Δύο τριτερπενοειδή από τα φύλλα Rubus Fraxinifolius και τις ανασταλτικές τους δραστηριότητες τυροσινάσης και ελαστάσης

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Πολλές θεραπευτικές ενώσεις έχουν απομονωθεί από φυσικά άφθονους οργανικούς πόρους, οι οποίοι μπορεί να προσφέρουν οικονομικές και βιώσιμες πηγές ενώσεων με ασφαλείς και αποτελεσματικές βιολογικές δραστηριότητες. Στη βιομηχανία καλλυντικών αναζητούνται εναγωνίως φυσικές ενώσεις με αντιγηραντική δράση. Έτσι, παρασκευάσαμε διάφορα εκχυλίσματα από φύλλα Rubusfraxinifolius και χρησιμοποιήσαμε δοκιμές αναστολής ενζύμων για να απομονώσουμε ενώσεις με προστατευτική δράση κατά της γήρανσης του δέρματος. Δύο τριτερπενοειδή απομονώθηκαν από το Rubus fraxinifolius Poir. φύλλα. Οι δομές χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπικές αναλύσεις (LC-ESI-MS, 1D/2D NMR) και σύγκριση με αναφερόμενα δεδομένα. Η ένωση 1 και 2 προσδιορίστηκαν ως 2,3-Ο-αιθυλενογλυκόλη,19-υδροξυουρές-12-εν-23,28-διοϊκό οξύ και 2,{{15} }Ο-προπανοδιόλη,19-υδροξυουρές-12-εν-28-οϊκό οξύ. Το εκχύλισμα μεθανόλης και τα προϊόντα απομόνωσης αξιολογήθηκαν για την ανασταλτική τους δράση στην ελαστάση και την τυροσινάση. Οι ενώσεις 1 και 2 ανέστειλαν την ελαστάση με ICso 122,199 ug/mL και 98,22 ug/mL, και επίσης ανέστειλαν την τυροσινάση με ICso 207,79 ug/mL και 221,51 ug/mL, αντίστοιχα. Η μοριακή σύνδεση απέδειξε ότι και οι δύο ενώσεις έχουν συγγένειες προς τα ένζυμα.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Αν και είναι δύσκολο να επιτευχθεί, οι φυσικές αντιγηραντικές ουσίες που είναι ασφαλείς για τον άνθρωπο μπορούν να συλλεχθούν οικονομικά και βιώσιμα από άφθονους φυσικούς πόρους. Περίπου 700 είδη Rubus (Rosaceae) διανέμονται παγκοσμίως, παρόλο που λίγα είδη βρίσκονται στις τροπικές περιοχές. Αυτό το γένος περιέχει θρεπτικά συστατικά (ζάχαρη, βιταμίνες, κ.λπ.), δευτερογενείς μεταβολίτες (τριτερπενοειδή, φλαβονοειδή, πολυφαινόλες κ.λπ.) και έχει πολλές αντιγηραντικές δραστηριότητες (αντιοξειδωτικό, ελαστάση μυρμηγκιού, τυροσινάση μυρμηγκιού, αντικολλαγενάση, αντι-UV, αντιφλεγμονώδη, επούλωση πληγών κ.λπ.)1. Επιπλέον, το είδος Rubus ανέφερε επίσης ότι περιείχε διάφορα τριτερπένια με διάφορες βιολογικές δραστηριότητες -».

