Τοποθεσία ευπάθειας στον SARS-CoV-2 Spike επάγει ευρέως προστατευτικό αντίσωμα κατά των αντιγονικά διακριτών υπομεταβλητών του Omicron

Η ταχεία εξέλιξη του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) Οι παραλλαγές του Omicron τονίζουν την ανάγκη εντοπισμού αντισωμάτων με ευρείες εξουδετερωτικές ικανότητες για ενημέρωση μελλοντικών μονοκλωνικών θεραπειών και στρατηγικών εμβολιασμού. Εδώ, εντοπίσαμε το S{3}}, ένα ευρέως εξουδετερωτικό αντίσωμα (bnAb) που στοχεύει τη θέση σύνδεσης του υποδοχέα (RBS) που προήλθε από ένα άτομο που είχε προηγουμένως μολυνθεί με WT SARS-CoV-2 πριν από την εξάπλωση του παραλλαγές ανησυχίας (VOCs). Το S{7}} έδειξε ευρεία διασταυρούμενη εξουδετέρωση όλων των κυρίαρχων παραλλαγών, συμπεριλαμβανομένων των D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu και Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Επιπλέον, το S728-1157 προστάτευσε τα χάμστερ από in vivo προκλήσεις με τους ιούς WT, Delta και BA.1. Η δομική ανάλυση έδειξε ότι αυτό το αντίσωμα στοχεύει έναν επίτοπο κατηγορίας 1/RBS-A στην περιοχή δέσμευσης υποδοχέα μέσω πολλαπλών υδρόφοβων και πολικών αλληλεπιδράσεων με την περιοχή προσδιορισμού της συμπληρωματικότητας βαριάς αλυσίδας 3 (CDR-H3), επιπλέον των κοινών μοτίβων στο CDR-H1/ Αντισώματα CDR-H2 κατηγορίας 1/RBS-A. Είναι σημαντικό ότι αυτός ο επίτοπος ήταν πιο εύκολα προσβάσιμος στην ανοικτή κατάσταση και στην κατάσταση πρόγχυσης ή στα κατασκευάσματα ακίδας που έχουν σταθεροποιηθεί με εξαπρολίνη (6Ρ), σε σύγκριση με τα κατασκευάσματα διπρολίνης (2Ρ). Συνολικά, το S728-1157 επιδεικνύει ευρύ θεραπευτικό δυναμικό και μπορεί να ενημερώσει τους σχεδιασμούς εμβολίων με γνώμονα τους στόχους έναντι μελλοντικών παραλλαγών SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Εισαγωγή

Από την έναρξη της πανδημίας τον Δεκέμβριο του 2019, ο ιός του κοροναϊού 2 (SARS-CoV-2) του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου έχει οδηγήσει σε πάνω από 660 εκατομμύρια περιπτώσεις νόσου του κορωνοϊού το 2019 (COVID-19) και σε πάνω από 6,5 εκατομμύρια θανάτους παγκοσμίως. Αν και η ταχεία ανάπτυξη και διανομή εμβολίων και θεραπευτικών φαρμάκων έχει περιορίσει την επίδραση του COVID-19 σε μεγάλο βαθμό, η εμφάνιση κυκλοφορούντων παραλλαγών ανησυχίας (VOCs) εξακολουθεί να αποτελεί σημαντική απειλή λόγω της πιθανότητας περαιτέρω ανοσοδιαφυγής και αυξημένη παθογένεια. Η παραλλαγή D614G ήταν η παλαιότερη παραλλαγή που εμφανίστηκε και έγινε παγκοσμίως διαδεδομένη στη συνέχεια. Σε σύγκριση με το WT, η παραλλαγή D614G επέδειξε αυξημένη μεταδοτικότητα παρά αυξημένη παθογένεια και επομένως ήταν απίθανο να μειώσει την αποτελεσματικότητα των εμβολίων σε κλινικές δοκιμές (1). Μεταξύ της εμφάνισης του D614G έως τον Οκτώβριο του 2021, 4 επιπλέον σημαντικές πτητικές οργανικές ενώσεις εξελίχθηκαν παγκοσμίως, συμπεριλαμβανομένων των Alpha, Beta, Gamma και Delta. Μεταξύ αυτών των παραλλαγών, το Delta έγινε μια σοβαρή παγκόσμια απειλή λόγω της μεταδοτικότητάς του, της αυξημένης σοβαρότητας της νόσου και της μερικής ανοσοδιαφυγής, όπως φαίνεται από τη μειωμένη ικανότητα του πολυκλωνικού ορού και των mAbs να εξουδετερώνουν αυτό το στέλεχος (2-6). Λίγο αργότερα, τον Νοέμβριο του 2021, η παραλλαγή Omicron αναγνωρίστηκε και ανακοινώθηκε ως νέα VOC. Αυτή η παραλλαγή διέθετε τον μεγαλύτερο αριθμό μεταλλάξεων μέχρι σήμερα και φάνηκε να εξαπλώνεται πιο γρήγορα από τα προηγούμενα στελέχη (7, 8). Επί του παρόντος, υπάρχει ένα ευρύ φάσμα υπογραμμών Omicron που οδηγούν σε νέα κρούσματα COVID{-19, με τα BQ.1, BQ.1.1 και XBB.1.5 να κυριαρχούν έναντι του BA.5 και να αντιπροσωπεύουν τις περισσότερες νέες περιπτώσεις παγκοσμίως εκείνη την εποχή της γραφής. Οι παραλλαγές Omicron μπορούν να αποφύγουν την αναγνώριση από την ανοσία που σχετίζεται με το εμβόλιο COVID-19 σε διάφορους βαθμούς, μειώνοντας έτσι σημαντικά την εξουδετερωτική ισχύ των αντισωμάτων ορού από αναρρώνοντα, πλήρως εμβολιασμένα με mRNA άτομα και άτομα ενισχυμένα με το νέο δισθενές WT/BA.5 Εμβόλιο mRNA (9, 10). Ομοίως, οι παραλλαγές του Omicron μπόρεσαν να ξεφύγουν από τη δέσμευση πολλών θεραπευτικών mAbs με έγκριση χρήσης έκτακτης ανάγκης (EUA), παρόλο που αυτά είχαν προηγουμένως αποδειχθεί αποτελεσματικά έναντι των προηγούμενων VOCs (10-12). Λόγω της μειωμένης εξουδετέρωσης έναντι του Omicron και της συνεχιζόμενης απειλής μελλοντικών πτητικών οργανικών ενώσεων, υπάρχει επείγουσα ανάγκη εντοπισμού ευρειών και ισχυρών εξουδετερωτικών αντισωμάτων που μπορούν να προστατεύσουν από διάφορες, εξελισσόμενες γενεαλογίες SARS-CoV-2. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε ένα ισχυρό mAb που αντιδρά στον τομέα δέσμευσης υποδοχέα (αντιδραστικό με RBD) από το περιφερικό αίμα ενός ατόμου SARS-CoV-2-ανάρρων που εξουδετέρωσε αποτελεσματικά τα Alpha, Beta, Kappa, Delta, Mu, και παραλλαγές Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 και XBB). Αυτό το mAb, S728-1157, μείωσε σημαντικά τα ιικά φορτία BA.1 Omicron, Delta και WT στους πνεύμονες και τον ρινικό βλεννογόνο μετά από πρόκληση in vivo σε χάμστερ. Το S728-1157 δεσμεύει τη θέση δέσμευσης υποδοχέα (RBS) που είναι πλήρως εκτεθειμένη όταν η RBD στην ακίδα είναι στην επάνω διαμόρφωση. Το mAb χρησιμοποιεί μοτίβα που βρίσκονται σε CDR-H1 και CDR-H2 που είναι κοινά στα αντισώματα IGHV3-53/3-66 κατηγορίας 1/RBS-A (13, 14), αλλά και μέσω εκτεταμένων μοναδικών επαφών με CDR -H3 για την παράκαμψη μεταλλάξεων στις αιχμές των VOCs. Αυτό υποδηλώνει ότι ο ορθολογικός σχεδιασμός των μελλοντικών ενισχυτικών εμβολίων που καλύπτουν παραλλαγές Omicron θα πρέπει να τροποποιηθεί για να παρουσιάσει μια σταθεροποιημένη ακίδα στην ως επί το πλείστον επάνω διαμόρφωση για να προκληθούν βέλτιστα mAbs κατηγορίας 1/RBS-A που έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά CDR-H3.

Οφέλη από το cistanche-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Αποτελέσματα

Απομόνωση αντιδρώντων στο RBD mAbs που εμφανίζουν διαφορετικά μοτίβα εξουδετέρωσης και ισχύος. Πριν από την εξάπλωση των σειρών Omicron, χαρακτηρίσαμε προηγουμένως 43 mAbs που στοχεύουν διακριτούς επιτόπους στην πρωτεΐνη ακίδας, συμπεριλαμβανομένου του Ν-τερματικού τομέα (NTD), του RBD και της υπομονάδας 2 (S2). Κανένα από αυτά τα αντισώματα δεν μπόρεσε να εξουδετερώσει τις παραλλαγές SARS-CoV-2 που κυκλοφορούσαν εκείνη τη στιγμή (15). Σε αυτή τη μελέτη, ένα πρόσθετο πάνελ από mAbs που αντιδρούν στο RBD εκφράστηκαν από 3 άτομα υψηλής απόκρισης που παρουσίασαν ισχυρές αποκρίσεις IgG κατά της ακίδας, όπως ορίστηκε προηγουμένως (16) (Συμπληρωματικοί πίνακες 1 και 3, συμπληρωματικό υλικό διαθέσιμο στο διαδίκτυο με αυτό το άρθρο. https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Αν και το ποσοστό των Β-λεμφοκυττάρων που δεσμεύονταν με ακίδα ήταν παρόμοιο σε άτομα με υψηλή ανταπόκριση σε σύγκριση με μεσαίας και χαμηλής ανταπόκρισης (Εικόνα 1, A-C), τα ποσοστά σωματικής υπερμετάλλαξης βαριάς αλυσίδας ήταν σημαντικά μεγαλύτερα στην ομάδα υψηλής ανταπόκρισης (Εικόνα 1 , D, και E), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα άτομα μπορεί να έχουν τη μεγαλύτερη δυνατότητα να δημιουργήσουν ισχυρά διασταυρούμενα αντιδραστικά mAbs (16). Αυτά τα αντισώματα διερευνήθηκαν περαιτέρω έναντι μεταλλαγμάτων RBD για να προσδιοριστούν οι ταξινομήσεις επιτόπων τους (17). Μεταξύ 14 mAbs που αντιδρούν με RBD, εντοπίσαμε 4 mAbs τάξης 2, 2 mAbs κατηγορίας 3 και 8 μη ταξινομημένα mAbs που έδειξαν μικρή έως καθόλου μείωση στη δέσμευση έναντι οποιωνδήποτε βασικών μεταλλαγμάτων RBD που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 1F). Πρέπει να σημειωθεί, τα αντισώματα κατηγορίας 2, κατηγορίας 3 και κατηγορίας 4 αντιστοιχούν περίπου στους επίτοπους RBS BD, S309 και CR3022 που ορίστηκαν σε προηγούμενες μελέτες (13, 18). Τα mAbs RBD κατηγορίας 2 και 3 δεν αναγνώρισαν ένα πολυπαραλλαγμένο μετάλλαγμα RBD που περιέχει υποκαταστάσεις K417N/E484K/L452R/N501Y, ένα τεχνητά σχεδιασμένο RBD για να περιλαμβάνει βασικές μεταλλάξεις για διαφυγή ιού (17, 18), ούτε έδειξαν κάποια διασταυρούμενη αντιδραστικότητα στο RBD του SARS-CoV-1 και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS)-CoV (Εικόνα 1ΣΤ). Λειτουργικά, τα mAbs RBD κατηγορίας 2 και 3 εξουδετέρωσαν δυναμικά τις παραλλαγές D614G και Delta, αλλά η εξουδετερωτική δραστηριότητα ήταν πιο περιορισμένη έναντι των Beta, Kappa και Mu (Εικόνα 1G). Κανένα από τα αντισώματα κατηγορίας 2 ή 3 που αναλύθηκαν δεν εξουδετέρωσε οποιαδήποτε δοκιμασμένη παραλλαγή Omicron.

