Τρισδιάστατη αρχιτεκτονική των νεφρώνων στο φυσιολογικό και κυστικό νεφρό
Mar 17, 2022
για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
Τόμας Μπλανκ1,2,7, Νικολά Γκουντίν3,7, Μοχάμεντ Ζαϊντάν1,4,7, Μεριέμ Γκαρφά Τραορέ3, Frank Bienaime1,5, Λίζα Τουρίνσκι1, Σερζ Γκαρμπάι1, Clement Nguyen1, Μαρτίν Μπέρτιν1, Gerard Friedlander1,6, Φαμπιόλα Τερζή1,8και Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université deParis, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Παρίσι, Γαλλία;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Παρίσι, Γαλλία;3Structure Fédérative de Recherche Necker, ΗΠΑ24-UMS3633, Παρίσι, Γαλλία; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Γαλλία;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Παρίσι, Γαλλία; και6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Παρίσι, Γαλλία
ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: κυστικήνεφρόνόσος;νεφρό; νεφρώνας; νεφρονοφθίαση; κάθαρση ιστού
Μεταφραστική δήλωση
Οι μέθοδοι εκκαθάρισης παρέχουν ένα μοναδικό εργαλείο για την κατανόηση του πώς οι μορφολογικές αλλαγές οδηγούν σε παθολογικές συνέπειες.Νεφράείναι κρίσιμα όργανα που διατηρούν την ομοιόσταση του σώματος μέσω του νερού, του μεταβολίτη και του χειρισμού ηλεκτρολυτών, τα οποία εξαρτώνται καθοριστικά από τη σύνθετη 3-διαστατική δομή τουνεφρώνες.Όταν αυτή η δομική οργάνωση αλλοιώνεται, ακολουθεί νεφρική παθοφυσιολογία. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια ισχυρή μέθοδο που βασίζεται στην οπτική διαγραφή, τη μικροσκοπία πολλαπλών φωτονίων και την ψηφιακή ανίχνευση για τη μελέτη τουνεφρόσε επίπεδο μονού νεφρώνα υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, παρέχουμε την πρώτη 3-διαστατική ανακατασκευή ενός πολυκυστικού νεφρού στην κλίμακα του απλούνεφρώνες. Αυτή η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί σε πολλά παθολογικά πλαίσια, επιτρέποντάς μας να κατανοήσουμε καλύτερα τη σύνθετη διαδικασία της νεφρικής φθοράς και, κατά συνέπεια, να αναπτύξουμε πιο στοχευμένες θεραπευτικές στρατηγικές
Ο νεφρός διατηρεί την ομοιόσταση του σώματος μέσω του συμπλόκου του3-διάστατο(3D) δομή νεφρώνα. Όταν αυτή η δομική οργάνωση μεταβάλλεται, η νεφρική παθοφυσιολογία προκαλείται. ΧρόνιοςνεφρόΟι ασθένειες χαρακτηρίζονται από την ανάπτυξη νεφρικών βλαβών. Περιέργως, οι παθολόγοι έχουν αναφέρει μια ευρεία ετερογένεια στην κατανομή των βλαβών κατά τη διάρκεια των χρόνιων νεφρικών παθήσεων. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, είναι υποχρεωτική η ανακατασκευή του 3D (Τρισδιάστατο) σχήμα τουνεφρώνεςσε παθολογικά πλαίσια.
Εξ όσων γνωρίζουμε,νεφρώνεςέχουν ανακατασκευαστεί πλήρως μόνο χρησιμοποιώντας σειριακές τομές 2D.3–5 Αν και η τυπική ιστολογική τομή παρέχει υψηλή ανάλυση, οι 3Drestructions είναι επίπονες και δύσκολο να ληφθούν. Αυτό οφείλεται κυρίως σε μηχανικές παραμορφώσεις, οι οποίες είναι αναπόφευκτη επίδραση της διαδικασίας τεμαχισμού. Επιπλέον, η 3D( ανακατασκευή από 2D εικόνες δεν επιτρέπει την άμεση απεικόνιση τρισδιάστατων δομών σε ιστούς που είναι τοποθετημένοι σε ολόκληρο το σώμα.
