Πώς να αποτρέψετε και να μειώσετε τον σχηματισμό πέτρας στα νεφρά;

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Μέρος Ⅰ Ⅱ: Εκτροπή φωσφατιδυλοσερίνης που ρυθμίζεται από φωσφολιπιδική κρέμπλαση που ενεργοποιείται από σηματοδότηση TGF‑ 1/Smad στο πρώιμο στάδιο σχηματισμού πέτρας στα νεφρά

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Εισαγωγή

Η ουρολιθίαση είναι μια από τις πιο κοινές ασθένειες που προσβάλλουν τον άνθρωπο και σχετίζεται με πολλαπλές ουρολογικές επιπλοκές [1]. Το οξαλικό ασβέστιο (CaOx) αναφέρεται ότι τραυματίζει καλλιεργημένα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, μετά από τα οποία η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) της κυτταρικής μεμβράνης αναστρέφεται από την εσωτερική στιβάδα στην εξωτερική στιβάδα in vitro για να παίξει σημαντικό ρόλο στηνπέτρα στα νεφράσχηματισμός [2]. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί από διάφορες μελέτες [3-6]που πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρικό επίπεδο. Ωστόσο, ο μηχανισμός στον οποίο βασίζεται η εξωτερίκευση του PS σε κύτταρα νεφρικών σωληναρίων που προκαλείται από βλάβη που προκαλείται από το CaOx παραμένει ασαφής. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μια υψηλή συγκέντρωση οξαλικού ασβεστίου οδηγεί στην υπερπαραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)[7], η οποία στη συνέχεια συμβάλλει στην εξωτερίκευση του PS στα κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων για να οδηγήσει σε πυρήνωση και ανάπτυξη κρυστάλλων CaOx [8]. Το ROS και η υπεροξείδωση των λιπιδίων ενεργοποιούν έντονα τη φωσφολιπιδική σκραμπλάση (PLSCR)[9], ενώ η έκθεση σε σαρωτές ROS, όπως η γλουταθειόνη, το συνένζυμο Q10 ή η ιδεβενόνη (ένα ομόλογο συνθετικού συνένζυμου Q10), μειώνει την ενεργοποίηση του PLSCR στην πολυκυστική νόσο των νεφρών [10] . Το PLSCR, το οποίο είναι αγκυρωμένο στην κυτταρική μεμβράνη[11], λειτουργεί ως ένα από τα τρία ένζυμα που ανατρέπουν τα φωσφολιπίδια ικανά να καταλύουν την ταχεία αμφίδρομη κίνηση του PS και στις δύο πλευρές της μεμβράνης κατά μήκος μιας βαθμίδας συγκέντρωσης [12]. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η κυτταρική μεμβράνη βρίσκεται σε ασύμμετρη κατάσταση και το PLSCR δεν έχει καμία επίδραση στη μεμβράνη [13]. Ωστόσο, μετά τον τραυματισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων, το PLSCR ενεργοποιείται και μετακινεί το PS από το εσωτερικό στο εξωτερικό στρώμα[14,15]. Επιπλέον, η υπερέκφραση των κυττάρων Κ1 ωοθήκης κινέζικου χάμστερ PLSCRin διεγείρει την εξωτερίκευση του PS, ενισχύοντας την προς τα έξω κίνηση του PS προς την κυτταρική επιφάνεια κατά τη διάρκεια της απόπτωσης [16]. Επομένως, υποθέσαμε ότι το PLSCR εμπλέκεται επίσης στην εξωτερίκευση του PS στην κυτταρική μεμβράνη του νεφρικού σωληναριού μέσω της ενεργοποίησης του ROS.

