Η εχινακοσίδη Ασκεί αντικαρκινική δράση στον καρκίνο του ήπατος
Mar 31, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wen Li*, Jing Zhou, Yajie Zhang, Jing Zhang, Xue Li, Qiao Yan, Jiabing Han και Fangdi Hu*
Αφηρημένη
Ιστορικό:Η εχινακοσίδη (ECH) είναι το κύριο δραστικό συστατικό του Cistanches Herba, το οποίο είναι γνωστό ότι έχει θεραπευτικά αποτελέσματα σε μεταστατικούς όγκους. Ωστόσο, οι επιπτώσεις της ECH στον καρκίνο του ήπατος είναι ακόμη ασαφείς. Αυτή η μελέτη ήταν να διερευνήσει τις επιδράσεις της ECH στην επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων του ήπατος.
Μέθοδοι:Δύο τύποι ηπατικών καρκινικών κυττάρων Huh7 και HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις ECH σε διαφορετικούς χρόνους και βαθμίδες. ΜΤΤ και προσδιορισμοί σχηματισμού αποικιών χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των επιδράσεων της ECH στη βιωσιμότητα των κυττάρων Huh7 και HepG2. Οι δοκιμασίες transwell και οι μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιδράσεων της θεραπείας με ECH στην εισβολή, τη μετανάστευση, την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων Huh7 και HepG2. Η ανάλυση Western blot χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιδράσεων της ECH στα επίπεδα έκφρασης των TGF- 1, smad3, smad7, πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση (κασπάση-3, κασπάση-8) και Cyto C στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Η σχέση μεταξύ του miR-503-3p και του TGF- 1 εντοπίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση βιοπληροφορικής και ανάλυση αναφοράς Luciferase.
Αποτελέσματα:Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ECH ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων Huh7 και HepG2 με τρόπο που εξαρτάται από τη δόση και τον χρόνο. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ECH προκάλεσε απόπτωση των κυττάρων Huh7 και HepG2 αποκλείοντας κύτταρα στη φάση S. Επιπλέον, η έκφραση του miR-503-3p βρέθηκε να είναι μειωμένη στους ιστούς όγκων του ήπατος, αλλά η θεραπεία με ECH αύξησε την έκφραση του miR-503-3p στα κύτταρα Huh7 και HepG2. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ο TGF- 1 αναγνωρίστηκε ως πιθανός στόχος miR-503-3p. Το ECH προώθησε την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης TGF- 1/Smad και αύξησε τα επίπεδα έκφρασης του Bax/Bcl-2. Επιπλέον, το ECH θα μπορούσε να πυροδοτήσει την απελευθέρωση του μιτοχονδριακού Cyto C και να προκαλέσει την αντίδραση βαθμού κασπασών.
Συμπεράσματα:Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η ECH ασκεί αντικαρκινική δράση μέσω του άξονα miR-503-3p/TGF- 1/Smad στον καρκίνο του ήπατος και παρέχει έναν ασφαλή και αποτελεσματικό παράγοντα κατά του όγκου για τον καρκίνο του ήπατος.
Λέξεις-κλειδιά: Εχινακοσίδη, Καρκίνος ήπατος, Απόπτωση, MiR-503-3p, TGF- 1/smad
Το Cistanche είναι ένας ασφαλής και αποτελεσματικός αντικαρκινικός παράγοντας για τον καρκίνο του ήπατος.
Εισαγωγή
Ο καρκίνος του ήπατος είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους κακοήθεις όγκους με υψηλό ποσοστό επίπτωσης και η συχνότητα του καρκίνου του ήπατος αυξάνεται ραγδαία [1]. Η ηπατεκτομή είναι ο καλύτερος τρόπος για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος για ασθενείς στα αρχικά του στάδια [2]. Ωστόσο, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν υποτροπή και μετάσταση μετά την επέμβαση. Το ποσοστό επιβίωσης 5-του έτους είναι μόνο περίπου 3–5 τοις εκατό [2]. Επομένως, χρειάζονται επειγόντως νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και παράγοντες.
