​Ασθενείς αγγειοχειρουργικής με αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα έχουν μειωμένη έκφραση RNA του συμπληρώματος ουδετερόφιλων

Η αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα (NLR) σε ασθενείς που υποβάλλονται σε εκλεκτική αγγειοχειρουργική (EVS) έχουν αυξημένη θνησιμότητα ανεξάρτητα από τα περιεγχειρητικά αποτελέσματα. Για να κατανοήσουμε γιατί ο υψηλός NLR σχετίζεται με υψηλότερη θνησιμότητα, διερευνήσαμε την έκφραση μεταγραφώματος ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε EVS. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε EVS και υγιείς δότες για τον υπολογισμό του NLR. Τα δείγματα RNA απομονώθηκαν από τα ουδετερόφιλα και τα λεμφοκύτταρα των ασθενών και χωρίστηκαν σε NLR_Χαμηλό (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Εισαγωγή

Η καρδιαγγειακή νόσος (CVD) είναι η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως. Οφείλεται, σε μεγάλο βαθμό, στην αθηρογένεση και την αθηροσκλήρωση που, εκτός από την ατομική γενετική και τη διατροφή, διαμεσολαβείται από φλεγμονώδεις και ανοσολογικούς μηχανισμούς.1-3 Πρόσφατα, ο διαφορικός αριθμός λευκοκυττάρων (ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα) έχει τεθεί στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος. για την πρόβλεψη των καρδιαγγειακών (CV) εκβάσεων. Η αναλογία του απόλυτου αριθμού ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα (NLR) έχει αναγνωριστεί ως προγνωστικός παράγοντας της συνολικής θνησιμότητας σε πολλές μικρές μελέτες οξέων στεφανιαίων παρεμβάσεων, υπέρτασης, 7,8 και καρδιακής ανεπάρκειας.9

Πίνακας 1. Κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών με εκλεκτική αγγειοχειρουργική που εξετάστηκαν με RNA-seq

Προηγούμενες έρευνες έδειξαν επίσης ότι το NLR είναι ένας προγνωστικός παράγοντας μακροπρόθεσμων εκβάσεων σε ασθενείς με περιφερική αγγειακή νόσο.10-13 Οι αναδρομικές μελέτες μας σε πληθυσμούς ασθενών με αγγειοχειρουργικές επεμβάσεις υποστηρίζουν αυτό το συμπέρασμα. Σε 1 μελέτη 108 ασθενών με εκλεκτική ενδαγγειακή αποκατάσταση ανευρύσματος κοιλιακής αορτής, δεν υπήρχε διαφορά στην 30-ημέρα μετεγχειρητική θνησιμότητα μεταξύ ενός NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 ασθενείς, 42,6% κίνδυνος εγκεφαλικού) από εκείνους με NLR<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] Ομάδες NLR, αντίστοιχα).16 Ασθενείς με χαμηλότερο προεγχειρητικό NLR πέτυχαν σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς ακρωτηριασμό κατά την 4-ετή παρακολούθηση (χαμηλό NLR 65,5%, mid NLR, 37,5% και υψηλό NLR, 17,6 % [Ρ < .0001]).16

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία RNA (RNA-seq) ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων από ασθενείς που πληρούν τις προϋποθέσεις για επισκευή εκλεκτικής αγγειοχειρουργικής (EVS) για να προσδιορίσουμε πιθανούς μηχανισμούς για αυξημένο NLR. Οι μελέτες εξέτασαν εάν υπάρχει μοριακή βάση για αυξημένο NLR. Οι έρευνές μας αποκαλύπτουν ότι οι ασθενείς με αυξημένο NLR που υποβλήθηκαν σε επισκευή EVS διακρίνονται από εξαιρετικά σημαντική μείωση της ρύθμισης της ανοσοσφαιρίνης και των γονιδίων του συμπληρώματος στα ουδετερόφιλα.

Οφέλη από το cistanche-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Μέθοδοι

Ασθενείς

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), κατάσταση καπνίσματος, θεραπεία με στατίνες, ιατρικό ιστορικό χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας, καρκίνου, χρόνιας νεφρικής νόσου, στεφανιαίας νόσου (CAD), περιφερικής αρτηριακής νόσου, εγκεφαλοαγγειακής νόσου και χρόνιας καρδιακής ανεπάρκειας. Όλοι οι ασθενείς είχαν πλήρη αιματολογική εξέταση με διαφορικό αριθμό λευκών αιμοσφαιρίων. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε χαμηλό NLR (NLR_Χαμηλό [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Διαχωρισμός αίματος

Ολόκληρο αίμα (20 mL ανά ασθενή) συλλέχθηκε σε σωλήνες vacutainer των 10 mL αντιπηκτικά με EDTA και το αίμα διαχωρίστηκε εντός μιας ώρας από τη συλλογή. Πληθυσμοί κυττάρων ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων απομονώθηκαν ο καθένας από 8 mL αίματος χρησιμοποιώντας κιτ άμεσης απομόνωσης ανθρώπινων κυττάρων EasySep (STEMCELL Technologies, Βανκούβερ, Καναδάς) και τον μαγνήτη Big Easy EasySep (STEMCELL Technologies, Βανκούβερ, Καναδάς) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ο μαγνήτης ψύχθηκε στον πάγο προηγουμένως και τα κύτταρα του αίματος και τα αντιδραστήρια αναμίχθηκαν απαλά αναστρέφοντας το σωλήνα σε αντίθεση με το σιφώνιο. Οι αναλογίες των αντιδραστηρίων προσαρμόστηκαν επίσης με τον ακόλουθο τρόπο για να βελτιστοποιηθεί η ανάκτηση: 400 mL μίγματος αντισωμάτων, 400 mL μαγνητικών σφαιριδίων και 4 mL φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά προστέθηκαν στο αίμα πριν από τον πρώτο διαχωρισμό, ακολουθούμενα από 200 mL αντισώματος μείγμα και 400 mL σφαιριδίων πριν από τον δεύτερο διαχωρισμό και 200 ​​mL σφαιριδίων πριν από τον τρίτο και τελικό διαχωρισμό. Ελήφθη ένα μικρό δείγμα 200 mL από τους τελικούς όγκους ανάκτησης για μέτρηση κυττάρων και προετοιμασία αντικειμένων. Το υπόλοιπο του όγκου ανάκτησης φυγοκεντρήθηκε με 1000 στροφές ανά λεπτό για 7 λεπτά για να σφαιροποιηθούν τα κύτταρα.