Ένας πιθανός μοριακός μηχανισμός παραγωγής ROS που προκαλείται από οξαλικά λαμβάνει χώρα μέσω της επαγωγής της σηματοδότησης TGF- 1/Smad, η οποία μπορεί να παίζει ρόλο στην παραγωγή ROS [17,18]. Πράγματι, η σηματοδότηση TGF- 1/Smad αναφέρεται ότι εμπλέκεται σε μια μυριάδα νεφρικών παθήσεων, όπως η σπειραματονεφρίτιδα, η νεφρική διάμεση ίνωση και η νεφρολιθίαση[19]. Επιπλέον, τα μονοπύρηνα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TGF- 1 εμφανίζουν εξωτερίκευση PS στην κυτταρική μεμβράνη προκαλώντας την αναστροφή του PS από το εσωτερικό στο εξωτερικό στρώμα [20]. Ωστόσο, από ό,τι γνωρίζουμε, η σχέση μεταξύ της σηματοδότησης TGF- 1/Smad και της PSeversion στις κυτταρικές μεμβράνες των νεφρικών σωληναρίων παραμένει άγνωστη. Υποθέσαμε ότι ο TGF- 1 συμμετέχει στην εκτροπή του PS στις κυτταρικές μεμβράνες των νεφρικών σωληναρίων ενεργοποιώντας το PLSCR στο πρώιμο στάδιο του αρουραίουπέτρα στα νεφράσχηματισμός με μεσολάβηση ROS.

Επομένως, διερευνήσαμε εάν η σηματοδότηση TGF- 1/Smad διεγείρει την εξωτερίκευση του PS μέσω της ενεργοποίησης του ROS και εάν το TGF ενεργοποιεί το PLSCR στην κυτταρική μεμβράνη του νεφρικού σωληναριού κατά το πρώιμο στάδιο τηςπέτρα στα νεφράανάπτυξη in vitro και in vivo, θέτοντας έτσι μια θεωρητική βάση για την αιτιολογία τουπέτρα στα νεφράσχηματισμός.

Κάντε κλικ στο Cistanche DHT για νεφρική νόσο

Υλικά και μέθοδοι

Μοντέλο αρουραίου πρώιμου σταδίου σχηματισμού πέτρας στα νεφρά CaOx

Εξήντα καθαροί αρσενικοί αρουραίοι Wistar 3- μηνών με βάρος 200±20 g παρασχέθηκαν από το Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Χαρμπίν και στεγάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (22 βαθμοί ±2 βαθμοί ) και 50-70 τοις εκατό υγρασία. Μετά από 3 ημέρες προσαρμοστικής αναπαραγωγής, χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (20 αρουραίους/ομάδα) - έλεγχος,πέτρα στα νεφρά, καιπέτρα στα νεφράσυν SB431542 (ένας αναστολέας οδού σηματοδότησης TGF- 1/Smad).

Πέτρα στα νεφράΟ σχηματισμός ξεκινά ως μια πρώιμη παθολογική αλλαγή μετά από βλάβη των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων [21,22]. Για τη μελέτη αυτής της διαδικασίας τραυματισμού, ένα μοντέλο αρουραίου πρώιμου σταδίουπέτρα στα νεφράδιαμορφώθηκε, καθώς δεν έχει ακόμη αναφερθεί τυποποιημένη προσέγγιση. Για να παρατηρήσουμε τις πρώιμες αλλαγές μετά από βλάβη των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων, εφαρμόσαμε τη μέθοδο που αναφέρεται από τον Liet al. [23]. Εν συντομία, στους αρουραίους της ομάδας ελέγχου χορηγήθηκαν 2 mL απεσταγμένου νερού ημερησίως μέσω καθετήρα από το στόμα, ενώ στους αρουραίους στηνπέτρα στα νεφράστην ομάδα χορηγήθηκαν 2 mL διαλύματος αιθυλενογλυκόλης 1 τοις εκατό και διαλύματος NHCl 1 τοις εκατό καθημερινά μέσω καθετήρα από το στόμα. Οι αρουραίοι στοπέτρα στα νεφράσυν την ομάδα SB431542 ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με συνδιαλύτη SB431542 (5 mg/kg, S1067, Selleckchem, Σαγκάη, Κίνα) κάθε 7 ημέρες [24]. Τροφή και νερό παρείχαν κατά βούληση. Την ημέρα 14, οι επίμυες ευθανατίστηκαν με υπερβολική δόση αναισθητικού (νατριούχο πεντοβαρβιτάλη, 200 mg/kg, μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης) και οι νεφροί τους αφαιρέθηκαν. Οι αριστεροί νεφροί διατηρήθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για την επακόλουθη ανίχνευση πρωτεΐνης. Οι δεξιοί νεφροί στερεώθηκαν και στη συνέχεια αφυδατώθηκαν και ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης. Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Χρήσης Πειράματος σε Ζώα του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Χάρμπιν (Αριθμός έγκρισης: 2020005, Χαρμπίν, Κίνα).