Η πολυφωτονική μικροσκοπία έχει βελτιώσει την ικανότητά μας να ανιχνεύουμε μορφολογικές αλλαγές σε παχιές τομές. Ωστόσο, σημαντικός περιορισμός είναι το μικρό προσβάσιμο βάθος λόγω της σκέδασης του φωτός. Με την ελαχιστοποίηση των διαφορών του δείκτη διάθλασης, οι καθαριστικοί παράγοντες έχουν βελτιώσει δραματικά την ικανότητα απεικόνισης βάθους.6,7 Παρά το γεγονός ότι ο πρώτος καθαριστικός παράγοντας εισήχθη πριν από έναν αιώνα,8 μόλις πρόσφατα αναπτύχθηκαν πολλά πρωτόκολλα εκκαθάρισης, κυρίως για τον εγκέφαλο.9 –17 Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει τις δυνατότητές τους για απεικόνιση άλλων στερεών οργάνων, όπως το ήπαρ, το πάγκρεας ήνεφρό.18–26
Πολυκυστικήνεφρόασθένεια, μια γενετικά ετερογενής διαταραχή που περιλαμβάνει μεταλλάξεις σε πολλά βλεφαρικά γονίδια, είναι η πιο συχνή κληρονομική νόσος των νεφρών.27,28 ΠολυκυστικήνεφρόΗ νόσος χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη κύστεων που οδηγούν στην πλήρη καταστροφή του νεφρού.28 Μελέτες μικροτομής πρότειναν ότι οι κύστεις μπορούν να αναπτυχθούν είτε ως «ώθηση προς τα έξω» ενός τμήματος νεφρώνα, όπως στην αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νεφρική νόσο. ως εκστατική διαστολή συλλεκτικών αγωγών (CDs), όπως σε αυτοσωματικό υπολειπόμενο πολυκυστικόνεφρόνόσος; ή αποκλειστικά σε μυελικούς σωληνίσκους, όπως στη νεφροφθίαση (NPHP).27,29 Ωστόσο, πώς αναπτύσσονται οι κύστεις σε 3D (Τρισδιάστατο) και οργανώνουν μεταξύ τους και κανονικές γειτονικές σωληνώσεις ακόμα άγνωστες.
Εδώ, συνδυάσαμε την οπτική εκκαθάριση με την πολυφωτονική μικροσκοπία για να παρέχουμε νέες πληροφορίες για το πώςνεφρώνεςέχουν σχήμα και οργάνωση σε φυσιολογικές συνθήκες και πώς τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της νόσου, όπως η κυστεογένεση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι υπάρχουν 3 τύποινεφρώνεςΚαι ότι τα αγγεία μπορεί να επηρεάσουν τη χωρική οργάνωση των νεφρώνων. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι οι νεφρώνες τείνουν να βρίσκονται σε συγκεκριμένα επίπεδα. Απροσδόκητα, όταν εφαρμόσαμε αυτή την τεχνική στο jckmice, παρατηρήσαμε ότι οι κύστεις αναπτύχθηκαν μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα με ατρακτοειδείς κύστεις αναμεμειγμένες με φυσιολογικά σωληνάρια.
Κάντε κλικ στοCistancheπαρενέργειεςγια νεφρική νόσο
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Πειραματική ρύθμιση
Να μελετήσει το σχήμα ολόκληρουνεφρώνεςσε σχέση με το περιβάλλον τους, υιοθετήσαμε μια τεχνική που βασίζεται στην οπτική εκκαθάριση και στην πολυφωτονική μικροσκοπία (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Συγκρίνοντας διαφορετικά πρωτόκολλα οπτικής εκκαθάρισης, προσδιορίσαμε ότι για τονεφρό, η βενζυλική αλκοόλη/βενζοϊκός βενζυλεστέρας (BABB) ήταν η καταλληλότερη όσον αφορά την αποτελεσματικότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B και C και Συμπληρωματικός Πίνακας S1).
3D (Τρισδιάστατο) η ανακατασκευή και η ψηφιακή ανίχνευση απαιτούν εικόνες υψηλής ποιότητας με υψηλή ανάλυση και υψηλή αναλογία σήματος προς φόντο. Παρατηρήσαμε ότι το οπτικό σήμα που παρέχεται από τον φυσικό φθορισμό δεν ήταν ομοιόμορφο στις τομές των νεφρών. Ειδικότερα, οι εικόνες από το μυελό είχαν μικρή αντίθεση με χαμηλή αναλογία σήματος προς φόντο (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Για να βελτιωθεί η αναλογία σήματος προς φόντο, οι τομές χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff (Συμπληρωματικό Σχήμα S1D), επειδή εμπειρικά παρατηρήσαμε ότι αυτή η χρώση οδήγησε σε υψηλή αντίθεση σε λεπτές τομές κατά τον 2-φωτονφθορισμό. Ωστόσο, το σήμα δεν ήταν ομοιόμορφο σε όλο το παχύρρευστο περιοδικό οξύ - Schiff - χρωματισμένονεφρότμήματα (Συμπληρωματικό Σχήμα S1E). Ως εκ τούτου, χρωματίσαμε τις τομές των νεφρών με λεκτίνες συζευγμένες με φθόριο: συγκολλητίνη φιστικιού και συγκολλητίνη φύτρων σιταριού, που λερώνουν τα σπειράματα και τους σωληνίσκους και τη συγκολλητίνη Griffonia simplicity I folia, η οποία σηματοδοτεί τα αιμοφόρα αγγεία. αυξήθηκε δραματικά σε ολόκληρες τομές νεφρού, με σημαντική βελτίωση τόσο στο επίπεδο XY όσο και στον άξονα z (Συμπληρωματικό Σχήμα S1E και Συμπληρωματική ταινία S1).