Εικόνα 1. Ολόκληρο μεταγραφικό RNA από ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα που συλλέγονται από ασθενείς με NLR, υψηλό (NLR_Υψηλό), χαμηλό (NLR_Χαμηλό) ή έλεγχο (NLR_Έλεγχος) . Ο κωδικός του γράμματος "N" ή "L" στο όνομα του δείγματος σημαίνει ότι είτε τα ουδετερόφιλα είτε τα λεμφοκύτταρα ήταν η πηγή του RNA. Υπήρχαν 6 ασθενείς σε κάθε κατηγορία. Μπλε=μειωμένο επίπεδο έκφρασης. κόκκινο=υψηλό επίπεδο έκφρασης.

Καταμέτρηση κυττάρων και προετοιμασία αντικειμένων

Κύτταρα που επαναιωρήθηκαν σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά μοιράστηκαν περαιτέρω, αναμίχθηκαν με μπλε τρυπάνης και μετρήθηκαν χειροκίνητα χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Τυπικά, 9 × 106 έως 15 × 106 ουδετερόφιλα και 3 × 106 έως 10 × 106 λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν ανά δείγμα. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες των απομονωθέντων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κυτταροφυγόκεντρο, περιστράφηκαν με 600 στροφές ανά λεπτό για 3 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με χρώση Wright-Giemsa. Η καθαρότητα κάθε πληθυσμού κυττάρων προσδιορίστηκε με χειροκίνητη μέτρηση, στην οποία διακρίνονταν τουλάχιστον 1000 κύτταρα ανά πλακίδιο. Η μέση καθαρότητα των διαχωρισμών των ουδετερόφιλων και των λεμφοκυττάρων με μέτρηση κυττάρων ήταν 98,3% και 96,2%, αντίστοιχα. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε 1 ζεύγος δείγματος ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων και έδειξε καθαρότητα 90,6% και 92,2%, αντίστοιχα. Τα άλλα κύτταρα στο παρασκεύασμα ουδετερόφιλων διασπάστηκαν σε λεμφοκύτταρα (4%), μονοκύτταρα (2%), ηωσινόφιλα (2,3%) και βασεόφιλα (0,3%). Στο παρασκεύασμα λεμφοκυττάρων, τα άλλα κύτταρα ήταν ουδετερόφιλα (1,2%), μονοκύτταρα (1,4%), ηωσινόφιλα (1,2%) και βασεόφιλα (1,8%). Μαζικά δεδομένα RNA-seq από όλα τα μεμονωμένα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τον προσδιορισμό της έκτασης της μόλυνσης από μονοκύτταρα στα κυτταρικά παρασκευάσματα, προσδιορίζοντας εάν τα ουδετερόφιλα ή τα λεμφοκύτταρα από NLR_Υψηλό ή NLR_Χαμηλά δείγματα είχαν σημαντικά αυξήσει το CD14 , CD68, CD83 ή CD163. Ανεξάρτητα, τα δεδομένα RNA-seq εισήχθησαν για την εκτίμηση της αναλογίας ανοσοκυττάρων και καρκινικών κυττάρων (EPIC), ένα πρόγραμμα που σχεδιάστηκε για να εκτιμήσει την αναλογία ανοσοκυττάρων και καρκινικών κυττάρων σε μαζικά δεδομένα γονιδιακής έκφρασης.17 Το προφίλ αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε παρέχεται από το EPIC για κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που κυκλοφορούν στο αίμα και περιέχει το προφίλ για Β κύτταρα, CD4 και CD8 Τ κύτταρα, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα και φυσικά κύτταρα φονείς. Η έξοδος που αναφέρεται δίνεται ως κλάσματα κυττάρων ανά δείγμα.

Εικόνα 2. Σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα. (Α) Ο αριθμός των σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε ουδετερόφιλα (μπλε) και λεμφοκύτταρα (πορτοκαλί). (Β) Το διάγραμμα ανάλυσης του κύριου συστατικού των σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε ουδετερόφιλα (πράσινο και μωβ) και λεμφοκύτταρα (κόκκινο και μπλε) σε NLR_Υψηλό (κύκλοι) και NLR_Χαμηλό (τετράγωνα). (Γ) Ένας θερμικός χάρτης σημαντικώς διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων από NLR_Υψηλό έναντι NLR_Χαμηλό RNA ουδετερόφιλων. (Δ) Ένας θερμικός χάρτης σημαντικώς διαφοροποιημένα εκφραζόμενων γονιδίων από NLR_Υψηλό έναντι NLR_Χαμηλού RNA λεμφοκυττάρων.

RNA-seq και στατιστική ανάλυση

Λεπτομερείς μέθοδοι για την εκχύλιση και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA παρουσιάζονται στις συμπληρωματικές μεθόδους. Οι αναγνώσεις αλληλουχίας αξιολογήθηκαν ως προς την ποιότητα και ο προσαρμογέας περικόπηκε χρησιμοποιώντας το TrimGalore! (Babraham Institute), ένα σενάριο περιτυλίγματος για το FastQC και το CutAdapt. Οι αναγνώσεις που περνούσαν τον ποιοτικό έλεγχο ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς GRCh38 χρησιμοποιώντας το λογισμικό ευθυγράμμισης STAR. Οι ευθυγραμμισμένες αναγνώσεις υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Cufflinks έκδοση 2.2.1 για ανάλυση διαφορικής έκφρασης χρησιμοποιώντας τον σχολιασμό γονιδίου GENCODE για GRCh38 και τα δεδομένα έκφρασης σε επίπεδο γονιδίου αναφέρθηκαν σε θραύσματα ανά μεταγραφή κιλοβάσης ανά εκατομμύριο αναγνώσεις που χαρτογραφήθηκαν. αποκοπή ρυθμού ανακάλυψης τιμή P του<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά ασθενούς