Τα τελευταία χρόνια, η ανάπτυξη φαρμάκων για τον καρκίνο και η έρευνα για φυτοχημικά έχουν αρχίσει να δίνουν προσοχή στην εθνοφαρμακολογία [3, 4]. Ένας μεγάλος αριθμός κλινικών και πειραματικών μελετών έχει δείξει ότι τα φαρμακευτικά μονομερή μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετάσταση των κυττάρων του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, να προκαλέσουν απόπτωση και διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων [5]. Το Cistanches Herba είναι ένα φυτό που ανήκει στην οικογένεια των φυτών, το οποίο είναι παραδοσιακή ιατρική στην Κίνα και είναι γνωστό ως «τζίνσενγκ της ερήμου» [6]. Το Cistanches Herba είναι πλούσιο σε τύπους χημικών συστατικών και οι ερευνητές στο εσωτερικό και στο εξωτερικό έχουν απομονώσει περισσότερες από εκατό ενώσεις από αυτό, συμπεριλαμβανομένων των γλυκοσιδίων φαινυλαιθανόλης, λιγνάνων, κυκλοαλειφατικών τερπενίων, σακχάρων, αμινοξέων κ.λπ. [7]. Η εχινακοσίδη (ECH) είναι το κύριο συστατικό του Cistanches Herba και θεωρείται επίσης γενικά το κύριο δραστικό συστατικό του [6]. Τα τελευταία χρόνια, μελέτες έχουν δείξει ότι η ECH μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική επιλογή για επιθετικούς ή ευρέως μεταστατικούς όγκους [8]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ECH μπορεί να αναστείλει τον καρκίνο του παγκρέατος, τη λευχαιμία, τον καρκίνο του στομάχου, τον καρκίνο του ενδομητρίου και πολλούς άλλους όγκους [9]. Ωστόσο, δεν υπάρχει αναφορά για την επίδραση της ECH στην εξέλιξη του καρκίνου του ήπατος.
Τα MiRNA παίζουν καθοριστικό ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (10). Εκτεταμένες μελέτες έχουν δείξει ότι τα miRNA σχετίζονται στενά με τον καρκίνο του ήπατος [11] και τη σκλήρυνση κατά πλάκας. Το MiR-503-3p είναι ένα νέο miRNA που ανακαλύφθηκε και εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [12]. Ωστόσο, η λειτουργία του στον καρκίνο του ήπατος είναι ασαφής. Προς το παρόν, η έρευνα των γονιδίων-στόχων miRNA προς τα κάτω βρίσκεται σε σχετικά ώριμο στάδιο, αλλά πολλοί τόποι γονιδίων στόχου παραμένουν άγνωστοι. Η οδός μεταγωγής σήματος Te TGF- 1/Smad3 είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ογκογένεση και την ανάπτυξη [13]. Διαπιστώθηκε ότι η οδός TGF- 1/Smad3 ενεργοποιήθηκε στο μοντέλο ηπατώματος, υποδηλώνοντας ότι η οδός TGF{- 1/Smad3 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου του ήπατος [14]. Η υψηλή έκφραση της οδού TGF- 1/Smad3 θεωρείται ένας από τους βασικούς λόγους για την εμφάνιση καρκίνου του ήπατος [15]. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο υποκείμενος μηχανισμός που μεσολάβησε στις επιδράσεις της ECH στον καρκίνο του ήπατος, διερευνήθηκε η οδός miRNA/TGF- 1/Smad3.
Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της ECH στην εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων του ήπατος και βρήκαμε ότι η ECH άσκησε αντικαρκινική δράση μέσω του άξονα miR-503-3p/TGF- 1/Smad στον καρκίνο του ήπατος, και παρέχει έναν ασφαλή και αποτελεσματικό παράγοντα κατά του όγκου για τον καρκίνο του ήπατος.
cistanche tcmείναι αντικαρκινικό.
