Θεραπεία για πέτρες στα νεφρά: G. Fruticosus
Mar 22, 2022
Επικοινωνία: Όντρεϊ Χου Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο:audrey.hu@wecistanche.com
ΜΕΡΟΣ I.: Αξιολογήσεις της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των εκχυλισμάτων διαλύτη G. fruticosus σε πειραματικά επαγόμενους νεφρολιθικούς αρσενικούς αρουραίους Wistar
Τιλαχούν Αλελίν, Τεσφάγιε Σισαΐ Τεσέμα, Ασφάου Ντεμπέλα και Μπεγιέν Πέτρος
Φόντο
Ουρολιθίαση(Πέτρεςστο ουροποιητικό σύστημα) επηρεάζει περίπου το 12% του παγκόσμιου πληθυσμού σε κάποιο στάδιο της ζωής του [1]. Άλλες μελέτες ανέφεραν ότι ο παγκόσμιος επιπολασμός τηςπέτρες στα νεφράκυμαίνεται μεταξύ 2 και 20%[2, 3]. Η ουρολιθίαση επηρεάζει όλες τις ηλικίες, τα φύλα και τις φυλές[4,5], αλλά εμφανίζεται συχνότερα στους άνδρες από ό,τι στις γυναίκες ηλικίας μεταξύ 20 και 49 ετών [6]. Η παθογένεση τουπέτρες στα νεφράπαραμένει ελλιπώς κατανοητό [7] και η θεραπεία του παραμένει μια πρόκληση, αν και υπάρχουν σύγχρονες μέθοδοι θεραπείας, συμπεριλαμβανομένου του ESWL[8]. Η ακολουθία των συμβάντων που ενεργοποιούνπέτραο σχηματισμός περιλαμβάνει πυρήνωση, ανάπτυξη, συσσωμάτωση και κατακράτηση κρυστάλλων μέσα στα νεφρά [9, 10].
Πέτρα στα νεφράο σχηματισμός απαιτεί επίμονη συγκράτηση κρυστάλλων στοΝεφράμετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας κρυστάλλωσης[11, 12]. Η αλληλεπίδραση των κρυστάλλων COM με μια επιφάνεια νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων είναι ένα κρίσιμο περιστατικό έναρξης στη νεφρολιθίαση [13]. Οι διασταυρώσεις των κρυσταλλοκυττάρων έχουν ως αποτέλεσμα την κίνηση των κρυστάλλων από τη βασεόπλευρη πλευρά των κυττάρων στην υπόγεια μεμβράνη [14]. Μια μελέτη σε ζωικά μοντέλα αποκάλυψε επίσης ότι η χορήγηση υψηλών συγκεντρώσεων κρυστάλλων CaOx ή ιόντων οξαλικών φαίνεται να είναι τοξική, προκαλώντας βλάβη των νεφρικών σωληναρίων κυττάρων [7]. Η έκθεση σε υψηλότερα επίπεδα κρυστάλλων οξαλικού ή CaOx προκαλεί τραυματισμό των επιθηλιακών κυττάρων, ο οποίος αποτελεί προδιαθεσικό παράγοντα για τους επόμενουςπέτρασχηματισμός [15, 16].
Μια ανισορροπία μεταξύΟυροποιητικούπέτρααναστολείς και προωθητές έχει προταθεί ότι είναι η αιτία τηςπέτρασχηματισμός [17]. Οι φορείς προώθησης διευκολύνουνπέτρασχηματισμός [18], αλλά οι αναστολείς μειώνουν την έναρξη του υπερκορεσμού, της πυρήνωσης, της ανάπτυξης κρυστάλλων και του ρυθμού συσσωμάτωσης [17]. Ωστόσο, οι αναστολείς λειτουργούν εξίσου για όλους. ως εκ τούτου, μερικοί άνθρωποι σχηματίζουν πέτρες. ενώ άλλοι όχι [19]. Μεταξύ των επαναλαμβανόμενωνπέτραπρωκτικά, η απέκκριση οξαλικών στα ούρα ήταν υψηλότερη, ενώ η απέκκριση κιτρικού άλατος ήταν χαμηλότερη Μια μελέτη έδειξε επίσης ότι το οξαλικό μπορεί να διευκολύνει την επαναρρόφηση χλωρίου, νατρίου και νερού στα εγγύς σωληνάρια και να ενεργοποιήσει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης στα νεφρικά επιθηλιακά κύτταρα [20].