Επιλέχθηκαν έξι ζεύγη δειγμάτων ασθενών από 7 NLR_Υψηλό και 9 NLR_Χαμηλό με βάση την υψηλότερη ποιότητα του RNA στο ζεύγος, όπως αξιολογήθηκε από τον αριθμό ακεραιότητας RNA (RIN) (Πίνακας 1 ). Εξετάστηκαν επίσης έξι μάρτυρες από 8 υγιείς δότες. Στους ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, η μέση ± τυπική απόκλιση NLR για το NLR_Υψηλό ήταν 4,37 ± 0,66 έναντι του NLR_Χαμηλό, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Η μέση ± τυπική απόκλιση της ηλικίας των ασθενών ήταν 61,0 ± 17,0 έτη για το NLR_Υψηλό και 64,5 ± 7,5 έτη για το NLR_Χαμηλό (P= 0,68). Όλοι οι ασθενείς εκτός από 1 είχαν αορτική ανευρυσματική νόσο, 9 ήταν θωρακικό/θωρακοκοιλιακό και 2 κοιλιακά. Και οι δύο ασθενείς με ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής ήταν στην ομάδα NLR_Χαμηλή. Έντεκα από τους 12 ασθενείς είχαν ιστορικό υπέρτασης. Τέσσερις στους 6 ασθενείς και στις δύο ομάδες NLR_High ή NLR_Low είχαν ιατρικό ιστορικό λιπιδικών ανωμαλιών. Τέσσερις ασθενείς στις ομάδες NLR_Υψηλής και 3 ασθενείς στις ομάδες NLR_Χαμηλών ήταν πρώην καπνιστές. Ένας ασθενής στην ομάδα NLR{40}}Low ήταν ενεργός καπνιστής. Πέντε ασθενείς στις ομάδες NLR_Υψηλή και 4 στις ομάδες NLR_Χαμηλή έπαιρναν στατίνες. Μόνο 3 ασθενείς και στις δύο ομάδες ήταν διαβητικοί. Ένας ασθενής σε κάθε ομάδα είχε ιστορικό CAD και 2 ασθενείς στην ομάδα NLR_Low είχαν περιφερική αρτηριακή νόσο.

Σχήμα 3. Τα δεδομένα RNA-seq σε αυτήν την έρευνα χρησιμοποιήθηκαν ως ανεξάρτητο μέσο για τον προσδιορισμό άλλης κυτταρικής μόλυνσης στα παρασκευάσματα ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων. Δείχνονται μόνο δεδομένα από τα ουδετερόφιλα. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση EPIC για να εκτιμηθεί η αναλογία των ανοσοποιητικών και καρκινικών κυττάρων σε δεδομένα μαζικής έκφρασης γονιδίων. Αυτή η ανάλυση έδωσε το ποσοστό ουδετερόφιλων, μονοκυττάρων, Β κυττάρων, CD4 Τ κυττάρων, CD8 Τ κυττάρων, φυσικών φονέων (ΝΚ) κυττάρων και άλλων κυττάρων στο παρασκεύασμα ουδετερόφιλων.

Ολόκληρη μεταγραφή

Παρατηρήσαμε συνολικές διαφορές σε ολόκληρο το μεταγραφικό κατά τη σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων (Εικόνα 1). Αυτό το εύρημα δεν προκάλεσε έκπληξη, καθώς η γονιδιακή έκφραση του τύπου κυττάρου είχε χαρακτηριστεί προηγουμένως διαφορετική.19 Στην ενότητα ουδετερόφιλων, στους ασθενείς με NLR_High, NLR_Low και NLR{{ 4}}Ομάδες ελέγχου, υπήρχαν πολλά γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω που σαφώς δεν ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στο τμήμα των λεμφοκυττάρων και αντίστροφα. Σε ολόκληρο το μεταγραφικό επίπεδο, οι κυτταροειδικές διαφορές μεταξύ ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων ήταν διακριτές και κυρίαρχες ανεξάρτητα από το NLR ή αν ήταν ασθενής ή μάρτυρας. Ωστόσο, μετά από προσεκτικότερη εξέταση, άρχισαν να εμφανίζονται διαφορές. Μια γραφική παράσταση ανάλυσης κύριου συστατικού έδειξε ότι ο έλεγχος NLR_ είτε για ουδετερόφιλα είτε για λεμφοκύτταρα επικαλύπτεται με NLR_Υψηλό και NLR_Χαμηλό και στα δύο κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Στη συνέχεια, οι έρευνες προσπάθησαν να βρουν πρόσθετες διαφορές μεταξύ των ομάδων NLR_High και NLR{11}}Low στα σημαντικά διαφοροποιημένα εκφραζόμενα γονίδια. Παρατηρήθηκε ότι 900 (74,5%) σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια παρατηρήθηκαν σε ουδετερόφιλα σε ομάδες NLR_High έναντι NLR_Low (Εικόνα 2Α). Συγκριτικά, τα λεμφοκύτταρα είχαν μόνο 190 (15,7%) σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια. Μια γραφική παράσταση ανάλυσης κύριου συστατικού NLR_Υψηλά γονίδια έναντι NLR_Χαμηλά γονίδια σε ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα αποκάλυψε ότι η ομάδα NLR_Υψηλή έναντι NLR_Χαμηλά γονίδια στο τα ουδετερόφιλα διαχωρίστηκαν σε 2 διακριτές περιοχές, ενώ τα γονίδια NLR_High και NLR_Low λεμφοκυττάρων επικαλύπτονταν (Εικόνα 2Β). Και πάλι, όπως και με όλα τα δεδομένα μεταγραφής, ο έλεγχος NLR_επικαλύπτεται με NRL_High και NLR_Χαμηλά σημαντικά διαφοροποιημένα εκφραζόμενα γονίδια τόσο στα ουδετερόφιλα όσο και στα λεμφοκύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Τα περισσότερα από τα σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια στο NLR_Υψηλό σε ουδετερόφιλα υπορυθμίστηκαν από το NLR_Χαμηλό (Εικόνα 2C). Ένας παρόμοιος αλλά πολύ μικρότερος αριθμός γονιδίων μειώθηκε στο NLR_Υψηλό των λεμφοκυττάρων από αυτό των ουδετερόφιλων (Εικόνα 2D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα NLR σχετίζονταν κυρίως με αλλοιωμένη έκφραση γονιδίου στα ουδετερόφιλα. Επιπλέον, έπρεπε να συγκριθεί με ασθενείς από την ομάδα ασθενειών της NLR_Χαμηλό, όχι NLR-Control, επειδή η προηγούμενη ομάδα διαχωρίστηκε σαφώς από NLR_High αλλά όχι NLR_Control ( Σχήμα 2Β· συμπληρωματικό Σχήμα 2).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Πριν από τη διερεύνηση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων και του εμπλουτισμού του συνόλου γονιδίων, πρόσθετες μελέτες χαρακτήρισαν τον βαθμό μόλυνσης από μονοκύτταρα στο παρασκεύασμα ουδετερόφιλων. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα RNA-seq, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση των μονοκυτταρικών δεικτών CD14, CD68, CD83 και CD163 σε NLR_High έναντι NLR_Χαμηλά ουδετερόφιλα ή παρασκευάσματα λεμφοκυττάρων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική. Η ανάλυση EPIC των δεδομένων RNA-seq ουδετερόφιλων έδειξε ότι τα μη ανοσοκύτταρα ("άλλα κύτταρα") και τα CD4 Τ κύτταρα ήταν οι κύριοι μολυντές στα παρασκευάσματα ουδετερόφιλων (Εικόνα 3). Εκτός από τα NLR{{10}}Χαμηλά Τ κύτταρα CD4 και Β κύτταρα, κανένα από τα άλλα μολυσματικά κύτταρα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό στα NLR_Χαμηλά ουδετερόφιλα έναντι του NLR_Υψηλά ουδετερόφιλα . Στο παρασκεύασμα ουδετερόφιλων, η μόλυνση από μονοκύτταρα με ανάλυση EPIC ήταν μόνο 0.17% ± 0.05% για το NLR_Χαμηλό έναντι 0,1% ± 0,033% για το NLR_Υψηλή προετοιμασία (P=.12). Αυτή η τιμή υποδεικνύει ότι η μόλυνση από μονοκύτταρα ήταν μια τάξη μεγέθους χαμηλότερη όταν προσδιορίστηκε με ανάλυση δεδομένων RNA-seq έναντι κυτταρομετρίας ροής.