Αντίθετα, η πλειονότητα των μη ταξινομημένων mAbs δεσμεύτηκε στην πολυμεταβλητή RBD και αντέδρασε διασταυρούμενη στον SARS-CoV-1 RBD (Εικόνα 1ΣΤ). Μεταξύ αυτών, εντοπίσαμε 3 mAbs, S451-1140, S626-161 και S728-1157, τα οποία έδειξαν υψηλή ισχύ εξουδετέρωσης έναντι του D614G και των εξουδετερωμένων Beta, Delta, Kappa, Mu και Omicron BA.1 με 99% ανασταλτική συγκέντρωση (IC99) στην περιοχή από 20–2.500 ng/mL (Εικόνα 1G). Δεδομένης της ευρείας ισχύος εξουδετέρωσης αυτών των 3 mAbs, εκτός από την πλατφόρμα ανάλυσης πλάκας, πραγματοποιήσαμε επίσης τη δραστηριότητα εξουδετέρωσης έναντι των αυθεντικών BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, Ιοί BA.5 και XBB χρησιμοποιώντας δοκιμή εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης (FRNT) (Εικόνα 1G). Από αυτά, το S728-1157 εμφάνισε υψηλές δραστηριότητες εξουδετέρωσης έναντι του πίνακα των παραλλαγών της Omicron, συμπεριλαμβανομένων των BA.1, BA.2, BA.4 και BA.5, με IC99 έως 100 ng/mL, όπως μετρήθηκε με δοκιμασία πλάκας. Ένα παρόμοιο σενάριο παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας το FRNT, όπου το S728-1157 διατήρησε την υψηλή του δραστηριότητα εξουδετέρωσης έναντι BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 και XBB με IC50 στην περιοχή 8–300 ng /mL (Εικόνα 1G). Το S{44}} εξουδετέρωσε δυναμικά τα BA.1, BA.2, BA.2.75 και BL.1, αλλά όχι τα BA.4 και BA.5, όπως παρατηρήθηκε και στις δύο πλατφόρμες ανάλυσης εξουδετέρωσης. Από την άλλη πλευρά, το S626-161 δεν έδειξε εξουδετερωτική δραστηριότητα έναντι παραλλαγών Omicron πέρα ​​από την παραλλαγή BA.1 (Εικόνα 1G). Παρόλο που το S626-161 είχε χαμηλότερη ισχύ εξουδετέρωσης έναντι των δοκιμασμένων VOC από τα άλλα 2 αντισώματα, ήταν το μόνο mAb που έδειξε διασταυρούμενη αντιδραστικότητα όχι μόνο στο SARS CoV-1 RBD αλλά ήταν επίσης σε θέση να εξουδετερώσει τη νυχτερίδα κορωνοϊοί WIV-1 και RsSHC014 (Εικόνα 1, F και G). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το S626-161 αναγνωρίζει έναν διατηρημένο επίτοπο που μοιράζεται μεταξύ αυτών των γραμμών αρβοϊών, αλλά απουσιάζει στα BA.2 και μεταγενέστερα στελέχη. Επιπλέον, σε σύγκριση με τα S728-1157 και S{451-1140, το S626-161 έχει μεγαλύτερο CDR-H3 που θα μπορούσε να παρέχει μια βελτιωμένη ικανότητα αναγνώρισης ενός εξαιρετικά διατηρημένου τμήματος υπολειμμάτων που μοιράζονται μεταξύ των αρβοϊών, όπως περιγράφεται σε προηγούμενη μελέτη (19) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Κατά τη σύγκριση των μεταβλητών γονιδίων ανοσοσφαιρίνης βαριάς (IGHV) και ελαφριάς αλυσίδας (IGLV ή IGKV) αυτών των 3 mAbs με τη διαθέσιμη βάση δεδομένων mAbs εξουδετέρωσης του SARS-CoV{73} (13, 15, 20-27), βρήκαμε ότι η βαριά αλυσίδα μεταβλητά γονίδια που χρησιμοποιούνται από τα S728-1157 (IGHV{3-66), S451-1140 (IGHV{3-23) και S626-161 (IGHV{4-39) έχουν έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι κωδικοποιεί αρκετά ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα SARS-CoV-2 που στοχεύουν το RBD (21, 22, 28, 29). Ωστόσο, μόνο το S728-1157 είχε μοναδικά ζεύγη μεταβλητών γονιδίων βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας που δεν έχουν αναφερθεί στη βάση δεδομένων (Συμπληρωματικός Πίνακας 3), υποδεικνύοντας ότι δεν είναι δημόσιος κλωνότυπος.

Σχήμα 1. Χαρακτηρισμός των αντιδρώντων στο RBD mAbs που απομονώθηκαν από άτομα με COVID-19-ανάρρωση

Αυτά τα 3 mAbs (S451-1140, S626-161 και S728-1157) χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω για τον προσδιορισμό του εύρους δέσμευσής τους έναντι των πτητικών οργανικών ενώσεων SARSCoV-2 (Εικόνα 2, Α και Β) . Η ακίδα σταθεροποιημένης με πρόγχυση που περιέχει 2-υποκαταστάσεις προλίνης στην υπομονάδα S2 (2P, διπρολίνη) έχει αποδειχθεί ότι είναι ανώτερο ανοσογόνο σε σύγκριση με την ακίδα WT και αποτελεί τη βάση αρκετών σημερινών SARS-CoV-2 εμβόλια, συμπεριλαμβανομένων των εμβολίων που βασίζονται σε mRNA (30, 31). Πιο πρόσφατα, η πρωτεΐνη ακίδας σταθεροποιημένη με 6 προλίνες (6Ρ, εξαπρολίνη) αναφέρθηκε ότι ενισχύει την έκφραση και είναι ακόμη πιο σταθερή από το αρχικό κατασκεύασμα διπρολίνης. ως αποτέλεσμα, έχει προταθεί για χρήση στην επόμενη γενιά εμβολίων COVID-19 (32, 33). Για να προσδιοριστεί εάν υπάρχουν διαφορές αντιγονικότητας μεταξύ των κατασκευών ακίδας διπρολίνης και εξαπρολίνης, και τα δύο ανοσογόνα συμπεριλήφθηκαν στο δοκιμαστικό μας πάνελ. Όπως μετρήθηκε με ELISA, βρήκαμε ότι 3 mAbs δέσμευαν το αντιγόνο ακίδας 6P-WT σε μεγαλύτερο βαθμό σε σύγκριση με την ακίδα WT-2P (Εικόνα 2, Α και Β). Και τα 3 mAbs έδειξαν συγκρίσιμη δέσμευση με τις αιχμές των ιών Άλφα, Βήτα, Γάμμα και Δέλτα, σε σχέση με εκείνη του WT-2P (Εικόνα 2, Α και Β). Ωστόσο, η αντιδραστικότητα δέσμευσης αυτών των 3 mAbs μειώθηκε ουσιαστικά έναντι ενός πίνακα αντιγόνων της οικογένειας Omicron (Εικόνα 2, Β, και C). Η δέσμευση S{31}} ήταν ευαίσθητη σε μεταλλάξεις που βρέθηκαν στα BA.1 και BA.2, με αποτέλεσμα μεγάλη μείωση στη δέσμευση και 31-πλάσια μείωση στην εξουδετέρωση έναντι αυτών των παραλλαγών σε σύγκριση με το WT-2 Αντιγόνο P και ιός D614G, αντίστοιχα (Εικόνα 2Β). Το mAb εξουδετέρωσης διασταυρούμενου σαρμπεκοϊού, S626-161, έδειξε επίσης 1.2- έως 3.5-πλάσια μειωμένη σύνδεση στο αντιγόνο BA.1 της ακίδας, το οποίο μπορεί να ευθύνεται για ένα {{45} }πλάσια μείωση της δραστηριότητας εξουδετέρωσης έναντι του BA.1 (Εικόνα 1G και Εικόνα 2, Β και Γ). Για το πιο ισχυρό ευρέως εξουδετερωτικό αντίσωμα (bnAb), S728-1157, η δέσμευση με τα αντιγόνα Omicron μειώθηκε σε μικρότερο βαθμό (που κυμαίνεται από 1.1- έως 4.4-φορές) σε σύγκριση με Το WT-2P αυξήθηκε και δεν επηρεάστηκε στη δραστηριότητα εξουδετέρωσης (Εικόνα 1G και Εικόνα 2, B και C). Η σημαντική μείωση στη δέσμευση του mAb που εξουδετερώνει το Omicron στην ακίδα BA.1 μπορεί να οφείλεται σε αλλαγές στην κινητικότητά του και σχετίζεται με τη σφιχτή συσκευασία των δομών Omicron 3-RBD-down και προτίμηση για 1- αυξάνουν την RBD που βοηθούν στην αποφυγή αντισωμάτων, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη μελέτη (34). Οι σταθεροποιητικές μεταλλάξεις 2P και 6P έχουν επίσης διαφορικά αποτελέσματα στις παραλλαγές Omicron όπου και τα 3 mAbs έδειξαν πάνω από 2.8-πλάσια αυξημένη δέσμευση στην ακίδα BA.1-6P σε σύγκριση με την BA.1-2P. έκδοση, αλλά μόνο οριακά αυξήθηκε η σύνδεση με τις εκδόσεις ακίδας BA.2 και BA.4/5 6P σε σύγκριση με τις εκδόσεις 2P τους κατά 1,2 × έως 1,4 ×, υποδηλώνοντας ελαφρώς καλύτερη προσβασιμότητα των mAb που εξουδετερώνουν το Omicron στις εξαπολικές εκδόσεις, ειδικά για την κατασκευή της ακίδας BA.1. Εκτός από την ELISA, η συμβολομετρία βιοστιβάδων (BLI) χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ρυθμού δέσμευσης και των σταθερών ισορροπίας (kon, koff και KD) αυτών των 3 mAbs σε μια ομάδα αντιγόνων ακίδας (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Οι ρυθμοί αναγνώρισης kon της δέσμευσης του θραύσματος αντιγόνου (Fab) στις αιχμές της εξαπρολίνης ήταν 1.5- έως 3.3-διπλώνονται ταχύτερα σε σύγκριση με τις αιχμές διπρολίνης (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, Β και Γ), δείχνοντας ότι τα αντισώματα που συνδέονται με το κατασκεύασμα 6Ρ πιο γρήγορα από το κατασκεύασμα 2Ρ. Αυτό μπορεί να ήταν αναμενόμενο εάν οι επίτοποι ήταν πιο προσιτοί στο RBD σε ανοιχτή κατάσταση στην ακίδα εξαπρολίνης. Εκτός από το S{626- 161, τα Fabs διαχωρίστηκαν από την ακίδα της εξαπρολίνης πιο αργά (είχε χαμηλότερο koff) από την ακίδα της διπρολίνης, έτσι ώστε το συνολικό KD έδειξε ότι το S728-1157 και το S451-1140 δεσμεύονταν σε η ακίδα εξαπρολίνης με μεγαλύτερη συγγένεια (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, Β και Γ). Η αύξηση στη δέσμευση στην ακίδα εξαπρολίνης ήταν ακόμη πιο αξιοσημείωτη για ανέπαφη IgG από το μοντέλο αλληλεπίδρασης 1:2 όπως φαίνεται από τα S728-1157 και S451- 1140 mAbs, σύμφωνα με την έκθεση πολλαπλών επιτόπων με σταθεροποίηση 6P που επιτρέπει βελτιωμένη απληστία (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, Α και Γ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι στοχευόμενοι επίτοποι μπορεί να είναι συγκριτικά πιο προσιτοί στην ακίδα που έχει σταθεροποιηθεί με 6P όταν το RBD βρίσκεται σε ανοιχτή κατάσταση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν δομικές αναλύσεις για να επαληθευτεί αυτή η εικασία.

