Η πρωτεΐνη 75 ρυθμιζόμενη με μορταλίνη/γλυκόζη προάγει την αντίσταση στη σισπλατίνη του καρκίνου του στομάχου

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη

Η θεραπεία με φάρμακα με πλατίνα είναι μια από τις πιο κυρίαρχες χημειοθεραπευτικές στρατηγικές για ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (GC). Ωστόσο, το θεραπευτικό αποτέλεσμα είναι λιγότερο από ικανοποιητικό, σε μεγάλο βαθμό λόγω της επίκτητης αντοχής στα φάρμακα από πλατίνα. Επομένως, η καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της GC. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε τις λειτουργίες/μηχανισμούς που σχετίζονται με τη χημειοανθεκτικότητα και την κλινική σημασία της ρυθμιζόμενης με γλυκόζη πρωτεΐνης 75 (GRP75) στο GC. Εδώ, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα SGC7901, η έκφραση του GRP75 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην αντίσταση στη σισπλατίνη (κύτταρα (SGC7901 *). Η πτώση του GRP75 κατάργησε τη διατήρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MP) και ανέστειλε τον πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδές{{{ 10}}σχετιζόμενος παράγοντας 2 (NRF2), κινάση φωσφατιδυλινοσιτόλης 3/κινάση πρωτεΐνης Β (Pl3K/AKT), επαγόμενος από την υποξία παράγοντα 1a (HIF-1a) και c-myc, που οδήγησε σε αποκλεισμό της ενεργοποίησης Οι διεργασίες αυτές εξασθένησαν τις ικανότητες κατά της οξείδωσης/απόπτωσης και άλλαξαν τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό στα κύτταρα SGC7901, οδηγώντας στην εκ νέου ευαισθητοποίηση αυτών των κυττάρων στη σισπλατίνη. Ωστόσο, η υπερέκφραση του GRP75 στα κύτταρα SGC7901 προκάλεσε τα αντίθετα αποτελέσματα. Ένα μοντέλο ξενομοσχευμάτων επιβεβαίωσε τα προαναφερθέντα αποτελέσματα Σε ασθενείς με GC που έλαβαν χημειοθεραπεία με πλατίνα και μια μετα-ανάλυση, ένα υψηλό επίπεδο GRP75 συσχετίστηκε θετικά με επιθετικά χαρακτηριστικά και κακή πρόγνωση, συμπεριλαμβανομένης, αλλά χωρίς περιορισμό, της γαστρικής καρκίνους του εντέρου και ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση. Συλλογικά, η μελέτη μας έδειξε ότι το GRP75 εμπλέκεται στην αντοχή του GC στη σισπλατίνη και ότι το GRP75 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για την αποκατάσταση της απόκρισης του φαρμάκου σε κύτταρα με αντίσταση στην πλατίνα και ένα χρήσιμο πρόσθετο προγνωστικό εργαλείο στην καθοδήγηση της κλινικής διαχείρισης ασθενών με GC.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του στομάχου (GC) ήταν η πρώτη κύρια συχνότητα εμφάνισης και η δεύτερη κύρια θνησιμότητα καρκίνων του πεπτικού συστήματος στην Κίνα. Οι τρέχουσες θεραπείες για προχωρημένο GC ήταν η χειρουργική επέμβαση σε συνδυασμό με συστηματική χημειοθεραπεία, αλλά το ποσοστό μακροπρόθεσμης επιβίωσης ήταν λιγότερο από ικανοποιητικό λόγω της υψηλής μετεγχειρητικής υποτροπής2. Στην κλινική πρακτική, τα φάρμακα από πλατίνα ήταν ένας από τους παράγοντες πρώτης γραμμής για προχωρημένες Χημειοθεραπεία GC3. Ωστόσο, η επίκτητη αντοχή στα φάρμακα εμφανιζόταν πάντα μετά από πολλαπλούς κύκλους θεραπείας με βάση την πλατίνα και υποδηλώνει κακή πρόγνωση.κιστανάκιΩς εκ τούτου, ο φωτισμός των πιθανών μηχανισμών και ο εντοπισμός των νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την υπερνίκηση της αντίστασης στα φάρμακα της πλατίνας σε ασθενείς με GC ήταν επειγόντως απαραίτητη.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Η ρυθμιζόμενη με γλυκόζη πρωτεΐνη 75 (GRP75) ήταν ο επαγόμενος από το στρες μοριακός συνοδός που ανήκε στην οικογένεια των πρωτεϊνών θερμικού σοκ4. Η υπερέκφραση του GRP75 συσχετίστηκε στενά με την εξέλιξη του όγκου σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους5-7. Εδώ, μέσω της διερεύνησης μιας μετα-ανάλυσης, διαπιστώσαμε ότι ένα υψηλό επίπεδο GRP75 έδειξε μια σημαντικά κακή πρόγνωση σε αρκετούς καρκίνους του πεπτικού συστήματος (καρκίνος του παχέος εντέρου, χολαγγειοκαρκίνωμα και καρκίνος του παγκρέατος). Για την αντοχή στα φάρμακα, η αναστολή του GRP75 ανέστρεψε την αντίσταση στη σισπλατίνη και τη δοξορουβικίνη στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και τον καρκίνο των ωοθηκών ". Το GRP75 δέσμευσε κλασικά την ρ53 στο κυτταρόπλασμα, οδηγώντας στην απενεργοποίηση της λειτουργίας της ρ53 και καταστέλλοντας την εφαρμογή-tosis10. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η GRP75 οι θετικοί όγκοι είχαν χειρότερη πρόγνωση σε σύγκριση με τους αρνητικούς όγκους GRP75 σε GC με φυσιολογική λειτουργία p53. Ωστόσο, το p53 ήταν ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια στο GC (επηρεάζει περισσότερο από το 50 τοις εκατό των ασθενών)l2-15. Έτσι υποθέσαμε ότι εκτός από την κλασική καταστολή της δραστηριότητας του p53, το GRP75 μπορεί να εμπλέκεται στην πρόκληση/διατήρηση της αντίστασης στα φάρμακα της πλατίνας στο GC μέσω της χρήσης ap53-ανεξάρτητου τρόπου.

