Δοκιμασία TUNEL: Ένα ισχυρό εργαλείο για την αξιολόγηση του νεφρικού τραυματισμού

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Αφηρημένη:Η δοκιμασία επισήμανσης τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUTP (TUNEL) είναι μια μακροχρόνια καθιερωμένη δοκιμασία που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση κατακερματισμού DNA που σχετίζεται με τον κυτταρικό θάνατο (3'-ΟΗ άκρα DNA) από ενδονουκλεάσες. Επειδή αυτά τα ένζυμα είναι ιδιαίτερα ενεργά στους νεφρούς, το TUNEL χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό του κατακερματισμού του DNA και του κυτταρικού θανάτου σε καλλιέργειανεφρό κύτταρα και νεφρούς ζώων και ανθρώπων που προκύπτουν από τηντοξικό ή υποξικό τραυματισμό. Ο πρώιμος χαρακτηρισμός του TUNEL ως αποπτωτικής ανάλυσης έχει οδηγήσει σε πολυάριθμες παρερμηνείες των μηχανισμώννεφρικό κύτταρο βλάβη.Ωστόσο, το TUNEL γίνεται όλο και πιο δημοφιλές γιανεφρική βλάβηεκτίμηση γιατί μπορεί να χρησιμοποιηθεί παγκοσμίως σε καλλιεργημένα και ιστικά κύτταρα και για όλους τους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Επιπλέον, είναι ευαίσθητο, ακριβές, ποσοτικό, συνδέεται εύκολα με συγκεκριμένα κύτταρα ή διαμερίσματα ιστών και μπορεί να συνδυαστεί με ανοσοϊστοχημεία για να επιτρέψει την αξιόπιστη ταυτοποίηση τύπων κυττάρων ή πιθανούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Παραδοσιακά, η ανάλυση TUNEL περιορίζεται στην παρουσία ή απουσία σήματος TUNEL. Ωστόσο, πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τον μηχανισμό του κυτταρικού θανάτου μπορούν να ληφθούν από την ανάλυση των προτύπων TUNEL.

Θεραπεία νεφρικής διαταραχής σεξουαλικής διέγερσης με σκόνη συμπληρώματος κιστανσέ

Εισαγωγή Το DNA είναι το μόνο μόριο στο κύτταρο που μπορεί να επισκευαστεί, αλλά δεν μπορεί να επανασυντεθεί πλήρως μετά από βλάβη. Η καταστροφή του DNA είναι ένα από τα τελικά στάδια μιας διαδικασίας κυτταρικού θανάτου πολλαπλών σταδίων, η οποία είναι δυνητικά αναστρέψιμη μέχρι το σημείο του τερματικού κατακερματισμού του DNA. Επομένως, το τελευταίο είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό και μηχανιστικός δείκτης μη αναστρέψιμου κυτταρικού θανάτου [1,2]. Ο κατακερματισμός DNA που σχετίζεται με τον θάνατο του κυττάρου συνήθως "οπτικοποιείται" με την ανάλυση τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUTP nick-end labeling (TUNEL), βαθμίδα DNA ή δοκιμασία κομήτη [3]. Η ηλεκτροφόρηση παλμικού πεδίου [4] και η δοκιμασία τυχαίας εκκίνησης με ολιγονουκλεοτίδια (ROPS) [5] είναι δύο άλλες δευτερεύουσες δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται σπάνια. Η χρήση της δοκιμασίας κομήτων περιορίζεται μόνο σε in vitro (καλλιεργημένα κύτταρα) και η ποσοτικοποίησή της είναι εντατική [6]. Η διεξαγωγή δοκιμασιών κομητών σε απομονωμένους κυτταρικούς πυρήνες είναι δυνατή, αλλά σχετίζεται με πρόσθετους συγχυτικούς παράγοντες κατά την απομόνωση των πυρήνων. Η δεύτερη, η δοκιμασία κλιμάκωσης DNA, δεν είναι μια ποσοτική μέθοδος και η αρχική ελπίδα ότι το σχέδιο σκάλας έναντι του επιχρίσματος θα διέκρινε μεταξύ της απόπτωσης και της νέκρωσης, αντίστοιχα, διαλύθηκε καθώς αυτή η προσέγγιση αποδείχθηκε αναξιόπιστη [7]. Από τις τρεις κύριες μεθόδους, το TUNEL είναι η πιο ευαίσθητη, η λιγότερο χρονοβόρα και η πιο καθολικά εφαρμόσιμη. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς και για όλους τους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Είναι ακριβές, ποσοτικό, συνδέεται εύκολα με συγκεκριμένα κύτταρα ή διαμερίσματα ιστών και μπορεί να συνδυαστεί με ανοσοϊστοχημεία για να επιτρέψει την αξιόπιστη αναγνώριση των τύπων κυττάρων ή των μηχανισμών κυτταρικής βλάβης που σχετίζονται με τα θετικά σήματα TUNEL [2].

Οι θραύσματα του DNA που μπορούν να μετρηθούν με TUNEL παράγονται κυρίως από αποπτωτικές ενδονουκλεάσες. Οι πιο ενεργές ενδονουκλεάσες στο νεφρό είναι η δεοξυριβονουκλεάση 1 (DNase I) και η ενδονουκλεάση G (EndoG) [8-10]. Η DNase I είναι η πιο ενεργή και άφθονη αποπτωτική ενδονουκλεάση στα θηλαστικά [11]. Ο νεφρός, οι σιελογόνοι αδένες, το πάγκρεας και το έντερο είναι όργανα που είναι γνωστό ότι παράγουν υψηλές ποσότητες DNase I. Τα επιθηλιακά κύτταρα στους σιελογόνους αδένες, το πάγκρεας και το έντερο εκκρίνουν DNase I ως πεπτικό ένζυμο στην πεπτική οδό. Κάποια κυτταρική DNase I καταπολεμά το «ξένο» DNA που εισβάλλει στα κύτταρα ξενιστές [12]. Η μη εκκρινόμενη DNase I παρουσιάζει έναν κρυφό κίνδυνο για το DNA του κυττάρου-ξενιστή, αλλά κανονικά οι DNase δεν δρουν στο DNA του κυττάρου-ξενιστή μέχρι τον τραυματισμό ή το θάνατο του κυττάρου. Στο νεφρό, η DNase I εκκρίνεται από σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, πιθανώς για να καταστρέψει τους ιούς και τα βακτήρια στα ούρα. Αυτή η λειτουργία πιθανότατα λαμβάνει χώρα σε συνδυασμό με πρωτεϊνάσες, ιδιαίτερα τη μεπρίνη, η οποία είναι η κύρια πρωτεϊνάση στα ούρα [13]. Αν και είναι προστατευτικό έναντι της μόλυνσης, η παρουσία υψηλής ενεργότητας DNase στο νεφρό καθιστά αυτό το όργανο ευάλωτο σε τραυματισμό, όπου η δραστηριότητα της DNase είναι γνωστό ότι είναι κυτταροτοξική για τα κύτταρα ξενιστές. Οι DNases προάγουν τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από τοξικά ή υποξικά ερεθίσματα και καταστρέφουν όλα τα κύτταρα DNA του νεφρού ξενιστή που απελευθερώνονται ως αποτέλεσμα του κυτταρικού θανάτου.