Σχήμα 2. Εύρος σύνδεσης mAbs που εξουδετερώνουν το Omicron

Δομική ανάλυση ευρείας εξουδετέρωσης mAbs. Ως πρώτη προσέγγιση των δεσμευμένων επιτόπων, χρησιμοποιήθηκε μια δοκιμασία ανταγωνισμού ELISA για να προσδιοριστεί εάν αυτά τα 3 ευρέως εξουδετερωτικά mAbs είχαν κάποια επικάλυψη με το τρέχον πάνελ mAbs μας, μια συλλογή mAbs με γνωστές ειδικότητες επιτόπου από προηγούμενες μελέτες (15, 25, 35). , και 2 άλλα mAbs σε κλινική χρήση, το LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) και το REGN10933 (Regeneron) (37). Οι θέσεις δέσμευσης των S451-1140 και S{728-1157 επικαλύπτονταν εν μέρει με το CC12.3 (23, 25), ένα εξουδετερωτικό αντίσωμα κατηγορίας 1 και τα περισσότερα αντισώματα κατηγορίας 2, συμπεριλαμβανομένων των LY-CoV555 και REGN10933, αλλά όχι με αντισώματα κατηγορίας 3 και κατηγορίας 4 (Εικόνα 3Α). Το S626-161 μοιράστηκε μια αξιοσημείωτη επικάλυψη στην περιοχή δέσμευσης με CC12.3 κατηγορίας 1, αρκετά αντισώματα κατηγορίας 4, συμπεριλαμβανομένου του CR3022, και άλλα μη ταξινομημένα αντισώματα, ενώ είχε κάποια μερική επικάλυψη με πολλά αντισώματα κατηγορίας 2 και ένα μόνο αντισώματα κατηγορίας 3 (Εικόνα 3Α). Αντίστοιχα, μια δοκιμασία BLI ανταγωνισμού αποκάλυψε ότι τα S451-1140 και S728-1157 ανταγωνίζονται έντονα μεταξύ τους για τη σύνδεση με την ακίδα WT-6P, ενώ η S626-161 όχι (Συμπληρωματικό σχήμα 3). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα S451-1140 και S728-1157 αναγνωρίζουν παρόμοιους επιτόπους που διαφέρουν από τον S626-161.

Εικόνα 3. Μηχανισμός ευρείας εξουδετέρωσης του S728-1157

Το αντίσωμα S728-1157 κωδικοποιήθηκε από IGHV3-66 και διέθετε μια σύντομη περιοχή προσδιορισμού συμπληρωματικότητας 3 (CDR-H3). Συγκεκριμένα, τα mAbs που δεσμεύουν το RBS στον τρόπο δέσμευσης 1 (δηλ. θέση RBS-A ή κατηγορίας 1), που χαρακτηρίζονται από CC12.1, CC12.3, B38 και C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), τείνουν να χρησιμοποιούν IGHV3-53 ή 3-66 και είναι ευαίσθητοι σε μεταλλάξεις VOC (40). Ωστόσο, η περιοχή CDR-H3 του S728-1157 είναι πολύ διακριτή από άλλα αντισώματα αυτής της κατηγορίας, γεγονός που πιθανώς ευθύνεται για την ευρύτερη δραστηριότητά της. Για να κατανοήσουμε τη δομική βάση της ευρείας εξουδετέρωσης από S728-1157 σε αυτόν τον επίτοπο, επιλύσαμε μια δομή κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας (cryo-EM) (Εικόνα 3Β) του IgG S728-1157 σε σύμπλοκο με ακίδα WT{ {31}}P-Mut7, μια έκδοση της ακίδας WT-6P που διαθέτει έναν ενδοπρωτομερή δισουλφιδικό δεσμό στα C705 και C883, σε συνολική ανάλυση περίπου 3,3 Å (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Ε). Χρησιμοποιώντας μεθόδους επέκτασης συμμετρίας, εστιασμένης ταξινόμησης και βελτίωσης, επιτύχαμε τοπική ανάλυση στη διεπαφή RBD-Fv σε περίπου 4 Å (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Ε και Συμπληρωματικός Πίνακας 8). Μια κρυσταλλική δομή του S{44}} Fab προσδιορίστηκε σε ανάλυση 3,1 Å και χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του ατομικού μοντέλου στη διεπαφή RBD-Fv. Οι δομές μας επιβεβαιώνουν ότι το S{48}} δέσμευε τον επίτοπο RBS-A (ή κατηγορία 1) στη διαμόρφωση RBD-up (Εικόνα 3Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 4Ε), παρόμοια με άλλα IGHV3-53/{{55} } αντισώματα (Εικόνα 3Γ). Η στερική απόφραξη της θέσης δέσμευσης του μετατρεπτικού ενζύμου 2 (ACE2) της αγγειοτενσίνης από το S728-1157 εξηγεί την υψηλή του ισχύ εξουδετέρωσης έναντι του SARS-CoV{-2. Το μοτίβο 32NY33 και το μοτίβο 53SGGS56 (23) στο S{68}} CDR-H1 και -H2 αλληλεπιδρούν με το RBD σχεδόν με τον ίδιο τρόπο όπως το CC12.3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 4, B και C). Ωστόσο, σε σύγκριση με το VH 98DF99 στο CC12.3, το VH 98DY99 στο S728-1157 CDR-H3 σχηματίζει πιο εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων τόσο υδρόφοβων όσο και πολικών αλληλεπιδράσεων, με το RBD, το οποίο μπορεί να ευθύνεται για την ευρεία εξουδετέρωση έναντι των VOC (Εικόνα τρισδιάστατοι και συμπληρωματικοί πίνακες 6 και 7). Η διγλυκίνη VH 100GG101 στο S728- 1157 CDR-H3 μπορεί επίσης να διευκολύνει πιο εκτεταμένη δέσμευση σε σύγκριση με το VH Y100 στο CC12.3, πιθανότατα λόγω της ευελιξίας στα υπολείμματα γλυκίνης που οδηγούν σε διαφορετική διαμόρφωση του άκρου του CDR -Η3 βρόχος και σχετική μετατόπιση υπολειμμάτων στο 98DY99.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Παρόλο που τα Omicron VOCs έχουν εκτεταμένες μεταλλάξεις στο RBD, τα περισσότερα από αυτά τα υπολείμματα δεν αλληλεπιδρούν με το S728-1157, καθώς η δέσμευση εξακολουθεί να παρατηρείται (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Α). Από το μοντέλο μας ακίδα WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157, το Y505 έως το VL Q31 και το E484 έως το VH Y99 προβλέπεται να δημιουργήσουν δεσμούς υδρογόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 4D και Συμπληρωματικός Πίνακας 6 ), τα οποία έχουν τη δυνατότητα να διαταραχθούν από τις μεταλλάξεις Omicron Y505H και E484A. Ωστόσο, μια μετάλλαξη Y505H θα επέτρεπε ακόμα έναν δεσμό υδρογόνου με το VL Q31 και μια μετάλλαξη E484A θα προσθέσει μια άλλη υδρόφοβη πλευρική αλυσίδα κοντά στα υδρόφοβα υπολείμματα VL Y99, F456 και Y489. Αυτές οι επαφές μπορεί να εξηγούν, εν μέρει, τον μηχανισμό που επιτρέπει στο S728-1157 να διατηρεί την εξουδετερωτική δραστηριότητα, αν και μειωμένη, έναντι του αντιγόνου BA.1 της ακίδας (Εικόνα 1G και Εικόνα 2Β). Το αντιγόνο BA.1, με τη σειρά του, πιθανώς σχετίζεται με τις μεταλλάξεις Omicron που μεταβάλλουν το διαμορφωτικό τοπίο της πρωτεΐνης ακίδας (34). Ωστόσο, αρκετά σωματικά μεταλλαγμένα υπολείμματα, π.χ., VH L27, L28, R31, F58 και VL V28 και Q31, στο S728-1157 εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με τον SARS-CoV-2 RBD (Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και Συμπληρωματικός Πίνακας 7), το οποίο μπορεί επίσης να συμβάλει στην ευρεία αντιδραστικότητά του σε σύγκριση με το CC12.3. Συνολικά, οι δομικές μας μελέτες αποκάλυψαν τη βάση της ευρείας εξουδετέρωσης του S728-1157 που μπορεί να φιλοξενήσει τις περισσότερες μεταλλάξεις στους SARS-CoV-2 VOCs.

Εικόνα 4. Προστατευτική αποτελεσματικότητα των bnAbs έναντι της μόλυνσης από SARS-CoV-2 σε χάμστερ.