Μέθοδοι και υλικά
Υλικά
Echinacoside (ECH) (purity>98 τοις εκατό, μονοένυδρο) ελήφθη από την Hetian Dichen sashing Pharmaceutical Development Co., Ltd (Xinjiang, Κίνα). Ο δομικός τύπος φαίνεται στο Σχ. 1.
Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση
Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου ήπατος Huh7 και HepG2 αγοράστηκαν από την FENGHUISHENGWU (Hunan, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco, USA) στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα κυττάρων 5 τοις εκατό CO2. Το MiR-503-3p mimic και το miR-NC ελήφθησαν από την Shanghai Gene Pharmaceutical Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επιπλέον 24-48 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για περαιτέρω μελέτες.
Δοκιμασία αναφοράς Luciferase
Τα συνολικά RNA εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα και ο TGF- ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές WT και MUT. Ένα θραύσμα TGF- 1 εισήχθη στον φορέα αναφοράς pGL3-Bashc λουσιφεράσης με το όνομα TGF- -WT-Luc. Η περιοχή δέσμευσης του 1 και του miR-503-3p μεταλλάχθηκε για να σχηματίσει ένα μεταλλαγμένο πλασμίδιο που ορίζεται ως TGF- 1-Mut-Luc. Το TGF 1-WT-Luc και το TGF- 1-Mut-Luc συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα με miR-503-3p mimic και pRLTK. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 6 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Το κιτ δοκιμασίας αναφοράς διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της λουσιφεράσης.
Δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης
Τα κύτταρα Huh7 και HepG2 (2×105) τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 96-φρεατίων. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ECH για 24, 36 και 48 ώρες. Μετά από αυτό, 10 mL διαλύματος ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες. Μετά από αυτό, 150 μL DMSO προστέθηκαν στα φρεάτια. Και η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με έναν αναγνώστη ELISA (Aoweiya, Πεκίνο, Κίνα).
Σχηματισμός αποικίας
Εναιώρημα μονοκυττάρου παρασκευάστηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα και καλλιεργήθηκε σε επωαστήρα για 7 ημέρες. Μετά την απόρριψη του μέσου, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με χρώση Wright για 5 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με διάλυμα χρωστικής Giemsa και ρυθμιστικό διάλυμα φωσφομολυβδαινικού Sorensen (1:9) για 10 λεπτά. Μετά το πλύσιμο, οι αποικίες μετρήθηκαν σε μικροσκόπιο.
Προσδιορισμός Transwell
Οι δοκιμές μετανάστευσης και εισβολής πραγματοποιήθηκαν σε θαλάμους Transwell (Costar, Badhoevedorp, Te Netherlands) επικαλυμμένοι με ή χωρίς Maribel (BD Biosciences) στην άνω επιφάνεια της μεμβράνης {{0}}μm (μέγεθος πόρων). Για τον προσδιορισμό μετανάστευσης, τα επιμολυσμένα κύτταρα Huh7 και HepG2 επαναιωρήθηκαν σε 200 μL μέσου DMEM χωρίς ορό και σπάρθηκαν στους άνω θαλάμους. Για τον προσδιορισμό εισβολής, το Matrigel (30 μg/φρεάτιο) προεπικαλύφθηκε στις μεμβράνες των άνω θαλάμων και άλλα βήματα ήταν τα ίδια με τον προσδιορισμό μετανάστευσης. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει ή εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης στην κάτω επιφάνεια στερεώθηκαν με αιθανόλη και χρωματίστηκαν με 0,2 τοις εκατό κρυσταλλικό ιώδες. Τέλος, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν και μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία πεδία χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο.