Σχηματισμός κρυστάλλων στον νεφρικό ιστό

Τα δείγματα ιστού χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Pizzolato [23] και οι κρύσταλλοι CaOx παρατηρήθηκαν κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο πολωμένου φωτός (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Κίνα). Οι θετικές στο pizzolato περιοχές μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ηλικίες permill της συνολικής επιφάνειας ιστού των διατομών χρησιμοποιώντας ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA).

Ανίχνευση PS στη μεμβράνη των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων in vivo με κυτταρομετρία ροής

Η έκθεση των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων σε PS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία χρώσης με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) σημασμένη με Annexin V, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν (σε κάθε ομάδα) κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία). Η ποσότητα της εξωτερίκευσης του PS προσδιορίστηκε ως το ποσοστό των V-θετικών κυττάρων Αννεξίνης. Ο φθορισμός της αννεξίνης V των δειγμάτων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής (διέγερση 488 nm/ εκπομπή 530 nm, Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Μέτρηση των επιπέδων TGF- 1 και Smad7 στη μεμβράνη των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων με western blotting

Μετά την ανάκτηση των κατεψυγμένων δειγμάτων ιστού, η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης φυσικής μεμβράνης ProteoExtract(M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad κιτ (Hercules, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ακολούθως, 40μg πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου 8 τοις εκατό (γέλη στοίβαξης 100 V, γέλη διαχωρισμού 200 V) για 1 ώρα σε σταθερό ρεύμα ηλεκτροδίου 300 mA. Οι πρωτεΐνες στο πήκτωμα μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Kexing Co., Beijing, China), μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη, και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς C με TGF 1 έναντι αρουραίου προβάτου ( ab208466· αντισώματα Abcam, Cambridge, UK) και Smad7 (66.478· Proteintech, Wuhan, Κίνα) [25]. Προστέθηκε δευτερεύον αντίσωμα κουνελιού κατά προβάτου επισημασμένο με υπεροξειδάση χρένου (1:400, Nakasugi Jinqiao Co., Πεκίνο, Κίνα) και επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 1 ώρα. Το σήμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Abcam). Οι θετικές ζώνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης οπτικής πυκνότητας gel-Pro 4.0 και μετρήθηκε η αθροιστική οπτική πυκνότητα (τιμή IOD), με την τιμή R να αντιπροσωπεύει τη σχετική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ως εξής: R{30}}τιμή αναφοράς IOD PLSCR(στόχος)/τιμή αναφοράς IOD του GAPDH (πρωτεΐνη αναφοράς).

Κυτταρική καλλιέργεια και παρεμβολή RNA

Μια νεφρική επιθηλιακή κυτταρική σειρά (κύτταρα MDCK, CCL34, περάσματα 53-90; ATCC, Manassas, VA, ΗΠΑ) αναπτύχθηκε στο τροποποιημένο υλικό Eagle της Dulbecco συμπληρωμένο με αντιβιοτικά (10{{1{{14} }}} U/mL πενικιλίνη, 100 mg/mL στρεπτομυκίνη, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) και 10 τοις εκατό ορός εμβρύου βοοειδών (Life Technologies Co.) σε 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO, ατμόσφαιρα και υποκαλλιέργεια με 0,25 τοις εκατό τρυψίνη και 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Life Technologies Co., CA, USA). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CaOx (0,5 mM, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) για 2 ώρες και με 0,5 mM CaOx και 100 ug/mL εξουδετερωτικού αντισώματος αντι-TGF- 1 （R&D Systems, Minneapolis , MN, USA) για 2 ώρες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Για να προσδιοριστεί ο ρόλος της εκτροπής του PLSCRin PS, τα νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα επιμολύνθηκαν με PLSCR siRNA [26]. Το siRNA σχεδιάστηκε και συντέθηκε από το Anhui General Biological System (Anhui, Κίνα; βλέπε Πίνακα 1). Το LipofectamineTM 2000(Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) χρησιμοποιήθηκε για επιμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη, φυγοκεντρήθηκαν στα 1000xg για 5 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και φυγοκεντρήθηκαν ξανά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το ίζημα εναιωρήθηκε σε PBS για να σχηματίσει ένα εναιώρημα ενός κυττάρου πυκνότητας 1x10 μοιρών κυττάρων/mL. Ο θετικός ρυθμός έκφρασης FAM (καρβοξυφθοροσκεΐνης) ήταν 93 τοις εκατό ± 5 τοις εκατό όπως προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Για περαιτέρω αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ TGF 1 και PLSCR, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5 mM CaOx ή 10 ng/mL TGF- 1 για 2 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με PLSCR siRNA.