Παρά τις σημαντικές βελτιώσεις στην ιατρική θεραπεία, όπως η χρησιμότητα της εξωσωματικής λιθοτριψίας κρουστικών κυμάτων (ESWL), δεν υπάρχει ικανοποιητικό φάρμακο για τη θεραπεία των νεφρικών λίθων [21]. Η θεραπεία με ESWL σχετίζεται με οξεία νεφρική βλάβη λόγω της τραυματικής επίδρασης του κλονιστικού κύματος και λοιμώξεις μετά τη θεραπεία [22]. Οδηγεί επίσης σε ελλιπήπέτραεκκαθάριση, και ανίκανος να αποφύγει νέαπέτρασχηματισμούς [23], ήπέτραυποτροπές συχνά έως και 60%[24,25]. Μετά το πρώτο επεισόδιο ενόςπέτρα, το ποσοστό υποτροπής είναι πάνω από 50% εντός 10 ετών [26,27]. Επομένωςπέτρα στα νεφράη υποτροπή είναι ένας σημαντικός κίνδυνος, ο οποίος θεωρείται μια μη ικανοποιητική κλινική πρόκληση στον τομέα της ουρολογίας [28].Πέτρασχηματίζοντας ασθενείς είναι επιρρεπείς στις υποτροπές του μετά την πρώτη χειρουργική θεραπεία [29]. Παρόλο που οι χημικές συνθέσεις ενόςπέτραεπηρεάζουν την επιλογή της παρέμβασης [30], η ανοικτή χειρουργική επέμβαση παραμένει ο στυλοβάτης της θεραπείας [31]. Ορισμένα φαρμακευτικά φυτά που έχουν μελετηθεί μέχρι στιγμής κατά της ουρολιθίασης αναφέρονται στον Πίνακα 1
Στην Αιθιοπία, οι περισσότεροι ασθενείς βασίζονται σε παραδοσιακά φαρμακευτικά φυτά ως εναλλακτική θεραπεία για διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της ουρολιθίασης. Τα φαρμακευτικά φυτά είναι οικονομικά προσιτά, προσβάσιμα, αποτελεσματικά, με λιγότερες παρενέργειες και είναι καλύτερα συμβατά με τον ανθρώπινο οργανισμό [41], σε σύγκριση με τα συμβατικά φάρμακα [42]. Στην παρούσα μελέτη,G. fruticosus(L.) επιλέχθηκαν για να εξετάσουν τις επιδράσεις τους στην πειραματικά επαγόμενη ουρολιθίαση. Πραγματοποιήθηκε διεξοδική βιβλιογραφική έρευνα για να διαπιστωθεί ότι κανένα από τα επιλεγμένα φαρμακευτικά μέρη του φυτού δεν έχει μελετηθεί μέχρι στιγμής για αντι-ουρολιθικές δραστηριότητες. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν επίσης επαρκή επιστημονικά στοιχεία που έχουν αναφερθεί σχετικά με την αντιηρωική-λιθιατική δράση αυτού του φαρμακευτικού φυτού. Ως εκ τούτου, ο στόχος της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των φαρμακευτικών φυτών σε πειραματικά επαγόμενους νεφρολιθικούς αρσενικούς αρουραίους.