Ανάλυση κυτταρικού κύκλου
Τα κύτταρα Huh7 και HepG2 σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων σε πυκνότητα 1×105 κύτταρα/mL. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επεξεργασία με ECH για 0, 24, 48 ώρες. Τα κύτταρα αυτά προστέθηκαν στη συνέχεια με 1 mL πάγου προψυγμένου 75 τοις εκατό αιθανόλης, σταθεροποιημένο στους 20 βαθμούς για 2 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα προστέθηκαν με διάλυμα χρώσης ΡΙ και επωάστηκαν στο σκοτάδι για 15 λεπτά. Ο κυτταρικός κύκλος στη συνέχεια αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής.
Ανάλυση αποπτωτικών κυττάρων
Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-πηγαδιών σε πυκνότητα 5×105 κύτταρα/φρεάτιο. Μετά τη συλλογή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση και προστέθηκαν 195 μL διαλύματος δέσμευσης Annexin V-FITC για την εκ νέου εναιώρηση των κυττάρων. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 5 μL Annexin V-FITC και 10 μL διαλύματος χρώσης ιωδιούχου προπιδίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε λουτρό πάγου.
Το Cistanche προστατεύει το συκώτι.
Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR)
Τα ολικά RNA εκχυλίστηκαν με αντιδραστήριο TRIZol (Haigene, Haerbin, China). Το σύστημα PCR πραγματικού χρόνου Te viiA™ 7 χρησιμοποιήθηκε για qRT-PCR. Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης πρώτου κλώνου cDNA BeyoRT™ (Beyotime Institute of Biotechnology). Το U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος [16]. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν οι εξής:
miR-503-3p: προς τα εμπρός: 5′-CTGATGGTTAAGAGAATGT-3′,
miR-503-3p: reverse: 5′-GTCCTTGGACATCCGGGCCG-3′,
U6: εμπρός: 5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′,
U6: όπισθεν: 5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′.
Ανάλυση Western blot
Τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με anti-TGF- 1 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Κίνα), SMAD3 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Κίνα), SMAD 7 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Κίνα), Bcl-2 (1:1000, Shifeng, Σαγκάη, Κίνα), Bax (1:1000, Shifeng, Shanghai, Κίνα), Cyto C (1:1000, Shifeng, Σαγκάη, Κίνα), κασπάση{ {19}} (1:1000, Shifeng, Σαγκάη, Κίνα), κασπάση-8 (1:1000, Shifeng, Σαγκάη, Κίνα) και αντίσωμα κατά της ακτίνης (1:1000, Shifeng, Σαγκάη , Κίνα) μια νύχτα. Δέκα η μεμβράνη επωάστηκε με το δευτερεύον αντίσωμα κατά του κουνελιού (1:1000, Shifeng, Σαγκάη, Κίνα) [17].
Στατιστικές μέθοδοι
Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με λογισμικό SPSS 13.0. Για συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκε το t-test του μαθητή. p-value < 0.05="" θεωρήθηκε="">
Αποτελέσματα
Επίδραση της ECH στη δραστηριότητα και τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος
Για τη διερεύνηση της επίδρασης της ECH στη λειτουργία των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση MTT και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυτταρική βιωσιμότητα του HepG2 (Εικ. 2a) και του Huh7 (Εικ. 2β) μειώθηκε σταδιακά με την αύξηση της δόσης και του χρόνου Θεραπεία ECH σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p < 0.01).="" μετά="" από="" 48="" ώρες="" έκθεσης="" σε="" ech,="" η="" βιωσιμότητα="" των="" κυττάρων="" ήταν="" η="" χαμηλότερη,="" επομένως="" επιλέχθηκε="" έκθεση="" 48="" ωρών="" σε="" ech="" για="" περαιτέρω="" πείραμα.="" τα="" αποτελέσματα="" της="" δοκιμασίας="" σχηματισμού="" αποικιών="" έδειξαν="" ότι="" ο="" αριθμός="" των="" αποικιών="" των="" κυττάρων="" hepg2="" (εικ.="" 2c)="" και="" huh7="" (εικ.="" 2δ)="" μειώθηκε="" σταδιακά="" με="" τη="" θεραπεία="" της="" ech="" με="" τρόπο="" εξαρτώμενο="" από="" τη="" δόση="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου="" (ρ="">< 0="" ,01,="" p="">< 0,001).="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" υποδεικνύουν="" ότι="" η="" ech="" παίζει="" σημαντικό="" ρόλο="" στη="" δραστηριότητα="" και="" τον="" πολλαπλασιασμό="" των="" κυττάρων="">
Επιδράσεις της ECH στη μετανάστευση και εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος
Για να διερευνηθεί περαιτέρω η επίδραση της ECH στη λειτουργία των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος, ανιχνεύθηκε η κυτταρική μετανάστευση και η εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3α, β, σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς θεραπεία με ECH, η μετανάστευση και η εισβολή των κυττάρων Huh7 και HepG2 μειώθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία της ECH με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (σ.<0.01,><0.001), suggesting="" that="" ech="" inhibited="" the="" migration="" and="" invasion="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
Η ECH ρύθμισε την κατανομή και την απόπτωση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του ήπατος
Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της ECH στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ήπατος, πραγματοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4α, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, το ποσοστό των κυττάρων Huh7 και HepG2 στη φάση G0/G1 μειώθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με ECH με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (σ.<0.01), and="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" the="" s="" phase="" was="" gradually="" increased="" after="" ech="" treatment="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01), but="" there="" was="" no="" change="" of="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" g2/m="" phase="" after="" ech="" treatment="" (p="">0.05), υποδεικνύοντας ότι το ECH προκάλεσε διακοπή φάσης S των κυττάρων Huh7 και HepG2. Επιπλέον, με την αύξηση της δόσης του ECH, ο ρυθμός απόπτωσης των κυττάρων Huh7 και HepG2 αυξήθηκε σταδιακά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 4b, p<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" induced="" the="" apoptosis="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
Οι επιπτώσεις του ECH στο μονοπάτι TGF-1/Smad
Είναι γνωστό ότι το μονοπάτι σηματοδότησης TGF- 1/Smad εμπλέκεται καλά στην κυτταρική απόπτωση. Προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός της απόπτωσης που προκαλείται από ECH σε κύτταρα HepG2. Ανιχνεύτηκε η έκφραση του μονοπατιού σηματοδότησης TGF- 1/Smad. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με ECH μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης του TGF- 1 και του Smad3 τόσο σε επίπεδα mRNA (Εικ. 5α) όσο και σε επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 5β) και ρύθμισε σημαντικά την έκφραση του Smad7 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τόσο σε επίπεδα mRNA όσο και σε επίπεδα πρωτεΐνης (σελ<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" inhibited="" the="" activation="" of="" the="" tgf-β1/smad="" signaling="">
Το TGF-1 ήταν άμεσος στόχος miR-503-3p
Επιπλέον, το διαδικτυακό εργαλείο πρόβλεψης Starbase v2. έδειξε ότι το TGF- 1 ήταν ένας πιθανός στόχος miR-503-3p (Εικ. 6a). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης έδειξαν ότι η δραστηριότητα της λουσιφεράσης των κυττάρων HepG2 και των κυττάρων Huh7 που συνεπιμολύνθηκαν με miR-503-3p mimic και TGF- 1-WT ήταν σημαντικά μειωμένη, αλλά όχι τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με miR {10}}p mimic and TGF- 1-MUT (Εικ. 6b, p<0.01). similarly,="" the="" luciferase="" activity="" of="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-="" mut="" was="" signifcantly="" increased,="" but="" not="" the="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-wt="" (fig.="" 6c,=""><0.01). furthermore,="" the="" expression="" levels="" of="" tgf-β1="" were="" signifcantly="" reduced="" in="" the="" mir-503-3p="" mimic="" group="" compared="" with="" that="" in="" the="" nc="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.01), but="" signifcantly="" increased="" in="" the="" mir-503-3p="" inhibitor="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.05). these="" results="" suggested="" that="" tgf-β1="" was="" a="" direct="" target="" of="" mir-503-3p.