Σε αυτή τη μελέτη, η υψηλότερη έκφραση του GRP75 συνέβαλε στην αντίσταση στη σισπλατίνη στα κύτταρα SGC7901 και σε ένα μοντέλο ξενομοσχευμάτων. Μηχανιστικά, το GRP75 προκάλεσε/διατήρησε την αντίσταση στη σισπλατίνη μέσω της ρύθμισης των αντιοξειδωτικών/αποπτωτικών ικανοτήτων και των ιδιοτήτων μεταβολικού επαναπρογραμματισμού.cistanche ΑυστραλίαΣε ασθενείς με GC, η υπερέκφραση του GRP75 συνέβαλε στα επιθετικά χαρακτηριστικά και στην κακή πρόγνωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το GRP75 προήγαγε την αντίσταση στη σισπλατίνη στο GC και θα μπορούσε να είναι ένας βιοδείκτης για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία με φάρμακα με πλατίνα.οφέλη από το cistancheΗ στόχευση GRP75 μπορεί να προσφέρει μια νέα κατανόηση της συστηματικής χημειοθεραπείας GC.

Αποτελέσματα

Οι επιδράσεις του GRP75 στην αντίσταση στην σισπλατίνη σε προσδιορισμούς βιωσιμότητας κυττάρων GC χρησιμοποιήθηκαν για την επαλήθευση της αντοχής των κυττάρων SGC7901~, τα Ipsos (uM) της σισπλατίνης για τα κύτταρα SGC7901 και SGC7901CR ήταν: 5.518 έναντι 72.46 (Εικ.). Με βάση τις βάσεις δεδομένων KM-Plotter, η αυξημένη έκφραση του GRP75 έδειξε κακή πρόγνωση (Εικ.1Β). Επιπλέον, αξιοσημείωτα αυξημένες εκφράσεις GRP75 στα κύτταρα SGC7901CR σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα SGC7901 (Εικ. 1C), υποδηλώνοντας ότι το GRP75 μπορεί να συνεισφέρει στην αντοχή στην σισπλατίνη. Για την επαλήθευση αυτής της υπόθεσης, τα κύτταρα SGC7901~ επιμολύνθηκαν με scramble- ή GRP75 siRNA και τα IC50s (uM) της σισπλατίνης για τα επιμολυσμένα με ή GRP75 siRNA κύτταρα SGC7901CK ήταν: 50,83 έναντι 20.{29}, αντίστοιχα. . 1D). Σε αντίθεση,

υπερέκφραση του GRP75 με διαμόλυνση των πλασμιδίων GRP75 σε κύτταρα SGC7901 έδειξε ότι οι IC50 της σισπλατίνης για τα μορφομετατραπέντα πλασμίδια SGC7901 με πλασμίδια GRP75 ήταν 3,825 έναντι 6,98 (Εικ. 1Ε). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το GRP75 έπαιξε κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση/επαγωγή της αντοχής στην σισπλατίνη στο GC, αλλά οι μηχανισμοί παρέμειναν περαιτέρω διερεύνησης.