Νεφράείναι όργανα φιλτραρίσματος που απομακρύνουν τις τοξικές ενώσεις από το σώμα. Η υψηλή δραστηριότητα DNase I στους νεφρούς κάνει τα κύτταρα των νεφρών πολύ ευαίσθητα σε τραυματισμούς από τοξικές ενώσεις και τα μεταβολικά προϊόντα τους. Αυτό καθιστά το TUNEL την πιο κατάλληλη και εφαρμόσιμη μέθοδο για τη μέτρηση του τραυματισμού του νεφρού. Σε αυτήν την ανασκόπηση, θα επικεντρωθούμε στο TUNEL ως μια ευρέως χρησιμοποιούμενη, ενημερωτική και ακριβής ανάλυση για τη μέτρηση του κυτταρικού θανάτου και της βλάβης των ιστών στο νεφρό. Θα συζητήσουμε πτυχές του TUNEL όπως ισχύει για νεφρικές παθήσεις και τραυματισμούς και θα εντοπίσουμε ποιότητες, τεχνικές και ανεπαρκώς χρησιμοποιούμενα χαρακτηριστικά του TUNEL για να προωθήσουμε την παραγωγική και κατάλληλη χρήση αυτής της ισχυρής ανάλυσης στην έρευνα, τη διάγνωση και τη θεραπεία νεφρικών παθήσεων. Θα συζητήσουμε επίσης διάφορα μοτίβα εικόνας TUNEL που μπορούν να συνδεθούν με μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Τα σημεία που θίγονται σε αυτήν την ανασκόπηση ισχύουν ευρέως για τη χρήση του TUNEL σε άλλα όργανα εκτός από τους νεφρούς.

Λέξεις-κλειδιά:TUNEL; κυτταρικός θάνατος; νεφρό; DNases; ενδονουκλεάσες; τραυματισμό ιστού

Αρχές TUNELΗ δοκιμασία TUNEL αναπτύχθηκε το 1992 από τους Gorczyca et al. [14] και Gavrieli et al. [15], χρησιμοποιώντας σήμανση φθορίου και υπεροξειδάσης αβιδίνης, αντίστοιχα. Εκείνη την εποχή, υπήρχε απελπιστική ανάγκη για νέες μεθόδους για την αξιολόγηση της απόπτωσης και το TUNEL κάλυψε με επιτυχία αυτό το κενό. Αρχικά κυκλοφόρησε στην αγορά ως δοκιμασία για σπασίματα κλώνου DNA κατά τη διάρκεια ή σχετιζόμενη με την απόπτωση [14,16], ελλείψει καλύτερων αναλύσεων, το TUNEL έγινε γρήγορα ο τυπικός προσδιορισμός για την απόπτωση [17,18]. Ωστόσο, αναγνωρίστηκε σχεδόν αμέσως από τους ερευνητές ότι το TUNEL μέτρησε αδιάκριτα κάθε κατακερματισμό του DNA, όχι μόνο αυτόν που σχετίζεται με την απόπτωση [19-21]. Ωστόσο, η ανάγκη για αποπτωτικές δοκιμασίες ήταν τόσο μεγάλη που οι σπάνιες αναφορές ότι το TUNEL ήταν μη ειδικό για απόπτωση γενικά αγνοήθηκαν. Αυτό οδήγησε σε τεράστιο αριθμό ψευδώς θετικών αναφορών απόπτωσης στους νεφρούς και σε άλλα όργανα, σε βαθμό που έως και 20 τοις εκατό των συνολικών κυττάρων αναφέρθηκαν αποπτωτικά ακόμη και χωρίς τραυματισμό [22-25] όταν αλλαγές μικρό όσο 0,01 τοις εκατό θα μπορούσε να είναι στατιστικά σημαντική ένδειξη τραυματισμού ιστού.

Η ανάλυση TUNEL γνώρισε μια αναγέννηση τα τελευταία χρόνια μετά το τέλος της έκρηξης στις μελέτες απόπτωσης πριν από μερικά χρόνια. Η αναζήτησή μας στο PubMed σε άρθρα περιοδικών που αφορούσαν όρους "νεφρός" και "TUNEL" παρήγαγε πάνω από 1500 αποτελέσματα από το 1992 έως το 2020. Το 2019 δημοσιεύθηκαν 170 άρθρα, ο υψηλότερος αριθμός σε ένα μόνο έτος τα τελευταία 28 χρόνια (Εικόνα S1) και τα οποία αποτελούν την πλειοψηφία των άρθρων που ερευνήθηκαν για αυτήν την ανασκόπηση. Πολυάριθμες μελέτες χρησιμοποίησαν τη θετικότητα του TUNEL ως καθολική μέτρηση του κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με τον κατακερματισμό του DNA σε άλλους τύπους κυτταρικού θανάτου εκτός από την απόπτωση. Για παράδειγμα, η φερρόπτωση, μια πρόσφατα ανακαλυφθείσα μορφή προγραμματισμένου, μη αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από οξειδωτική βλάβη που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της νεφρικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IR) σε ποντίκια, μπορεί να ανιχνευθεί από το TUNEL [26]. Η πυρόπτωση, η οποία είναι μια φλεγμονώδης μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που διαφέρει από την απόπτωση και τη νέκρωση, φαίνεται ότι σχετίζεται με θετικά σήματα TUNEL [27,28]. Παρατηρήθηκε θετικότητα TUNEL κατά τη διάρκεια της νεκρόπτωσης που συνέβαλε στην προοδευτική εξάντληση των κυττάρων των νεφρικών σωληναρίων σε αρουραίους που υποβλήθηκαν σε υποολική νεφρεκτομή [29]. Στους νεφρούς και σε άλλους ιστούς, έχουν βρεθεί θετικά σήματα TUNEL σε νέκρωση [30,31], δυσρυθμισμένη αυτοφαγία [32-35], ανοικία [36,37], μιτωτική καταστροφή [35,38], αυτόλυση [39], παυτόλυση [39], πρόπτωση [40] και απονεύρωση [30], αποδεικνύοντας ότι το TUNEL είναι μια πραγματικά καθολική ανάλυση για τον μη αναστρέψιμο κυτταρικό θάνατο.