Μέτρηση του επιπέδου PLSCR σε μεμβράνες νεφρικών σωληναριακών κυττάρων με western blotting

Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης φυσικής μεμβράνης ProteoExtract (Chemical Book Co., Beijing, Κίνα) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Beijing, China). Ακολούθως, 40 ug πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 8 τοις εκατό (γέλη στοίβαξης 100 V, γέλη διαχωρισμού 200 V) για 1 ώρα σε σταθερό ρεύμα 300 mA. Οι πρωτεΐνες στο πήκτωμα μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Kexing Co., Shenzhen, Κίνα) και μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα στους 37 C και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς με μονοκλωνικό αντίσωμα PLSCR έναντι αρουραίου προβάτου (1:200, PAB781HuO1· Abcam, Guangzhou, Κίνα). Στη συνέχεια προστέθηκε δευτερεύον αντίσωμα κουνελιού κατά προβάτου επισημασμένο με υπεροξειδάση χρένου (1:400) και το μίγμα επωάστηκε στους 37 βαθμούς C για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο της μεμβράνης, το σήμα ανιχνεύθηκε με ένα αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Abcam, Guang-zhou, Κίνα). Οι θετικές ζώνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης οπτικής πυκνότητας Gel-Pro 4.0gel και μετρήθηκε η τιμή IOD, με την τιμή R να αντιπροσωπεύει τη σχετική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη όπως περιγράφεται παραπάνω.

Πίνακας 1 αλληλουχίες siRNA για PLSCR

Μέτρηση κατανομής μεμβρανικής φωσφατιδυλοσερίνης

Η ποσότητα της εκτροπής PS της κυτταρικής μεμβράνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο απόσβεσης φθορισμού που περιγράφεται από τους Kim et al.[27] και η ερευνητική μας ομάδα [2], με νιτροβενζόλιο-2-οξα-1,3-διαζόλη (NBD, Σαγκάη, Κίνα) ως ανιχνευτή φθορισμού. Μετά την επισήμανση του PS στην εξωτερική στιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης με NBD, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε PBS που περιείχε 5 mM φθοροφωσφορικό διισοπροπυλεστέρα. Στη συνέχεια, προστέθηκε PBS που περιέχει οξαλικό ασβέστιο (1.0 mM) και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 βαθμούς. Ίση ποσότητα αιωρήματος κυττάρων εκκενώθηκε κάθε 10 λεπτά και η ένταση φθορισμού καταγραφόταν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφθορόμετρο RF (Shimadzu, Kyoto, Ιαπωνία). Οι ρυθμίσεις του φασματοφθορόμετρου ήταν οι εξής: Πλάτος σχισμής 10 nm για μήκος κύματος εκπομπής 530 nm. και πλάτος σχισμής 5 nm για μήκος κύματος διέγερσης 470 nm. Στη συνέχεια, η μέση τιμή φθορισμού (FT) καταγράφηκε στη δεκαετία του '50. Η μέση μειωμένη ένταση φθορισμού (FD) καταγράφηκε επίσης μετά τη χρήση ενός διαλύματος διθειονίτη για την απόσβεση του φθορισμού NBD από το εξωτερικό στρώμα του κυττάρου. Στη συνέχεια, προστέθηκε 1 τοις εκατό (w/v)Triton X-100 για να διαπερατήσει την κυτταρική μεμβράνη. Ο φθορισμός NBD από το εσωτερικό στρώμα της κυτταρικής μεμβράνης στη συνέχεια σβήστηκε και η ένταση φθορισμού (FO) καταγράφηκε. Το ποσοστό του NBD-PS στους εσωτερικούς λοβούς υπολογίστηκε αργότερα χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: ποσοστιαία ηλικία του εσωτερικευμένου NBD-PS{21}}×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Το ποσοστό της εξωτερίκευσης PS καθορίστηκε σύμφωνα με την αρχή που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της εσωτερίκευσης NBD-PS. Το ποσοστό του NBD-PS στους εξωτερικούς λοβούς υπολογίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: ποσοστό NBD-PS στους εξωτερικούς λοβούς=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Στατιστική ανάλυση