Πίνακας 1 Φαρμακευτικά φυτά με αντι-ουρολιθιακές επιδράσεις σε προηγούμενες μελέτες
Υλικά και μέθοδοι
Ταυτοποίηση και συλλογή φαρμακευτικού φυτικού υλικούΓκομφόκαρποςfruticosus(G. fruticosus)τα φύλλα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της ανθοφορίας ή των καρποφόρων χρόνων του. ΟG.fruticosusΙΒ) Σας ευχαριστώ, κύριε Πρόεδρε. Το Ait.f, γνωστό ως Tifriena (τοπική ονομασία), συλλέχθηκε στο Bole Bulbula γύρω στο"93 Mazoria"Αντίς Αμπέμπα κατά τη διάρκεια του Οκτωβρίου 2018.G. fruticosusΤο L.Ait.f(Asclepiadaceae)(αναφέρθηκε από τον βασικό πληροφοριοδότη) υποβλήθηκε σε αίτηση για θεραπεία ουρολιθίασης. Τα δείγματα φυτών υποβλήθηκαν στο National Herbarium, Τμήμα Βιολογίας Φυτών και Διαχείρισης Βιοποικιλότητας, Πανεπιστήμιο της Αντίς Αμπέμπα (AAU) για ταξινομική πιστοποίηση (TA238), και δόθηκε ο αντίστοιχος αριθμός συλλογής. Τα δείγματα κατατέθηκαν στο Εθνικό Herbarium της AAU για μελλοντικές αναφορές.
Παρασκευή του ακατέργαστου εκχυλίσματος
Τα φυτικά υλικά καθαρίστηκαν σχολαστικά με νερό βρύσης για να απομακρυνθούν οι μολυσματικοί παράγοντες και αποξηράνθηκαν σε υπόστεγο σε θερμοκρασία δωματίου από 2 έως 3 εβδομάδες στο εργαστήριο Βιοϊατρικών Επιστημών, AAU. Τα αποξηραμένα μέρη του φυτού ήταν λεπτώς κονιοποιημένα χρησιμοποιώντας ένα μύλο κουζίνας (κονίαμα και γουδοχέρι, μεγέθους περίπου 9 in.in διαμέτρου). Οι σκόνες τοποθετήθηκαν μέσω κόσκινου 3 μεγεθών ματιών έτσι ώστε να φιλτραριστεί μια ακαθάριστη στερεή ύλη.
Τα εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια διαδικασία παρόμοια με αυτή που χρησιμοποιείται συχνά από παραδοσιακούς θεραπευτές ή ασθενείς, με κάποιες μικρές τροποποιήσεις. Οι σκόνες των φυτών ήταν εμποτισμένες με απεσταγμένο νερό, το οποίο τοποθετήθηκε σε αναδευτήρα για 72 ώρες. Το μείγμα διηθείται μέσω βαμβακιού/γάζας και στη συνέχεια μέσω του διηθητικού χαρτιού Whatman με αριθμό 1 (μέγεθος πόρου: 1l μm) για την απομάκρυνση λεπτών στερεών σωματιδίων φυτών ή αδιάλυτων συστατικών. Ολόκληρα τα εκχυλίσματα συγκεντρώθηκαν σε ξηρότητα χρησιμοποιώντας μια μηχανή λυοφιλοποιητή αφαιρώντας το νερό που δεν είχε οργωθεί υπό μειωμένη πίεση. Στη συνέχεια, τα ημι-στερεά συμπυκνώματα χύνεται σε γυάλινες πλάκες petri και αφήνεται να στεγνώσουν εντελώς σε υδατόλουτρο προσαρμοσμένο στους 45 °C. Τα τελικά αποξηραμένα εκχυλίσματα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε επισημασμένες αποστειρωμένες φιάλες που καλύφθηκαν με ένα σφιχτό πώμα και διατηρήθηκαν στην κατάψυξη στους 20°C μέχρι να χρησιμοποιηθούν στα πειράματα.
Παρασκευάσματα διαδοχικών εκχυλίσεων με διαλύτη
Gomphocarpus fruticosusτο μητρικό εκχύλισμα (υδατικό) χωρίστηκε με διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας από μη πολικούς έως πολικούς διαλύτες εξασφαλίζοντας ότι θα μπορούσε να εξαχθεί ένα ευρύτερο φάσμα πολικότητας ενώσεων. Η διαδοχική εκχύλιση ξεκίνησε διαδοχικά με πετρελαϊκό αιθέρα, ακολουθούμενη από χλωροφόρμιο, οξικό αιθυλεστέρα, βουτανόλη και νερό, στα οποία αυτοί οι διαλύτες απομακρύνθηκαν και συγκεντρώθηκαν κάτω από περιστροφικό εξατμιστήρα κενού. Τα φυτικά υλικά διαβροχής σε απεσταγμένο νερό λυοφιλοποιήθηκαν κάτω από το λυοφιλοποιημένο στεγνωτήριο για να ληφθούν τα υπολείμματα σε σκόνη. Τα αποξηραμένα εκχυλίσματα καλύφθηκαν σφιχτά με πώμα και αποθηκεύτηκαν σε γυάλινες φιάλες και διατηρήθηκαν σε ψυγείο στους -20°CC μέχρι να χρησιμοποιηθούν για το πείραμα.