Η δοκιμασία TUNEL βασίζεται στη σήμανση των άκρων 3'ΟΗ από ένα ειδικό για το άκρο 3'ΟΗ ένζυμο DNA, την τελική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση (TdT) (Εικόνα). Η χρήση πολυμεράσης DNA ή πολυμεράσης DNA θραύσματος Klenow στη θέση του TdT μπορεί να βοηθήσει στον προσδιορισμό του τύπου των άκρων 3'ΟΗ (εγκοπές, κενά ή προεξέχοντα ολίγο), επειδή οι πολυμεράσες DNA χρειάζονται ένα πρότυπο (η αντίθετη αλυσίδα DNA) και επομένως δεν θα επισημανθούν κρεμαστά ή προεξέχοντα άκρα DNA. Είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι η παραγωγή των άκρων 3ZOH DNA δεν είναι μοναδική για τις αποπτωτικές (αποικοδομητικές του DNA) ενδονουκλεάσες. Τα άκρα του DNA του 3'OH είναι ένα κύριο σήμα «επικοινωνίας», κοινός παρονομαστής της πλειονότητας των ενζύμων DNA. Παράγονται και χρησιμοποιούνται σχεδόν από όλα τα ένζυμα DNA των ευκαρυωτών, συμπεριλαμβανομένων των ενδονουκλεασών επιδιόρθωσης του DNA (απουρινικό/απυριμιδινικό, ΑΡ), των εξωνουκλεασών, των πολυμερασών DNA, των λιγασών DNA, των τρανσφερασών DNA και των τοποϊσομερασών. Επιπλέον, τα συζεύγματα 3'Id 3z-σακχάρου ή 3z-πρωτεΐνης μπορούν να μετατραπούν σε άκρα 3'ΟΗ από φωσφατάσες, γλυκοζυλάσες και πρωτεϊνάσες, αντίστοιχα. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η ακριβής κατανόηση του τι μετράται είναι απαραίτητη για την επιτυχή εφαρμογή του TUNEL και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων του.

Σε σύγκριση με δύο άλλες πρωτεύουσες μεθόδους μέτρησης κατακερματισμού DNA, τη δοκιμασία κλιμάκωσης DNA και κομήτη, το TUNEL έχει το πλεονέκτημα ότι βασίζεται στην αναγνώριση των άκρων του DNA και όχι στα θραύσματα (Εικόνα 2). Θεωρητικά, το TUNEL δεν θα είναι πιο ευαίσθητο και γραμμικό για τον εντοπισμό του αρχικού (χαμηλού) κατακερματισμού του DNA από τη σκάλα DNA ή τον κομήτη, που και τα δύο έχουν περίοδο υστέρησης συσσώρευσης μικρών θραυσμάτων υψηλής κινητικότητας. Σε κάθε περίπτωση, οι μελέτες που συνδυάζουν το TUNEL είτε με κομήτη )41,42] είτε με σκάλα DNA [43,44] έχουν κάποιο πλεονέκτημα στο να πιάνουν τον πρώιμο κατακερματισμό του DNA με τη μέγιστη ευαισθησία.

Εφαρμογές TUNELΤο TUNEL χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό της νεφρικής βλάβης σε κλινικές και βασικές τοξικολογικές μελέτες σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένων ιατρικών θεραπειών [45], περιβαλλοντικών [46], γεωργικών [41] και βιομηχανικών [47] εκθέσεων και ζώων [48 ] και επιστήμες τροφίμων [49]. Το TUNEL εφαρμόζεται σε όλους τους τύπους κυττάρων, τα όργανα και τα είδη που έχουν DNA και DNases, τα οποία περιλαμβάνουν σχεδόν όλα τα είδη. Το TUNEL έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό της βλάβης των νεφρών σε ένα ευρύ φάσμα ζώων, συμπεριλαμβανομένων των ζέβρα [50], των ιαπωνικών ρυζοψαριών [51], των κοτόπουλων [48], των γερβίλων [52], των ποντικών [41], των αρουραίων [45], Rabb its [53], mini-pigs [54], and humans [55]. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα του TUNEL είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε σταθεροποιημένα καλλιεργημένα κύτταρα καθώς και σε σταθερούς ιστούς. Αυτό παρέχει μεθοδολογική συνέπεια για σύγκριση μεταξύ in vitro και in vivo αποτελεσμάτων σε μελέτες στις οποίες μπορούν να διερευνηθούν μηχανισμοί σε καλλιεργημένα νεφρικά κύτταρα, ενώ οι in vivo επιπτώσεις αξιολογούνται στους νεφρούς των ζώων. Οτιδήποτε βρίσκεται μεταξύ ολόκληρων κυττάρων και ιστών μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων των καλλιεργημένων σφαιροειδών κυττάρων [56] και των ex vivo φέτες νεφρού [57,58].

Η ένταση του TUNEL ως προς την ισχύ του σήματος ή τον αριθμό των TUNEL-θετικών κυττάρων μπορεί να ποικίλλει μεταξύ των ειδών ανάλογα με τη δραστηριότητα των DNases. Σύμφωνα με την εμπειρία μας, ο νεφρός αρουραίου έχει πιο ενεργό DNase I από το νεφρό ποντικού και η ισχύς του θετικού σήματος TUNEL συσχετίζεται με αυτό. Όταν ο νεφρός συγκρίνεται με άλλα όργανα, το θετικό του σήμα στο TUNEL είναι πολύ έντονο και παρόμοιο με άλλα όργανα με υψηλή δραστηριότητα DNase I, όπως το έντερο και ο σιελογόνος αδένας. Στο άλλο άκρο του φάσματος, η χαμηλότερη ισχύς σήματος θετικού TUNEL παρατηρείται στον εγκέφαλο και στα καρκινικά/καρκινικά κύτταρα, όπου η έκφραση της DNase I είναι πιθανότατα αδρανοποιημένη από εναλλακτικό μάτισμα στην κωδικοποιητική περιοχή [59]. Το θετικό σήμα TUNEL παρατηρείται σε όλους τους τύπους κυττάρων στο νεφρό. Κατά μέσο όρο, το σωληνοειδές επιθήλιο καταστρέφεται συχνότερα από τα σπειράματα, ειδικά σε οξείες κακώσεις (Εικόνα 3Α). Αυτό συσχετίζεται καλά με τη δραστηριότητα της DNase I που επικρατεί σε αυτούς τους τύπους κυττάρων. Κρίνοντας από τις διαφορές φύλου και ηλικίας που παρατηρήθηκαν στα πειράματά μας, η DNase I είναι πιο άφθονη και ενεργή στα αρσενικά παρά στα θηλυκά και στα ζώα μέσης ηλικίας σε σύγκριση με τα ηλικιωμένα ή νεογνά ζώα. Ωστόσο, καμία ξεκάθαρη διαφορά στη θετικότητα στο TUNEL δεν είναι εμφανής σε σχέση με το φύλο ή την ηλικία, πιθανώς επειδή η προεξέχουσα ή κυριαρχείται από άλλους παράγοντες. Σε ορισμένα μοντέλα νεφρών (όπως η ισχαιμία-επαναιμάτωση), η DNase I προκαλείται [9]. ενώ σε άλλες, δεν είναι και μπορεί ακόμη και να καταστέλλεται (για παράδειγμα, στην τοξικότητα της σισπλατίνης) [10]. Η ενεργοποίηση των ενδονουκλεασών, εάν υπάρχουν, έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει εντός των πρώτων 24 ωρών μετά τον τραυματισμό των νεφρών [9,60,61]. Επομένως, δεν ήταν έκπληξη το γεγονός ότι τουλάχιστον οι μισές από τις εφαρμογές TUNEL στην έρευνα των νεφρών σε αυτήν την ανασκόπηση χρησιμοποιήθηκαν για οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ), καθώς η αξιολόγηση της ΑΚΙ γίνεται συχνά εντός 24 έως 72 ωρών μετά τον τραυματισμό, όταν οι ενδονουκλεάσες είναι πιο ενεργές. . Ο κατάλογος των μελετών AKI είναι μακρύς και περιλαμβάνει τοξικά, σηπτικά, μεταμοσχευτικά και υποξικά τραύματα. Σε αυτήν την εργασία, ερευνήσαμε τα μοντέλα, τους τύπους έκθεσης, τις θεραπείες, τα χρονοδιαγράμματα αξιολόγησης και τους τύπους κυττάρων που επηρεάστηκαν σε αυτές τις μελέτες. Οι μελέτες που ερευνήθηκαν κάλυψαν οξεία και μικτά οξείες-χρόνιες μορφές νεφρικής βλάβης και χρόνια νεφρική νόσο.