="" to="" further="" investigate="" whether="" mir-503-3p="" mediated="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="" cancer,="" the="" expression="" of="" mir-503-3p="" was="" detected="" in="" liver="" cancer="" tissues="" and="" it="" showed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" were="" decreased="" in="" liver="" cancer="" tissues="" compared="" with="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="" (fig.="" 6f,=""><0.01). moreover,="" the="" expression="" levels="" of="" mir503-3p="" were="" further="" decreased="" in="" metastasis="" liver="" cancer="" tissues="" than="" that="" in="" nonmetastatic="" liver="" cancer="" tissues="" (fig.="" 6g,=""><0.01). the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" were="" gradually="" increased="" after="" ech="" exposure="" (fig.="" 6e,=""><0.05,><0.01). taken="" together,="" these="" results="" suggest="" that="" mir-503-3p/tgf-β1="" may="" mediate="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="">
Επίδραση της ECH στις δραστηριότητες του κυτοχρώματος C και των κασπασών
Όπως φαίνεται στο Σχ. 7α, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, βρήκαμε ότι η θεραπεία με ECH προκάλεσε σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (ρ.<0.01,><0.001), while="" the="" expression="" levels="" of="" bax="" were="" signifcantly="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01,><0.001). it="" was="" demonstrated="" that="" bcl-2="" and="" bax="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells.="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" cyto="" c,="" caspase-8,="" and="" caspase-3="" were="" signifcantly="" increased="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" (fig.="" 7b,=""><0.01,><0.001), indicating="" that="" the="" release="" of="" cyto="" c="" and="" the="" activation="" of="" caspase-8="" and="" caspase-3="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="">
Συζήτηση
Η χειρουργική εκτομή είναι η κύρια μέθοδος θεραπείας για ασθενείς με καρκίνο του ήπατος και το ποσοστό υποτροπών και μεταστάσεων μετά την εκτομή του ήπατος είναι υψηλό [18, 19]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η ECH έχει μια ορισμένη ανασταλτική επίδραση στους όγκους του ήπατος και παρέχει έναν ασφαλή και αποτελεσματικό αντικαρκινικό παράγοντα για τον καρκίνο του ήπατος. Η κλινική πρακτική έχει δείξει ότι η παραδοσιακή κινεζική ιατρική μπορεί να ανακουφίσει αποτελεσματικά τα κλινικά συμπτώματα ασθενών με καρκίνο του ήπατος [20]. Για την ECH, μελέτες έχουν δείξει ότι η ECH έχει αντιοξειδωτική, αντικαταθλιπτική, αντιφλεγμονώδη, αντιική, αντικαρκινική και αντιβακτηριακή δράση [21, 22]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η ECH μπορεί να προκαλέσει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζοντας προς τα πάνω την κασπάση-3 και διασπώντας ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA για να προκαλέσει οξείδωση του DNA [23]. Σε αυτήν τη μελέτη, βρήκαμε για πρώτη φορά ότι η ECH ασκεί αντικαρκινική δράση μέσω του άξονα miR 503-3p/TGF- 1/Smad στον καρκίνο του ήπατος.
Η μεσοκυτταρική φάση του κυτταρικού κύκλου των ευκαρυωτικών κυττάρων μπορεί να χωριστεί σε G1, S και G2. Τα σημεία ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετικές περιόδους ρυθμίζονται από διαφορετικούς ρυθμιστικούς παράγοντες [24]. Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι το ποσοστό των κυττάρων Huh7 και HepG2 στη φάση G0/G1 και G2/M μειώθηκε και το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S αυξήθηκε μετά την ECH, υποδεικνύοντας ότι η ECH προκάλεσε διακοπή της φάσης S των κυττάρων Huh7 και HepG2. Η ανισορροπία της απόπτωσης είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς των ανθρώπινων όγκων. Έχει αναφερθεί ότι τα αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα γενικά προκαλούν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και ελέγχουν την εξέλιξη του καρκίνου. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε επίσης ότι η ECH θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ήπατος με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, υποδηλώνοντας ότι η πρόκληση απόπτωσης καρκινικών κυττάρων μπορεί να είναι ένας από τους υποκείμενους μηχανισμούς της ECH στον καρκίνο του ήπατος.