Οπτικοποίηση 3D τμήματος νεφρώνα
Για να οπτικοποιήσετε το σχήμα του συνόλουνεφρώνες, εντοπίσαμε τα μονοπάτια τους, ξεκινώντας από τον ουροποιητικό πόλο του σπειράματος και καταλήγοντας στη διασταύρωση CD (Συμπληρωματική ταινία S2). Παρά το γεγονός ότι οι λεκτίνες που χρησιμοποιούνται παγκοσμίως δεσμεύουν όλα τα νεφρονικά τμήματα, παρατηρήσαμε ότι όταν επιθεωρήθηκαν προσεκτικά, αυτές οι λεκτίνες χαρακτηρίζονταν από ένα συγκεκριμένο σχέδιο στον τρόπο με τον οποίο έβαφαν τις βασικές ή αυλικές μεμβράνες στα διάφορα νεφρονικά τμήματα. Με άλλα λόγια, εκμεταλλευτήκαμε το στερεότυπο μοτίβο της χρώσης με λεκτίνη για να αναγνωρίσουμε τα διαφορετικά τμήματα του νεφρώνα. Με αυτόν τον τρόπο, θα μπορούσαμε εύκολα να αναγνωρίσουμε 6 οντότητες: εγγύς σωληνάριο (PT), λεπτό άκρο (TL) του Henleloop (HL), παχύ ανιούσα άκρο (TAL) του HL, περιφερικό σωληνάριο (DCT), συνδετικό σωληνάριο (CNT), και CD. Η μετάβαση μεταξύ PT και TL χαρακτηρίστηκε από την ξαφνική απώλεια του τυπικού σήματος ορίου βούρτσας PT και από τη μείωση του πλάτους του αυλού, η οποία σχεδόν ουσιαστικά απουσίαζε στο TL (Εικόνα 1α). Αντίθετα, η μετάβαση μεταξύ TL και TAL χαρακτηρίστηκε από σημαντική αύξηση στην εξωτερική σωληναριακή διάμετρο και σχετικά σταθερό πλάτος αυλού (Εικόνα 1β). Σε όλους τους νεφρώνες, η μετάβαση του TAL σε DCT βρέθηκε συστηματικά στον αγγειακό πόλο του σπειράματος. Αυτή η μετάβαση χαρακτηρίστηκε από μια ξαφνική μεγέθυνση της εξωτερικής σωληναριακής διαμέτρου που οφειλόταν κυρίως στη σημαντική αύξηση της διαμέτρου του αυλού (Εικόνα 1c). Η μετάβαση μεταξύ DCT και CNT χαρακτηρίστηκε από επαγωγή τόσο στη σωληναριακή διάμετρο όσο και στον αυλό (Εικόνα 1δ). Τέλος, η σύνδεση μεταξύ CNT και CD του φλοιού χαρακτηρίστηκε από μια ξαφνική αύξηση τόσο στη διάμετρο του σωλήνα όσο και στον αυλό (Εικόνα 1e). Η ποσοτικοποίηση αυτών των μορφολογικών μεταβάσεων ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 1στ) και η συνάφειά της επαληθεύτηκε με χρώση με ειδικούς σωληνωτούς δείκτες (Συμπληρωματικά Σχήματα S3–S5 και Συμπληρωματική ταινία S3–S5).