Το αν παρατηρείται νεφρική βλάβη με σήμα θετικό στο TUNEL σε σωληνάρια ή στο σπείραμα εξαρτάται από τον τύπο του βλαβερού παράγοντα ή της νόσου. Για παράδειγμα, η νεφρίτιδα του λύκου στους ανθρώπους και η βλάβη στα νανοσωματίδια νικελίου περιγράφηκε ότι έχει αυστηρά σπειραματικά σήματα θετικά στο TUNEL [62,63]. Από την άλλη πλευρά, η ισχαιμία-επαναιμάτωση και η επαγόμενη από στρεπτοζοτοκίνη διαβητική νεφροπάθεια σε αρουραίους παρήγαγαν θετικά στο TUNEL κύτταρα μόνο στα σωληνάρια [64,65]. Τα εγγύς σωληνάρια, ο βρόχος Henle, οι άπω σωληνίσκοι και οι συλλογικοί πόροι είναι συχνά θετικοί στο TUNEL σε μοντέλα ισχαιμίας-επαναιμάτωσης. Τα θετικά στο TUNEL κύτταρα τόσο στα σπειράματα όσο και στα σωληνάρια περιγράφηκαν σε αρουραίους που εκτέθηκαν σε φάρμακα όπως η κυκλοσπορίνη Α [66] και η δοξορουβικίνη [67] ή σε υλικά καταναλωτικών προϊόντων όπως τα νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου [68] και σε ένα μοντέλο αρουραίου με σακχαρώδη διαβήτη [68]. 69]. Το AKI που προκαλείται από σηπτικό σοκ σε ανθρώπους συσχετίστηκε επίσης τόσο με σπειραματικά όσο και με σωληναριακά κύτταρα θετικά στο TUNEL [70]. Η απόφραξη του λεπτού εντέρου με στραγγαλισμένο κλειστό βρόχο προκάλεσε θετικότητα στο TUNEL στο νεφρό σε 3 ώρες [87].

Η ΑΚΙ μπορεί να εμφανιστεί μετά από μεταμόσχευση και υποξικούς τραυματισμούς. Η απόρριψη αλλομοσχεύματος στον άνθρωπο συνδέεται συνήθως με την αύξηση των θετικών στο TUNEL κυττάρων [88,89]. Μετά από ψυχρή ισχαιμία, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα παρατηρήθηκαν συνήθως εντός 2-24 ωρών κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης [90], ή πιο στενά, μεταξύ 14 και 17 ωρών μετά την ισχαιμία [91], και μερικές φορές εξακολουθούμε να παρατηρούμε μέχρι και 7 ημέρες σε απόρριψη μοσχεύματος [92]. Ομοίως, σε μοντέλα ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα παρατηρήθηκαν συχνότερα 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση [44,93,94] ή εντός του εύρους μεταξύ 4 [95,96] και 72 ωρών [97]. Τόσο σε μελέτες μεταμόσχευσης όσο και σε ισχαιμικές μελέτες AKI, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα εντοπίστηκαν σε απομακρυσμένα και εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα [44,93]. Στο ποντίκινεφράΜετά από κάκωση ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα περιγράφηκαν ως συγκεντρωμένα στη φλοιομυελική συμβολή, τον συνήθη στόχο της ισχαιμικής βλάβης [98].

Μικτός οξύς και χρόνιος τραυματισμός, όπου οι τοξικές εκθέσεις, οι ασθένειες ή/και οι αξιολογήσεις ήταν τόσο οξείες (π.χ. ώρες, ημέρες) όσο και χρόνιες (π.χ. εβδομάδες, μήνες, χρόνια) στην ίδια μελέτη, παρατηρήθηκαν στην ανθρώπινη μεταμόσχευση απόρριψη (βιοψία 1 εβδομάδα έως 3 χρόνια μετά τη μεταμόσχευση) [88], λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Ε των χοίρων (7 και 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό) [52], στρες που προκαλείται από το CO2 πνευμοπεριτόναιο σε υδρονεφρωτικάνεφρά(2 εβδομάδες υδρονέφρωση, 2 ημέρες μετά το πνευμονοπεριτόναιο) [53], μεσαγγειακή πολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα που προκαλείται από δηλητήριο φιδιού (1 έως 14 ημέρες μετά την ένεση) [99], μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρα (1 έως 14 ημέρες απόφραξης) [100], έκθεση σε οξικό ουρανύλιο (από 1 έως 28 ημέρες έκθεσης) [101], νεφροπάθεια με αριστοχολικό οξύ (5 και 30-ημερήσια έκθεση) [102] και νεογνική υπεροξία (δοκιμάστηκε 1 έως 60 ημέρες μετά τον τοκετό, έκθεση σε υπεροξία την πρώτη 14 ημέρες) [103]. Δεκατέσσερις ημέρες μετά τον αντίκτυπο είναι ένα πολύ κοινό χρονικό σημείο αξιολόγησης για αυτά τα είδητραυματισμοί των νεφρών[52,53,99,101,103]. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα εντοπίστηκαν σε σωληνάρια και συλλογικούς πόρους. Η μόνη εξαίρεση ήταν η τοξικότητα από το δηλητήριο των φιδιών, η οποία κατέστρεψε κυρίως τα σπειράματα [99].