Σχήμα 4. Διάγραμμα φυσαλίδας διασποράς κατηγοριών συνόλου γονιδίων GO για βιολογικές διεργασίες μεταξύ NLR_High και NLR_Low. Η αναλογία k: K στην τετμημένη είναι ο αριθμός των γονιδίων που εκφράζονται σημαντικά διαφοροποιημένα (k) σε σύγκριση με τον συνολικό αριθμό γονιδίων της κατηγορίας (K). Η τεταγμένη είναι η σημασία του εμπλουτισμού που εκφράζεται ως log (τιμή P). (Α) Σύνολα γονιδίων GO που προέρχονται από αλληλουχία RNA ουδετερόφιλων συγκρίνοντας το NLR_Υψηλό με το NLR_Χαμηλό. (Β) σύνολα γονιδίων GO που προέρχονται από RNA-ακολουθία λεμφοκυττάρων. Τα σύνολα γονιδίων στην κάτω αριστερή γωνία και των δύο διαγραμμάτων είναι τα λιγότερο σημαντικά. Τα σύνολα γονιδίων στην επάνω δεξιά γωνία και των δύο διαγραμμάτων είναι τα πιο σημαντικά.

Εικόνα 4 (συνέχεια)

Για να εξετάσουμε τη φύση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, πραγματοποιήσαμε κατηγορίες GSEA με Γονιδιακή Οντολογία (GO) για βιολογικές διεργασίες χρησιμοποιώντας τα σημαντικά διαφορετικά εκφραζόμενα σύνολα γονιδίων μεταξύ NLR_High και NLR_Low. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα διαγράμματα φυσαλίδων διασποράς (Εικόνα 4). Ο διαχωρισμός των συνόλων γονιδίων στην επάνω δεξιά γωνία καθενός από τις γραφικές παραστάσεις δείχνει (1) ένα υψηλό ποσοστό των γονιδίων στα σύνολα γονιδίων που έχουν αλλάξει σημαντικά και (2) έναν υψηλό βαθμό σημασίας για τον εμπλουτισμό του συνόλου γονιδίων. Στο δείγμα μας, τα διαγράμματα φυσαλίδων διασποράς έδειξαν τον εμπλουτισμό τόσο των κατηγοριών GO του συμπληρώματος όσο και της χυμικής απόκρισης ανεξάρτητα τόσο για τα ουδετερόφιλα όσο και για τα λεμφοκύτταρα. Στα ουδετερόφιλα, τα σύνολα γονιδίων για την κλασική οδό ενεργοποίησης του συμπληρώματος, τη ρύθμιση του καταρράκτη ενεργοποίησης πρωτεΐνης και τη χυμική ανοσολογική απόκριση που μεσολαβείται από την κυκλοφορούσα ανοσοσφαιρίνη ήταν τα πιο σημαντικά με το υψηλότερο ποσοστό των μελών του συνόλου γονιδίων να έχει αλλάξει σημαντικά (Εικόνα 4Α). Ανεξάρτητα, τα πανομοιότυπα σύνολα γονιδίων στα λεμφοκύτταρα επίσης παρατηρήθηκε ότι έχουν υψηλή αναλογία σημαντικά αλλαγμένων γονιδίων και βαθμό σημασίας όπως στις μελέτες ουδετερόφιλων (Εικόνα 4Β).

Πίνακας 2. Σύνολα γονιδίων ανοσολογίας σε ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα

Ο Πίνακας 2 παραθέτει τα πιο σημαντικά μεταβαλλόμενα σετ γονιδίων ανοσολογίας σε ουδετερόφιλα (Πίνακας 2, Πίνακας Α) και λεμφοκύτταρα (Πίνακας 2, Πίνακας Β). Αυτή η μελέτη συνέκρινε την έκφραση γονιδίων σε ουδετερόφιλα ή λεμφοκύτταρα μεταξύ δειγμάτων NLR_Υψηλού και NLR_Χαμηλού δείγματος. Τα υγιή NLR_Δείγματα ελέγχου δεν συγκρίθηκαν καθώς τα επίπεδα έκφρασής τους αλληλεπικαλύπτονταν με δείγματα NLR_Υψηλού και NLR_Χαμηλού ασθενούς τόσο σε ολόκληρο το μεταγραφικό όσο και σε σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα σετ γονιδίων. Επιπλέον, τα υγιή δείγματα NLR_δεν ταιριάστηκαν σε ηλικία, νόσο και χειρουργική κατάσταση (συμπληρωματικά Σχήματα 1 και 2). Και στα ουδετερόφιλα (Πίνακας 2) και στα λεμφοκύτταρα (Πίνακας 2), τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση των συνόλων γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα ήταν πολύ σημαντικά διαφορετική όταν το NLR_Υψηλό συγκρίθηκε με το NLR_Χαμηλό . Στην αλληλουχία RNA, κάθε κυτταρικός τύπος έχει τα ίδια ευρήματα με τον άλλο κυτταρικό τύπο. Και στα δύο πλαίσια, τα επίπεδα σημαντικότητας των κύριων συνόλων γονιδίων μεγιστοποιήθηκαν στο P < 1E-24. Αυτά τα δεδομένα ήταν εξαιρετικά σημαντικά ανεξάρτητα από το εάν εξετάστηκε το ουδετερόφιλο ή το λεμφοκύτταρο. Για να επικεντρωθούμε στην εξαιρετικά σημαντική περιοχή περιεχομένου αυτής της έρευνας RNA-seq, εξετάστηκε η σημαντικά διαφοροποιημένη έκφραση γονιδίου ανοσοσφαιρίνης. Πρώτον, μια γραφική παράσταση ανάλυσης κύριου συστατικού των γονιδίων ουδετερόφιλων έδειξε ότι για NLR_Υψηλό έναντι NLR_Χαμηλό, τα σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια ανοσοσφαιρίνης διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες (συμπληρωματικό Σχήμα 3Α). Εναλλακτικά, τα γονίδια των λεμφοκυττάρων του NLR_High έναντι NLR_Low over lapped (συμπληρωματικό Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, συγκρίθηκε ένας συνδυασμένος θερμικός χάρτης γονιδιακής έκφρασης που σχετίζεται με το ανοσοποιητικό μεταξύ NLR_High με NLR_Low σε ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα (Εικόνα 5). Συνολικά, όταν εξετάζεται ολόκληρος ο χάρτης θερμότητας, υπάρχει προφανής μείωση της γονιδιακής οικογένειας των γονιδίων ανοσοσφαιρίνης στην ομάδα ουδετερόφιλων NLR_Υψηλή σε σύγκριση με αυτήν του NLR_Χαμηλή. Τα περισσότερα γονίδια (69/156, 44%) σχετίζονταν με την ανοσοσφαιρίνη. Μόνο 12 από τα 156 (7,7%) γονίδια σχετίζονταν με το συμπλήρωμα: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD και CD59. Στην ομάδα των λεμφοκυττάρων, υπήρξε επίσης μείωση της ρύθμισης κυρίως των γονιδίων της ανοσοσφαιρίνης στην υψηλή κατηγορία NLR_.