cistanche deserticola όφελος: θεραπεία της νεφρικής νόσου
Χημικές ουσίες και αντιδραστήρια/τυποποιημένα φάρμακα
Οι χημικές ουσίες και τα αντιδραστήρια ή τα κιτ που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικοί βαθμοί που αγοράστηκαν από διάφορες πηγές. Οι προμήθειες πετρελαϊκού αιθέρα, χλωροφορμίου, οξικού αιθυλεστέρα, βουτανόλης και αιθανόλης προέρχονταν από την Wisteam PLC (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία), το όξινο φωσφορικό κάλιο (άνυδρο), το φωσφορικό νάτριο (διβασικό άνυδρο έξτρα καθαρό), το ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl (CaHuNO) και το χλωριούχο νάτριο (NaCl) αγοράστηκαν από τον Διεθνή Οίκο Εμπορίας Micron PLC (Αντίς Αμπέμπα Αιθιοπίας). Ομοίως, το ισοφλουράνιο και η φορμαλδεΰδη αγοράστηκαν από την Neway Chemicals PLC (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία). Η αιθυλενογλυκόλη (EG) και το χλωριούχο αμμώνιο (NH, Cl) αγοράστηκαν από την Pharma PLC (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία). Σωλήνες EDTA, σωλήνες διαχωρισμού ορού, τριχοειδείς σωλήνες και χειρουργικές λεπίδες αγοράστηκαν από την Micro Pharma PLC (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία). Επιπλέον, τα κιτ για εξετάσεις ηπατικής και νεφρικής λειτουργίας αγοράστηκαν από μια Roshi PLC (Λονδίνο, Αγγλία). Τα κιτ δοκιμασίας οξαλικού (οξαλικού οξέος) colorimet-ric και η χρωματομετρική/φθορομετρική δοκιμασία κιτρικού οξέος που αγοράστηκαν από τα κιτ BioVision Incorporated ήταν (Milpitas, ΗΠΑ). Η σκόνη κιτρικού καλίου ελήφθη από το Νοσοκομείο Παραπομπής Μαύρου Λιονταριού (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία). Το Cystone (πολυερβαρικό σκεύασμα) αγοράστηκε από το Mumbi της Ινδίας. Ασκορβικό οξύ, το οποίο αγοράστηκε από την Micron International Trading House PLC (Αντίς Αμπέμπα, Αιθιοπία).
Διαλυτοποίηση του φυτικού εκχυλίσματος και των τυποποιημένων φαρμάκων Τα δοκιμαστικά εκχυλίσματα/φάρμακα διαφορετικών συγκεντρώσεων διαλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα οχήματα, τα οποία ήταν απεσταγμένο νερό και 3% Tween 80.Όλα τα φυτικά εκχυλίσματα και το κιτρικό κάλιο διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε για τη διάλυση του Cystone ήταν παρόμοια με τις μεθόδους των Pha-tak και Hendre [43] και Garimella et al. [44] με κάποιες τροποποιήσεις. Τα δισκία Cystone κονιοποιήθηκαν με τη χρήση κονιάματος και γουδοχέρι (μέγεθος: 0,23m) και διαλύθηκαν (αιωρούμενα) σε απεσταγμένο νερό (900μl) και 100 μl 3% Tween 80 (δηλαδή,750 mg/ml). Στη συνέχεια, διατηρήθηκαν για 3 ώρες για να διαλυθούν, φυγοκεντρήθηκαν στις 1000rpm για 5 λεπτά και φιλτραρίστηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού μεγέθους πόρων 0,22 mm. Το διαυγές υπερκείμενο υγρό συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για πυρήνωση οξαλικού ασβεστίου και δοκιμές συσσωμάτωσης. Τα εκχυλίσματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας σωλήνες Falcon (45 ml), σφίγγονται με αέρα και αποθηκεύονται στο ψυγείο μέχρι την πειραματική χρήση. Τα δοκιμαστικά εκχυλίσματα και τα τυποποιημένα φάρμακα παρασκευάστηκαν καθημερινά και λίγο πριν από τη δοκιμή χορηγήσεων σε δόση 200 mg/kg εκχυλισμάτων, 750mg/kg Κυστεόνης και 2,5g/kg κιτρικού καλίου. Ο δοσομετρικός όγκος της ελεγχόμενης ουσίας ήταν 2ml/100g σωματικού βάρους. Το απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή όλων των ex-tracts / φαρμάκων και αυτά παρασκευάζονταν καθημερινά πριν από τη δοκιμή των χορηγήσεων.