Χρόνιοςνεφρόασθένεια (ΧΝΝ), που ορίζεται ως η παρουσία τουνεφρόβλάβη ή μειωμένος ρυθμός σπειραματικής διήθησης (GFR) σε ανθρώπους για περισσότερο από 3 μήνες, είναι επίσης ένα κοινό θέμα για την αξιολόγηση του TUNEL, το οποίο μπορεί να καθορίσει εάν η ΧΝΝ σχετίζεται με προοδευτικήνεφρική βλάβη.Η πιο συχνά μελετημένη ΧΝΝ στην οποία εφαρμόζεται το TUNEL είναι η διαβητική νεφροπάθεια. Ο τραυματισμός που εντοπίστηκε από τη θετικότητα στο TUNEL εμφανίστηκε σε σωληνάρια και ποδοκύτταρα [69] σε διαβητικούς ασθενείς με εμφάνιση διαβήτη πριν από τη δοκιμή TUNEL που κυμαίνονταν από 7 έως 30 χρόνια [104,105] και 2 έως 16 εβδομάδες μετά τη θεραπεία με στρεπτοζοτοκίνη σε τρωκτικά [106,107]. Παρόμοια θετική στο TUNEL ιστοπαθολογία αναφέρθηκε σε νεφροπάθεια ανοσοσφαιρίνης Α [22]. Στη νεφρίτιδα του λύκου και στη μεμβρανοπολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα, η θετικότητα στο TUNEL παρατηρήθηκε κυρίως στα σπειράματα [62,108,109]. Από την άλλη πλευρά, μελέτες ασφάλειας φαρμάκων για σισπλατίνη [110], χλωροκίνη [45], δοξορουβικίνη [67], φιναστερίδη [23], τακρόλιμους [111] και λεβετιρακετάμη [24] παρατήρησαν κυρίως σωληναριακή βλάβη. Ομοίως, η συνεχιζόμενη οξεία βλάβη που εντοπίστηκε από σωληναριακά κύτταρα θετικά στο TUNEL περιγράφηκε σε μελέτες για νεφροπάθεια ουρικού οξέος [112], ανεπάρκεια μεθειονίνης [48], έκθεση σε περιβαλλοντικές τοξίνες μικροκυστίνη-LR [50] και κάδμιο [113] και σε συσχέτιση με επαγόμενη από οξαλικό ασβέστιονεφρόπέτρες [114] και ασβεστοποιούμενα νανοσωματίδια [115]. Ενώ η αναγνώριση της προοδευτικής νεφρικής βλάβης κατά τη διάρκεια της ΧΝΝ με τη χρήση της ανάλυσης TUNEL είναι ένα χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείο, ο συνδυασμός της ανάλυσης TUNEL με ανοσοϊστοχημεία (IHC) θα ήταν ίσως ακόμη πιο κατατοπιστικός για τον προσδιορισμό του μηχανισμού του τραυματισμού.

Τεχνικές Ποσοτικοποίησης και Συντοπισμού TUNEL

Οι μέθοδοι ποσοτικοποίησης TUNEL ποικίλλουν. Στην πλειονότητα των αναφορών, τα θετικά στο TUNEL κύτταρα/πυρήνες ποσοτικοποιούνται ως το ποσοστό των συνολικών κυττάρων/πυρήνων [83,116,117]. Αυτό φαίνεται το σωστό, αν και ο αριθμός των θετικών στο TUNEL κυττάρων πιθανότατα δεν αντιστοιχεί ακριβώς στον αριθμό των νεκρών κυττάρων. Ορισμένα κύτταρα μπορεί να μην έχουν φθάσει σε αναγνωρίσιμα επίπεδα κατακερματισμού DNA, ενώ άλλα θα μπορούσαν ήδη να έχουν εξαλειφθεί από τα μακροφάγα. Χρησιμοποιείται επίσης ποσοτικός προσδιορισμός του αριθμού των θετικών στο TUNEL κελιών ανά τετραγωνική μονάδα (mm2) [118], αλλά αυτή η μέθοδος φαίνεται λιγότερο ακριβής επειδή εξαρτάται από τη θέση και το περιεχόμενο του τύπου κυψέλης των περιοχών. Οι τομές του φλοιού περιέχουν κυρίως σπειράματα, σωληνάρια, αιμοφόρα αγγεία και μυελικές ακτίνες, ενώ οι μυελικές τομές περιέχουν κυρίως βρόχους Henle, αγωγούς συλλογής και αιμοφόρα αγγεία. Η ποσοτικοποίηση "ανά Fifield" εξαρτάται σίγουρα από το ποιο είναι το πεδίο [72,119] και η ποσοτικοποίηση "ανά τμήμα" είναι, ακόμη περισσότερο, απροσδιόριστο [61,120]. Οι κακώς προσδιορισμένες μετρήσεις, όπως "ιστολογική βαθμολογία" [121], "απόπτωσης δείκτης" [113], "ποσοστό απόπτωσης" [92], "ποσοστό απόπτωσης" [122], ή ποσοστό μη θεραπευόμενου ελέγχου [123,124], φαίνεται να είναι ακόμη λιγότερο κατάλληλη και καθιστούν την ερμηνεία δύσκολη και μη συγκρίσιμη με την πλειονότητα των μελετών.

Ο κυτταρικός θάνατος στα γειτονικά κύτταρα ξεκινά άνισα επειδή εξαρτάται από την αγγείωση, τον κυτταρικό κύκλο και άλλες μεταβλητές. Αυτό συχνά οδηγεί σε ανομοιόμορφη χρώση TUNEL των κυττάρων στον ιστό [45,96,125]. Παραδόξως, η γενική ένταση του θετικού σήματος TUNEL δεν χρησιμοποιείται για τη μέτρηση TUNEL, παρά το γεγονός ότι εξαρτάται άμεσα από τον βαθμό κατακερματισμού του DNA. Αυτό συμβαίνει ίσως επειδή τα κύτταρα θεωρούνται νεκρά ανεξάρτητα από την ένταση του σήματος TUNEL, καθώς ένα κύτταρο δεν μπορεί να είναι "πιο νεκρό" εάν η χρώση TUNEL είναι πιο έντονη. Αν και είναι δύσκολο να συγκριθούν μελέτες που χρησιμοποιούν μια μεγάλη ποικιλία μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων του TUNEL, η ποσότητα των θετικών στο TUNEL κυττάρων στα ζώα ελέγχου είναι συνήθως κάτω από 2 τοις εκατό [75,99,100,116,126]. Ένας οξύς τραυματισμός σχετίζεται με ~5–40× αύξηση της θετικότητας στο TUNEL [79,126,127]. Κατά τη διάρκεια του χρόνιου τραυματισμού, η αύξηση στα TUNEL-θετικά κύτταρα είναι ελαφρώς χαμηλότερη, ~2–20-πλάσια, [29,43,65] σε σύγκριση με τους μάρτυρες χωρίς θεραπεία.

Η αρχική δοκιμασία TUNEL που βασίζεται σε χρώση διαμινοβενζιδίνης (DAB) σχεδιάστηκε για μικροσκοπία φωτός [14,15]. Αυτή η παραδοσιακή μέθοδος εξακολουθούσε να χρησιμοποιείται στα δύο τρίτα των μελετών που εξετάστηκαν σε αυτήν την ανασκόπηση και στη συντριπτική πλειοψηφία των μελετών ανθρώπινης βιοψίας. Η ποσοτικοποίηση γίνεται με χειροκίνητη καταμέτρηση κυττάρων και, ενώ είναι ακριβής, είναι χρονοβόρα. Συχνά, η ποσοτικοποίηση δεν χρησιμοποιείται καθόλου και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται χρησιμοποιώντας εικόνες επεξεργασμένων και χρωματισμένων δειγμάτων ως απλή απόδειξη ότι έλαβε χώρα κυτταρικός θάνατος. Ο αυτοματισμός μπορεί να επιταχύνει τη διαδικασία ποσοτικοποίησης [128,129]. Ωστόσο, το DAB δεν μπορεί να συνδυαστεί με οποιαδήποτε άλλη χρώση στο ίδιο δείγμα, και έτσι το TUNEL με βάση το DAB μπορεί να παρέχει μόνο τον αριθμό των νεκρών κυττάρων, χωρίς καμία αναγνώριση του τύπου κυττάρου (εκτός της οπτικής αναγνώρισης) ή του μηχανισμού κυτταρικού θανάτου.