Οι συνεχείς μεταβλητές εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση. Χρησιμοποιήθηκε μια μη παραμετρική δοκιμή ζευγαρώματος κατάταξης, τεστ t και τεστ χ-τετράγωνου. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Αποτελέσματα με Π<0.05 were="" considered="" statistically="">

Αποτελέσματα

Η σηματοδότηση TGF- 1/Smad διεγείρει την εξωτερίκευση του PS in vivo

Σχηματισμός κρυστάλλων σε νεφρικό ιστό μοντέλου αρουραίου

Να καθιερωθεί ένα μοντέλο αρουραίου πρώιμου σταδίουπέτρα στα νεφράσχηματισμός, αιθυλενογλυκόλη και χλωριούχο αμμώνιο χορηγήθηκαν στο στομάχι των αρουραίων για 2 εβδομάδες, και στη συνέχεια κάθε τμήμα νεφρού εξετάστηκε με ψηφιακό μικροσκόπιο. Στα δείγματα της ομάδας ελέγχου, παρατηρήθηκαν φυσιολογικές νεφρικές σωληναριακές δομές χωρίς σχηματισμό κρυστάλλων την ημέρα 14 (Εικ. 1Α). Όταν ο νεφρικός ιστός από τοπέτρα στα νεφράΗ ομάδα παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο, τα νεφρικά σωληνάρια εμφανίστηκαν διεσταλμένα με ορατούς μικροκρυστάλλους. περιστασιακή συσσώρευση κρυστάλλων CaOx παρατηρήθηκε σε ορισμένα νεφρικά σωληνάρια, υποδεικνύοντας την επιτυχή καθιέρωση ενός μοντέλου αρουραίου πρώιμου σταδίουπέτρα στα νεφράσχηματισμός και η δημιουργία βλάβης των κυττάρων των νεφρικών σωληναρίων.

Παρουσία PS στην νεφρική σωληναριακή κυτταρική μεμβράνη

Το Annexin V-FITC, ένα φθορίζον μόριο που συνδέεται με το PS στην κυτταρική επιφάνεια, χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση της ανακατανομής του PS. Στη μελέτη μας, τα κύτταρα MDCK στον φυσιολογικό έλεγχο,πέτρα στα νεφρά, καιπέτρα στα νεφράσυν ομάδες SB431542 παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Εικ. 1Β). Το ποσοστό εκτροπής PS αυξήθηκε στοπέτρα στα νεφράομάδα σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας ελέγχου (Π<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">πέτρα στα νεφράσυν η ομάδα SB431542 εμφάνισαν χαμηλότερο βασικό επίπεδο εξωτερίκευσης του PS από ό,τι στην ομάδα τουνεφρόπέτραομάδα (Π<0.05, fig.="" 1c,="">

Μέτρηση των επιπέδων TGF- 1 και Smad7

Το επίπεδο TGF- 1 στοπέτρα στα νεφράΗ ομάδα προσδιορίστηκε ποσοτικά με western blotting. Ένα τυπικό western blot φαίνεται στο Σχήμα 2Α μαζί με την πυκνομετρική ανάλυση του επιπέδου TGF- 1. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν με αυτές του ελέγχου και εκφράστηκαν ως η αναλογία TGF- 1 προς τουμπουλίνη. Η προσθήκη αιθυλενογλυκόλης και NH Cl αύξησε σημαντικά το επίπεδο TGF- 1 και μείωσε το επίπεδο Smad7 σε σύγκριση με εκείνα στα κύτταρα ελέγχου (Εικ.2Α). Ωστόσο, η θεραπεία με SB431542 συν αιθυλενογλυκόλη και NH οδήγησε σε σημαντικά μειωμένο επίπεδο TGF- 1 και αυξημένο επίπεδο Smad7 σε σύγκριση με εκείνα σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αιθυλενογλυκόλη και NH, Cl.