Τα σύνολα γονιδίων του συμπληρώματος σε ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα 3. Και στα ουδετερόφιλα (Πίνακας 3) και στα λεμφοκύτταρα (Πίνακας 3), η έκφραση των γονιδίων σε 3 σετ γονιδίων που σχετίζονται με το σύστημα του συμπληρώματος ήταν πολύ σημαντικά διαφορετική (P <1E{{ 5}}) όταν NLR_Υψηλά δείγματα συγκρίθηκαν με NLR_Χαμηλά δείγματα. Αυτή η παρατήρηση ήταν η ίδια είτε η σύγκριση ήταν μεταξύ RNA από ουδετερόφιλα ή λεμφοκύτταρα. Τα 3 σύνολα γονιδίων περιλαμβάνουν ενεργοποίηση συμπληρώματος, κλασική οδό ενεργοποίησης συμπληρώματος και ρύθμιση ενεργοποίησης συμπληρώματος. Μια γραφική παράσταση ανάλυσης κύριου συστατικού των γονιδίων ουδετερόφιλων έδειξε και πάλι ότι για το NLR_Υψηλό έναντι του NLR{10}}Χαμηλό, τα σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα γονίδια του συμπληρώματος διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες (συμπληρωματικό Σχήμα 3Β). Εναλλακτικά, τα γονίδια των λεμφοκυττάρων του NLR_Υψηλό έναντι του NLR_Χαμηλή επικάλυψη (συμπληρωματικό Σχήμα 3Β).

Σχήμα 5. Χάρτης θερμότητας σημαντικών διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στο γονίδιο της ανοσοσφαιρίνης σε ουδετερόφιλα (αριστερά) και λεμφοκύτταρα (δεξιά). Τα γονίδια που αναφέρονται στα δεξιά κάθε χάρτη θερμότητας είναι τα μέλη της ανοσοσφαιρίνης

Ένας θερμικός χάρτης ουδετερόφιλων και έκφρασης λεμφοκυττάρων ενός συνόλου γονιδίων που σχετίζεται με το συμπλήρωμα που συγκρίνει το NLR_Υψηλό με το NLR_Χαμηλό φαίνεται στο σχήμα 6. Στα ουδετερόφιλα, ένας τεράστιος αριθμός γονιδίων ρυθμίστηκε προς τα κάτω στο NLR_Υψηλός πληθυσμός. Σε αυτό το σύνολο γονιδίων, παρόμοια με τα σύνολα γονιδίων ανοσοσφαιρίνης, τα περισσότερα γονίδια (69/ 86, 80%) σχετίζονταν με την ανοσοσφαιρίνη. Μόνο 12 από τα 86 (14%) ήταν γονίδια συμπληρώματος και ρυθμιστικά (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH και CFD). Στην ομάδα των λεμφοκυττάρων συνολικά, υπήρχαν λιγότερες εκφράσεις των γονιδίων του συμπληρώματος και τα γονίδια ανοσοσφαιρίνης ήταν ελαφρώς πιο μειωμένα στην ομάδα NLR_Υψηλή. Επειδή υπάρχει μεγαλύτερη κατανόηση των γονιδίων του συστήματος συμπληρώματος σε σύγκριση με τα γονίδια των συστημάτων ανοσοσφαιρίνης, η προσοχή εστιάστηκε στο σύστημα του συμπληρώματος ως πιθανό υποψήφιο για γονίδια στόχους που σχετίζονται με υψηλό και χαμηλό NLR. Ένας σύνθετος χάρτης θερμότητας που συγκρίνει το NLR_High με το NLR_Low ετοιμάστηκε που δείχνει την έκφραση του συστήματος συμπληρώματος και των σχετικών γονιδίων τόσο σε δείγματα ουδετερόφιλων όσο και σε δείγματα λεμφοκυττάρων (Εικόνα 7). Ως επί το πλείστον, το λεμφοκύτταρο δεν είναι ένα κυτταρικό σύστημα δεξαμενής για το σύστημα του συμπληρώματος. Τα περισσότερα γονίδια του συμπληρώματος δεν ρυθμίζονται προς τα πάνω στα λεμφοκύτταρα. Μόνο τα C1S, CR2, C5, C8G, C5 και CFB ήταν παρόντα με διαφορά στην έκφραση μεταξύ NLR_High και NLR_Low λεμφοκυττάρων (Εικόνα 7). Το CD81 στα λεμφοκύτταρα είναι μια τετρασπανίνη Β-κυττάρων. Οι εκφράσεις C1S και C8G φαίνεται να είναι σημαντικά υψηλότερες στο NLR των λεμφοκυττάρων_Υψηλό από εκείνες του NLR των λεμφοκυττάρων_Χαμηλό, παρόμοιο με το KLKB1, το γονίδιο για την προκαλλικρεΐνη του πλάσματος.