Ενώ οι μελέτες σε ανθρώπους βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στο TUNEL που βασίζεται σε DAB χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός, περίπου οι μισές μελέτες σε ζώα χρησιμοποιούν μικροσκοπία φθορισμού FL (Εικόνα 3). Το Fluorescent TUNEL είναι οπτικά ελκυστικό, εύκολα ερμηνεύσιμο και έχει πολλά σημαντικά πλεονεκτήματα. Εκτός από τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό με αναγνώριση των θετικών στο TUNEL πυρήνων ή της μέσης έντασης του χρώματος, το φθορίζον σήμα TUNEL FL μπορεί να εντοπίζεται με άλλα χρώματα για ιστοχημεία (π.χ. DAPI) (Εικόνα 3Α) ή IHC (Εικόνα 3Β). Στο τελευταίο, η χρήση πρωτεϊνικών δεικτών μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό θετικών σημάτων TUNEL που σχετίζονται με διαφορετικάνεφρόδιαμερισμάτων ή να δώσει πληροφορίες για τον τύπο του κυτταρικού θανάτου. Δεν μπορέσαμε να βρούμε παραδείγματα TUNEL σε συνδυασμό με διπλή χρώση αντισωμάτων IHC. Ενώ ένας τέτοιος συνδυασμός θα ήταν πολύ ενημερωτικός, για παράδειγμα, για την αναγνώριση ενός μηχανισμού κυτταρικού θανάτου σε ορισμένους τύπους κυττάρων, οι τεχνικές δυσκολίες που σχετίζονται με μια τέτοια χρώση μπορεί να υπερβαίνουν τα οφέλη.

Ταυτοποίηση τουνεφρόΟ κυτταρικός τύπος σίγουρα δεν είναι πρόβλημα για έναν έμπειρονεφρόπαθολόγος [104]. Εξαιτίας αυτού, η χρήση πρόσθετων δεικτών για την αναγνώριση κυτταρικού τύπου, για παράδειγμα, η χρήση CD31 για την ταυτοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων [130], είναι σπάνια. Ωστόσο, συχνά χρησιμοποιείται η χρήση δεικτών πρωτεΐνης IHC για τον χαρακτηρισμό της βλάβης των ιστών. Οι περισσότερες μελέτες χρησιμοποιούν τη θετικότητα στο TUNEL ως τη μοναδική απόδειξη της απόπτωσης. Σε άλλες μελέτες, η αναγνώριση ότι η θετικότητα στο TUNEL δεν είναι ειδική για την απόπτωση οδήγησε σε πολλούς μορφολογικούς (π.χ. χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης ή περιοδικού οξέος-Schiff), βιοχημικούς και IHC δείκτες που συνδυάζονται με τη χρώση TUNEL για επιβεβαίωση της απόπτωσης. Ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος δείκτης για την εξαρτώμενη από κασπάση απόπτωση είναι η διασπασμένη (ενεργή) κασπάση-3 με τη χρήση αντισώματος που δεν αναγνωρίζει την κασπάση πλήρους μεγέθους-3 [131,132]. Τόσο οι δοκιμασίες TUNEL όσο και οι δοκιμασίες διασπασμένης κασπάσης-3 έδειξαν αποκλειστικά σωληναριακή, όχι σπειραματική, χρώση σε ισχαιμία-επαναιμάτωση αρουραίου [64]. Άλλες μελέτες κασπάσης χρησιμοποίησαν κασπάση-1 [27], -9 [53], -11 [28] και -12 [75]. Άλλοι αποπτωτικοί δείκτες περιελάμβαναν την οικογένεια πρωτεϊνών του λεμφώματος Β-κυττάρου 2 (Bcl2) Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] και Bad [43]; αποπτωτικός υποδοχέας Fas [52] και αποπτωτικός υποδοχέας-συνδέτης FasL [66]. Παράγοντες μεταγραφής πρωτεΐνης forkhead box (FOX) Fox01 [133] και Fox03 [27]; και κυτόχρωμα c [53]. Η φλεγμονή ταυτοποιήθηκε με IHC του παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF) [134]. αυξητικοί παράγοντες όγκου TGF [66] και TGF- 1 [135]; κινάση σερίνης/θρεονίνης 1 (SGK1) [135]; Φλαβοπρωτεΐνη μεταφοράς ηλεκτρονίων, β-υπομονάδα (ETF) [136]; Janus kinase-2 (JAK2) [137]; μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής μεταγραφής 3 (STAT3) [137]; Ενισχυτής πυρηνικού παράγοντα κάπα-ελαφριάς αλυσίδας των ενεργοποιημένων Β-κυττάρων (NF-κB) [137] και της πρωτεΐνης αναστολέα του IκB [137]. Γιανεφρόεκτίμηση τραυματισμού, μόριο νεφρικής βλάβης-1 (KIM-1) [24], κανάλι ακουαπορίνης-1 (AQP-1) [45], παράγοντας που προκαλείται από υποξία {{7} }παράγοντας μεταγραφής άλφα (HIF-1 ) [103], μεταφορέας αμινοξέων τύπου Asc-1 (Asc-1) [121], θηλαστικός στόχος της ραπαμυκίνης (mTOR) [131] κινάση , και τρανσγλουταμινάση II [89] χρησιμοποιήθηκαν. Η οξειδωτική νεφρική βλάβη μελετήθηκε χρησιμοποιώντας δείκτες όπως 8-υδροξυγουανοσίνη (8OHdG) [102], λιποκαλίνη που σχετίζεται με ουδετερόφιλα ζελατινάση (NGAL) [102], εξαρτώμενη από NAD δεακετυλάση sirtuin-1 (SIRT1) [138] , και οξυγενάση αίμης 1 (HO-1) [90]. Οι κινάσες μελετήθηκαν εντατικά, συμπεριλαμβανομένης της οδού C-Jun N-τερματικής κινάσης (JNK) [101], φωσφοϊνοσιτιδικής 3-κινάσης/πρωτεϊνικής κινάσης Β/πυρηνικού παράγοντα ερυθροειδούς 2-σχετιζόμενου παράγοντα 2 μεταγραφικού παράγοντα (PI3K/ Akt/Nrf2) μονοπάτι [46], παννεξίνη-1 (PANX1) πρωτεΐνη διασύνδεσης πλασματικής μεμβράνης [26] και ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση/εξωκυτταρική κινάση ρυθμιζόμενη με σήμα (MAPK/ERK) [26]. Μελέτες αποπτωτικών ενδονουκλεασών περιελάμβαναν ενεργοποιημένη από κασπάση DNase (CAD) [139], DNase I [108] και EndoG [139] και δείκτες βλάβης στο DNA περιελάμβαναν την πρωτεΐνη όγκου p53 (p53) [99] και την πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με τη δυναμίνη (PARP1). ) [66]. Ορισμένες μελέτες βρήκαν επίσης χρήσιμη την αξιολόγηση της απόπτωσης που προκαλείται από το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου και του τραυματισμού των ιστών [75].