In vivo ουρολιθιαστικές φαρμακολογικές έρευνες
Ζώα-στόχοι: Χρησιμοποιήθηκαν υγιείς ενήλικοι αρσενικοί αρουραίοι αλμπίνο Wistar της ίδιας ηλικιακής ομάδας μεταξύ 8 και 10 εβδομάδων και βάρους (220-280g), που αγοράστηκαν από το Αιθιοπικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας (EPHI) και αναπαράγονται στο εργαστήριο ζώων Biomed-ical Sciences, AAU. Το πείραμα διεξήχθη στο Εργαστήριο Βιοϊατρικών Επιστημών της AAU και της EPHI, σύμφωνα με τις διεθνώς αποδεκτές τυποποιημένες κατευθυντήριες γραμμές για τη χρήση ζώων στην επιστημονική έρευνα. Πριν από την έναρξη του πειράματος, οι αρουραίοι εγκλιματίστηκαν σε κανονικές εργαστηριακές συνθήκες (6 αρουραίοι ανά κλωβό πολυπροπυλενίου) για 7 ημέρες. Διατηρήθηκαν κάτω από ένα ελεγχόμενο περιβάλλον θερμοκρασίας (27±2 °C), σχετικής υγρασίας (55±5%), και φωτός (12 ώρες κύκλοι φωτός/ σκότους). Αυτοί οι αρουραίοι τρέφονταν με κανονικά σφαιρίδια (τυπική διατροφή) και επέτρεπαν δωρεάν πόσιμο νερό (ad libitum) για 28 ημέρες.
cistanche deserticola όφελος: θεραπεία της νεφρικής νόσου
Επαγωγή ουρολιθίασης
Πέτρες στα νεφράπροκλήθηκαν με τη χρήση αιθυλενογλυκόλης (EG) μαζί με χλωριούχο αμμώνιο (NHCl) που χορηγήθηκε στο πόσιμο νερό του αρουραίου. Σε αυτό το μοντέλο υπεροξαλουρίας, 1% (w / v) NHACl δόθηκε με 0,75% (v / v) EG για τις πρώτες 5 ημέρες για την επιτάχυνση της λιθίασης, μετά από αυτό η παροχή νερού άλλαξε σε 0,75% ΜΌΝΟ EG για τις επόμενες 25 ημέρες [45-47]. Η έκθεση αυτών των επιπέδων δόσης ήταν επαρκώς ανεκτή σε μελέτες σε ζώα [48]. Οι χορηγήσεις EG οδηγούν σε υπεροξαλουρία, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε εναπόθεση CaOx στα νεφρά [49]. Οι πειραματικοί αρουραίοι που ορίστηκαν ωςπέτραθεραπευτικές ομάδες λάμβανανπέτραπροκαλώντας θεραπεία για 28 ημέρες.