Αντίθετα, στα ουδετερόφιλα, το NLR_High παρουσίασε αρνητική ρύθμιση των γονιδίων του συμπληρώματος C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 και C3AR1 και των ρυθμιστικών (ανασταλτικών) γονιδίων του συμπληρώματος CD59, CFB και CFI . Μόνο τα γονίδια C2 και CFD ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε ασθενείς με NLR_Υψηλό_Ν. Τα CD59 και C9 είναι σχετικά ρυθμισμένα προς τα πάνω στα ουδετερόφιλα NLR_Χαμηλό_N σε σύγκριση με εκείνα του NLR_High_N. Ο FGFR4 είναι ένας υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. Η CFH ήταν παρούσα αλλά δεν φάνηκε να επηρεάζεται από τα ουδετερόφιλα NLR_Υψηλό ή NLR_Χαμηλό. Εκφράζεται περισσότερο στα λεμφοκύτταρα.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Συζήτηση

Ο NLR στον διαφορικό αριθμό λευκοκυττάρων έχει γίνει ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος, απλός δείκτης για την αναγνώριση πιθανών επιβλαβών εκβάσεων σε ένα ευρύ φάσμα διαταραχών, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών παθήσεων, συμπαγών όγκων και φλεγμονωδών διαταραχών όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος και η συστηματική σκλήρυνση. Στις δικές μας αναδρομικές έρευνες σε ασθενείς με αθηροσκληρωτική καρδιαγγειακή νόσο, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με υψηλό NLR έχουν υψηλότερο ποσοστό όψιμης θνησιμότητας μετά από εκλεκτική αποκατάσταση ανευρύσματος αορτής, υψηλότερο όψιμο εγκεφαλικό επεισόδιο/θάνατο μετά από προφυλακτική ενδαρτηρεκτομή καρωτίδας και μειωμένη επιβίωση χωρίς ακρωτηριασμό μετά εκλεκτική επαναγγείωση μηριαίου-ιγνυακού εάν είναι αυξημένος ο NLR τους.14-16 Οι παρούσες έρευνες ξεκίνησαν για να βρεθεί μια μηχανιστική βάση για υψηλό NLR. λέμφωμα, πολλαπλούς συμπαγείς όγκους και φλεγμονώδεις διαταραχές όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος και η συστηματική σκλήρυνση. Στις δικές μας αναδρομικές έρευνες σε ασθενείς με αθηροσκληρωτική καρδιαγγειακή νόσο, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με υψηλό NLR έχουν υψηλότερο ποσοστό όψιμης θνησιμότητας μετά από εκλεκτική αποκατάσταση ανευρύσματος αορτής, υψηλότερο όψιμο εγκεφαλικό επεισόδιο/θάνατο μετά από προφυλακτική ενδαρτηρεκτομή καρωτίδας και μειωμένη επιβίωση χωρίς ακρωτηριασμό μετά εκλεκτική επαναγγείωση μηριαίου-ιγνυακού εάν είναι αυξημένος ο NLR τους.14-16 Οι παρούσες έρευνες ξεκίνησαν για να βρεθεί μια μηχανιστική βάση για υψηλό NLR.

Πίνακας 3. Σύνολα γονιδίων συμπληρώματος σε ουδετερόφιλα και λεμφοκύτταρα

Για να αναπτύξουμε μια αμερόληπτη προσέγγιση ως προς τον μηχανισμό(ους) των διαφορικών επιδράσεων του NLR στα CV αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε RNA-seq τόσο σε ουδετερόφιλα όσο και σε λεμφοκύτταρα από τους ίδιους ασθενείς. Για αυτήν τη μελέτη, όλοι οι ασθενείς με νόσο της αορτής συλλέχθηκαν προοπτικά και ομαδοποιήθηκαν σε κατηγορίες NLR με βάση τα αποτελέσματά τους. Τα τελικά 6 δείγματα σε καθέναν από τους 2 τύπους κυττάρων επιλέχθηκαν από το υψηλότερο επίπεδο του RIN τους στο παρασκευασμένο RNA των ζευγαρωμένων δειγμάτων ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το φύλο, η ηλικία ή οι προηγούμενες ιατρικές καταστάσεις. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, οι ασθενείς στις ομάδες NLR_High και NLR_Low ήταν αρκετά παρόμοιοι και διακρίνονταν μόνο από το NLR τους.

Η ποιότητα του RNA που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη φαίνεται από το RIN και τον πλήρη διαχωρισμό του προτύπου γονιδιακής έκφρασης μεταξύ ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων σε όλες τις ομάδες ασθενών που συλλέχθηκαν (υψηλό NLR, χαμηλό NLR και μάρτυρες) (Εικόνα 1). Μια γραφική παράσταση ανάλυσης κύριου συστατικού δείχνει ότι τα δεδομένα NLR_δεδομένων ελέγχου ήταν άσχετα σε αυτήν την έρευνα επειδή το NLR των ασθενών επικαλύπτονταν με το NLR_Υψηλό και NLR_Χαμηλό στους πληθυσμούς ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων ασθενών . Η ανάλυση GSEA παρείχε μεγάλη εικόνα ως προς το ποια σύνολα γονιδίων εμπλουτίστηκαν στα σύνολα γονιδίων GO βιολογικών διεργασιών και η γραφική παράσταση φυσαλίδων διασποράς το απέδειξε ξεκάθαρα σχεδιάζοντας τη λογαριθμική σημασία προς την αναλογία του αριθμού των γονιδίων που τροποποιήθηκαν επί του συνολικού αριθμού γονιδίων στα γονιδιακά σύνολα. Όταν αναθεωρήθηκαν, τα σύνολα γονιδίων που διαχωρίζονται από ολόκληρη τη λίστα ήταν αυτά στο σύστημα χυμικής (ανοσοσφαιρίνης) ανοσίας και συμπληρώματος (Πίνακες 2 και 3) με βάση την αναλογία και τη στατιστική σημασία σε μια αμερόληπτη προσέγγιση ανακάλυψης.