Στην Ινδονησία, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) διανέμεται στην Ιάβα, το Βόρνεο κ.λπ., και ευρέως γνωστό ως «αστικός».τι είναι το cistancheΕπιπλέον, ορισμένοι τοπικοί αγρότες συγκομίζουν αυτά τα φυτά και τα φρούτα του μούρου καταναλώνονται συνήθως είτε φρέσκα είτε κατεψυγμένα. Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι το εκχύλισμα στελέχους R. frascinifolius έχει τη δράση να αναστέλλει την ελαστάση, την τυροσινάση και ως αντιοξειδωτικό8. Κάποιες άλλες έρευνες έδειξαν επίσης ότι τα φύλλα και οι καρποί του R. fraxinifolius έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση;10. Ωστόσο, η μελέτη του R. fraxinifolius έχει ερευνηθεί ελάχιστα και δεν έχουν αναφερθεί μελέτες χημικών συστατικών.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Η ελαστάση είναι ένα ένζυμο πρωτεάσης της σερίνης, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρυτίδωση ή χαλάρωση του δέρματος μέσω της αποικοδόμησης της δερματικής ελαστικής ίνας (ελαστίνης) και προκαλεί απώλεια της ελαστικότητας του δέρματος. Ένα από αυτά είναι η ελαστάση που προέρχεται από ινοβλάστες δέρματος. Έτσι, ως επιβραδυντές της αποικοδόμησης των ινών ελαστίνης που προκαλεί τη γήρανση του δέρματος, οι αναστολείς της ελαστάσης έχουν τραβήξει την προσοχή ως παράγοντες για καλλυντικά παρασκευάσματα,12. Η μελανογένεση διαμεσολαβείται από την τυροσινάση και ρυθμίζει τη βιοσύνθεση της μελανίνης μέσω μιας αντίδρασης δύο σταδίων. Στο αρχικό στάδιο, η L-τυροσίνη υδροξυλιώνεται σε L-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA). Στο δεύτερο στάδιο, η L-DOPA οξειδώνεται προς την αντίστοιχη Ο-κινόνη. Ως εκ τούτου, φυσικές ενώσεις με ανασταλτική δράση τυροσινάσης χρησιμοποιούνται συνήθως στα καλλυντικά που αναστέλλουν την υπερμελάγχρωση με μελανίνη και ως εκ τούτου ευνοούν τη λεύκανση του δέρματος.Αντιγηραντικό κιστανάκιΟι αναστολείς των ενζύμων ελαστάση και τυροσινάσης θα μπορούσαν να αναπτυχθούν ως λευκαντικοί, αντιγηραντικοί ή αντιρυτιδικοί παράγοντες για τη θεραπεία δερματολογικών διαταραχών44.

Αυτή η μελέτη απομόνωσε τριτερπενοειδή ουρσανίου από φύλλα R.fraxinifolius και διευκρίνισε τις δομές τους σε φασματοσκοπικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI-MS) και 'H NMR, |3CNMR και 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC, και HMBC). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ανασταλτικών δράσεων ελαστάσης και τυροσινάσης ακατέργαστων εκχυλισμάτων, κλασμάτων και απομονωμένων ενώσεων.

Η δράση δύο επιλεγμένων ενώσεων παρατηρήθηκε επίσης μέσω της μεθόδου in silico σε αυτή την έρευνα. Πραγματοποιήθηκε μια προσέγγιση μοριακής σύνδεσης με το DockThorl516. Τα μακρομόρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν την έρευνα ελήφθησαν από τράπεζα δεδομένων πρωτεϊνών (RCSB PDB, 2000) με ταυτότητες 2y9x και 3hgp για τυροσινάση και ελαστάση, αντίστοιχα, Lyl718. παρατηρήθηκαν με PyMOL1920.

Αποτελέσματα και συζήτηση

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 τοις εκατό σε 100 ug/mL, ενώ το εκχύλισμα η-εξανίου δεν είχε δραστικότητα (Εικ. 1). Ορισμένοι Rubus εμφάνισαν επίσης ανασταλτική δραστηριότητα ελαστάσης όπως R. Sanctus (ποσοστό αναστολής 14.68-49.20 σε 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus κλπ.221. Ως εκ τούτου, κλασματοποιήσαμε τα ενεργά εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία κενού/VLC και συλλέξαμε κλάσματα ll από το καθένα. Κλάσματα από εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα έδειξαν ασθενή ανασταλτική δράση της ελαστάσης (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Τα προϊόντα απομόνωσης ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (LCMS), 'H and 13CNMR, DEPT, ετεροπυρηνική απλή κβαντική συνοχή (HSQC), ετεροπυρηνική πολλαπλή κβαντική συσχέτιση (HMQC) και ετεροπυρηνική συσχέτιση πολλαπλών δεσμών (HHMBC). Ο Πίνακας 1, έδειξε τα φασματικά δεδομένα NMR των ενώσεων.