Το S728-1157 μειώνει την αναπαραγωγή του SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta και WT SARS-CoV-2 σε συριακά χάμστερ. Για να αξιολογήσουμε την προστατευτική αποτελεσματικότητα των ευρέως εξουδετερωτικών mAb μας, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο μόλυνσης από χρυσό συριακό χάμστερ που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον SARS-CoV-2. Τα χάμστερ έλαβαν 5 mg/kg των δοκιμαστικών μας mAbs ή έναν ισοτύπο ελέγχου που στοχεύει ένα άσχετο αντιγόνο (γλυκοπρωτεΐνη ιού εμβολαίου) μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης 1 ημέρα μετά τη μόλυνση με ιούς SARS CoV{10}}. Οι ιστοί του πνεύμονα και της μύτης συλλέχθηκαν 4 ημέρες μετά τη μόλυνση (Εικόνα 4Α). Η θεραπευτική χορήγηση του S728-1157 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένους τίτλους των παραλλαγών WT, BA.1 Omicron και Delta τόσο στους ρινικούς κόγχους όσο και στους πνεύμονες των μολυσμένων χάμστερ (Εικόνα 4, B-D). Είναι ενδιαφέρον ότι η επίδραση του S728-1157 στους πνεύμονες ήταν δραματική, μειώνοντας τα ιικά φορτία WT και BA.1 Omicron κατά περίπου 104PFU, με τους ιικούς τίτλους της παραλλαγής BA.1 Omicron να έχουν πλήρως καταργηθεί (Εικόνα 4Γ). Σε αντίθεση με την εξουδετέρωση in vitro (Εικόνα 1G), το S451-1140 δεν μείωσε την αντιγραφή του ιού BA.1 Omicron στους πνεύμονες και τους ρινικούς κόγχους, υποδεικνύοντας αποσύνδεση μεταξύ εξουδετέρωσης in vitro και προστασίας in vivo για αυτόν τον κλώνο (Εικόνα 4Ε) . Συγκριτικά, η χορήγηση S626-161 οδήγησε σε οριακά σημαντικές μειώσεις στους τίτλους του ιού του πνεύμονα μετά την πρόκληση WT και BA.1 (Εικόνα 4, F και G). Αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν ότι, για τον ακριβή ορισμό των ευρέως προστατευτικών mAb, απαιτείται αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας προστασίας παράλληλα με τη δραστηριότητα εξουδετέρωσης. Προχωρώντας προς τα εμπρός, θα είναι ενδιαφέρον να εξετάσουμε σε ποιο βαθμό η προστατευτική ικανότητα του S728-1157 εξαρτάται από το Fc. Συνολικά, το S728-1157 αντιπροσωπεύει ένα πολλά υποσχόμενο mAb με ευρεία αποτελεσματικότητα εξουδετέρωσης έναντι των παραλλαγών SARS CoV-2 που είναι ικανές να μειώσουν δραματικά την αναπαραγωγή WT, Delta και BA.1 in vivo.

Η λοίμωξη SARS-CoV-2 σπάνια προκαλεί ισχυρά mAbs που εξουδετερώνουν τα S728-1157. Δεδομένης της διασταυρούμενης εξουδετέρωσης και της προφυλακτικής δυνατότητας του S728-1157, προσπαθήσαμε να αξιολογήσουμε εάν τα αντισώματα τύπου S728-1157 προκαλούνται συνήθως μεταξύ των πολυκλωνικών αποκρίσεων σε ασθενείς με SARS-CoV-2. Για να αξιολογηθεί αυτό, πραγματοποιήσαμε ELISA ανταγωνισμού χρησιμοποιώντας ορό ανάρρωσης για να ανιχνεύσουμε τίτλους αντισωμάτων κατά της RBD που θα μπορούσαν να ανταγωνιστούν για δέσμευση με S728-1157 (Εικόνα 5Α). Τα άτομα χωρίστηκαν σε 3 ομάδες με βάση το μέγεθος των αποκρίσεων αντισωμάτων, όπως ορίστηκε προηγουμένως (15, 16). Αν και τα άτομα με υψηλή και μέτρια ανταπόκριση είχαν υψηλότερους τίτλους S728-1157–ανταγωνιστικών αντισωμάτων ορού σε σύγκριση με χαμηλής ανταπόκρισης (Εικόνα 5Β), οι τίτλοι ήταν αρκετά χαμηλοί σε όλες τις ομάδες, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι ασυνήθιστο να αποκτηθούν υψηλά επίπεδα S{{ 18}}–όπως αντισώματα σε πολυκλωνικό ορό μετά από λοίμωξη από WT SARS-CoV-2. Εκτός από το S728-1157, δοκιμάσαμε τον ανταγωνισμό του ορού ανάρρωσης με άλλα mAbs, συμπεριλαμβανομένων των S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 και CC12.3. Παρόμοια με το S728-1157, παρατηρήσαμε σχετικά χαμηλούς τίτλους αντισωμάτων που ανταγωνίζονται τα S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 και CC12.3 στον πολυκλωνικό ορό από το μεγαλύτερο μέρος των ανάρρων άτομα (Εικόνα 5, C–F και H). Παρ' όλα αυτά, τα άτομα με υψηλή απόκριση έτειναν να έχουν σημαντικά υψηλότερους τίτλους έναντι αυτών που εξουδετερώνουν τα mAb από τα άτομα με χαμηλή απόκριση (Εικόνα 5, B-F και H). Αντίθετα, τα αντισώματα που στοχεύουν τη θέση του επιτόπου CR3022 ήταν πιο έντονα σε άτομα που αναρρώνουν, υποδηλώνοντας τον εμπλουτισμό των αντισωμάτων RBD κατηγορίας 4 σε πολυκλωνικό ορό (Εικόνα 5G). Σημειωτέον, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στους τίτλους του CR3022 στις 3 ομάδες που ανταποκρίθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αντισώματα της θέσης CR{45}προκαλούνταν σταθερά κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από WT SARS-CoV-2 στα περισσότερα άτομα. Είναι ενδιαφέρον ότι σε σύγκριση με το CC12.3, το S728-1157 ανιχνεύθηκε σε 4-πλάσια χαμηλότερα επίπεδα στον ορό των ατόμων με υψηλή απόκριση. Έτσι, παρά το γεγονός ότι τα αντισώματα κατηγορίας 1 προκαλούνται συχνά από φυσική μόλυνση και εμβολιασμό (14, 20, 28, 29, 41-43), τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι αντισώματα τύπου S728-1157 που αντιπροσωπεύουν ένα υποσύνολο αυτής της κατηγορίας είναι συγκριτικά σπάνια.

Επιπρόσθετα, εξετάσαμε τη διαφορά στην αντιδραστικότητα σε 2P έναντι σταθεροποιημένης με 6P ακίδα στους ορούς αναρρώμενης κοόρτης μας (Εικόνα 5, I–K). Διαπιστώσαμε ότι και οι 3 ομάδες ανταποκρινόμενων τοποθέτησαν αντιδραστικά αντισώματα κατά της ακίδας WT σταθεροποιημένης με 6P σε μεγαλύτερο βαθμό από τη σταθεροποιημένη με 2P ακίδα WT, κατά συντελεστή 6 έως 11 φορές (Εικόνα 5J), υποδεικνύοντας ότι η Οι κύριοι αντιγονικοί επίτοποι εμφανίστηκαν καλύτερα ή σταθεροποιήθηκαν σε 6Ρ-σταθεροποιημένο αντιγόνο. Χρησιμοποιώντας τα ίδια δείγματα, οι ανταποκριτές υψηλής και μέτριας έντασης είχαν επίσης χαμηλότερους τίτλους αντισωμάτων κατά της ακίδας κατά του BA.1-2P από το BA.{18}}P, κατά 4-έως-5-πλάσιο (Εικόνα 5K). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι χαμηλές ανταποκρίσεις είχαν μικρότερη αλλαγή πτυχής στην αντιδραστικότητα δέσμευσης έναντι της ακίδας BA.1 Omicron-2P και 6P (2-μείωση φορές) σε σύγκριση με την ακίδα WT-2P και 6P ({ {28}}πλάσια μείωση) (Εικόνα 5, J και K), υποδηλώνοντας ότι το αντίσωμα ορού έναντι των επιτόπων που αντιδρούν στο BA.1 Omicron μπορεί να είναι πιο περιορισμένο σε άτομα με χαμηλή ανταπόκριση. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπάρχει βελτιωμένη πολυκλωνική δέσμευση που προκαλείται από φυσική μόλυνση σε ακίδα σταθεροποιημένη με 6P, τόσο για τους ιούς WT όσο και για τους ιούς Omicron.