Θεραπευτικές επιδράσεις της ουρολιθίασης
Στη θεραπευτική αγωγή (διάλυση), συνολικά 54 αρσενικοί αρουραίοι al-bino Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε 9 ομάδες που περιελάμβαναν 6 άτομα ανά ομάδα με αντίστοιχο σωματικό βάρος. Στη θεραπευτική αγωγή, η νόσος προκλήθηκε εκ των προτέρων από την ημέρα 1 έως την 14η ημέρα. Στη συνέχεια, κάθε ένα από τα ex-tracts/φάρμακα χορηγήθηκε από το στόμα από την ημέρα 15 έως την 28 ταυτόχρονα με τα πρωτόκολλα επαγωγής της νόσου (EG) για τον προσδιορισμό των θεραπευτικών επιδράσεων [50, 51]. Στο τέλος των 28ων ημερών, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν για βιοχημικές και ιστοπαθολογικές μελέτες. Ο πειραματικός σχεδιασμός ανατέθηκε ως Ομάδα Ι (Κανονικός έλεγχος), Ομάδα ΙΙ (Έλεγχος λιθίου), Ομάδα Ι (K-Cit), Ομάδα IV (Κυστεόνη), Ομάδα V (G. fruticosusΕκχύλισμα PET), ομάδα VI (εκχύλισμα G.fruti-cost Chl.), ομάδα VI (G. fruticosusEtOAc ex-tract), ομάδα VIII (εκχύλισμα G.fruticosus BuOH) και ομάδα IX (G. fruticosusaq. κλάσμα). Άλλοι ερευνητές χρησιμοποίησαν επίσης κιτρικό κάλιο (2,5g/kg) ως θετικό μάρτυρα [52, 53]. Ο δοσομετρικός όγκος ήταν 2ml/100g σωματικού βάρους. Η ομάδα ελέγχου λάμβανε απεσταγμένο νερό μία φορά την ημέρα καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στο τέλος της 28ης ημέρας, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν για βιοχημικές και ιστοπαθολογικές μελέτες.
Συλλογή ούρων και μικροσκοπική ανάλυση
Τα ούρα, ο ορός και τα ιστολογικά προφίλ είναι δείκτεςπέτρασχηματισμός καθώς και υποτροπές. Η αφθονία και η μορφολογία των κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου που σχηματίζονται κάτω από in vivoπέτραοι επαγωγικές εξετάσεις εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (Wagtech Thatcham Berkshire RG194QD, Ηνωμένο Βασίλειο,40x μεγέθυνση). Οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ξεχωριστούς μεταβολικούς κλωβούς και υποβλήθηκαν σε 24ωρη συλλογή ούρων την 28η ημέρα για θεραπευτική εξέταση [50]. Στην ανάλυση κρυσταλλουρίας, περίπου 3 ml από τα δείγματα φρέσκων ούρων που συλλέχθηκαν τοποθετήθηκαν σε γυάλινο σωλήνα και φυγοκεντρήθηκαν στις 3000rpm για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα συντρίμμια και τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν. Αυτά τα ιζήματα ούρων χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του σχηματισμού κρυστάλλων CaOx. Περίπου 10 μl των ιζημάτων με δίνη τοποθετήθηκαν σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρα πλάκα μικροσκοπίου (καλυμμένη με κάλυμμα) και εξετάστηκαν για κρυστάλλους CaOx λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό και το μέγεθός τους κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (40x). Οι κρύσταλλοι που σχηματίστηκαν από χημικές ουσίες στα ούρα εξετάστηκαν προσεκτικά από άλλα τεχνουργήματα ούρων. Οι φωτογραφίες μικροσκοπικών παρατηρήσεων τραβήχτηκαν χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP με οπτικό ζουμ 3x, Νιου Τζέρσεϊ, ΗΠΑ) τοποθετημένη χειροκίνητα πάνω της.
Βιοχημική ανάλυση ούρων
Στο τέλος των αντίστοιχων περιόδων θεραπείας, τα ζώα στεγάζονταν μεμονωμένα σε μεταβολικούς κλωβούς και συλλέχθηκαν 24ωρα δείγματα ούρων (οξινισμένα και μη οξινισμένα). Τα ούρα οξύνθηκαν με 1 ml HCL 6N (υδροχλωρικό οξύ) και αποθηκεύτηκαν στους 4°C για 5 ημέρες. Στη συνέχεια, αυτά φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 σ.α.λ. για 10 λεπτά (REMI, R24) και το υπερκείμενο των οξινισμένων ούρων χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση εκκρίσεων όπως οξαλικά, ασβέστιο, μαγνήσιο και φωσφορικά άλατα. Σε μη οξινισμένα ούρα, οι περιεκτικότητες δειγμάτων όπως κιτρικό άλας, κρεατινίνη και ουρικό οξύ, και οι συνολικές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα διαγνωστικά κιτ από τον αυτοματοποιημένο αναλυτή κλινικής χημείας. Τόσο οι συγκεντρώσεις οξαλικού όσο και κιτρικού άλατος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο πολλαπλών φρεατίων (αναγνώστης ELISA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο που παρέχεται με κιτ. Για τους σκοπούς της ποσοτικοποίησης, καταρτίστηκε καμπύλη βαθμονόμησης με τη χρήση κιτ οξαλικών και κιτρικών αλάτων ως στάνταρ.