Δεδομένου του μεγάλου αριθμού μηχανιστικών μελετών που ερευνήθηκαν και του πλεονεκτήματος του συνδυασμού του TUNEL με τους δείκτες IHC για την αναγνώριση μηχανισμών κυτταρικού θανάτου, θα περίμενε κανείς πολλές μελέτες που χρησιμοποιούν συνεντοπισμό μεταξύ των δύο. Η ανάλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί με εντοπισμό εικονοστοιχείων μεταξύ θετικών κυττάρων TUNEL και δεικτών IHC, μέσης έντασης δείκτη IHC σε θετικές περιοχές TUNEL ή μέσης έντασης σήματος θετικού TUNEL σε θετικές περιοχές δείκτη IHC. Δυστυχώς, αυτό το πλεονέκτημα του TUNEL έχει χρησιμοποιηθεί σε λίγες μόνο μελέτες. Τα θετικά στο TUNEL κύτταρα εντοπίστηκαν με διασπασμένη κασπάση-3 στονεφρόσωληνάρια κατά την τοξικότητα της ακεταμινοφαίνης σε αρουραίους [74]. Ο εντοπισμός IHC με σήμα θετικό στο TUNEL επέτρεψε την ταυτοποίηση του κυτταρικού θανάτου των μεσαγγειακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της νεφρίτιδας Habu [99]. Στο μικροσκόπιο φωτός, ο εντοπισμός με μηχανιστικούς δείκτες τοξικότητας έγινε σε σειριακές τομές, όπως αναφέρεται από τους Ott et al. [89].

TUNEL Προβλήματα και περιορισμοί

Μπορούν να προκύψουν πολλά πιθανά προβλήματα και θα πρέπει να αναμένονται όταν εργάζεστε με το TUNEL. Το ένα είναι ότι τα άκρα του 30OH DNA εμφανίζονται όχι μόνο κατά τον κυτταρικό θάνατο ως αποτέλεσμα της δράσης της ενδονουκλεάσης αλλά και ως φυσιολογικός ενδιάμεσος μεταβολίτης σε όλες σχεδόν τις ενζυμικές αντιδράσεις με το DNA. Μια κύρια κυτταρική λειτουργία που παράγει άκρα 30OH είναι η σύνθεση DNA, στην οποία πολλά θραύσματα Okazaki μπορεί θεωρητικά να παράγουν ένα ψευδώς θετικό σήμα TUNEL, ειδικά σε τροποποιήσεις υψηλής ευαισθησίας της δοκιμασίας. Στη διάρκειανεφρική βλάβη,Η επιδιόρθωση του DNA μπορεί επίσης να συμβάλει σε ψευδή θετικά σήματα TUNEL ως αποτέλεσμα μιας δράσης ενδονουκλεάσης AP. Μαζική οξειδωτική νεφρική βλάβη που προκαλείται από χημική (υπεροξείδιο του υδρογόνου, μπλεομυκίνη) ή φυσική (ακτινοβολία γάμμα) τραυματισμό μπορεί να προστεθεί στον αριθμό των άκρων 30OH, αυξάνοντας τις ψευδώς θετικές μετρήσεις TUNEL εκτός από τον κατακερματισμό του DNA που προκαλείται από ενδονουκλεάση.

Πιο συχνά και πιο πιθανό, οι ακατάλληλες πειραματικές συνθήκες της αντίδρασης TdT (χρόνος, θερμοκρασία, ενζυματική δραστηριότητα ή συμπαράγοντες) μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα ένα τεχνητά αυξημένο υπόβαθρο θετικού σήματος TUNEL. Αν και παραμένει απροσδιόριστο ως προς το ποια θεωρείται η κανονική γραμμή βάσης για δείγματα νεφρικού ιστού χωρίς θεραπεία, φαίνεται εύλογο ότι περίπου το 1 τοις εκατό των συνολικών κυττάρων θα ήταν ένας λογικός αριθμός. Βεβαίως, ένα υπόβαθρο 10 τοις εκατό ή υψηλότερο αποτελεί σαφή ένδειξη είτε αχαρακτήριστων και μη επεξεργασμένων συνθηκών ανάλυσης είτε απόκλισης από τις κατάλληλες συνθήκες αποθήκευσης δειγμάτων.

Ένα άλλο αναμενόμενο πρόβλημα είναι η χαμηλή δραστηριότητα DNase I σε ορισμένους τύπους κυττάρων (π.χ. ενδοθήλιο),νεφρόδιαμερίσματα (π.χ. σπειράματα) ή παθολογικούς ιστούς (π.χ. όγκοι). Αυτά τα κύτταρα θα πρέπει να αναμένεται να παρουσιάζουν χαμηλή θετικότητα στο TUNEL, όχι επειδή είναι ανθεκτικά σε τραυματισμούς, αλλά επειδή δεν υπάρχει αρκετή δραστηριότητα ενδονουκλεάσης για να παραχθεί ένα μετρήσιμο σήμα στο TUNEL. Σύμφωνα με την εμπειρία μας, ακόμη και αλλαγές μεταξύ {{0}},01 τοις εκατό και 0,1 τοις εκατό των θετικών κυττάρων TUNEL μπορεί να είναι στατιστικά σημαντικές και να χρησιμοποιηθούν ως σταθερή απόδειξη τραυματισμού του νεφρού (άλλου ιστού).

Τέλος, ένα πρόβλημα με τον ποσοτικό προσδιορισμό της χρώσης TUNEL προκύπτει όταν η ποσότητα του κατακερματισμού του DNA είναι πολύ υψηλή, για παράδειγμα, σε τελευταία στάδια κυτταρικού θανάτου ή σε τραυματισμούς υψηλής έντασης, όπου το υπόλοιπο DNA δεν μπορεί να αντιχρωματιστεί σωστά με DAPI λόγω αποσυναρμολόγησης του διπλή έλικα (Εικόνα 3D). Σε αυτές τις περιπτώσεις, τα θετικά σήματα TUNEL «κρέμονται στον αέρα» και φαινομενικά δεν συνδέονται με έναν πυρήνα. Αποτελεί ευθύνη ενός παθολόγου να τα ερμηνεύσει ως κύτταρα θετικά στο TUNEL παρά ως τεχνούργημα. Με το TUNEL με σήμανση φλουορεσκεΐνης, υπάρχει ο κίνδυνος αναγνώρισης του αυτοφθορισμού υποβάθρου στον ιστό ως θετικότητα στο TUNEL [140]. Σε αυτές τις περιπτώσεις, συνιστάται η μετάβαση σε TUNEL κόκκινου φάσματος [51,54].