Πιθανοί μηχανισμοί στους οποίους βασίζεται το GRP75 προκάλεσαν αντοχή στη σισπλατίνη

Κατεβάσαμε σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχίας GSE122130 (SGC7901CR έναντι SGC7901) και GSE14209 (ιστοί, ανθεκτικοί στη σισπλατίνη έναντι ευαίσθητοι στη σισπλατίνη) από το GEO, στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε τη διαδικασία GO-Biological και το KEGG-Pathway ID0, ανάλυση εμπλουτισμού με βάση την κορυφή DAV1 Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 2Α-Δ. Οι βασικές διαφορές των βιολογικών διεργασιών μεταξύ των κυττάρων SGC7901C* και των κυττάρων SGC7901 περιελάμβαναν την οξείδωση-αναγωγή, την αποπτωτική διαδικασία (Εικ. 2Α), την ανάλυση εμπλουτισμού του KEGG-Pathway διαπίστωσε ότι τα σύνολα DEGs συσχετίστηκαν στενά με τις μεταβολικές οδούς και την κινάση Β-3 φωσφατιδυλινοσιτόλης/κινάση (PI3K/AKT) μονοπάτι (Εικ. 2Β). Η απόκριση στο φάρμακο συμπεριλήφθηκε στις βασικές διαφορές των βιολογικών διεργασιών μεταξύ των ανθεκτικών στη σισπλατίνη και των ευαίσθητων στη σισπλατίνη ιστών όγκου και η μεταβολική οδός ήταν επίσης ο βασικός κρίκος στην ανάλυση εμπλουτισμού KEGG-Pathway (Εικ. 2C, D). Επιπλέον, ένα δίκτυο 60 πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούσαν σημαντικά με το GRP75 κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων String, και στη συνέχεια η ανάλυση KEGG-Pathway έδειξε ότι τα μεταβολικά μονοπάτια έπαιξαν σημαντικό ρόλο μεταξύ του GRP75 και των αλληλεπιδρώντων του (Εικ. 2Ε). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, υποθέσαμε ότι η αντιοξείδωση/απόπτωση και ο μεταβολικός επαναπρογραμματισμός μπορεί να προάγουν την επιβίωση και την ανάπτυξη του GC που οδηγεί σε αντίσταση στη σισπλατίνη. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της συμμετοχής του GRP75 στη ρύθμιση χρειάζονταν περαιτέρω μελέτη (Εικ. 2ΣΤ).

Επιδράσεις του GRP75 στην αντι-οξείδωση και κατά της απόπτωσης Εδώ, το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS ήταν αυξημένο στα κύτταρα SGC7901CR σε σύγκριση με τα γονικά αντίστοιχα (Εικ. 3Α), υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα SGC7901Ck εκτέθηκαν σε σχετικά υψηλότερες συνθήκες οξειδωτικού στρες. Μια προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι το GRP75 συμμετείχε στη σταθεροποίηση του MMP, μιας σημαντικής πηγής παραγωγής ROS. Εδώ, η καταστροφή του GRP75 κατάργησε τη διατήρηση της MMP σε κύτταρα SGC7901CK που προκλήθηκαν από σισπλατίνη και η υπερέκφραση του GRP75 είχε το αντίθετο αποτέλεσμα στα κύτταρα SGC7901 (Εικ. 3Β).cistanche χοληστερόληΣτη συνέχεια, επικυρώσαμε τη σχέση μεταξύ GRP75 και αντιοξείδωσης και αντι-απόπτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Γ, η μείωση του GRP75 μείωσε το επίπεδο του πυρηνικού παράγοντα ερυθροειδούς-2-που σχετίζεται με τον παράγοντα 2 (NRF2) και τα κατάντη γονίδια-στόχους του (HO-1 και NQO-1) στο SGC7901 ~ κύτταρα και η υπερέκφραση του GRP75 έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα στα κύτταρα SGC7901. Επιπλέον, η καταστροφή του GRP75 ή του NRF2 σε κύτταρα SGC7901CR ενίσχυσε περαιτέρω τις ενδοκυτταρικές γενιές ROS, την απόπτωση (Εικ. 3D) και τις δραστηριότητες κασπάσης-3 (Συμπληρωματικό Σχήμα S1) που προκαλούνται από τη σισπλατίνη. Αντίθετα, η υπερέκφραση του GRP75 σε κύτταρα SGC7901 εξασθένησε σημαντικά τις επαγόμενες από σισπλατίνη γενιές ROS, την κυτταρική απόπτωση (Εικ. 3Ε) και τις δραστηριότητες κασπάσης-3 (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η διατήρηση/επαγόμενη αντίσταση στην σισπλατίνη από το GRP75 μπορεί να οφείλεται στην πρόκληση αντιοξείδωσης και αντι-απόπτωσης σε κύτταρα GC.