Συλλογή και ανάλυση ορού
Μετά το τέλος της πειραματικής περιόδου (ημέρα 28η), οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο και 3 ml αίματος sam-ples συλλέχθηκαν από τη ρετρο-τροχιακή φλέβα με διάτρηση capil-lary. Ο ορός διαχωρίστηκε μετά από φυγοκέντρηση στις 3000 σ.α.λ., 20°C°C για 15 λεπτά. Ο ορός που συλλέχθηκε διερευνήθηκε για βιοχημικές παραμέτρους όπως κρεατινίνη, άζωτο ουρίας αίματος, ουρικό οξύ, ουρία, ασβέστιο, μαγνήσιο και φωσφορικό άλας με αυτόματο αναλυτή κλινικής χημείας (αναλυτής Cobas 6000, Γερμανία) με τα αντίστοιχα διαγνωστικά κιτ. Οι συγκεντρώσεις οξαλικού και κιτρικού οξέος που προσδιορίστηκαν πολλαπλώς καλά χρησιμοποιώντας 1 ήταν φασματοφωτόμετρο (αναγνώστης ELISA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο που παρέχεται με κιτ. Για τους σκοπούς της ποσοτικοποίησης, καταρτίστηκε καμπύλη βαθμονόμησης με τη χρήση κιτ οξαλικών και κιτρικών αλάτων ως στάνταρ.
cistanche deserticola όφελος: αντι-φλεγμονή
Ανάλυση ομογενοποιημένων νεφρών
Στο τέλος της πειραματικής περιόδου (ημέρα 28η), οι αρουραίοι θυσιάστηκαν υπό αναισθησία ισοφλουρανίου, ακολουθούμενη από εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας. Στη συνέχεια, άνοιξε η κοιλιά και τα δύο νεφρά συλλέχθηκαν από κάθε αρουραίο. Οι απομονωμένοι νεφροί αφαιρέθηκαν προσεκτικά και καθαρίστηκαν (πλύθηκαν/ξεπλύθηκαν) από εξωτερικούς ιστούς με ένα παγωμένο φυσιολογικό διάλυμα (0,15 M NaCl). Οι αριστεροί νεφροί από κάθε ζώο διατηρήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη ουδέτερη φορμαλίνη και χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογικές μελέτες. Τα δεξιά νεφρά τεμαχίστηκαν σε δύο ίσα μισά χρησιμοποιώντας μια λεπίδα και το μισό στέγνωσε στους 80 ° C σε φούρνο ζεστού αέρα. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν παρόμοια με τους Ashok et al. [35] με κάποιες τροποποιήσεις, στις οποίες ένα σταθερό βάρος 200 mg (29%) του μέσου βάρους του συνολικού νεφρού (0,67 g) θερμαινόταν περαιτέρω ξεχωριστά σε 10 ml υδροχλωρικού οξέος 1N (1% HCl), το οποίο τοποθετήθηκε σε ζέον υδατόλουτρο 100°CC για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τεμαχίστηκε σε κομμάτια χρησιμοποιώντας μια λεπίδα, συνετρίβη από γουδοχέρι και κονίαμα και ομογενοποιήθηκε περαιτέρω για 10 λεπτά χρησιμοποιώντας το Ultra-Sonicator. Το ομογενοποιημένο φυγοκεντρήθηκε στις 3000 σ.α.λ. για 15 λεπτά και το υπερκείμενο υγρό συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας επισημασμένους Κρυοσωλήνες. Τέλος, τα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν για εκτιμήσεις της περιεκτικότητας σε ασβέστιο, οξαλικό και φωσφορικό με εμπορικά διαθέσιμα βιοχημικά κιτ (BioVision PLC, ΗΠΑ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή [54,55].