Ένωση 1: απομονώθηκε ως άμορφη λευκή σκόνη. Τα φάσματα LCMS-ESI για αυτήν την ένωση εμφάνισαν μια κορυφή μοριακού ιόντος σε m/z 543,32[MH]t, υποδηλώνοντας τον μοριακό τύπο C32H48O- με εννέα ισοδύναμα ακόρεστου. Τα φάσματα IR αποκάλυψαν μέγιστα απορρόφησης που αντιστοιχούν σε υδροξύλιο (3,343,4 cm-l) ολεφινικές (1,684 cm-1) λειτουργικές ομάδες. Επιπλέον, τα φάσματα H NMR της ένωσης I αποκάλυψαν ένα μονό σήμα στο 2,6, ένα χαρακτηριστικό σήμα για το H-18 του τύπου ursane τριτερπένια με 19-Ο-υποκαταστάσεις. Το τριτερπένιο τύπου 19a-υδροξυ-ουρσάνιο έχει επίσης ένα τυπικό σήμα πρωτονίου στην περιοχή γύρω από ou 2,6 ppm. Αυτό το αποθωρακισμένο σήμα μπορεί να διαφέρει αισθητά από άλλα συνηθισμένα σήματα πρωτονίων μεθυλενίου, με χαρακτηριστική μετατόπιση λόγω ενός ολεφινικού πρωτονίου (H12) στα 5,28 (t, J=6Hz).cistanche benefíciosΟι πλήρεις και σαφείς αναθέσεις χημικής μετατόπισης «H και l3C» υποβοηθήθηκαν από φάσματα HMQC(13Cx'H) και HMBC(15Cx'H). Από τη διασταυρούμενη κορυφή HMBC, το πρωτόνιο στο ou 2,60 επιβεβαιώθηκε ότι είναι H{ {5}}(Εικ.2α). Άλλοι συγκεκριμένοι χαρακτήρες βρέθηκαν για τις πέντε μονές μεθυλίου στα 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20(κάθε,Η24-27;29),ένα διπλό μεθυλίου σε og 0,92(d, J=6 Hz), και το σήμα ολεφινικού πρωτονίου στα 5,30 (t, J=7 Hz, H-12). Τα σημερινά φάσματα13CNMR δείχνουν 32 συντονισμούς άνθρακα, και με τα φάσματα DEPT και HMQC, εμφάνισαν δύο άνθρακες καρβονυλίου (δC183.70, C-28 και 8-178.96, C-23), έναν ολεφινικό άνθρακα σε oc 127,23,C-12,ένας ολεφινικός τεταρτοταγής άνθρακας(oc139,49,C-13),ένας τεταρτοταγής άνθρακας που φέρει οξυγόνο （o-72.7, C-19 ）, δέκα αλειφατικά μεθυλένια και έξι μεθυλάνθρακες. Οι δύο ολεφινικοί άνθρακες σε δ-127.23(C-12) και 139.49(C-13) ήταν χαρακτηριστικοί του τύπου ουρσανο-τριτερπενοειδούς. Ένα άλλο σήμα έδειξε την παρουσία αιθυλενογλυκόλης (-OCH-CH-O-) εμφανίστηκε σε σήματα στα δ4.62 (d, J=11.5 Hz), 4.05 (d, J=11). 5 Hz）,3,52（d, J{=11,5Hz) και 4,06（d, J{=11,5Hz) και υποστηρίζεται με δ61,27(t) και 63,20(t).Βρισκόταν στο C-2και C-3 με βάση την παρουσία συσχέτισης μεγάλης εμβέλειας στα φάσματα HMBC. Ως εκ τούτου, η ένωση 1 ταυτοποιήθηκε ως 2,3-Ο-αιθυλενογλυκόλη,19-υδροξυουρές-12-εν-23,28-διοϊκό οξύ (Εικ. 3α).