Το σχήμα και το μέγεθος των PT διαφέρουν ανάλογα με το βάθος τους
Η χρώση του παχύνεφρότα τμήματα μας επέτρεψαν να εντοπίσουμε τις συντεταγμένες της χωρικής εξέλιξης ολόκληρων τμημάτων PT. Είναι ενδιαφέρον ότι ανακαλύψαμε ότι το σχήμα τους ήταν εξαιρετικά μεταβλητό και καθοριζόταν από τη θέση των σπειραμάτων τους στον φλοιό. Σε παγκόσμιο επίπεδο, εντοπίσαμε 3 μοτίβα. Το πρώτο αντιστοιχούσε στο πιο επιφανειακόνεφρώνες(SNs) (Εικόνα 2α, Συμπληρωματική ταινία S6), που καταλάμβανε το πιο εξωτερικό μέρος του φλοιού (το πιο εξωτερικό 30 τοις εκατό κοντά στη νεφρική κάψουλα). Τα περίπλοκα μέρη τους σχημάτισαν συμπαγείς δομές με μόνο 6 έως 7 περιελίξεις γύρω από το δικό τους σπείραμα, καταλαμβάνοντας πολύ μικρούς και σφιχτά γεμάτους χώρους. Η συνέλιξη αυτών των SN κατέληγε σε μακρύ και ευθύ ορθό τμήμα που κατέβαινε στον μυελό. Στο αντίθετο άκρο αυτού του φάσματος, παρατηρήσαμε ένα δεύτερο μοτίβο νεφρώνων που βρίσκεται στο βαθύτερο τμήμα του φλοιού (40 τοις εκατό περισσότερο εσωτερικό βάθος), δίπλα στον μυελό (παραμυελικοί νεφρώνες [JNs]) (Εικόνα 2α, Συμπληρωματικό Σχήμα S6 και Συμπληρωματική Ταινία S6). Τα PTs τους χαρακτηρίζονταν από έναν αρχικό βραχύ βρόχο που κατέβαινε συστηματικά προς την θηλή και στη συνέχεια το U γύριζε για να ανέλθει προς τη νεφρική κάψουλα. Σε αντίθεση με τα SN, τα JN εγγύς ελικοειδή σωληνάρια χαρακτηρίστηκαν από μεγάλα πηνία που εξελίχθηκαν γύρω από το δικό τους σπειράμα και καταλάμβαναν μεγάλες, χαλαρά γεμάτες περιοχές στον παραμυελικό φλοιό. Το σύνθετο τμήμα του PT των JNs είχε 10 έως 15 συνελίξεις, σχηματίζοντας μεγάλες περιοχές. Τέλος, το τρίτο πρότυπο περιελάμβανε νεφρώνες που βρίσκονται στο μεσαίο τμήμα του φλοιού (μεσαίοι νεφρώνες [MNs]) (Εικόνα 2α; Συμπληρωματική ταινία S6). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτά τα σωληνάρια είχαν σχήμα και χωρικό προσανατολισμό που αντιπροσώπευε μια μετάβαση μεταξύ SNs και JNs. Στην πραγματικότητα, περιείχαν 8 έως 9 περιελίξεις με πηνία που ήταν μεγαλύτερα από τα SN, αλλά μικρότερα από τα JN. Επιπλέον, τα MNs είχαν μακρύτερα pars recta από τα JNs. Είναι ενδιαφέρον ότι μια συνολική σύγκριση των σχημάτων των PTs έδειξε ότι τα SNs και MNs είχαν ένα ομοιογενές μοτίβο ενώ τα JNs ήταν εξαιρετικά ετερογενή (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Επιπλέον, η χωρική ανασυγκρότηση αρκετώννεφρώνες αποκάλυψε ότι τα PT δεν αναμειγνύονται ποτέ (SupplementaryMovie S6), υποδεικνύοντας ότι κάθε νεφρώνας καταλαμβάνει τον δικό του ξεχωριστό χώρο στον φλοιό.
Οι μορφομετρικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν τις μεγάλες διαφορές στο μέγεθος και το σχήμα των SNs και JNs, με μια ενδιάμεση όψη για τα MNs. Το PT των JN ήταν περισσότερο από 2-φορές μεγαλύτερο από το PT των SN (Εικόνα 2β). Ωστόσο, η ευθύτητα ήταν μεγαλύτερη στα SNs από ό,τι στα JNs (Εικόνα 2c), σύμφωνα με την παρατήρηση ότι τα σωληνάρια JN ήταν πολύ πιο ελικοειδή (Εικόνα 2α, Συμπληρωματικό Σχήμα S6).