Επιδράσεις του GRP75 στον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό Στη συνέχεια, διερευνήσαμε περαιτέρω όπου το GRP75 προκάλεσε μεταβολή του μεταβολικού επαναπρογραμματισμού. Τα αυξανόμενα στοιχεία έδειξαν ότι ο μεταβολισμός των καρκινικών κυττάρων δεν ήταν μια ανώμαλη αλλαγή σε ένα μόνο μεταβολικό μονοπάτι, αλλά ένας επαναπρογραμματισμός ολόκληρου του κυτταρικού μεταβολικού δικτύου7. Πολλά κλασικά ογκογονίδια ή μονοπάτια σηματοδότησης εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό, όπως το PI3K/AKT, ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντα la (HIF-la), ο c-myc και ούτω καθεξής"'819. Επομένως, επαληθεύσαμε εάν το GRP75 ήταν εμπλέκονται στον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό των κυττάρων GC Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα p-AKT, HIF-la και c-myc στα κύτταρα SGC7901CR σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα SGC7901. Επιπλέον, στα κύτταρα SGC7901CR, καταστροφή του Το GRP75 μείωσε τα επαγόμενα από σισπλατίνη επίπεδα πρωτεΐνης p-AKT, HIF-la και c-Myc και τους κατάντη στόχους τους που σχετίζονται με τη γλυκόλυση (HK2: εξοκινάση 2, PDK1: πυροσταφυλική αφυδρογονάση κινάση l και LDHA: γαλακτική αφυδρογονάση Α αλυσίδα). Αντίθετα, η υπερέκφραση του GRP75 στα κύτταρα SGC7901 έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα (Εικ. 4Β, Γ).Περαιτέρω, η μείωση του GRP75 ή του AKT στα κύτταρα SGC7901CR έδειξε σημαντική μείωση στην πρόσληψη γλυκόζης και τη βιωσιμότητα/ανάπτυξη των κυττάρων που επάγεται από τη σισπλατίνη. υπερέκφραση του GRP75 σε κύτταρα SGC7901 αξιοσημείωτα αύξησε την ικανότητα πρόσληψης γλυκόζης και τη βιωσιμότητα/ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από τη σισπλατίνη (Εικ. 4D-F). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η GRP75 που διατηρεί/επάγει την αντίσταση στη σισπλατίνη στα κύτταρα GC μπορεί να οφείλεται στη συμμετοχή σε μεταβολικό επαναπρογραμματισμό με τη μεσολάβηση p-AKT, HIF-la και c-myc.

Επιβεβαίωση των δεδομένων in vitro σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος Στη συνέχεια ερευνήσαμε την πιθανή κλινική σημασία του GRP75 in vivo. Τα δεδομένα του ξενομοσχεύματος έδειξαν ότι η θεραπεία με σισπλατίνη μόνο ή η μείωση του GRP75 μόνο θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, η θεραπεία με σισπλατίνη σε συνδυασμό με την αναστολή του GRP75 διευκόλυνε σημαντικά την επαγόμενη από τη σισπλατίνη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (Εικ. 5Α). Επιπλέον, οι δοκιμές IHC και qPCR έδειξαν ότι η σισπλατίνη συν GRP75 siRNA μείωσε σημαντικά τις εκφράσεις των Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT και των κατάντη στόχων σε σύγκριση με τη θεραπεία με σισπλατίνη μόνο, αλλά αύξησε την απόπτωση (όπως προσδιορίστηκε με χρώση TUNEL, Εικ. 5Β , Γ). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μέσω της ρύθμισης των αντιοξειδωτικών/αντι-απόπτωσης και του μεταβολικού επαναπρογραμματισμού, το GRP75 διέγειρε την in vivo επιβίωση και ανάπτυξη που με τη σειρά του οδήγησε σε αντίσταση του GC στην σισπλατίνη.