Ένωση 2: ελήφθη ως λευκή άμορφη σκόνη. MS-ESI m/z 527,33 [ΜΗ] t (υπολογ. Για 528,3815). Στα φάσματα LCMS-ESI, υπάρχει μια κορυφή μοριακού ιόντος σε m/z 527,33 [MH]t, υποδεικνύοντας τον μοριακό τύπο CH Os, ο οποίος απαιτούσε 8 βαθμούς ακορεστότητας." {15}})και ολεφινικές(1.686cm-1)λειτουργικές ομάδες.Επιπλέον, τα φάσματα HNMR για την ένωση 2 έδειξαν ένα μονό στο 2,42, το οποίο είναι χαρακτηριστικό του Η18 ενός τριτερπενίου τύπου ουρσανίου με {{24 }}Ο-υποκατάσταση.Εκχύλισμα Cistanche Anti RadiationΆλλα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά φάσματα περιελάμβαναν την παρουσία έξι μονών μεθυλίου σε og1. -24-28,H-30),μια διπλή μεθυλίου στα 0,91 (d,J{=7Hz) και το σήμα ολεφινικού πρωτονίου σε ou 5,37 (d, J{=7 Hz, Η-12). Τα αντίστοιχα φάσματα l3(CNMR και DEPT δείχνουν 33 συντονισμούς άνθρακα, και τα φάσματα HSQC και HMQC υποδεικνύουν την παρουσία ενός άνθρακα καρβονυλίου (oc 182.23, C-28), ενός ολεφινικού άνθρακα （δ-129.36, C -12）, ένας ολεφινικός τεταρτοταγής άνθρακας (δ-140.24, C-13), ένας τεταρτοταγής άνθρακας που φέρει οξυγόνο (oc73.68, C-19), έντεκα αλειφατικό μεθυλένιο και επταμεθυλάνθρακες. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ένωση 2 φέρει έναν ουρσανο-τριτερπενοειδή σκελετό. Τα άλλα σήματα υποδεικνύουν την παρουσία 1,{38}}λειτουργικής ομάδας προπανοδιόλης, σε og 3,22(d,J=11 .5 Hz), 3.42(d,J=10.5 Hz),1.38(m),1.51(m)και 4.02(d,J=11.5Hz)και 3.36(t, J{ {57}}.5Hz).Η λειτουργική του ομάδα έχει συσχέτιση μακράς εμβέλειας με το C2-C3. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, η ένωση 2 ταυτοποιήθηκε ως 2,3-Ο-προπανοδιόλη,{{ 66}}υδροξυουρές-12-εν-28-οϊκό οξύ (Εικ. 2β και 3β). Μια παρόμοια ένωση είναι το 2,3-Ο-Ισοπροπυλιδένιο βασανίζει το οξύ, που απομονώθηκε από το Rubus xanthocarpus.7

Στον Πίνακα 1, όλα τα φάσματα 'Η και ''C NMR συγκρίθηκαν με το torments οξύ (TA/2a,3a,19-τριυδροξυ-12-ursen-28-οϊκό οξύ）², το οποίο είναι Το τριτερπενοειδές ουρσανίου που έχει βρεθεί σε πολλά είδη Rubus-p Το Tormentic acid είχε ισχυρές ομοιότητες με τις ενώσεις 1 και 2, εκτός από το ότι οι χημικές μετατοπίσεις που σχετίζονται με το C-23 και το C31-33 διέφεραν. Αυτό το τμήμα επιβεβαιώθηκε επίσης σε Πειράματα DEPT, HMQC και HMBC (Εικ.2).

Το τριτερπενοειδή βασανίζει το οξύ είναι ευρέως διανεμημένο σε φυσικές φυτικές τροφές. Έχει διάφορες βιοδραστηριότητες: υπογλυκαιμικές επιδράσεις, αντιφλεγμονώδεις και αντιαθηρογόνες ιδιότητες μείωσε τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων των αγγείων και αντιπολλαπλασιαστικές δραστηριότητες σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του νεφρού, του προστάτη και του μελανώματος2426. Επομένως, επειδή αυτές οι ενώσεις έχουν τον ίδιο σκελετό, δεν έχουν πιθανές κατάλληλες πιθανές δραστηριότητες.

Το Σχήμα 4, αντιπροσωπεύει την ανασταλτική δραστικότητα ελαστάσης και τυροσινάσης των προϊόντων απομόνωσης. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από δοκιμασίες αναστολής ενζύμου in vitro εκφράστηκαν ως η τυπική απόκλιση (SD). Οι ενώσεις 1 και 2 ανέστειλαν την ελαστάση με ICso 122.199 και 98.22 ug/mL, και επίσης ανέστειλαν τυροσινάση με ICso 207.79 και 221.51 ug/mL, αντίστοιχα. Ορισμένα πεντακυκλικά τριτερπενοειδή (ουρσολικό οξύ και ολεανολικό οξύ) ανέφεραν ότι έχουν ανασταλτική δράση ελαστάσης2728. Η επίσης τιμή αναστολής ελαστάσης της ένωσης 2 είναι χαμηλότερη από εκείνη της ένωσης 1. Και οι δύο ενώσεις είχαν μικρότερη ανασταλτική δράση από το ολεανολικό οξύ θετικού ελέγχου, το οποίο είχε τιμή ICso 90,39 ug/mL. Σε συμφωνία, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ICso για το ολεανολικό οξύ 76,5 ug/mL και τιμή ICso 31,0 ug/ml για το ουρσολικό οξύ28. Προηγουμένως αναφερθείσες κινητικές αναλύσεις πεντακυκλικών τριτερπενίων έδειξαν ότι αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν ανταγωνιστικά και αναστρέψιμα την ελαστάση των ουδετερόφιλων. Στην ίδια μελέτη, πειράματα μοριακής σύνδεσης έδειξαν ότι το τμήμα μοριακής σκαλωσιάς 28-COOH και οι διπλοί δεσμοί στα πεντακυκλικά τριτερπένια είναι απαραίτητα για τις ανασταλτικές τους δραστηριότητες