Ο μεγάλος αριθμός των εμπλεκόμενων γονιδίων χυμικής ανοσίας ανοσοσφαιρίνης είναι δύσκολο να εργαστεί κανείς επειδή σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών των γονιδίων δεν είναι καλά γνωστές. Εναλλακτικά, πολλά περισσότερα είναι γνωστά για το σύστημα συμπληρώματος και η εστίαση στο κλασικό σύστημα συμπληρώματος που ενεργοποιείται από την ανοσοσφαιρίνη είναι ένας αναγνωρίσιμος στόχος για φλεγμονή και νόσο που σχετίζεται με τις ανοσοσφαιρίνες. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι τα γονίδια του κλασσικού συμπληρώματος C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 και αρκετά ρυθμιστικά γονίδια (CD59, CFB CFI και CFH) ρυθμίζονται προς τα κάτω στα ουδετερόφιλα των ασθενών. με υψηλό NLR (Εικόνα 7). Αυτά τα ευρήματα είναι εντυπωσιακά για 3 λόγους. Πρώτον, τα γονίδια που εμπλέκονται είναι εκείνα κυρίως του κλασικού μονοπατιού του συμπληρώματος. Δεύτερον, σε ασθενείς με υψηλό NLR, αυτά τα γονίδια του συμπληρώματος είναι, ως επί το πλείστον, ρυθμισμένα προς τα κάτω σε σύγκριση με αυτά των ασθενών με χαμηλό NLR. Τέλος, περισσότερο F12 εκφράζεται σε ουδετερόφιλα από NLR_Υψηλό από εκείνα από NLR_Χαμηλά δείγματα. Οι ενζυμικές μορφές του πρωτεϊνικού προϊόντος του F12 (παράγοντας XII [FXII]) ενεργοποιούν την κλασική οδό του συμπληρώματος και των ουδετερόφιλων. {21}}Υψηλό, υποδηλώνοντας ότι η ίδια η ενεργοποίηση του FXII μπορεί να είναι ρυθμιστής της ενεργοποίησης του συμπληρώματος.

Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι το κλασικό σύστημα συμπληρώματος εμπλέκεται σε επιταχυνόμενη καρδιαγγειακή νόσο. Το συστατικό συμπληρώματος 1q (C1q) είναι ο αρχικός παράγοντας της οδού του συμπληρώματος, ο οποίος έχει σημαντικό ρόλο τόσο στο έμφυτο όσο και στο επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα.21 Το C1q έχει αποδειχθεί ότι έχει διπλούς ρόλους, θετικές και αρνητικές επιπτώσεις στην αθηροσκλήρωση.22 Στην κλασική μονοπάτι του συμπληρώματος, το C1q έχει προστατευτικό ρόλο στην αθηροσκλήρωση πρώιμου σταδίου ρυθμίζοντας το μοριακό σήμα των μακροφάγων μέσω μιας ανεξάρτητης από το συμπλήρωμα μονοπατιού, ρυθμίζοντας την πρόσληψη αθηρογόνου λιποπρωτεΐνης, μεσολαβώντας στα αποπτωτικά κύτταρα και στην αποβολή κυτταρικών υπολειμμάτων.23,24 Μια πρόσφατη μελέτη από τον Jia et al23 υποδεικνύουν ότι η μειωμένη C1q ορού σχετίζεται με CAD. Μια άλλη μελέτη από τους Guo et al24 δείχνει ότι η αυξημένη δραστηριότητα C1q σχετίζεται με CAD. Τέλος, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι ασθενείς με διαβήτη με μειωμένο C1q έχουν συντομεύσει την επιβίωση.25 Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η εξέταση του συστήματος συμπληρώματος μπορεί να είναι σημαντική για την κατανόηση της παθογένειας της καρδιαγγειακής νόσου που προκαλείται από φλεγμονή.

Σχήμα 6. Χάρτης θερμότητας σημαντικών διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στο γονίδιο του συμπληρώματος σε ουδετερόφιλα (αριστερά) και λεμφοκύτταρα (δεξιά). Τα γονίδια που αναφέρονται στα δεξιά κάθε χάρτη θερμότητας είναι τα μέλη του συνόλου γονιδίων του συμπληρώματος. Το RNA προέρχεται από ουδετερόφιλα ή λεμφοκύτταρα που συλλέγονται από ασθενείς με υψηλό (NLR_Υψηλό) ή χαμηλό (NLR_Χαμηλό) NLR. Έξι μεμονωμένα δείγματα από NLR_Υψηλό συγκρίνονται με 6 μεμονωμένα δείγματα από NLR_Χαμηλό τόσο από ουδετερόφιλα όσο και από λεμφοκύτταρα.

Εικόνα 7. Σύνθετος χάρτης θερμότητας συμπληρώματος και σχετικών γονιδίων από ουδετερόφιλο ή λεμφοκύτταρο NLR_Υψηλό ή NLR_Χαμηλό. Σε κάθε κατηγορία, ο σύνθετος χάρτης θερμότητας ετοιμάστηκε από 6 μεμονωμένα δείγματα RNA-seq από κάθε τύπο κυττάρου.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Αν και η μείωση των λιπιδίων δεν είχε καμία επίδραση στο NLR, η αντιφλεγμονώδης θεραπεία με canakinumab, έναν αναστολέα ιντερλευκίνης 1 μείωσε το NLR (P <.0001). επιρροή των στατινών. Αυτή η ad hoc ανάλυση πολλαπλών προοπτικών τυχαιοποιημένων δοκιμών υποδηλώνει ότι το NLR μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για θνησιμότητα στην καρδιαγγειακή νόσο.

Υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Τα ουδετερόφιλα παρασκευάσματα μας είχαν 4% λεμφοκύτταρα και 2% μονοκύτταρα μόλυνση με κυτταρομετρία ροής. Επειδή τα ουδετερόφιλα δεν είναι γνωστό ότι συνθέτουν ανοσοσφαιρίνη, οι αλλαγές στο γονίδιο της ανοσοσφαιρίνης των ουδετερόφιλων μπορεί να οφείλονται σε μόλυνση Β κυττάρων. Στην ανάλυση EPIC, υπήρξε σημαντική αύξηση στη μόλυνση των Β-κυττάρων των δειγμάτων NLR-Low. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι μια αύξηση στο επίπεδο των γονιδίων ανοσοσφαιρίνης στα δείγματα NLR_Χαμηλά ουδετερόφιλα μπορεί να προκύψει από μόλυνση των Β-κυττάρων. Έτσι, μειωμένα γονίδια ανοσοσφαιρίνης σε NLR_Υψηλά δείγματα μπορεί να οφείλονται σε αυξημένα Β κύτταρα στο NLR_Χαμηλά δείγματα και όχι απαραίτητα μειωμένα επίπεδα γονιδίων ανοσοσφαιρίνης στα δείγματα NLR_Υψηλά. Ομοίως, τα ουδετερόφιλα δεν είναι γνωστό ότι είναι κύτταρα που παράγουν συμπλήρωμα. Μόλυνση δύο τοις εκατό με μονοκύτταρα θα μπορούσε να είναι η πηγή των γονιδίων του συμπληρώματος. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας τα δεδομένα αλληλουχίας RNA, παρατηρήσαμε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στη μόλυνση από μονοκύτταρα των παρασκευασμάτων ουδετερόφιλων μεταξύ NLR_Χαμηλού και NLR_Υψηλού. Επιπλέον, η εκτέλεση μιας ανάλυσης EPIC των δεδομένων RNA-seq δείχνει ότι η μόλυνση από μονοκύτταρα ήταν<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Εν ολίγοις, το βασικό εύρημα σε αυτήν την έρευνα είναι ότι, σε καταστάσεις υψηλού NLR, πολλά γονίδια του συμπληρώματος και ορισμένοι από τους ρυθμιστές τους ρυθμίζονται προς τα κάτω στα ουδετερόφιλα. Δεν είναι σαφές ως προς τη συνολική σημασία και την κατάσταση ενεργοποίησης των αναγνωρισμένων γονιδίων του συμπληρώματος που ρυθμίζονται προς τα κάτω. Επειδή τα σύνολα γονιδίων του συμπληρώματος είναι εντυπωσιακά μειωμένα, υποθέτουμε ότι τα άτομα με NLR_Υψηλή και συντομευμένη μετεγχειρητική επιβίωση έχουν απώλεια των κύριων προστατευτικών μηχανισμών CV που παρέχονται από τα συστήματα του συμπληρώματος. Αυτή η αξιολόγηση πρέπει να εξεταστεί μελλοντικά σε κλινικές έρευνες για τον(τους) υποκείμενο(ους) μηχανισμό(ους) για αυτό το αποτέλεσμα.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Ross R. Αθηροσκλήρωση – μια φλεγμονώδης νόσος. N Engl J Med. 1999; 340(2):115-126.