Τα αντισώματα που μοιάζουν με S728-1157 επάγονται βέλτιστα στο πλαίσιο της υβριδικής ανοσίας. Η πρωτοπαθής λοίμωξη από SARS-CoV-2 χωρίς εμβολιασμό έχει γίνει σπάνια στο τρέχον παγκόσμιο περιβάλλον και αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η ανοσία του SARS-CoV-2 διαφέρει μεταξύ ατόμων με συγκεκριμένο ιστορικό εμβολιασμού/λοίμωξης. Ως αποτέλεσμα, στη συνέχεια προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε ποιες κοινές εκθέσεις, εκτός από τη μόλυνση με WT μόνο με προγονικό SARS-CoV-2, θα επάγουν αποτελεσματικά αντισώματα τύπου S728-1157 στο πλάσμα από μονοσθενή εμβόλια που βασίζονται σε mRNA με και χωρίς προηγούμενη μόλυνση. Λάβαμε το απαραίτητο βιοδείγμα από την ομάδα μελέτης Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), η οποία παρακολουθεί διαχρονικά τους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας από την αρχή της πανδημίας (44). Επιλέξαμε δείγματα πλάσματος από πλήρως ανοσοποιημένους (2 × εμβολιασμένους) συμμετέχοντες στη μελέτη με και χωρίς μόλυνση καθώς και από ενισχυμένους συμμετέχοντες (3 × εμβολιασμένους) με και χωρίς μόλυνση. Επιπλέον, συμπεριλάβαμε επίσης δείγματα από συμμετέχοντες στη μελέτη που είχαν λάβει το δισθενές εμβόλιο mRNA (προγονικό WA1/2020 συν Omicron BA.5) (Εικόνα 6Α και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Οι πρωτοποριακές λοιμώξεις σε συμμετέχοντες που είχαν λάβει αναμνηστικούς εμβολιασμούς εμφανίστηκαν σε μια εποχή που οι γενεαλογίες Omicron είχαν εκτοπίσει όλες τις άλλες γενεαλογίες SARS-CoV-2 στη μητροπολιτική περιοχή της Νέας Υόρκης. Βρήκαμε ότι τα διπλά εμβολιασμένα άτομα είχαν τους χαμηλότερους τίτλους ανταγωνιστικών αντισωμάτων ορού S728-1157 μεταξύ των 5 ομάδων δειγμάτων που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 6Β). Σημειωτέον, αυτά τα επίπεδα ήταν παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν για την ανάρρωση-μη εμβολιασμένη κοόρτη μας (όλοι οι ανταποκρινόμενοι, Εικόνα 5Β). Συγκριτικά, άτομα με ιστορικό φυσικής λοίμωξης, συμπεριλαμβανομένων ατόμων που αναρρώνουν με 2 από τις 3 δόσεις εμβολίου, και άτομα που είχαν παρουσιάσει πρωτοποριακή λοίμωξη και έλαβαν δισθενή αναμνηστική, εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα πρόκλησης S728-1157 σε σύγκριση με μη μολυσμένα αλλά εμβολιασμένα άτομα (Εικόνα 6Β). Αν και η μη μολυσμένη 3-ομάδα δόσης εμφάνισε μόνο μια μη σημαντική αύξηση σε σύγκριση με την 2-ομάδα δόσης, η ζευγαρωμένη ανάλυση ανά τύπο εμβολίου έδειξε ότι οι ομόλογες τρίτες δόσεις BNT162b2 και mRNA-1273 αύξησαν σημαντικά το S{{ 38}}όπως οι τίτλοι αντισωμάτων εξουδετέρωσης κατά 2,72 × και 2,85 ×, αντίστοιχα (Εικόνα 6, C και D). Σημειωτέον, μεταξύ των συμμετεχόντων με 3 συνολικά επαφές με ακίδα με οποιοδήποτε μέσο, ​​οι τίτλοι αντισωμάτων τύπου S{45} ήταν 3 × υψηλότεροι σε ανάρρωσης με διπλά εμβόλια σε σύγκριση με τους τριπλούς εμβολιασμούς χωρίς λοίμωξη, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο SARS-CoV{{ 51}} η μόλυνση προκαλεί βέλτιστα αυτόν τον κλωνότυπο. Μεταξύ των ομάδων υβριδικής ανοσίας, παρατηρήσαμε ότι η πλειονότητα των ενισχυμένων ατόμων με σημαντική ανακάλυψη που έλαβαν τη δόση του δισθενούς αναμνηστικού εμβολίου είχαν οριακά υψηλότερο τίτλο αντισωμάτων S728-1157 σε σύγκριση με τις εμβολιασμένες ομάδες πριν από την ανάρρωσή τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι το S{{53 Ο τίτλος }} πιθανότατα πλησίαζε ένα οροπέδιο μετά από 3 εκθέσεις. Διερευνήσαμε επίσης τους τίτλους των πολυκλωνικών αντισωμάτων που ανταγωνίζονταν τα CC12.3 και CR3022 εκτός από το S728-1157. Όλα τα άτομα εμφάνισαν σχετικά υψηλούς τίτλους CC12.3- και CR3022-όπως αντισώματα, ανεξάρτητα από τον αριθμό και τον τύπο των εκθέσεων (Συμπληρωματικό Σχήμα 5), σε αντίθεση με αυτό που παρατηρήσαμε για το S728-1157- όπως τα αντισώματα. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η λοίμωξη από SARS-CoV{-2 και ο εμβολιασμός mRNA συμβάλλουν αμφότερα στην επαγωγή αντισωμάτων τύπου S{{66}, με τη μόλυνση να παίζει πιο κυρίαρχο ρόλο στα εμβολιασμένα άτομα.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Τέλος, συγκρίνοντας τις αποκρίσεις έναντι της σταθεροποιημένης αιχμής 2P- έναντι 6P στη κοόρτη εμβολιασμού mRNA, βρήκαμε ότι οι περισσότερες ομάδες προκάλεσαν παρόμοια επίπεδα αντισωμάτων έναντι και των δύο κατασκευών. Η εξαίρεση σε αυτό ήταν η μη μολυσμένη τριπλή-εμβολιασμένη ομάδα, η οποία επέδειξε στατιστικά υψηλότερη, αν και ελαφρώς αυξημένη, αντιδραστικότητα στο 2P σε σύγκριση με τη σταθεροποιημένη με 6P ακίδα (Εικόνα 6Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι σε αντίθεση με τη φυσική μόλυνση (Εικόνα 5, J και Κ), ο εμβολιασμός από μόνος του παράγει μια πολυκλωνική απόκριση που περιορίζεται περισσότερο στους επίτοπους στο κατασκεύασμα Spike-2P, σύμφωνα με το Spike{{12 }}P σκεύασμα των σημερινών εμβολίων. Τελικά, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η σταθεροποίηση 6P των μελλοντικών εμβολίων SARS-CoV-2 θα μπορούσε να αποφέρει σημαντικό όφελος για την πρόκληση κλωνοτύπων αντισωμάτων σε ευρεία κλίμακα, όπως το S728-1157.

Σχήμα 5. Ανταγωνισμός αντισωμάτων ορού αναρρόφησης με ευρέως εξουδετερωτικά αντιδρώντα με RBD mAbs και σύγκριση της απόκρισης αντισωμάτων ορού έναντι αιχμών 6P-σταθεροποιημένων με 2P

Σχήμα 6. Συναγωνισμός αντισωμάτων ορού εμβολιασμένου με mRNA με S{2}} που εξουδετερώνουν RBD-αντιδραστικά mAbs και σύγκριση της απόκρισης αντισώματος ορού έναντι αιχμών σταθεροποιημένων με 6P- έναντι 2Ρ.

Συζήτηση

Σε αυτήν τη μελέτη, προσδιορίζουμε ένα ισχυρό bnAb που απομονώθηκε από ένα κύτταρο Β μνήμης ενός ατόμου που είχε αναρρώσει από λοίμωξη από SARS-CoV-2 κατά το αρχικό κύμα της πανδημίας COVID{-19. Αυτό το bnAb, S728- 1157, διατήρησε ουσιαστική αντιδραστικότητα δέσμευσης και είχε σταθερή εξουδετερωτική δραστηριότητα έναντι όλων των ελεγμένων SARS-CoV-2 VOC, συμπεριλαμβανομένων των Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 και XBB, και ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά τους τίτλους των μολυσματικών ιών μετά τη μόλυνση από Delta και BA.1 σε χάμστερ.

Διαπιστώσαμε ότι ο ορός ανάρρωσης από την κοόρτη μας περιείχε χαμηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων που ανταγωνίζονται το S728-1157 (ένα αντίσωμα κατηγορίας 1/ RBS-A) και τα mAbs επίτοπων κατηγορίας 2. Αυτό υποδηλώνει ότι το S728-1157 είναι κάπως μοναδικό από άλλα αντισώματα που στοχεύουν επιτόπους κατηγορίας 1 και σπάνια προκαλείται στη δεξαμενή Β κυττάρων μνήμης ειδικής για RBD. Αντίθετα, η φυσική μας κοόρτη μόλυνσης φάνηκε να προκαλεί αντισώματα που στοχεύουν τον επίτοπο CR3022 (κατηγορία 4). Τα αντισώματα αυτής της εξειδίκευσης είναι συχνά διασταυρούμενα αντιδρώντα αλλά λιγότερο ισχυρά εξουδετερωτικά από τα αντισώματα στόχευσης RBS (14, 17). Αυτά τα δεδομένα είναι συμπληρωματικά με τα προηγούμενα ευρήματά μας που καταδεικνύουν ότι η αφθονία αντισωμάτων κατηγορίας 3/S309 σε ορούς ανάρρωσης μπορεί να συμβάλει στην εξουδετερωτική δράση έναντι των παραλλαγών Άλφα και Γάμμα, ενώ η έλλειψη αντισωμάτων κατηγορίας 2 μπορεί να ευθύνεται για μειωμένη ικανότητα εξουδετέρωσης έναντι του Delta (15). . Παρόλα αυτά, το εύρος δραστηριότητας των περισσότερων από αυτά τα αντισώματα στόχευσης RBS (RBS-A/κατηγορία 1, RBS-B, C/τάξη 2 και RBS-D, S309/τάξη 3) έναντι των παραλλαγών Omicron αναφέρεται ότι είναι εξαιρετικά περιορισμένο (11, 40, 45).

Η βασική πρόκληση θα είναι ο προσδιορισμός του τρόπου βελτίωσης της πρόκλησης αντισωμάτων με ευρεία διασταυρούμενη αντίδραση σε διατηρημένους επιτόπους RBS. Από την άποψη αυτή, παρατηρήσαμε εδώ ότι τα άτομα με υβριδική ανοσία παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερους τίτλους αντισωμάτων τύπου S{0}}από τα εμβολιασμένα άτομα χωρίς προηγούμενη μόλυνση. Είναι σημαντικό ότι αυτό το φαινόμενο σημειώθηκε ακόμη και όταν ελέγχεται ο αριθμός των εκθέσεων (δηλαδή, σε αναρρώμενα διπλά εμβόλια έναντι μη μολυσμένων τριπλών εμβολίων), υποδηλώνοντας ότι κάποιο στοιχείο της ανοσίας που σχετίζεται με τη μόλυνση (ή μια σύνθεση εμβολίου που μπορεί να μιμηθεί αυτόν τον τύπο ανοσίας) είναι σημαντικό για την πρόκληση αυτού του κλωνότυπου. Αυτό είναι σύμφωνο με πειραματικά στοιχεία που τεκμηριώνουν ότι τα άτομα με υβριδική ανοσία έχουν ευρύτερα προφίλ αντιδραστικότητας αντισωμάτων σε σύγκριση με εκείνα που έχουν μόνο ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από εμβολιασμό ή πρωτογενή μόλυνση (9).

Οι δομές εδώ επεξηγούν ότι το S728-1157 δέσμευε τον επίτοπο RBS-A/κατηγορίας 1 στο RBD ανώτατης διαμόρφωσης. Αυτός ο επίτοπος φαίνεται να είναι πιο εύκολα προσβάσιμος σε 6P-σταθεροποιημένες αιχμές, οι οποίες έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν 2 RBDs στο άνω μέρος, σε σύγκριση με αιχμές 2P, που παρουσιάζουν μόνο 1 (30, 33, 46, 47) και στις οποίες τα αντισώματά μας Ειδικά για ακίδα ανοδικής διαμόρφωσης παρουσιάζουν βελτιωμένη σύνδεση. Το S728-1157 απομονώθηκε μετά από φυσική μόλυνση. Σε τέτοια περιβάλλοντα, οι πιθανότητες πρόκλησης κλώνων τύπου S{15}} είναι πιθανώς υψηλότερες, δεδομένου ότι το RBD πρέπει να είναι σε θέση να υιοθετήσει μια ανοδική διαμόρφωση, έστω και παροδικά, για να συνδεθεί με το ACE2, εκθέτοντας έτσι αυτόν τον επίτοπο. Σε αντίθεση με την πλειονότητα των αντισωμάτων IGHV3-53/3-66 RBS-A/κατηγορίας 1, το S728-1157 μπορεί να φιλοξενήσει βασικές μεταλλάξεις σε αιχμές VOC χρησιμοποιώντας εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ CDR-H3 και RBD (29, 48–50). Το S{27}} χρησιμοποιεί επίσης μια διαφορετική ελαφριά αλυσίδα (IGLV{3-9) σε σύγκριση με άλλα λιγότερο ευρεία αντισώματα όπως το CC12.3 (IGKV3-20), η οποία μπορεί να επηρεάσει τις συνολικές αλληλεπιδράσεις δέσμευσης. Ωστόσο, η ανάλυσή μας δείχνει ότι υπάρχει λιγότερος δεσμός υδρογόνου μεταξύ της ελαφριάς αλυσίδας S728-1157 και του RBD σε σύγκριση με το CC12.3 (Συμπληρωματικός Πίνακας 7). Αν και τα περισσότερα από τα υπολείμματα επαφής CDR-H3 που είναι κρίσιμα για τη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα VOC σε αυτή την αλληλεπίδραση κωδικοποιούνται από τη βλαστική σειρά και δεν εισάγονται από σωματικές μεταλλάξεις, αρκετά σωματικά μεταλλαγμένα υπολείμματα σε περιοχές πλαισίου ή CDR-H1, CDR-H2 και CDR-L1 είναι εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με τον SARS-CoV-2 RBD. Από τη μία πλευρά, αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα Β μνήμης που κωδικοποιούν αντισώματα κατηγορίας IGHV3-53/66 θα μπορούσαν να αποκτήσουν παρόμοιο βαθμό διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με περαιτέρω ωρίμανση συγγένειας. Από την άλλη πλευρά, αυτό υποδηλώνει επίσης τη δυνατότητα σχεδιασμού ανοσογόνων στοχευμένων στη βλαστική σειρά που στοχεύουν τα S728-1157-όπως τα αφελή Β κύτταρα. Αν και μπορεί να είναι δύσκολο να σχεδιαστούν εμβόλια που μπορούν να προκαλέσουν ειδικά αντισώματα τύπου S{53}} με επιλεγμένα CDR-H3 ικανά να ξεπεράσουν τις μεταλλάξεις VOC, είναι ενθαρρυντικό ότι ο περιορισμός του γονιδίου IGHV παρατηρείται σε άλλους ισχυρούς SARS-CoV {58}} μελέτες εξουδετέρωσης mAbs (13, 15, 20-27). Εναλλακτικά, αυτό μπορεί επίσης να είναι εφικτό μέσω επαναληπτικής ανοσοποίησης με βελτιστοποιημένα ανοσογόνα RBD, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως για άλλα παθογόνα (51-55).