Ένα από τα προβλήματα που προκύπτουν με την αύξηση της ηλικίας είναι η υπερμελάγχρωση.cistanche herbaΩς εκ τούτου, υπάρχει μια συνεχής αναζήτηση για παράγοντες λεύκανσης του δέρματος ή νέα αποχρωματισμό. Η καταστολή της τυροσινάσης μπορεί να δράσει κατά της μελανογένεσης ". Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το εκχύλισμα μεθανόλης και οι ενώσεις I και 2 επέδειξαν μέτριες δραστικότητες ως αναστολείς τυροσινάσης.

Σε αυτή την έρευνα, η μοριακή σύνδεση χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ανάλυση των δεσμευτικών δραστηριοτήτων επιλεγμένων ενώσεων στην τυροσινάση και την ελαστάση ως στόχους τους. Οι κρυσταλλικές δομές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το 2Y9X, μια κρυσταλλική δομή τυροσινάσης από Agaricus bisporus με αναστολέα τροπολόνη. και BHGP, μια κρυσταλλική δομή από χοιρινή παγκρεατική ελαστάση συμπλοκοποιημένη με έναν ισχυρό αναστολέα πεπτιδυλίου FR130180. Και τα δύο επιλέχθηκαν επειδή ελήφθησαν από τον ίδιο οργανισμό που χρησιμοποιήθηκε για την in vitro δοκιμασία αυτής της έρευνας. Τα μακρομόρια συνδέονται επίσης με τους αντίστοιχους αναστολείς τους, έτσι ώστε να μπορεί να ληφθεί η ενεργή κατάσταση των διαμορφώσεων του ενζύμου. Οι κρύσταλλοι χρησιμοποιήθηκαν ως το κέντρο του στόχου μοριακής σύνδεσης για να περιορίσουν τις πιθανότητες δέσμευσης της ένωσης έτσι ώστε η διαδικασία βαθμολόγησης να γίνει πιο αποτελεσματική.

Από τη μοριακή σύνδεση, λήφθηκαν μέσες συγγένειες δέσμευσης και για τις δύο ενώσεις, όπως φαίνεται στα Σχήματα 5 και 6. Η πρόβλεψη συγγένειας χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση διαφορετικών προσδεμάτων λαμβάνοντας υπόψη την κορυφαία ενεργειακή θέση κάθε ένωσης, μια πρόβλεψη καλύτερης ενεργειακής στάσης φαίνεται από χαμηλότερες βαθμολογίες συγγένειας δέσμευσης16. Η επαναδέσμευση του καθορισμένου αναστολέα τροπολόνης έγινε με μέσες συγγένειες δέσμευσης -7,41 kcal/mol. Οι μέσες συγγένειες δέσμευσης των ενώσεων 1 και 2 με την τυροσινάση ήταν-7,84 kcal/mol και -8,37 kcal/mol, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Και οι δύο ενώσεις προβλέφθηκε ότι είχαν καλύτερη συγγένεια από τον αναστολέα.

Εν τω μεταξύ, οι μέσες συγγένειες δέσμευσης της δέσμευσης ελαστασέρης ήταν -7,84 kcal/mol. Οι μέσες συγγένειες δέσμευσης των ενώσεων 1 και 2 με την ελαστάση ήταν-7,58 kcal/mol και -8,06 kcal/mol, αντίστοιχα. Παρόλο που το αποτέλεσμα έδειξε ότι η ένωση 1 έχει χαμηλότερες συγγένειες από τον κόκρυσταλλο, είναι ελαφρώς διαφορετική (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Μέθοδοι