Προσδιορισμός του GRP75 ως χαρακτηριστικού παράγοντα που προάγει τον καρκίνο και η κλινική σημασία του GRP75 στο GC

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την έκφραση GRP75 σε διαδοχικές τομές δειγμάτων GC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, σε σύγκριση με γειτονικούς γαστρικούς ιστούς χωρίς όγκο, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της έκφρασης GRP75 σε ιστούς GC. Η υπερέκφραση του GRP75 καταδείχθηκε σε ιστούς GC με βαθμολογία IHC-έντασης (Εικ. 6Β). Ισχυρότερη χρώση για το GRP75 παρατηρήθηκε επίσης με την αύξηση του TNM Ταξινόμηση σταδίου κακοήθων όγκων (Εικ. 6C, D). Στη συνέχεια, χωρίσαμε αυτά τα 116 δείγματα GC σε δύο ομάδες ("GRP75 low" vs." GRP75 high", σύμφωνα με την ένταση IHC, Εικ. 6E). Οι εγκάρσιες διάμετροι όγκων στην ομάδα "GRP75 high" ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από αυτές στην ομάδα "GRP75 low" (Εικ. 6F). Επικυρώσαμε περαιτέρω την κλινική πρόγνωση του GRP75 σε GC. Η ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε επίσης ότι οι ασθενείς με GC στην ομάδα "GRP75 υψηλό" είχαν χειρότερη συνολική επιβίωση από εκείνους στην ομάδα "GRP75 low" (Εικ. 6G).

Η πολυπαραγοντική ανάλυση εντόπισε ότι το GRP75 ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση (Πίνακας 1).παρενέργειες cistanche deserticola,Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GRP75 είχε έναν χαρακτηριστικό ρόλο στην καθοδήγηση της εξέλιξης του GC, στην αντίσταση στη σισπλατίνη και στην κακή πρόγνωση. Η μετα-ανάλυση του υψηλού επιπέδου του GRP75 με το διάγραμμα ροής πρόγνωσης της βιβλιογραφικής αναζήτησης και επιλογής και μετα-ανάλυσης παρουσιάστηκαν στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2. Το μοντέλο τυχαίας επίδρασης και το μοντέλο σταθερού αποτελέσματος χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό και την ανάλυση της τιμής HR, και τα δύο έδειξαν ότι τα υψηλά επίπεδα GRP75 σχετίζονται σημαντικά με κακή έκβαση των ασθενών. Το συγκεντρωμένο HR ήταν 1,91 (95 τοις εκατό CI 1,62 έως 2,25), με ετερογένεια(I'{=0.0 τοις εκατό ,p =0.559)(Εικ. 7Α). Στη συνέχεια, κάναμε μια ανάλυση υποομάδας, η οποία έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης του GRP75 στον καρκίνο του γαστρεντερικού (το συγκεντρωμένο HR ήταν 1,99,95 τοις εκατό CI 1,64 έως 2,43), έχει σημαντική σχέση με την κακή πρόγνωση επιβίωσης. Βεβαίως, παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και σε άλλους όγκους (το ομαδοποιημένο HR ήταν 1,74,95 τοις εκατό CI 1,29 έως 2,33) (Εικ. 7Β). Και τα δυο

Η γραφική παράσταση της διοχέτευσης του Begg και η δοκιμή Egger χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της πιθανής μεροληψίας δημοσίευσης των μελετών που συμπεριλήφθηκαν. Στην ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ GRP75 και OS, η τιμή p της δοκιμής Begg και της δοκιμής Egger ήταν 0.076 και 0,024, αντίστοιχα (Εικ. 7C και D). Ωστόσο, το τεστ Egger έχει μεγαλύτερη ευαισθησία στην αξιολόγηση της μεροληψίας δημοσίευσης. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος περικοπής και πλήρωσης για να γίνουν πιο αξιόπιστα τα αποτελέσματά μας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Ε, το προσαρμοσμένο HR στο μοντέλο σταθερής επίδρασης ήταν 1,785 (95 τοις εκατό CI 1,530 έως 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε έναν από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες πρώτης γραμμής για ασθενείς με GC, φάρμακα πλατίνας. Κλασικά, τα φάρμακα πλατίνας θα μπορούσαν να συνδεθούν ομοιοπολικά με τη γουανίνη στην αλυσίδα του DNA και έτσι να εμποδίσουν την αντιγραφή και τη μεταγραφή του DNA2. Ωστόσο, λόγω της αντοχής στο φάρμακο και των ανεπιθύμητων παρενεργειών, ο εντοπισμός νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την αναστροφή της αντίστασης σε ασθενείς με GC ήταν επειγόντως απαραίτητος. Επιπλέον, οι ασθενείς με GC ανέπτυξαν αντοχή στο φάρμακο μετά τη λήψη πολλών σειρών σισπλατίνης και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα κύτταρα SGC7901~ παρουσίασαν σημαντική αντοχή στη σισπλατίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα SGC7901.

