. Μετά την επώαση, το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκαν κλάσματα 150 μL DMSO σε κάθε φρεάτιο για να διαλυτοποιηθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό της μείωσης του ΜΤΤ, αποδίδοντας την τιμή 100% στην απορρόφηση των κυττάρων ελέγχου. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές και παρουσιάστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD).

Η ανάλυση CCK-8 πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη βιβλιογραφία με μικρές τροποποιήσεις [23]. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις 6,25–50 μΜ 1, 2, 3 ή 4 για 24 ώρες και πλύθηκαν δύο φορές με PBS πριν από την προσθήκη 10 μL διαλύματος CCK-8 και 100 μL μέσου καλλιέργειας. Μετά από επώαση της μικροπλάκας στους 37 βαθμούς για 2 ώρες, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η κυτταρική βιωσιμότητα εκφράστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (100%). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές και εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD.

3.6. Απόπτωση Αξιολόγηση από Hoechst 33342 Χρώση

Αποπτωτικές μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν με χρώση Hoechst 33342. Εν συντομία, τα κύτταρα EA.hy926 σπάρθηκαν σε 48-πλάκες φρεατίων (2 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ ένωση 1, 2, 3 ή 4 για 48 ώρες στους 37 βαθμούς, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και σταθεροποιήθηκε με 4% (ν/ν) παραφορμαλδεΰδης για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από ξέπλυμα δύο φορές με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (10 ug·mL−1) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Πυρήνες χρωματισμένοι με Hoechst οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία).

3.7. Ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με αννεξίνη V-FITC/PI διπλής χρώσης και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Εν συντομία, μετά από επεξεργασία με 50 μΜ ένωση 1, 2, 3 ή 4 για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS σε 1 × 105 κύτταρα·mL−1. Μετά από φυγοκέντρηση στα 500 × g για 5 λεπτά στους 25 βαθμούς, προστέθηκαν 195 μL ρυθμιστικού δεσμευτικού διαλύματος αννεξίνης V-FITC και 5 μL αννεξίνης V-FITC. Μετά από ήπια ανάμιξη με στροβιλισμό, το μίγμα επωάστηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά από φυγοκέντρηση στα 500 × g για 5 λεπτά στους 25 βαθμούς, προστέθηκαν 190 μL συζευγμένου με FITC ρυθμιστικού δεσμευτικού διαλύματος αννεξίνης V και 10 μL PI. Μετά από ήπια ανάμιξη με στροβιλισμό, τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) εντός 30 λεπτών.

3.8. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειραματικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD. Η σημασία των διαφορών μεταξύ των πειραματικών δειγμάτων και του αντίστοιχου ελέγχου αξιολογήθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS (έκδοση 11.5). Η στατιστική σημασία ορίστηκε στο p < 0.05.

4. Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι μια υπερεκτίμηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων που παρατηρήθηκε στον προσδιορισμό ΜΤΤ θα μπορούσε να καλύψει την κυτταροτοξικότητα ορισμένων ενώσεων. Επομένως, κατά τη διάρκεια των διαδικασιών διαλογής φαρμάκων, συνιστούμε τη χρήση ποικίλων μεθόδων για τον προσδιορισμό της επίδρασης της συγκεκριμένης ένωσης στη βιωσιμότητα των κυττάρων (όπως οι αναλύσεις CCK-8 και 3 H-TdR) για να αποφευχθεί η δημιουργία παραπλανητικών αποτελεσμάτων.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΠΡΟΩΘΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗΣ ΤΕΣΤΟΣΤΕΡΟΝΗΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%