Αν και πολλές μεταλλάξεις έχουν παρατηρηθεί στην αντιγονική θέση RBS-A/ τάξης 1 (18), όσον αφορά τον επίτοπο S728-1157, 13 από 15 συνολικά υπολείμματα επαφής RBD και 2 από 3 CDR-H{{9} }τα δεσμευμένα υπολείμματα επαφής RBD διατηρούνται στο Omicron και σε όλα τα άλλα VOC. Αυτό υποδηλώνει ότι η περιοχή RBD όπου βρίσκεται ο επίτοπος S{10}} μπορεί να περιλαμβάνει υπολείμματα κρίσιμα για τη δυναμική λειτουργία και την ιική καταλληλότητά του και επομένως θα ήταν λιγότερο ανεκτική σε μεταλλάξεις και αντιγονική μετατόπιση σε σχέση με τα υπολείμματα θέσης RBS-A/τάξης 1. Εάν συμβαίνει αυτό, η τάση για απώλεια αυτού του συγκεκριμένου επίτοπου καθώς εξελίσσονται οι ιικές παραλλαγές θα πρέπει να μειωθεί, καθιστώντας τον χαρακτηρισμό του S{13}} και παρόμοιων αντισωμάτων και επιτόπων σημαντικών για ανθεκτικά στις παραλλαγές εμβόλια ή θεραπευτική ανάπτυξη mAb. Συνοπτικά, η μελέτη μας προσδιορίζει bnAbs που μπορεί να πληροφορήσουν τον σχεδιασμό ανοσογόνου για εμβόλια για τον κορωνοϊό επόμενης γενιάς ανθεκτικά σε παραλλαγή ή να χρησιμεύσουν ως θεραπευτικά mAb που είναι ανθεκτικά στην εξέλιξη του SARS CoV-2. Συγκεκριμένα, όσον αφορά τη συνδυασμένη ισχύ και το εύρος, το S728-1157 φαίνεται να είναι το καλύτερο αντίσωμα στην κατηγορία που έχει απομονωθεί μέχρι σήμερα. Δεδομένου ότι αυτό το αντίσωμα συνδέεται πιο εύκολα με τη σταθεροποίηση 6P, προβλέπεται ότι προκαλείται κατά προτίμηση από σταθεροποιημένες με 6P ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ακίδας ή ολόκληρο τον ιό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η τροποποίηση της εξαπρολίνης θα μπορούσε να ωφελήσει μελλοντικά κατασκευάσματα εμβολίων προκειμένου να προστατεύεται βέλτιστα από μελλοντικό SARS-CoV -2 παραλλαγές και άλλοι αρβοϊοί.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Μέθοδοι

Απομόνωση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Τα PBMCs απομονώθηκαν από φίλτρα λευκομείωσης και καταψύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (24). Τα Β κύτταρα εμπλουτίστηκαν από PBMCs μέσω FACS. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με CD19, CD3 και ανιχνευτές αντιγόνου συζευγμένους με ολιγοφθοροφόρο. Τα κύτταρα ενδιαφέροντος ταυτοποιήθηκαν ως CD3– CD19+ Αντιγόνο+. Όλα τα mAbs δημιουργήθηκαν από κύτταρα με ολιγοεπισήμανση, ταξινομημένα με δόλωμα αντιγόνου που ταυτοποιήθηκαν μέσω RNA-Seq ενός κυττάρου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (15, 24). Τα δεδομένα μεμονωμένων κυττάρων Β που δημιουργήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus: GSE171703 και GSM5231088–GSM5231123.

Επιλέχθηκαν ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα για να δημιουργήσουν mAbs με βάση την ένταση του αντιγόνου-ανιχνευτή που αναλύθηκε από το JMP Pro 15. Γονίδια βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας αντισώματος συντέθηκαν με Integrated DNA Technologies (IDT) και κλωνοποιήθηκαν σε ανθρώπινη IgG1 και ανθρώπινη κ ή λ ελαφριά αλυσίδα φορείς έκφρασης με συγκρότημα Gibson, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (56). Οι βαριές και ελαφριές αλυσίδες του αντίστοιχου mAb συνεπιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (ATCC). Μετά από επιμόλυνση για 18 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα συμπληρώθηκαν με υπερκείμενο μέσου υβριδώματος χωρίς πρωτεΐνη (PFHM-II, Gibco). Το υπερκείμενο που περιείχε εκκρινόμενο mAb συλλέχτηκε την ημέρα 4 και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια πρωτεΐνης Α-αγαρόζης (Thermo Fisher Scientific) όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (56). Αλληλουχίες βαριών και ελαφρών αλυσίδων των καλά χαρακτηρισμένων αντισωμάτων προήλθαν από Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) και REGN1{{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) και συντέθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Το CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) παρασχέθηκε από τον Meng Yuan στο Scripps Research Institute (Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Έκφραση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ακίδας. Ο ανασυνδυασμένος D614G SARS-CoV-2 ακίδα πλήρους μήκους (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, μεμονωμένα μεταλλαγμένα RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y49Y, Q49Y, Q49Y, Q489F, Y505A και Y505F), ο συνδυασμός μετάλλαξης RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD και MERS-CoV RBD δημιουργήθηκαν εσωτερικά. Εν συντομία, τα ανασυνδυασμένα αντιγόνα εκφράστηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Το γονίδιο ενδιαφέροντος κλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης θηλαστικών (εσωτερικά τροποποιημένο AbVec) και επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το υπερκείμενο συλλέχτηκε την ημέρα 4 μετά την επιμόλυνση και επωάστηκε με Νι-νιτριλοτριοξικό οξύ (Νί-ΝΤΑ) αγαρόζη (Qiagen). Ο καθαρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας στήλη ροής βαρύτητας και εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει ιμιδαζόλη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (57, 58). Το έκλουσμα ρυθμίστηκε και ανταλλάχθηκε με PBS χρησιμοποιώντας μια φυγοκεντρική μονάδα Amicon (Millipore). Οι αιχμές ανασυνδυασμένης FL σταθεροποιήθηκαν με μεταλλάξεις 2P των παραλλαγών B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 και BA.4 Omicron και ήταν που παράγεται στο εργαστήριο Sather στο Παιδικό Ερευνητικό Ινστιτούτο του Σιάτλ. Τα K417V, N439K και E484K RBD και τα ανασυνδυασμένα FL spike WT-2P και 6P παρήχθησαν στο εργαστήριο Krammer στην Ιατρική Σχολή Icahn στο Όρος Σινά. Το SARS-CoV-2-6P-Mut7 και το spike BA.1-6P σχεδιάστηκαν και παρήχθησαν όπως περιγράφεται σε προηγούμενη μελέτη (59). Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες και οι πόροι για κάθε αντιγόνο παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4. ELISA. Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ακίδας/RBD SARS-CoV-2 επικαλύφθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης υψηλής δέσμευσης πρωτεϊνών (Costar) στα 2 ug/mL σε PBS στα 50 μL/φρεάτιο και διατηρήθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS που περιείχε 0,05% Tween 20 (PBS-T) και μπλοκαρίστηκαν με 150 μL PBS που περιείχε 20% FBS για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Τα μονοκλωνικά αντισώματα αραιώθηκαν σειριακά 3-πλάσια ξεκινώντας από 10 ug/mL σε PBS και επωάστηκαν στα φρεάτια για 1 ώρα στους 37 βαθμούς . Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντισώμα αντι-ανθρώπινου IgG κατσίκας συζευγμένο με HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Μετά το πλύσιμο, προστέθηκαν 100 μL υποστρώματος Super AquaBlue ELISA (eBioscience) ανά φρεάτιο. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm σε φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας (Bio-Rad). Οι δοκιμές τυποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα ελέγχου S144-509 (15), με γνωστά χαρακτηριστικά δέσμευσης σε κάθε πλάκα, και οι πλάκες αναπτύχθηκαν μέχρις ότου η απορρόφηση του μάρτυρα έφτασε σε OD 3,0. Όλα τα mAbs δοκιμάστηκαν εις διπλούν και κάθε πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές.

ELISA ορού. Τρυβλία μικροτιτλοδότησης υψηλής δέσμευσης πρωτεϊνών επικαλύφθηκαν με ανασυνδυασμένα αντιγόνα SARS-CoV-2 στα 2 ug/mL σε PBS κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS 0.05% Tween και μπλοκαρίστηκαν με 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Τα δείγματα πλάσματος απενεργοποιήθηκαν με θερμότητα για 1 ώρα στους 56 βαθμούς πριν από τη διεξαγωγή του ορολογικού πειράματος. Το πλάσμα αραιώθηκε σειριακά 2- φορές σε PBS 0,1% Tween + 1% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη. Οι πλάκες επωάστηκαν με αραιώσεις ορού για 2 ώρες σε ΘΔ. Το συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά της ανθρώπινης Ig αραιωμένο σε 1:3,000 με PBS 0,1% Tween + 1% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της δέσμευσης αντισωμάτων. Μετά από 1 ώρα επώασης, οι πλάκες αναπτύχθηκαν με 100 μL διαλύματος SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν 50 μL 3M HCl για να σταματήσει η αντίδραση ανάπτυξης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm σε φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας (Bio-Rad). Οι τίτλοι τελικού σημείου προέκτασαν από τη σιγμοειδή πρότυπη καμπύλη 4PL (όπου x είναι η λογαριθμική συγκέντρωση) για κάθε δείγμα. Το όριο ανίχνευσης (LOD) ορίζεται ως η μέση τιμή + 3 SD του σήματος OD που καταγράφεται με χρήση πλάσματος από άτομα πριν από τον SARS-CoV-2. Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν στο λογισμικό GraphPad Prism (έκδοση 9.0).