Το GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) έπαιξε βασικό ρόλο στη ρύθμιση της έναρξης και της εξέλιξης των ανθρώπινων καρκίνων-7. Πιο πρόσφατα, έγινε σαφές ότι το GRP75 είχε επίσης κρίσιμο ρόλο στην αντοχή στη χημειοθεραπεία ". Εκτός από το GRP75, άλλες πρωτεΐνες θερμικού σοκ έπαιξαν κρίσιμο ρόλο στην αντοχή στη σισπλατίνη μέσω PI3K/AKT/NF-KB και άλλων οδών21-24 Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του GRP75 και της αντίστασης στη σισπλατίνη αναφέρθηκε σπάνια. Εδώ, η μελέτη μας αποκάλυψε ότι το GRP75 προήγαγε τις ικανότητες αντιοξείδωσης/απόπτωσης και άλλαξε τον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό, οδηγώντας σε αντίσταση στη σισπλατίνη στα κύτταρα GC. Βρήκαμε επίσης ότι το GRP75 ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε SGC7901~ κύτταρα και σε δείγματα ιστών από ασθενείς και συσχετίστηκε με την αντοχή στα φάρμακα, την προ-επιβίωση, την ανάπτυξη και τα φτωχά αποτελέσματα. Εν τω μεταξύ, η πολυπαραγοντική ανάλυση εντόπισε ότι το GRP75 ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση. Επιπλέον, η μετα-ανάλυση έδειξε ότι Το υψηλό επίπεδο GRP75 έδειξε κακή πρόγνωση συμπεριλαμβανομένης, ενδεικτικά, της GC, η οποία ήταν σε μεγάλο βαθμό συνεπής με την έρευνά μας. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα επικύρωσαν ότι η στόχευση GRP75 θα μπορούσε αναμένεται να γίνει μια νέα προσέγγιση για την αναστροφή της αντίστασης στη σισπλατίνη και τη βελτίωση της πρόγνωσης των ασθενών με GC.

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα κύτταρα αναπόφευκτα εκτέθηκαν σε ROS από εξωτερικούς παράγοντες και τον ενδοκυτταρικό αερόβιο μεταβολισμό. Ως δίκοπο μαχαίρι, τα κατάλληλα ROS ήταν σημαντικά μόρια σήματος που ρυθμίζουν τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, ενώ το υπερβολικό ROS οδήγησε σε απόπτωση. Ως εκ τούτου, υπήρχε ένα ακριβές σύστημα ρύθμισης αντιοξειδωτικών στο σώμα για τη διατήρηση της ισορροπίας οξειδοαναγωγής και των αποπτωτικών διαδικασιών 20. Ωστόσο, σε αντίθεση με τις φυσιολογικές συνθήκες, τα επίπεδα ROS των όγκων ήταν γενικά σημαντικά υψηλότερα από τα φυσιολογικά μάρτυρες ίδιας προέλευσης ιστού, γεγονός που καθόρισε την ύπαρξη ειδικής αντιοξειδωτικό σύστημα σε καρκινικά κύτταρα, ειδικά για καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά στα φάρμακα27-29. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι τα κύτταρα SGC7901CR εμφάνισαν σχετικά υψηλότερο επίπεδο ROS σε σύγκριση με τα κύτταρα SGC7901 και ότι το GRP75 αύξησε τις ικανότητες αντιοξείδωσης/απόπτωσης. Τα καρκινικά κύτταρα είχαν μακρά ιστορία μεταβολικών ανωμαλιών. Ήδη από τη δεκαετία του 1930, ο Otto Warburg ανακάλυψε ότι τα καρκινικά κύτταρα προτιμούν τη γλυκόλυση. Ακόμη και υπό συνθήκες επαρκείς σε οξυγόνο, τα καρκινικά κύτταρα εξακολουθούσαν να διατηρούν υψηλά ποσοστά γλυκόλυσης για την παραγωγή ΑΤΡ. Αυτό το μη φυσιολογικό μεταβολικό πρότυπο ονομάστηκε «φαινόμενο Warburg»3031. Οι μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από το φαινόμενο Warburg είχαν πρόσφατα αναφερθεί ως μεταβολικός επαναπρογραμματισμός και οι μελέτες αυτών των αλλαγών παρείχαν μια βαθύτερη κατανόηση του μεταβολισμού των κυττάρων GC. Είχε αποδειχθεί ότι τα κύτταρα GC και τα φυσιολογικά κύτταρα εμφάνισαν μεταβολικές διαφορές όχι μόνο στο μεταβολισμό της γλυκόζης αλλά και στο μεταβολισμό των λιπιδίων και των αμινοξέων³2-35.Σε αυτήν την έρευνα, διαπιστώσαμε ότι οι αλλαγές στον μεταβολισμό της γλυκόζης ήταν ένας από τους βασικούς δεσμούς διατήρησης της κυτταρικής ανάπτυξης, οδηγώντας τελικά σε αντίσταση GC σισπλατίνης.