Τα μοτίβα TUNEL ως πηγή πρόσθετων πληροφοριών

Πολλά μοτίβα TUNEL μπορούν να διακριθούν με σαφήνεια και να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό ενός πιθανού μηχανισμού και του βαθμού τραυματισμού (Πίνακας 1, Εικόνα 3). Συνήθως, ένας τύπος μοτίβου TUNEL μόνο για πυρήνες παράγεται από ήπιο τραυματισμό, ενώ ο ισχυρότερος τραυματισμός (δηλαδή, αυξημένη έκθεση) οδηγεί σε ισχυρότερη χρώση και αποσύνθεση πυρήνων ή κυττάρων. Ένα αυστηρά αποπτωτικό πρότυπο TUNEL είναι ο πυρηνικός κατακερματισμός ως αποτέλεσμα του σχηματισμού αποπτωτικών σωμάτων (Εικόνα 3Ε). Μικρά θραύσματα θετικών στο TUNEL πυρήνων, που είναι πιθανώς αποπτωτικά σώματα, παρατηρήθηκαν σε ισχαιμία-επαναιμάτωση αρουραίου στις 24-72 ώρες [97]. Αποπτωτικά σώματα παρατηρήθηκαν επίσης με επισήμανση TUNEL των πυρήνων στο νεφρικό σωληναριακό επιθήλιο και στο διάμεσο 14 ημέρες μετά τον τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης σε αρουραίους [141]. Οι αυξανόμενες δόσεις ελαίου λεβάντας μείωσαν τα μοτίβα TUNEL μόνο για πυρήνες και τα μετέτρεψαν σε TUNEL που μοιάζει με νέκρωση με κυτταροπλασματική διαρροή [94]. Το τελευταίο ήταν αποτέλεσμα καταστροφής του πυρηνικού περιβλήματος λόγω της δράσης πρωτεϊνασών και λιπασών στη νέκρωση. Το κυτταροπλασματικό TUNEL (Εικόνα 3F) που φαίνεται ως θετικό στο TUNEL κυτταρόπλασμα παρατηρήθηκε σε μικροσκοπία φωτός στο μοντέλο ραβδομυόλυσης σε σωληνάρια αρουραίου [142] και σε ποδοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία υψηλής γλυκόζης και σε διαβητική νεφροπάθεια σε ποντίκια [135]. Το κυτταροπλασματικό TUNEL περιγράφηκε επίσης σε νεφρική ισχαιμία-επαναδιάχυση σε ποντίκια χρησιμοποιώντας FL fluorescent TUNEL [98] και σε ισχαιμία-επαναιμάτωση σε αρουραίους χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός [143]. Βαθιά και αποκλειστικά σωληναριακή βλάβη που προκαλείται από το χλωριούχο υδράργυρο με ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση TUNEL ενδεικτική βλάβης της πυρηνικής μεμβράνης [60]. Εάν ο τραυματισμός συνεχιστεί ή η δόση του βλαβερού παράγοντα αυξηθεί, το κυτταροπλασματικό TUNEL μπορεί να μετατραπεί σε μια «ακατάστατη» εικόνα διάσπαρτου TUNEL (Εικόνα 3G) που αποδίδεται σε όψιμα στάδια κυτταρικής καταστροφής λόγω νέκρωσης και διαρροής κυτταρικού κυτταροπλάσματος και υπολειμμάτων. Για παράδειγμα, τόσο το κυτταροπλασματικό όσο και το διεσπαρμένο TUNEL παρατηρήθηκε σε ποντίκια που έλαβαν σισπλατίνη [71,72] και αρουραίους [144] και σε τραυματισμό των ποδοκυττάρων σε διαβητικούς αρουραίους που προκλήθηκαν από στρεπτοζοτοκίνη [145]. Διασκορπισμένο νεκρωτικό TUNEL παρατηρήθηκε επίσης κατά τη διάρκεια της νεφροτοξικότητας που προκαλείται από οξικό ουρανύλιο σε ποντικούς [101]. Τέλος, μια άλλη μεταβλητή σήματος TUNEL που πρέπει να προσέξετε είναι η ένταση των θετικών σημάτων TUNEL, τα οποία μπορεί να αποκλίνουν από κύτταρο σε κύτταρο ανάλογα με τον αριθμό των διαλειμμάτων (βαθμός τραυματισμού) που βιώνει κάθε κύτταρο, όπως τεκμηριώνεται από ορισμένες μελέτες [45,96,125 ]. Για μοντέλα στα οποία παρατηρείται μεταβαλλόμενη ένταση σήματος TUNEL, συνιστάται ποσοτικοποίηση τόσο με τον αριθμό των θετικών στο TUNEL αντικειμένων όσο και με τη μέση ένταση της χρώσης.

συμπεράσματα

Λόγω της υψηλής δραστικότητας των αποπτωτικών ενδονουκλεασών στους νεφρούς, ιδιαίτερα της DNase I και του EndoG, η χρήση του TUNEL γιαέρευνα και διάγνωση νεφρώνείναι πολύ κατατοπιστικό. Μπορεί να γίνει ακόμη πιο χρήσιμο εάν το TUNEL εφαρμοστεί πέρα ​​από την αρχική του χρήση ως μέθοδος αναγνώρισης της απόπτωσης. Η εφαρμογή του TUNEL αποκλειστικά για μελέτες απόπτωσης είναι ένα καλό παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο η επιστήμη μπορεί να παραπλανηθεί ακούσια από μια ακατάλληλα χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Παρά τη χρήση του ως δοκιμασία ως επί το πλείστον οξείας βλάβης, το TUNEL μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία για την αξιολόγηση τόσο της ΑΚΙ όσο και της ΧΝΝ. Ωστόσο, στη ΧΝΝ, ο βαθμός θετικότητας στο TUNEL θα πρέπει να αναμένεται να είναι χαμηλότερος από ό,τι στον οξύ τραυματισμό. Επειδή η δραστηριότητα των ενδονουκλεασών (κυρίως της DNase I) είναι πολύ υψηλότερη στο σωληναριακό επιθήλιο από ό,τι σε άλλα διαμερίσματα των νεφρών, η βλάβη στα νεφρικά σωληνάρια συνήθως θεωρείται πιο εμφανής. Ωστόσο, οι σπειραματικοί ή αγγειακοί τραυματισμοί μπορούν επίσης να μελετηθούν χρησιμοποιώντας TUNEL εάν ο τραυματισμός συμβαίνει πράγματι σε αυτά τα διαμερίσματα. Ο εντοπισμός του φθορίζοντος TUNEL FL με δείκτες IHC επιτρέπει την αναγνώριση και τη σύνδεση τύπων κυττάρων και μηχανισμών κυτταρικού θανάτου με σήματα TUNEL. Η ποσοτικοποίηση TUNEL μπορεί να συνεισφέρει πολύτιμες πληροφορίες για τον βαθμό κυτταρικού θανάτου και η εφαρμογή λογισμικού ανάλυσης εικόνας μπορεί να είναι πολύ χρήσιμη από αυτή την άποψη. Λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλία των μοτίβων TUNEL, προτείνεται να καθιερωθούν και να επιδειχθούν αντιπροσωπευτικές εικόνες

Σήματα TUNEL που θεωρούνται θετικά. Τέλος, τα πρότυπα TUNEL θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν ως πηγή πρόσθετων πληροφοριών, όπως ο μηχανισμός κυτταρικού θανάτου και ο βαθμός τοξικότητας. Για παράδειγμα, η διάκριση μεταξύ θετικών σε TUNEL αποπτωτικών σωμάτων, παρουσίας κυτταροπλασματικών σημάτων TUNEL ή διάσπαρτων μοτίβων TUNEL μπορεί να βοηθήσει στην αναγνώριση αποπτωτικών έναντι νεκρωτικών θετικών στο TUNEL κυττάρων για πιο ακριβείς ερμηνείες των αποτελεσμάτων έρευνας και διάγνωσης.

θεραπεία διαταραχής των νεφρών σεξουαλικής διέγερσης