Ιστοπαθολογικές εξετάσεις
Οι ιστοπαθολογικές εξετάσεις έγιναν για τους ιστούς των νεφρών των πειραματικών αρουραίων. Όλοι οι αρουραίοι θυσιάστηκαν με ανθρώπινο τρόπο χρησιμοποιώντας αναισθησία ισοφλουρανίου στο τέλος της 28ης ημέρας (θεραπευτικές μελέτες ουρολιθίασης). Τα κομμάτια των ιστών ελήφθησαν από τα νεφρά και αναλύθηκαν για ουρολιθικά θεραπευτικά δυναμικά φυτικών εκχυλισμάτων. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν με 10% ρυθμιστικό διάλυμα ουδέτερης φορμαλίνης και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης. Τα τμήματα (πάχους 5μm) κόπηκαν χρησιμοποιώντας το Περιστροφικό Μικρότομο 4060E (Γερμανία), τοποθετήθηκαν σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες και χρωματίστηκαν με Αιματοξυλίνη και Ηωσίνη για να μελετήσουν τις ιστοπαθολογικές αλλαγές[34]. Όλα τα πεδία της μορφολογίας των ιστών εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός (μεγέθυνση 100x)(Wagtech Thatcham, Berkshire, RG19 4QD, Ηνωμένο Βασίλειο), και οι φωτομι-κρογραφίες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή που το τοποθέτησε χειροκίνητα (Sony Cyber-shot DSC-W180 10.1MP με 3x οπτικό Ζουμ, Νιου Τζέρσεϊ, ΗΠΑ) για περαιτέρω αναφορές.
Εναποθέσεις κρυστάλλων οξαλικού ασβεστίου
Στα νεφρά, οι εναποθέσεις κρυστάλλων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ημιποσοτικές δοκιμασίες, που είναι μια μικροσκοπική μέθοδος βαθμολόγησης [46,56]. Χρησιμοποιήθηκε το νηματοειδές μικροσκόπιο μικροσκόπιο (0,1 mm) προσοφθάλμιο (10x, ευρύ πεδίο 23,3 mm, Olympus Optics OSM 212422, κατασκευασμένο στην Ιαπωνία). Δηλαδή, οι εναποθέσεις κρυστάλλων στους ιστούς των νεφρών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Οι βαθμοί σοβαρότητας των αποθέσεων κρυστάλλων ορίστηκαν ως 0=<1 crystal(no="" crystal="" deposition),1="1-10,2=11-30," 3="31-50," 4="51-75" and="" 5="">75 μετρήσεις κρυστάλλων, λαμβάνοντας υπόψη τις μέσες τιμές [46].
Κατά την καταμέτρηση των αποθέσεων κρυστάλλων CaOx, ένα οβελιαίο τμήμα κάθε νεφρικού δείγματος χωρίστηκε σε τέσσερις περιοχές ίσου μεγέθους με δύο εικονικές γραμμές και αναφέρθηκαν μετρήσεις κατά μέσο όρο 4 μικροσκοπικών πεδίων [57,58]. Ένα πεδίο 100x επιλέχθηκε τότε τυχαία από κάθε περιοχή και καταμετρήθηκαν οι αποθέσεις CaOx. Η εικόνα μιας από τις τέσσερις περιοχές κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός καταγράφηκε τυχαία [58] χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή τοποθετημένη χειροκίνητα πάνω από το Μικροσκόπιο.
Στατιστική ανάλυση
Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Graph Pad Prism Prism έκδοση 6 (λογισμικό Graph Pad, Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Η μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από μετα-hoc συγκρίσεις δοκιμών της Dunnett πραγματοποιήθηκε όταν ήταν απαραίτητο για τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και των ομάδων που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Οι τιμές των δεδομένων εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Τιμές του P<0.05 was="" considered="" statistically="">
cistanche deserticola όφελος: θεραπεία της νεφρικής νόσου