Όπως αναφέραμε, τα κλασικά ογκογονίδια και οι οδοί σηματοδότησης όπως τα PI3K/AKT, HIF-la και c-myc εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό. Η ενεργοποίηση της οδού PI3K/AKT στα καρκινικά κύτταρα ενίσχυσε πολλές από τις μεταβολικές δραστηριότητες. Πρώτον, επέτρεψε στα κύτταρα να προσλάβουν γλυκόζη, αμινοξέα και άλλα θρεπτικά συστατικά. Δεύτερον, το AKT αύξησε τη γλυκόλυση και την παραγωγή γαλακτικού μέσω των επιδράσεών του στην έκφραση γονιδίων και τη δραστηριότητα των ενζύμων και ήταν επαρκής για να προκαλέσει ένα φαινόμενο War-burg στα καρκινικά κύτταρα. Τρίτον, η ενεργοποίηση αυτής της οδού ενίσχυσε τη βιοσύνθεση των μακρομορίων και διεγείρει την έκφραση λιπογονικών γονιδίων και τη σύνθεση λιπιδίων»7. Επιπλέον, το GRP75-ενεργοποίησε το AKT και τις εξωκυτταρικές πρωτεϊνικές κινάσες 1 και 2 ρυθμιζόμενες με σήμα ανέστειλαν τις διαμορφωτικές αλλαγές Bax και την απόπτωση 8. Τα καρκινικά κύτταρα προσαρμόστηκαν στην υποξία που περιλαμβάνει μεταβολικό επαναπρογραμματισμό μέσω γονιδίων στόχου HIF-la που ρυθμίζουν προς τα πάνω για να διεγείρουν την πρόσληψη γλυκόζης, γλυκόζη παραγωγή και έκκριση γαλακτικού οξέος, αποθήκευση γλυκογόνου, καταβολή γλουταμίνης³ και προαγωγή της συσσώρευσης τριγλυκεριδίων σε σταγονίδια λιπιδίων³. Πιο πρόσφατα, έγινε σαφές ότι το GRP75 θα μπορούσε να συνδεθεί ειδικά με το HIF-la και να στοχεύσει την εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, που σχετίζεται με VDAC1 και HK2, που απέτρεψαν την απόπτωση». Το C-myc θα μπορούσε να μεσολαβήσει στον μεταβολικό επαναπρογραμματισμό με διάφορους τρόπους και ο μεταβολικός επαναπρογραμματισμός με τη μεσολάβηση του c-myc επιτεύχθηκε σε μεγάλο βαθμό επηρεάζοντας τα μιτοχόνδρια. Από τη μία πλευρά, το c-myc προήγαγε επίσης τη γλυκόλυση ρυθμίζοντας άμεσα την έκφραση των ενζύμων που σχετίζονται με τη γλυκόλυση, συμπεριλαμβανομένων των LDHA, HK2 και PDK11938. Από την άλλη, τα ενεργοποιημένα ένζυμα c-myc που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της γλουταμίνης μέσω μεταγραφής προώθησαν τη χρήση γλουταμίνη από τα μιτοχόνδρια στα καρκινικά κύτταρα. Αυτή η επίδραση ονομάζεται «γλουταμινόλυση». Επιπλέον, η υπερέκφραση του GRP{27} μείωσε την Cyclin-B1 και ρυθμίζει προς τα πάνω τα Cyclin-D1 και c-myc για την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών*. Με βάση τα σημερινά μας αποτελέσματα, προσφέραμε μια νέα κατανόηση της αντίστασης της GC σισπλατίνης μέσω του GRP75 ως δυνητικά σημαντικού κρίκου στη ρύθμιση των δικτύων επαναπρογραμματισμού μεταβολικού όγκου.