Γενικές πειραματικές διαδικασίες. Τα φάσματα «Η και» NMR καταγράφηκαν στα 500 MHz χρησιμοποιώντας ένα όργανο JEOL JNM-ECZ500R/S1. Τα υπέρυθρα (IR) φάσματα μετρήθηκαν με FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Άλλες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, έναν αναγνώστη VersaMax Microplate και έναν BioTek ELX800 Microplate Reader, φύλλα αλουμινίου επικαλυμμένα με lore TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Γερμανία) , χρωματογραφία στήλης (CC) διεξήχθη χρησιμοποιώντας πυριτική γέλη 60 (Merck, Darmstadt, Γερμανία) με 70-230 mesh για ανοιχτή χρωματογραφία και 230-400 mesh για χρωματογραφία κενού. Φυτικά υλικά. Τα φύλλα του R. fraxinifolius συλλέχθηκαν από μια περιοχή φυτείας στο όρος Pangrango της Δυτικής Ιάβας σε ύψος 4.343 ποδιών, τον Δεκέμβριο του 2018. Το δείγμα αναγνωρίστηκε από έναν βοτανολόγο (Dr. Joni Setijo) στο Ερευνητικό Κέντρο Βιολογίας, Ινδονησιακό Ινστιτούτο Sciences, Ινδονησία, με αριθμό δείγματος 033/IPH.1.01/If.07. Η συλλογή φυτικού υλικού είχε λάβει άδεια από τον αγρότη και συμμορφωνόταν με τους θεσμικούς κανονισμούς και οδηγίες.

Εξαγωγή και απομόνωση. Αποξηραμένα στον αέρα κονιοποιημένα φύλλα (2300 g) εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή Soxhlet με διαλύτη βαθμίδωσης (n-εξάνιο, EtOAc και MeOH) για να δώσουν τα αντίστοιχα εκχυλίσματα, και στη συνέχεια εξατμίστηκαν με περιστροφικό εξατμιστήρα και φούρνος κενού. Το εκχύλισμα μεθανόλης (291 g) και το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα (65 g) προσροφήθηκαν στο πυριτικό πήκτωμα και διεξήχθησαν υγρή χρωματογραφία/VLC υπό κενό, εκλούοντας με μια σταδιακή βαθμίδα EtOAc: MeOH (από 1:0 έως 0:1) έως παράγουν κλάσματα για κάθε εκχύλισμα (Eal-Hall και M1-Mill και). Παρόμοια κλάσματα που είχαν θετικές αντιδράσεις με αντιδραστήρια θειικής βανιλίνης σε TLC συνδυάστηκαν. Απόδοση κλάσματος: Eal-3 (2,27 g), Ea4-6 (8,47 g); Ea7-8 (12,9 g); και M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166.42g);M9(10.53g);M{38 }}(2,9 g). Όλα τα κλάσματα υποβλήθηκαν για δράση αναστολέα ελαστάσης, Fr. Το Μ8 έδωσε τη μεγαλύτερη απόδοση και είχε ισχυρή δραστηριότητα. Ο π. Μ8 διαδοχικά περαιτέρω καταμερισμός με CC πάνω από πυριτική πηκτή (διαλύτης έκλουσης CH2Cl2/MeOH με βαθμιαία βαθμίδα) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας στήλη Sephadex LH-20 (έκλουση με CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Δύο κλάσματα παρουσίασαν στερεά φύση και κρυσταλλώθηκαν με χλωροφόρμιο και μεθανόλη για να ληφθούν δύο προϊόντα απομόνωσης: ένωση 1 (18 mg) και: 2 (31 mg). οξύ σε μεθανόλη, ακολουθούμενη από θέρμανση των πλακών στους 110 βαθμούς για 5 λεπτά.

Οι κρύσταλλοι ταυτοποιήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (LCMS), ενίσχυση παραμορφώσεων LH και '3C με μεταφορά πόλωσης (DEPT)NMR, ετεροπυρηνική απλή κβαντική συνοχή (HSQC), ετεροπυρηνική πολλαπλή κβαντική συσχέτιση (HMQC), και πολλαπλή συσχέτιση ομολόγων (HMBC).