Τα MiRNA παίζουν βασικούς ρόλους στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων HCC, του κύκλου, της απόπτωσης, της μετανάστευσης μέσω αλληλεπιδράσεων με διαφορετικά μονοπάτια σηματοδότησης και μόρια [25, 26]. Για παράδειγμα, βρέθηκε ότι το miR-26a εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό σε φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα, αλλά είναι σημαντικά μειωμένο στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό [27]. Η υπερέκφραση του miR-503-3p προκαλεί απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα και αναστέλλει την κυτταρική εισβολή και μετανάστευση [28]. Επιπλέον, ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει δείξει ότι η οδός σηματοδότησης TGF- 1/Smad παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου του ήπατος [7]. Επιπλέον, όταν ο καρκίνος του ήπατος συνεχίζει να εξελίσσεται, η έκφραση του TGF- 1 αναφέρεται ότι αυξάνεται σταδιακά [29]. Σε αυτήν τη μελέτη, βρήκαμε ότι το ECH ρυθμίζει προς τα κάτω τα TGF{- 1 και Smad3 και το Smad7 προς τα πάνω, αποδεικνύοντας ότι η ECH ανέστειλε την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης TGF- 1/Smad. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του miR-503-3p βρέθηκε να μειώνεται στους ιστούς του όγκου του ήπατος, αλλά η θεραπεία με ECH αύξησε την έκφραση του miR-503-3p στα κύτταρα Huh7 και HepG2. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ο TGF- 1 αναγνωρίστηκε ως πιθανός στόχος miR-503-3p. Το ECH προώθησε την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης TGF{- 1/Smad και αύξησε τα επίπεδα έκφρασης του Bax/Bcl-2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η οδός σηματοδότησης miR-503-3p/ TGF- 1/Smad μπορεί να μεσολαβεί στις επιδράσεις της ECH στον καρκίνο του ήπατος. Είναι γνωστό ότι η αυξημένη αναλογία Bax/Bcl-2 μπορεί να προκαλέσει την απελευθέρωση Cyto C στα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα. Το Cyto C αλληλεπιδρά με την Κασπάση-8 και σχηματίζει ένα αποπτωτικό σώμα που στη συνέχεια στρατολογεί και ενεργοποιεί την Κασπάση-3, η οποία προκαλεί τον καταρράκτη των Κασπάσεων και προάγει τον κυτταρικό θάνατο [30]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η ECH μείωσε την έκφραση του Bcl-2 και αύξησε την έκφραση των Bax, Cyto C, κασπάσης-8 και κασπάσης-3. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ECH μπορεί να επιδιορθώσει τη μιτοχονδριακή βλάβη σε κάποιο βαθμό.
ΣυμπέρασμαΣε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με ECH ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση και προκάλεσε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ήπατος. Ο υποκείμενος μηχανισμός της θεραπείας με ECH στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος βρέθηκε ότι σχετίζεται με τη οδό σηματοδότησης miR-503-3p/TGF- 1/Smad. Αυτή η μελέτη θα παρέχει μια ορισμένη πειραματική βάση για την έρευνα της ECH για την αντικαρκινική δράση. Αξίζει να σημειωθεί ότι η παρούσα μελέτη περιορίζεται από την έλλειψη πειραμάτων σε ζώα. Ως εκ τούτου, η μελλοντική μας μελέτη θα πραγματοποιήσει πειράματα σε ζώα για να επιβεβαιώσει περαιτέρω τα ευρήματά μας.