Ο TGF ενεργοποιεί τη δραστηριότητα PLSCR στην κυτταρική μεμβράνη του νεφρικού σωληναριού in vitro

PLSCR

Το επίπεδο PLSCR αξιολογήθηκε με στύπωμα western. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CaOx για 2 ώρες. Το επίπεδο PLSCR ήταν αμελητέο στα κύτταρα ελέγχου, αλλά αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Μειωμένη κίνηση NBD-PS προς τα μέσα

Προσδιορίσαμε τις κινήσεις του PS προς τα μέσα και προς τα έξω στη μεμβράνη των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων για να αξιολογήσουμε τη δραστηριότητα του PLSCR. Για να εκτιμήσουμε εάν το PLSCR επηρεάζει την κίνηση του PS από το εξωτερικό φυλλάδιο στο εσωτερικό φυλλάδιο της μεμβράνης πλάσματος, ενσωματώσαμε το PS με φθορισμό (NBD-PS) στο εξωτερικό φυλλάδιο της πλασματικής μεμβράνης και παρακολουθήσαμε την εσωτερίκευσή του (Εικ. 3). Η ποσότητα NBD-PS που εσωτερικεύεται από κύτταρα MDCK στις ομάδες ελέγχου και CaOx ήταν περίπου 46,2 τοις εκατό και 17,8 τοις εκατό, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, ο ρυθμός εσωτερίκευσης PS στα κύτταρα της ομάδας CaOx ήταν σημαντικά χαμηλότερος από εκείνον στα κύτταρα της ομάδας ελέγχου (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Εικ. 1 Ο σχηματισμός κρυστάλλων και η εξωτερίκευση του PS παρατηρήθηκαν στις ομάδες ελέγχου, πέτρα στα νεφρά και πέτρα στα νεφρά συν SB431542.

(Α) Σχηματισμός κρυστάλλων στον νεφρικό ιστό την ημέρα 14. Το βέλος υποδεικνύει μικροκρυσταλλικές δομές. (Β) Τα κύτταρα MDCK παρατηρήθηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία λέιζερ.

(Γ) Διαγράμματα κυτταρομετρίας ροής ρυθμού εκτροπής. (Δ) Ποσοστό εκτροπής ( τοις εκατό ). Το τρίγωνο δείχνει P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">πέτρα στα νεφράομάδα

Ενισχυμένη κίνηση NBD-PS προς τα έξω

Για να προσδιοριστεί εάν η μεταφορά του PS προς τα έξω επηρεάζεται από το οξαλικό, τα κύτταρα MDCK επισημάνθηκαν ενδοκυτταρικά με NBD-PS και προσδιορίστηκε η έκταση της μετακίνησής του στο φυλλάδιο των παραδειγμάτων-μικρών. Το μέσο επώασης περιείχε αλβουμίνη βόειου ορού (1 τοις εκατό w/v), η οποία εξήγαγε ταχέως εκφραζόμενο στην επιφάνεια NBD-PS. Περίπου το 34,5 τοις εκατό του NBD-PS μετανάστευσε στο εξωτερικό φυλλάδιο στα κύτταρα ελέγχου, ενώ ο ρυθμός μεταφοράς PS προς τα έξω στα κύτταρα της ομάδας CaOx αυξήθηκε στο 75,3 τοις εκατό σε σύγκριση με εκείνο του συνολικού εσωτερικού επισημασμένου NBD-PS, το οποίο ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από ότι στα κύτταρα της ομάδας ελέγχου (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Εικ. 2 TGF- 1/Έκφραση Smad στις ομάδες ελέγχου, πέτρα στα νεφρά και πέτρα στα νεφρά συν SB431542 και έκφραση PLSCR στην κυτταρική μεμβράνη των νεφρικών σωληναρίων.

(A)TGF- 1/Smad έκφραση. (Β) Σχετικά επίπεδα φωσφολιπιδικής σκραμπλάσης (PLSCR) και αντιπροσωπευτικό στύπωμα με έκφραση κανονικοποιημένη σε αυτήν του GAPDH.P<>

Το τρίγωνο δείχνει P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΜΕΡΟΣ Ⅱ