Εικόνα 1|Μορφολογικά κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση τμημάτων νεφρώνων. (α–ε) Μορφολογία των διαφορετικών τμημάτων των ποντικών ανεξέλεγκτου νεφρώνα.Νεφρώνεςεντοπίστηκαν από τον ουροποιητικό πόλο του σπειράματος στον αγωγό συλλογής (εγγύς σωληνάριο [PT]: τιρκουάζ· λεπτό άκρο[TL] του βρόχου Henle: ανοιχτό γκρι· παχύ ανιόν άκρο [TAL] του βρόχου Henle: σκούρο γκρι· περιφερικό σωληνίσκος [DCT]: ροζ· συνδετικός σωλήνας [CNT]: κίτρινος· φλοιώδης αγωγός συλλογής [CCD]: πορτοκαλί). Τα βέλη υποδεικνύουν τη διάμετρο των διαφορετικών τμημάτων νεφρώνων. (Συνεχίζεται)
Εικόνα 1|(Συνέχεια) (στ) Ποσοτικοποίηση της εξωτερικής σωληνοειδούς διαμέτρου των διαφορετικών τμημάτων νεφρώνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: **P < 0.01, ***P <0,001.
Εικόνα 2 |ΤρισδιάστατοΗ (3D) ανακατασκευή του εγγύς σωληναρίου αποκαλύπτει 3 διαφορετικά σχήματα και οργανώσεις. (α) Αντιπροσωπευτικές 3 εικόνες ανακατασκευής εγγύς σωληναρίων μέσω ολόκληρου του νεφρικού φλοιού, χωρισμένες σε 3 επίπεδα (λευκές γραμμές) ανάλογα με το σχήμα των εγγύς σωληναρίων (PTs): επιφανειακός (μπλε), μεσαίος (πράσινος) και παραμυελικός (κόκκινος) φλοιός, που αντιστοιχεί στο εξωτερικό 30 τοις εκατό, το μεσαίο 30 τοις εκατό, και το 40 τοις εκατό του φλοιού, αντίστοιχα. Σημειώστε τα διαφορετικά σχήματα των 3 τύπωννεφρώνεςκαι ειδικότερα το μήκος και τη στρεβλότητα των παραμυελικών σωληναρίων. Μπάρα{{0}} χλστ. (β, γ) Ποσοτικοποίηση του (β) μήκους και (γ) της ευθύτητας των 3 τύπων εγγύς σωληναρίων. (δ)Ποσοτικοποίηση του όγκου των σπειραμάτων από κάθε περιοχή του φλοιού. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: παραμυελική PT έναντι επιφανειακής PT: ###P < 0.001;="" παραμυελική="" pt="" έναντι="" μέσης="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" επιφανειακό="" pt="" έναντι="" μεσαίου="" pt:="" $$$p=""><>
Εικόνα 3 |ΤρισδιάστατοΗ (3D) ανακατασκευή νεφρώνων αποκαλύπτει 3 διαφορετικούς τύπους νεφρώνων. (α) Αντιπροσωπευτικές τρισδιάστατες εικόνες ολικού νεφρώνα (αριστερά πάνελ) από σπειράματα μέχρι αγωγό συλλογής στον επιφανειακό φλοιό (μπλε), στον μεσαίο φλοιό (πράσινο) και στην παραμυελική περιοχή (κόκκινο) σε ποντικούς ελέγχου. Τμηματοποίηση νεφρώνων (δεξιά πλαίσια) για τους 3 διαφορετικούς τύπους νεφρώνων. Μπάρα=150 χλστ. (β) Ποσοτικοποίηση της εσωτερικής απόστασης μεταξύ των 2 άκρων του βρόχου Henle για τους 3 τύπους νεφρώνων. (γ) Ποσοτικοποίηση του μήκους νεφρώνων για το (συνέχεια)
Εικόνα 3|(συνέχεια) 3 είδηνεφρώνες. (δ) Ποσοτικοποίηση του μήκους των διαφορετικών τμημάτων του νεφρώνα ανάλογα με τον τύπο του νεφρώνα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: παραμυελικός νεφρώνας (JN) έναντι επιφανειακού νεφρώνα (SN): ###P < 0.001;="" jn="" έναντι="" μέσου="" νεφρώνα="" (mn):="" *p="">< 0.05,="" **p=""><0.01, ***p=""><0.001. cnt,="" συνδετικό="" σωληνάριο.="" dct,="" περιελιγμένο="" σωληνάριο.="" pt,="" εγγύς="" σωληνάριο;="" tal,="" παχύ="" ανερχόμενο="" άκρο="" του="" βρόχου="" henle.="" tl,="" λεπτό="" άκρο="" του="" βρόχου="">
Το μέγεθος των σπειραμάτων ποικίλλει ανάλογα με το βάθος
Στη συνέχεια αναλύσαμε το βάθος και τη διάμετρο των σπειραματικών τυχαίων επιλεγμένων από καθεμία από τις 3 ζώνες. Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα σπειράματα εντοπίστηκαν κατά μέσο όρο 783 και 355 mm από τη νεφρική κάψουλα σε JNs και SNs, αντίστοιχα. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, παρατηρήσαμε ότι το μέγεθος των σπειραμάτων ποικίλλει ανάλογα με το βάθος τους. Συγκεκριμένα, ο σπειραματικός όγκος των JNs ήταν 3 φορές μεγαλύτερος από αυτόν των SNs και MNs (Εικόνα 2δ).
Τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων
Στη συνέχεια παρακολουθήσαμε τη χωρική εξέλιξη του συνόλουνεφρώνεςαπό PT σε CNT. Η συνολική άποψη του 3D τους (Τρισδιάστατο) η ανακατασκευή επιβεβαίωσε ότι το σχήμα του νεφρώνα διέφερε μεταξύ των SN, MNs και JNs (Εικόνα 3a, Συμπληρωματική ταινία S7). Αυτή η διαφορά οφειλόταν κυρίως στη δομή του PT. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η HL είχε μια διαφορετική τρισδιάστατη χωρική οργάνωση. Ειδικότερα, το TL και το TAL διαχωρίστηκαν πιο απομακρυσμένα στο JNsthan σε SNs και MNs (Εικόνα 3β). Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα JN ήταν συνολικά 2- φορές μεγαλύτερα από τα SN (Εικόνα 3γ). Το αυξημένο μήκος κατανεμήθηκε αναλογικά σε όλα τα τμήματα, εκτός από τα TAL και DCT, τα οποία έτειναν να έχουν παρόμοιο απόλυτο μήκος σε όλους τους τύπους νεφρώνων (Εικόνα 3δ). Αυτό υποδηλώνει ότι η επιμήκυνση νεφρώνων είναι εκπληκτικά ομοιογενώς διαμορφωμένη διαδικασία.
Τα τοξοειδή αγγεία επηρεάζουν την παραμυελική συνέλιξη PT
Για να αποκτήσετε μια πιο ολοκληρωμένη προοπτική τουνεφρόδομή, εκμεταλλευτήκαμε τη χρώση Griffonia simplicifoliaagglutinin, η οποία μας επέτρεψε να εντοπίσουμε τα τοξοειδή αγγεία και τους κλάδους τους στα αγγεία ακτινοβολίας του φλοιού (Εικόνα 4α, Συμπληρωματική ταινία S8). Είναι ενδιαφέρον ότι η συνακόλουθη 3D (Τρισδιάστατο) η ανακατασκευή νεφρώνων και αγγείων έδειξε ότι τα τοξοειδή αγγεία τείνουν να βρίσκονται σε μια εκπληκτική παράλληλη χωρική οργάνωση με κοντινούς σωληνίσκους. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι η διαδρομή που ακολουθείται από συγκεκριμένα JNs (περιορισμένα JNs) τείνει να ακολουθεί τη διαδρομή του κοντινού σκάφους (Εικόνα 4β, Συμπληρωματική ταινία S9). Αξιοσημείωτα, αυτή η μεροληψία (παρατηρήθηκε μόνο σε ένα υποσύνολο του JNνεφρώνες) αντιπροσώπευαν τη μεγάλη ετερογένεια στα σχήματα του PT (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Οι μορφομετρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα "περιορισμένα" PT ήταν σημαντικά μακρύτερα και πιο ελικοειδή (μειωμένη ευθύτητα) από τα "μη περιορισμένα" (Εικόνα 4γ και δ). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα σύνθετα μέρη τόσο των SN όσο και των MNs ήταν τοποθετημένα πάνω από τα τοξοειδή αγγεία και δεν ήταν περιορισμένα.