συμπεράσματα

Συμπερασματικά, δείξαμε ότι η υπερέκφραση του GRP75 θα μπορούσε να προάγει την επιβίωση/ανάπτυξη στα κύτταρα GC ρυθμίζοντας τα δίκτυα αντιοξείδωσης/απόπτωσης και μεταβολικού επαναπρογραμματισμού, προκαλώντας έτσι αντίσταση στη σισπλατίνη

Υλικά και μέθοδοι

Κύτταρα, αντιδραστήρια και συνθήκες καλλιέργειας

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 τοις εκατό καθαρότητας), αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, ΗΠΑ), συμπληρώθηκαν με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 U/ml πενικιλλίνη, 100 ug/ml στρεπτομυκίνη (Gibco) και επωάστηκαν σε 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς. Για τη διατήρηση του φαινοτύπου αντοχής στη σισπλατίνη, τα κύτταρα SGC7901CR επωάστηκαν σε ένα μέσο που περιείχε σισπλατίνη (5μM).

Ξενομοσχεύματα και θεραπείες

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Ναντζίνγκ και τα ζώα αντιμετωπίστηκαν με ανθρώπινη μεταχείριση και όσον αφορά την ανακούφιση του πόνου. Τα γυμνά ποντίκια BALB/c ελήφθησαν από το SLRC Laboratory Animal Center (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρήθηκαν συμβατικά όπως περιγράψαμε προηγουμένως*l. Για τη μελέτη ξενομοσχεύματος, κύτταρα SGC7901CK 2 × 10 βαθμών σε 100 μl matrigel εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ποντικών για 5 εβδομάδες. Για να προσδιορίσουμε τις επιδράσεις του GRP75 στην αντίσταση του GC στην σισπλατίνη, πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία ενδοογκικής και ενδοπεριτοναϊκής ένεσης. Εν συντομία, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες (5 ποντίκια ανά ομάδα): (1)MOCK, (2)GRP75KD, (3)MOCK-σισπλατίνη, και (4) GRP75 KD-σισπλατίνη. 100 ul siRNA (si-Con ή si-GRP75, 100 ηΜ) ήταν ενδοογκικές ενέσεις κάθε 3 ημέρες. Οι ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη (5 mg/kg) ήταν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις 3 φορές την εβδομάδα και οι άλλες ομάδες εγχύθηκαν με ίσο όγκο φυσιολογικού ορού. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε εβδομάδα και οι όγκοι τους υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: V=Y (πλάτος2 μήκος). Μετά από 5 εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι ιστοί του όγκου αφαιρέθηκαν για περαιτέρω έρευνα.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Second Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, και του Affiliated Changzhou No. Τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Η μικροσυστοιχία ιστού κατασκευάστηκε από την Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Σαγκάη, Κίνα) όπως περιγράψαμε προηγουμένως*

Επιμόλυνση κυττάρων

Για επιμόλυνση, κωδικοποιημένο και pcDNA-3.1-GRP75-Το Flag συντέθηκε από την General Biotech (Σαγκάη, Κίνα). ενώ τα siRNA καταγράφηκαν στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά μέσω αντιδραστηρίου lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6-πηγαδιών σε πυκνότητα κυττάρων 1×10 μοιρών σε μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10 τοις εκατό FBS χωρίς αντιβιοτικά. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 5 ng/ml κρυπτογραφημένο ή GRP{12}}Flag ή 20 nM si-Con ή si-GRP75 για 12 ώρες. Μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα φρέσκο ​​μέσο συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS για άλλες 24 ώρες πριν χρησιμοποιηθούν για άλλα πειράματα.

Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR) Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν καταγράφηκαν στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Η απομόνωση του ολικού RNA, η μεταγραφή του RNA σε cDNA και η απόδοση του qRT-PCR με τη μηχανή Applied Biosystems 7300HT ήταν όλα σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας 2. Η -ακτίνη ενισχύθηκε για να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα του cDNA και να ομαλοποιηθεί η έκφραση. Οι πολλαπλές αλλαγές στην έκφραση κάθε γονιδίου υπολογίστηκαν με μια μέθοδο συγκριτικού κύκλου κατωφλίου (Ct) χρησιμοποιώντας τον τύπο 2-(4ACt)

Αυτό το άρθρο εξάγεται από τους Dai et al. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w