Διαγωνισμός ELISA. Για τον προσδιορισμό της ταξινόμησης επιτόπου στόχου των αντιδρώντων με RBD mAb, πραγματοποιήθηκαν ανταγωνιστικές ELISA χρησιμοποιώντας άλλα mAb με γνωστά χαρακτηριστικά δέσμευσης επιτόπου ως ανταγωνιστικά mAb. Τα ανταγωνιστικά mAbs βιοτινυλιώθηκαν χρησιμοποιώντας EZ-Link sulfo-NHS-βιοτίνη (Thermo Fisher Scientific) για 2 ώρες σε RT. Η περίσσεια βιοτίνης των βιοτινυλιωμένων mAbs αφαιρέθηκε με 7 k μοριακού βάρους-αποκοπής (MWCO) στήλες αφαλάτωσης Zeba spin (Thermo Fisher Scientific). Οι πλάκες επικαλύφθηκαν με 2 ug/mL αντιγόνου RBD όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με PBS–20% FBS για 2 ώρες σε RT και προστέθηκε η 2-πλάσια αραίωση των mAbs μιας απροσδιόριστης κατηγορίας ή ορού, ξεκινώντας από το 20 ug/mL mAbs και αραίωση 1:10 ορού. Μετά από επώαση αντισώματος για 2 ώρες σε RT, το βιοτινυλιωμένο ανταγωνιστικό mAb προστέθηκε σε συγκέντρωση διπλάσια από τη σταθερά διάστασής του (KD) και επωάστηκε για άλλες 2 ώρες σε RT μαζί με το mAb ή τον ορό που προστέθηκε προηγουμένως. Οι πλάκες πλύθηκαν και επωάστηκαν με 100 μL συζευγμένη με HRP στρεπταβιδίνη (Southern Biotech) σε αραίωση 1:1,000 για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Οι πλάκες αναπτύχθηκαν με το υπόστρωμα Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Για να ομαλοποιηθούν οι δοκιμασίες, το ανταγωνιστικό βιοτινυλιωμένο mAb προστέθηκε σε ένα φρεάτιο χωρίς ανταγωνιστικά mAb ή ορό ως έλεγχος. Τα δεδομένα καταγράφηκαν όταν η απορρόφηση του φρεατίου ελέγχου έφτασε σε OD 1,0–1,5. Ο επί τοις εκατό ανταγωνισμός μεταξύ mAbs υπολογίστηκε στη συνέχεια διαιρώντας την παρατηρούμενη OD ενός δείγματος με την OD που έφτασε ο θετικός μάρτυρας, αφαιρώντας αυτή την τιμή από το 1 και πολλαπλασιάζοντας με το 100. Για τον ορό, τα ODs μετασχηματίστηκαν log10 και αναλύθηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση για να προσδιοριστεί το 50 % τιμές συγκέντρωσης αναστολής (IC50) χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism (έκδοση 9.0). Τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν σε Log1P και σχεδιάστηκαν σε ένα γράφημα αντιπροσωπευτικό της αμοιβαίας αραίωσης ορού του IC50 της αραίωσης ορού που μπορεί να επιτύχει ανταγωνισμό 50% με το ανταγωνιστικό mAb ενδιαφέροντος. Όλα τα mAbs δοκιμάστηκαν εις διπλούν, κάθε πείραμα διεξήχθη 2 φορές ανεξάρτητα και υπολογίστηκε ο μέσος όρος των τιμών από 2 ανεξάρτητα πειράματα.

Δοκιμασίες πλάκας. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές πλάκας με ιούς παραλλαγής SARS-CoV-2 σε κύτταρα Vero E6/TMPRSS2 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)) (Συμπληρωματικός Πίνακας 5). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για να επιτευχθεί συρροή 90% προτού υποβληθούν σε θρυψίνη και σπορά σε πυκνότητα 3 × 104 κύτταρα/φρεάτιο σε 96-πλάκες φρεατίου. Την επόμενη ημέρα, 102 PFU της παραλλαγής SARS-CoV-2 επωάστηκαν με 2-διπλά αραιωμένα mAbs για 1 ώρα. Το μίγμα αντισώματος-ιού επωάστηκε με κύτταρα Vero E6/TMPRSS2 για 3 ημέρες στους 37 βαθμούς. Οι πλάκες σταθεροποιήθηκαν με 20% μεθανόλη και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους. Οι πλήρεις ανασταλτικές συγκεντρώσεις (IC99) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την λογαριθμική (αναστολέας) έναντι της κανονικοποιημένης απόκρισης (μεταβλητή κλίση), που πραγματοποιήθηκε στο GraphPad Prism (έκδοση 9.0). Όλα τα mAbs δοκιμάστηκαν εις διπλούν και κάθε πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές. Δοκιμή εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης. Οι δοκιμές εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης (FRNTs) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των δραστηριοτήτων εξουδετέρωσης ως πρόσθετη πλατφόρμα εκτός από τον προσδιορισμό πλάκας. Σειριακές αραιώσεις ορού ξεκινώντας από μια τελική συγκέντρωση 1:20 αναμίχθηκαν με 103 μονάδες ιού που σχηματίζουν εστίαση ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Ένα συγκεντρωμένο προπανδημικό δείγμα ορού χρησίμευσε ως έλεγχος. Το μίγμα αντισώματος-ιού εμβολιάστηκε σε κύτταρα Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) σε τρυβλία 96-πηγαδιών και επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Σε κάθε φρεάτιο προστέθηκε ίσος όγκος διαλύματος μεθυλοκυτταρίνης. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 βαθμούς και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη. Αφού αφαιρέθηκε η φορμαλίνη, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα mAb ποντικού έναντι της νουκλεοπρωτεΐνης SARS-CoV-1/2 [κλώνος 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], ακολουθούμενη από ανοσοσφαιρίνη κατσίκας αντι-ποντικού σημασμένη με HRP (Sigma- Aldrich· A8924). Τα μολυσμένα κύτταρα χρωματίστηκαν με Υπόστρωμα TrueBlue (SeraCare Life Sciences) και στη συνέχεια πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό. Μετά το στέγνωμα, οι αριθμοί εστίασης ποσοτικοποιήθηκαν με χρήση ενός ImmunoSpot S6 Analyzer, λογισμικού ImmunoCapture και λογισμικού BioSpot (Cellular Technology). Το IC50 υπολογίστηκε από την παρεμβαλλόμενη τιμή από την λογαριθμική (αναστολέα) έναντι της κανονικοποιημένης απόκρισης, χρησιμοποιώντας μη γραμμική παλινδρόμηση μεταβλητής κλίσης (4 παράμετροι) που πραγματοποιήθηκε στο GraphPad Prism (έκδοση 9.0).

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Hou YJ, et al. Η παραλλαγή SARS-CoV-2 D614G παρουσιάζει αποτελεσματική αντιγραφή ex vivo και μετάδοση in vivo. Επιστήμη. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. Πολλαπλές παραλλαγές του SARS CoV-2 διαφεύγουν της εξουδετέρωσης από την επαγόμενη από το εμβόλιο χυμική ανοσία. Κύτταρο. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC, et al. Δραστηριότητα εξουδετέρωσης αντισωμάτων κατά του SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 και B.1.351 με εμβολιασμό BNT162b2. Νυστέρι. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV, et al. Λοιμώξεις και αποκρίσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων που προκαλούνται από το εμβόλιο στις παραλλαγές SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D, et al. Στοιχεία διαφυγής SARS-CoV-2 παραλλαγής B.1.351 από φυσικούς ορούς και ορούς που προκαλούνται από εμβόλια. Κύτταρο. 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Υ, et al. Αποδράστε από τα εξουδετερωτικά αντισώματα από παραλλαγές πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV-2. Elife. 2020; 9: e61312.

7. Graham F. Καθημερινή ενημέρωση: Η παραλλαγή του κορωνοϊού Omicron θέτει τους επιστήμονες σε εγρήγορση. Φύση. 2021;.

8. Karim SSA, Karim QA. Παραλλαγή Omicron SARS-CoV-2: ένα νέο κεφάλαιο στην πανδημία COVID-19. Νυστέρι. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM, et al. Δραστηριότητα ορού ανάρρωσης και εμβολίου κατά του SARS-CoV-2 Omicron. Φύση. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q, et al. Ανησυχητικές ιδιότητες διαφυγής αντισωμάτων των αυξανόμενων υποπαραλλαγών SARS-CoV-2 BQ και XBB. Κύτταρο. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA, et al. Ένας μολυσματικός ιός SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron διαφεύγει της εξουδετέρωσης από θεραπευτικά μονοκλωνικά αντισώματα. Nat Med. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E, et al. Αποτελεσματικότητα αντισωμάτων και αντιιικών φαρμάκων κατά του Covid-19 Παραλλαγή Omicron. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan Μ, et al. Αναγνώριση του τομέα δέσμευσης του υποδοχέα SARS-CoV-2 με εξουδετέρωση αντισωμάτων. Biochem Biophys Res Commun. 2021; 538:192-203.

14. Barnes CO, et al. Οι δομές αντισωμάτων εξουδετέρωσης του SARS-CoV-2 ενημερώνουν τις θεραπευτικές στρατηγικές. Φύση. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S, et al. Διασταυρούμενη εξουδετέρωση των αναδυόμενων παραλλαγών του SARS-CoV-2 που προκαλούν ανησυχία από αντισώματα που στοχεύουν διαφορετικούς επιτόπους στην ακίδα. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ, et al. Η σοβαρότητα της λοίμωξης από SARS-CoV-2 συνδέεται με ανώτερη χυμική ανοσία έναντι της ακίδας. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ, et al. Χαρτογράφηση μεταλλάξεων στο SARS-CoV-2 RBD που διαφεύγουν της δέσμευσης από διαφορετικές κατηγορίες αντισωμάτων. Nat Commun. 2021; 12 (1): 4196.

18. Liu Η, Wilson ΙΑ. Προστατευτικοί εξουδετερωτικοί επίτοποι στον SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022; 310(1):76-92.

19. Jette CA, et al. Ευρεία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ αρβοϊών που εκδηλώνεται από ένα υποσύνολο εξουδετερωτικών αντισωμάτων που προέρχονται από δότη COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, et al. Ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα από ασθενείς με COVID-19 ορίζουν πολλαπλούς στόχους ευπάθειας. Επιστήμη. 2020;369(6504):643–650.

21. Pinto D, et al. Διασταυρούμενη εξουδετέρωση του SARS CoV-2 από ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα SARS-CoV. Φύση. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF, et al. Συγκλίνουσες αποκρίσεις αντισωμάτων στον SARS-CoV-2 σε άτομα που βρίσκονται σε ανάρρωση. Φύση. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan Μ, et αϊ. Δομική βάση μιας κοινής απόκρισης αντισωμάτων στον SARS-CoV-2. Επιστήμη. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL, et al. Το προφίλ της ανοσοκυριαρχίας των Β κυττάρων μετά από μόλυνση από SARS-CoV-2 αποκαλύπτει την εξέλιξη των αντισωμάτων σε μη εξουδετερωτικούς ιικούς στόχους. Ασυλία, ανοσία. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF, et al. Απομόνωση ισχυρού SARS CoV-2 εξουδετερωτικών αντισωμάτων και προστασία από ασθένειες σε μοντέλο μικρού ζώου. Επιστήμη. 2020;369(6506):956–963.