Cistanche-χρόνια νεφρική νόσο
Τα σωληνάρια τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα
Είναι ενδιαφέρον ότι μια επιθεώρηση του 3D (Τρισδιάστατο) σχήματα τουνεφρώνεςέδειξε ότι τείνουν να βρίσκονται σε επίπεδα (Εικόνα 5α, Συμπληρωματική ΤαινίαS10). Για να ποσοτικοποιήσουμε αυτήν την παράμετρο και να αξιολογήσουμε την πιθανή στατιστική μεροληψία αυτής της διαμόρφωσης, μετρήσαμε τη γενική τάση των σωληναρίων να κάμπτονται έξω από το επίπεδο που ορίζεται από τους βρόχους τους. Οι μετρήσεις μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με ένα προσομοιωμένο μοντέλο τυχαίου περπατήματος που δημιουργήθηκε με το ίδιο σύνολο διαδοχικών μετρούμενων γωνιών και μήκους μεταξύ διαδοχικών σημείων (Εικόνα 5β), τα σωληνάρια έτειναν να εξελίσσονται με μικρότερη απόκλιση από ένα επίπεδο (Εικόνα 5γ). Αυτό έδειξε ότι οι σωληνίσκοι τείνουν να περιορίσουν την πορεία τους κατά μήκος ενός αεροπλάνου. Οι παρατηρούμενες διαφορές ήταν πολύ στατιστικά σημαντικές (P <>
Η τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων αποκαλύπτει ένα συγκεκριμένο μοτίβο για την ανάπτυξη κύστεων
Για να προσδιορίσουμε εάν το πρωτόκολλό μας επιτρέπει τον εντοπισμό νεφρώνων σε αποδιοργανωμένους παθολογικούς ιστούς, χαρακτηρίσαμε τα σχήματα και τη χωρική κατανομή των κύστεων σε ποντίκια jack, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο NPHP και κυστικής νόσου.31–33 3Οι εικόνες D έδειξαν ότι παρά την εμφάνιση εμφανών κύστεων, η γενική 3D (Τρισδιάστατο) η πορεία των νεφρώνων δεν διέφερε σημαντικά από αυτή των ποντικών ελέγχου (Συμπληρωματική ταινία S11). Ομοίως, μορφομετρικές αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι το παγκόσμιο μήκοςνεφρώνες, ο σπειραματικός όγκος και το μήκος κάθε τμήματος νεφρώνα ήταν συγκρίσιμα με αυτά των ποντικών ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Αξίζει να σημειωθεί ότι λόγω της ανάπτυξης κύστης, δεν μπορέσαμε να διαφοροποιήσουμε το TL από το TAL στο HL. Όλοι οι νεφρώνες ανέπτυξαν ατρακτοειδείς κύστεις (SupplementaryMovies S11 και S12). Ένα από τα πιο εντυπωσιακά χαρακτηριστικά ήταν η παρατήρηση ότι οι ατρακτοειδείς κυστικές διαστολές εμφανίστηκαν σε πολλές θέσεις κατά μήκος του ίδιου τμήματος νεφρώνων (Συμπληρωματικές ταινίες S12 και S13). Περιέργως, παρατηρήσαμε ότι οι κύστεις δεν αναπτύχθηκαν ποτέ σε PTs και HL κατερχόμενα άκρα (Εικόνα 6a, Συμπληρωματική ταινία S12). Αντίθετα, ανιχνεύθηκαν κυρίως σε ανιόντες άκρες HL, DCT, CNT και στο πάνω μέρος των CD, σε συνέχεια με CNT (Εικόνα 6α, Συμπληρωματική ταινία S12). Ειδικότερα, παρατηρήσαμε ότι τα τμήματα DCT, καθώς και τα τμήματα CNT, είχαν μια ιδιαίτερα αυξημένη πιθανότητα να αναπτύξουν κύστεις στα αντίστοιχα πιο απομακρυσμένα μέρη τους (Εικόνα 6β). Οι ποσοτικές μορφομετρικές αναλύσεις τρισδιάστατων εικόνων ανακατασκευής αποκάλυψαν ότι ο συνολικός όγκος κύστης ανά νεφρώνα ήταν ιδιαίτερα υψηλός σε CNT (Εικόνα 7α). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεγεθύνσεις κύστεων στο HL και το DCT ήταν μεγαλύτερες σε JNs παρά σε SNs και MNs (Εικόνα 7a, Συμπληρωματική ταινία S12). Επιπλέον, η συχνότητα εμφάνισης κύστης ήταν σημαντικά υψηλότερη στους JNs από ότι στους άλλους τύπουςνεφρώνες(Εικόνα 7β). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η μέση απόσταση μεταξύ των σπειραμάτων (υπολογισμένη στα πλησιέστερα 5 σπειράματα) έτεινε να είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε ινκυστικά ποντίκια, ειδικά στον πιο επιφανειακό φλοιό (Συμπληρωματικό Σχήμα S8).