Δοκιμασία αναστολής ελαστάσης. Η δοκιμασία αναστολής ελαστάσης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις32. Εν συντομία, σε πλάκες μικροτιτλοδότησης Nunc-96 πηγαδιών, 20-μL κλάσματα του 0.8-μονάδες/mL PPE σε ρυθμιστικό διάλυμα βάσης βαθμών Trizma (pH 8.0). ） αναμίχθηκαν με 20-μL δείγματα και τα μείγματα στη συνέχεια αραιώθηκαν στα 180 μL σε ρυθμιστικό διάλυμα βάσης Trizma βαθμού. Τα εκχυλίσματα δοκιμής προεπωάστηκαν με ένζυμο για 15 λεπτά και προστέθηκαν κλάσματα 20-μL του υποστρώματος N-ηλεκτρυλο-Αla-Αla-Αla-ρ-νιτροανιλίδιο (A3PVN;2,9 mM) και επωάστηκαν για άλλα 15 λεπτά. Ο θετικός έλεγχος και τα τυφλά φρεάτια περιείχαν ολεανολικό οξύ και νερό, αντίστοιχα. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και οι ρυθμοί αναστολής προσδιορίστηκαν ανάλογα με την απορρόφηση. στα 401 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας VersaMax. Η ποσοστιαία αναστολή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

όπου E είναι η απορρόφηση της ενζυμικής αντίδρασης, Eb είναι η απορρόφηση του τυφλού ενζύμου, T είναι η απορρόφηση του δείγματος δοκιμής και Tb είναι η απορρόφηση του τυφλού τυφλού ενζύμου. Οι τιμές προσδιορίστηκαν επίσης από ένα γραμμικό γράφημα ποσοστιαίας αναστολής ελαστάσης έναντι της συγκέντρωσης (50,75,100,125,150 μg/mL). Δοκιμασία αναστολής τυροσινάσης. Η αναστολή της τυροσινάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σχηματισμού χρωμίου DOPA όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις13. Εν συντομία, σε 96-πλάκες φρεατίων, κλάσματα 20 μL DMSO (μάρτυρας) ή ενώσεις δοκιμής σε ποικίλες συγκεντρώσεις αναμίχθηκαν με δείγματα 40 μL 30 U/mL τυροσινάσης μανιταριού (Sigma Aldrich) και 100-μL 0.1-Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών Μ (pH 6,8). Προεπωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με κλάσματα addirg4μL 10mML-DOPA σε κάθε φρεάτιο και επώασαν στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά. Η δραστικότητα τυροσινάσης στη συνέχεια προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 475 nm. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το Kojic acid. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Το ποσοστό της αναστολής της τυροσινάσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

όπου E είναι η απορρόφηση της ενζυμικής αντίδρασης, Eb είναι η απορρόφηση του τυφλού ενζύμου, T είναι η απορρόφηση του δείγματος δοκιμής και Tb είναι η απορρόφηση του τυφλού τυφλού ενζύμου. Οι τιμές προσδιορίστηκαν επίσης από ένα γραμμικό γράφημα ποσοστιαίας αναστολής ελαστάσης έναντι της συγκέντρωσης (250,125,62,5,31,25,15,6 μg/mL).

Μοριακή σύνδεση. Σε αυτή την έρευνα, η φαρμακολογική δραστηριότητα στο silico προβλέφθηκε με μοριακή σύνδεση χρησιμοποιώντας γιατρό. Η στοχευμένη μοριακή σύνδεση έγινε με τη χρήση ενός συγκρυσταλλωμένου συνδετήρα ως το κέντρο της ενεργού θέσης. Η δομή 2Y9X χρησιμοποιήθηκε για τη μοριακή σύνδεση της τυροσινάσης με την τροπολόνη, έναν αναστολέα της τυροσινάσης μανιταριού, ως κρύσταλλο. Το κέντρο της θέσης μοριακής σύνδεσης ορίζεται στις διαστάσεις -10.032;-28.769 και-43.467 ως Χ, Υ και Ζ αντίστοιχα. Η αλυσίδα Α διαχωρίστηκε για χρήση και το άτομο Holmium αφαιρέθηκε από τη δομή χρησιμοποιώντας Χίμαιρα UCSF.

Η δομή του 3HGP, μιας ελαστάσης χοίρου χρησιμοποιήθηκε επίσης σε αυτή την έρευνα. Οι συντεταγμένες ήταν 12.453, 9.237, και 1.199 για τις διαστάσεις X,Y,Z, αντίστοιχα. Η συγγένεια δέσμευσης αναλύθηκε από τους δέκα καλύτερους διαμορφωτές κάθε υπολογισμού μοριακής σύνδεσης.

Αυτό το άρθρο προέρχεται από το Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x