26. Schmitz AJ, et al. Ένα δημόσιο αντίσωμα που προκαλείται από εμβόλιο προστατεύει από τον SARS-CoV-2 και τις αναδυόμενες παραλλαγές. Ασυλία, ανοσία. 2021;54(9):2159–2166.ε6.

27. Shi R, et αϊ. Ένα ανθρώπινο εξουδετερωτικό αντίσωμα στοχεύει τη θέση δέσμευσης υποδοχέα του SARS-CoV-2. Φύση. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y, et αϊ. Ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα κατά του SARS-CoV-2 που εντοπίζονται με προσδιορισμό αλληλουχίας μονοκυττάρου υψηλής απόδοσης των Β κυττάρων ασθενών που βρίσκονται σε ανάρρωση. Κύτταρο. 2020; 182 (1): 73–84.

29. Barnes CO, et al. Οι δομές των ανθρώπινων αντισωμάτων που συνδέονται με την ακίδα SARS-CoV-2 αποκαλύπτουν κοινούς επίτοπους και υποτροπιάζοντα χαρακτηριστικά αντισωμάτων. Κύτταρο. 2020; 182 (4): 828–842.

30. Corbett KS, et al. Ο σχεδιασμός του εμβολίου mRNA του SARS-CoV-2 ενεργοποιήθηκε από την ετοιμότητα πρωτότυπου παθογόνου. Φύση. 2020;586(7830):567–571.

31. Amanat F, et al. Η εισαγωγή δύο προλινών και η αφαίρεση της πολυβασικής θέσης διάσπασης οδήγησε σε υψηλότερη αποτελεσματικότητα ενός ανασυνδυασμένου εμβολίου SARS-CoV-2 με βάση την ακίδα στο μοντέλο ποντικού. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, et al. Ένας ιός της νόσου του Newcastle που εκφράζει μια σταθεροποιημένη πρωτεΐνη ακίδας του SARS-CoV-2 προκαλεί προστατευτικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Nat Commun. 2021; 12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. Σχεδιασμός βασισμένος στη δομή των αιχμών SARS-CoV-2 που σταθεροποιούνται σε προ-σύγχυση. Επιστήμη. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM, et al. Δομική ποικιλομορφία της ακίδας του SARS-CoV-2 Omicron. ΜοΙ Cell. 2022; 82 (11): 2050–2068.

35. Yuan Μ, et αϊ. Ένας εξαιρετικά διατηρημένος κρυπτικός επίτοπος στους τομείς δέσμευσης υποδοχέα του SARS-CoV-2 και του SARS-CoV. Επιστήμη. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN, et al. Πλήρης χάρτης των μεταλλάξεων SARS-CoV-2 RBD που διαφεύγουν από το μονοκλωνικό αντίσωμα LY-CoV555 και το κοκτέιλ του με τον LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, et al. Τα αντισώματα REGN-COV2 προλαμβάνουν και θεραπεύουν τη μόλυνση από SARS-CoV-2 σε μακάκους ρέζους και χάμστερ. Επιστήμη. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC, et αϊ. Ένας εναλλακτικός τρόπος δέσμευσης αντισωμάτων IGHV3-53 στον τομέα δέσμευσης του υποδοχέα SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. Ένα μη ανταγωνιστικό ζεύγος ανθρώπινων εξουδετερωτικών αντισωμάτων εμποδίζει τη σύνδεση του ιού COVID-19 στον υποδοχέα του ACE2. Επιστήμη. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan Μ, et αϊ. Δομικές και λειτουργικές διακλαδώσεις της αντιγονικής μετατόπισης σε πρόσφατες παραλλαγές SARS-CoV-2. Επιστήμη. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q, et αϊ. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα που στοχεύουν RBD με κωδικοποίηση IGHV3-53-της βλαστικής γραμμής υπάρχουν συνήθως στα ρεπερτόρια αντισωμάτων ασθενών με COVID-19. Emerg Microbes Infect. 2021, 10(1):1097–1111.

42. Zhang Q, et al. Ισχυρά και προστατευτικά δημόσια αντισώματα IGHV3- 53/{3-66 και το κοινό τους μετάλλαγμα διαφυγής στην αιχμή του SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021; 12 (1): 4210.

43. Wang Ζ, et al. Αντισώματα κατά του SARS-CoV-2 και των κυκλοφορούντων παραλλαγών που προκάλεσε το εμβόλιο mRNA. Φύση. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V, et al. ΠΑΡΙΣΙ και ΣΠΑΡΤΗ: εύρεση της αχίλλειας πτέρνας του SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. SARS-CoV-2 Αντισώματα RBD που μεγιστοποιούν το εύρος και την αντίσταση στη διαφυγή. Φύση. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Walls AC, et al. Δομή, λειτουργία και αντιγονικότητα της γλυκοπρωτεΐνης ακίδας του SARS-CoV-2. Κύτταρο. 2020; 181 (2): 281–292.

47. Henderson R, et al. Έλεγχος της διαμόρφωσης γλυκοπρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV-2. Nat Struct ΜοΙ Biol. 2020; 27(10):925–933.

48. Shrestha LB, et al. Αντισώματα ευρείας εξουδετέρωσης κατά των αναδυόμενων παραλλαγών του SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021; 12:752003.

49. Greaney AJ, et al. Τα αντισώματα που προκαλούνται από τον εμβολιασμό με mRNA-1273 συνδέονται ευρύτερα στον τομέα δέσμευσης του υποδοχέα από ό,τι αυτά από τη μόλυνση από SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 Η λοίμωξη από παραλλαγή βήτα προκαλεί ισχυρά αντισώματα ειδικά για τη γενεαλογία και διασταυρούμενη αντίδραση. Επιστήμη. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, et al. Τα αντισώματα με ευρεία διασταυρούμενη αντίδραση κυριαρχούν στην απόκριση των ανθρώπινων Β κυττάρων έναντι της πανδημίας λοίμωξης από τον ιό H1N1 του 2009. J Εχρ Med. 2011; 208 (1): 181–193.

52. Guthmiller JJ, et al. Πρώτη έκθεση σε ευρέως εξουδετερωτικά αντισώματα που προκαλούνται από την πανδημία του ιού H1N1 που στοχεύουν τους επιτόπους της κεφαλής της αιμοσυγκολλητίνης. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, et al. Η μηχανική αντιγόνου της γρίπης εστιάζει στις ανοσολογικές αποκρίσεις σε έναν υποκυρίαρχο αλλά ευρέως προστατευτικό ιικό επίτοπο. Μικρόβιο ξενιστή κυττάρων. 2019; 25(6): 827–835.

54. Nachbagauer R, et al. Μια χιμαιρική προσέγγιση του καθολικού εμβολίου κατά του ιού της γρίπης με βάση την αιμοσυγκολλητίνη προκαλεί ευρεία και μακροχρόνια ανοσία σε μια τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο δοκιμή φάσης Ι. Nat Med. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D, et al. Υπερπλανώμενη ανοσοκυριαρχία με στόχο υποκυρίαρχους ευρέως εξουδετερωτικούς επιτόπους. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ, et al. Μια αποτελεσματική μέθοδος για τη δημιουργία μονοκλωνικών αντισωμάτων από ανθρώπινα Β κύτταρα. Μέθοδοι ΜοΙ ΒίοΙ. 2019; 1904: 109-145.

57. Amanat F, et al. Μια ορολογική ανάλυση για την ανίχνευση ορομετατροπής SARS-CoV-2 σε ανθρώπους. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. Ορομετατροπή SARS-CoV-2 σε ανθρώπους: ένα λεπτομερές πρωτόκολλο για ορολογική ανάλυση, παραγωγή αντιγόνου και ρύθμιση δοκιμής. Curr Protoc Microbiol. 2020; 57(1):e100.

59. Torres JL, et al. Δομικές γνώσεις ενός εξαιρετικά ισχυρού πανεξουδετεροποιητικού ανθρώπινου μονοκλωνικού αντισώματος SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et αϊ. Αυτοματοποιημένη μοριακή μικροσκοπία: το νέο σύστημα Leginon. J Struct ΒίοΙ. 2005; 151 (1): 41–60.

61. Lander GC, et al. Appion: ένας ολοκληρωμένος αγωγός που βασίζεται σε βάσεις δεδομένων για τη διευκόλυνση της επεξεργασίας εικόνας EM. J Struct ΒίοΙ. 2009; 166 (1): 95–102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker και TiltPicker: εργαλεία λογισμικού για τη διευκόλυνση της επιλογής σωματιδίων στην ηλεκτρονική μικροσκοπία ενός σωματιδίου. J Struct ΒίοΙ. 2009; 166 (2): 205–213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--ένα σύστημα οπτικοποίησης για διερευνητική έρευνα και ανάλυση. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani Α, et al. Μη ομοιόμορφη βελτίωση: η προσαρμοστική τακτοποίηση βελτιώνει την ανακατασκευή κρυο-ΕΜ ενός σωματιδίου. Μέθοδοι Nat. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: Προσδιορισμός και διόρθωση CTF σε πραγματικό χρόνο. J Struct ΒίοΙ. 2016; 193 (1): 1–12.

66. Zivanov J, et al. Νέα εργαλεία για αυτοματοποιημένο προσδιορισμό δομής κρυο-EM υψηλής ανάλυσης στο RELION-3. Elife. 2018; 7: e42166.

67. Casanal Α, et al. Τρέχουσες εξελίξεις στην φαλαρίδα για την κατασκευή μακρομοριακών μοντέλων ηλεκτρονιακής κρυο-μικροσκοπίας και κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B, et al. Αυτόματη διόρθωση σφαλμάτων σε δομές γλυκοπρωτεϊνών με ροζέτα. Δομή. 2019; 27(1): 134–139.

69. Klaholz BP. Εξαγωγή και τελειοποίηση ατομικών μοντέλων στην κρυσταλλογραφία και την κρυο-ΕΜ: τα πιο πρόσφατα εργαλεία Phenix για τη διευκόλυνση της ανάλυσης δομής. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019; 75 (πτ 10): 878–881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: Οπτικοποίηση δομής για ερευνητές, εκπαιδευτικούς και προγραμματιστές. Protein Sci. 2021; 30 (1): 70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Επεξεργασία δεδομένων περίθλασης ακτίνων Χ που συλλέγονται σε λειτουργία ταλάντωσης. Μέθοδοι Enzymol. 1997; 276:307-326.

72. McCoy AJ, et al. Το λογισμικό κρυσταλλογραφίας Phaser. J Appl Crystallogr. 2007; 40 (σημ. 4): 658–674.

73. Qiang Μ, et αϊ. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα κατά του SARS CoV-2 επιλέχθηκαν από μια βιβλιοθήκη ανθρώπινων αντισωμάτων που κατασκευάστηκε πριν από δεκαετίες. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: εργαλεία κατασκευής μοντέλων για μοριακά γραφικά. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004; 60 (pt 12 pt 1): 2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: ένα ολοκληρωμένο σύστημα βασισμένο σε Python για λύση μακρομοριακής δομής. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66 (σημ. 2): 213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: Ένα εργαλείο ιστού που βασίζεται σε δομή για την ανάλυση των επιτόπων που εξουδετερώνουν ευρέως. J Struct ΒίοΙ. 2022;214(1):107839.