2. Getz GS. Θεματική σειρά ανασκόπησης: το ανοσοποιητικό σύστημα και η αθηρογένεση. Ανοσολογική λειτουργία στην αθηρογένεση. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Το ανοσοποιητικό σύστημα στην αθηροσκλήρωση. Nat Immunol. 2011; 12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Η χρησιμότητα μιας αυξημένης αναλογίας ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα στην πρόβλεψη μακροχρόνιας θνησιμότητας μετά από διαδερμική στεφανιαία παρέμβαση. Είμαι ο J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Συσχέτιση μεταξύ της αναλογίας ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα εισαγωγής και των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με οξύ στεφανιαίο σύνδρομο. Είμαι ο J Cardiol. 2008; 102(6):653-657.

6. Gibson ΡΗ, Croal BL, Cuthbertson ΒΗ, et αϊ. Προεγχειρητική αναλογία ουδετερόφιλων-λεμφοκυττάρων και έκβαση από μόσχευμα παράκαμψης στεφανιαίας αρτηρίας. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik Τ, Balta S, et al. Συγκριτικές επιδράσεις της νεμπιβολόλης και της μετοπρολόλης στο εύρος κατανομής των ερυθρών αιμοσφαιρίων και στην αναλογία ουδετερόφιλων/λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με νεοδιαγνωσθείσα ιδιοπαθή υπέρταση. J Cardiovasc Pharmacol. 2013; 62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. Οι συγκριτικές επιδράσεις της βαλσαρτάνης και της αμλοδιπίνης στα επίπεδα vWf και την αναλογία N/L σε ασθενείς με πρόσφατα διαγνωσθείσα υπέρταση. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Χρησιμότητα της αναλογίας ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα στην πρόβλεψη μακροπρόθεσμων εκβάσεων σε οξεία μη αντιρροπούμενη καρδιακή ανεπάρκεια. Είμαι ο J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Αναλογία ουδετερόφιλων λεμφοκυττάρων στην περιφερική αγγειακή νόσο: μια ανασκόπηση. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta Η, Agha R, Wong J, Tang ΤΥ, Wilson YG, Walsh SR. Η αναλογία ουδετερόφιλων-λεμφοκυττάρων προβλέπει τη μεσοπρόθεσμη επιβίωση μετά από εκλεκτική μείζονα αγγειακή χειρουργική επέμβαση: μια μελέτη διατομής. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Η αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα προβλέπει την περιεγχειρητική θνησιμότητα μετά από ανοιχτή εκλεκτική αποκατάσταση ανευρυσμάτων κοιλιακής αορτής. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Η αναλογία ουδετερόφιλων-λεμφοκυττάρων προβλέπει τη σοβαρότητα και την έκβαση της νόσου μετά από επεμβάσεις κάτω άκρων. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Η αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων-λεμφοκυττάρων προβλέπει τη θνησιμότητα μετά από εκλεκτική αποκατάσταση του ενδαγγειακού ανευρύσματος. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Η αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα σχετίζεται με χειρότερα αποτελέσματα μετά από ενδαρτηρεκτομή καρωτίδας σε ασυμπτωματικούς ασθενείς. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Μια αυξημένη αναλογία ουδετερόφιλων προς λεμφοκύτταρα σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση χωρίς ακρωτηριασμό μετά από διαδερμική επαναγγείωση του μηριαίου βλεννογόνου. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Ταυτόχρονη απαρίθμηση τύπων καρκίνου και ανοσοκυττάρων από δεδομένα έκφρασης γονιδίων όγκου όγκου. Elife. 2017; 6: e26476.

18. Trapnell C, Roberts Α, Goff L, et αϊ. Ανάλυση διαφορικής έκφρασης γονιδίου και μεταγραφής πειραμάτων RNA-seq με TopHat και Μανικετόκουμπα. Nat Protoc. 2012; 7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn Μ, Alizadeh AA, Brown ΡΟ. Ειδικά προφίλ γονιδιακής έκφρασης κυτταρικού τύπου λευκοκυττάρων στο ανθρώπινο περιφερικό αίμα. BMC Genomics. 2006; 7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Ο παράγοντας XII και το uPAR ρυθμίζουν προς τα πάνω τις λειτουργίες των ουδετερόφιλων για να επηρεάσουν την επούλωση του τραύματος. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Song WC. Το συμπλήρωμα και ο ρόλος του στις εγγενείς και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Συμπλήρωμα στην αθηροσκλήρωση: φίλος ή εχθρός; J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Υ, Wen W, Yang Υ, et αϊ. Ο κλινικός ρόλος του συνδυασμού C1q ορού και hsCRP στην πρόβλεψη της στεφανιαίας νόσου. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Η δραστηριότητα του συμπληρώματος ορού C1q σχετίζεται με αποφρακτική στεφανιαία νόσο. Front Cardiovasc Med. 2021; 8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Η χρησιμότητα του συμπληρώματος C1q για την πρόβλεψη 10-ετής θνησιμότητας σε άνδρες με σακχαρώδη διαβήτη που παραπέμπονται για στεφανιογραφία. Είμαι ο J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et αϊ. Η αναλογία ουδετερόφιλων-λεμφοκυττάρων και τα συμβάντα αθηροσκληρωτικών συμβάντων: αναλύσεις από πέντε σύγχρονες τυχαιοποιημένες δοκιμές. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.