Εικόνα 4|Τα αγγεία καθορίζουν το σχήμα του νεφρώνα. (ένα)Τρισδιάστατοανακατασκευή της αρχιτεκτονικής του αγγείου από το τοξοειδές αγγείο στα αγγεία ακτινοβολίας του φλοιού. Μπάρα ¼ 200 mm. (β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες "μη περιορισμένων" (άνω πλαίσιο) και "περιορισμένοι" (κάτω πλαίσιο) παραμυελών εγγύς σωληναρίων. Μπάρα ¼ 100 mm. (γ, δ) Ποσοτικοποίηση του (γ) μήκους και (δ) ευθύτητας των "μη περιορισμένων" και "περιορισμένων" παραμυελών εγγύς σωληναρίων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Δοκιμή Mann-Whitney: "περιορισμένη" έναντι "μη περιορισμένη":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Τρισδιάστατο) η ανακατασκευή πολυάριθμων κύστεων αποκάλυψε ότι είχαν εξαιρετικά μεταβλητό σχήμα και όγκο (Εικόνα 6γ; Συμπληρωματικές ταινίες S11 και S13). Στο HL ανιούσα άκρο, οι κύστεις είχαν ατρακτοειδές σχήμα με μικρή διάμετρο. Στο DCT, οι κύστεις είχαν ένα μάλλον σφαιρικό και μεγαλύτερο σχήμα και ήταν διάσπαρτες μεταξύ των μη διασταλμένων σωληναρίων. Είναι ενδιαφέρον ότι η μετάβαση μεταξύ DCT και CNT χαρακτηρίστηκε συστηματικά από μια κανονική μη διασταλμένη δομή. Αντίθετα, στη CNT, παρατηρήσαμε συστηματικά μια συνεχόμενη διευρυμένη κυστική δομή απευθείας σε επαφή με το CD. Είναι ενδιαφέρον ότι στο CD, αυτή η δομή συρρικνώθηκε προοδευτικά σε ένα κανονικό μέγεθος σωληναρίου. Περιφερικά, δεν μπορούσαν να ανιχνευθούν περαιτέρω κύστεις στο συνεχόμενο τμήμα του CD. Ένα άλλο σταθερό χαρακτηριστικό ήταν η ιδιόμορφη χωρική οργάνωση των κύστεων στο HL ανιούσα άκρο. Πράγματι, αν και οι κύστεις ήταν βαθύτερες και πιο κοντά στον βρόχο στα SNs, ήταν πιο επιφανειακές και πιο κοντά στο DCT στα JNs (Εικόνα 6γ). Και πάλι, οι κύστεις κατέλαβαν μια ενδιάμεση θέση στα ΜΝ (Εικόνα 6γ).
Εικόνα 5|Τα σωληνάρια του νεφρώνα τείνουν να εξελίσσονται ως επίπεδη δομή. (α) Μια τυπική διαδρομή ενός εγγύς σωληνίσκου νεφρώνα. Αυτό το μονοπάτι δείχνει την τάση του να βρίσκεται σε ένα αεροπλάνο. Η επιπεδότητα της εξέλιξης της διαδρομής μπορεί να φανεί καλύτερα όταν περιστραφεί σωστά και ευθυγραμμιστεί με την οπτική γωνία του παρατηρητή (δείτε τη δεξιά αναπαράσταση του ίδιου σωληνοειδούς τμήματος, το οποίο, στην αριστερή πλευρά, αναπαρίσταται σε διαφορετική γωνία) . (β) Σχηματική αναπαράσταση μιας σωληνοειδούς διαδρομής που αποτελείται από 4 τμήματα (μεταξύ 5 σημείων που ορίζουν μια δεδομένη σωληνοειδή διαδρομή που φαίνεται ως παράδειγμα). Ο βαθμός στον οποίο τα μονοπάτια τείνουν να βγαίνουν "έξω από το επίπεδό τους" μπορεί να αναπαρασταθεί από τη γωνία που υποδεικνύεται εδώ ως "βήτα". (Συνεχίζεται)
Εικόνα 5|(Συνέχεια) Αυτή η γωνία μετριέται μεταξύ του τμήματος p3-p4 ως προς το επίπεδο (που ορίζεται από τα αμέσως προηγούμενα σημεία p3, p2 και p1) και αντιπροσωπεύεται από ένα σκούρο γκρι ορθογώνιο στο σχήμα. Στη συνέχεια, ο υπολογισμός των γωνιών βήτα υπολογίστηκε αναδρομικά μαζί με το σύνολο των σημείων σε μια σωληνοειδή διαδρομή. Για να αξιολογήσουμε την έκταση της προκατάληψης αυτών των γωνιών βήτα, προσομοιώσαμε ένα τυχαίο περπάτημα (Monte Carlosimulation [MCs]) χρησιμοποιώντας το ίδιο σύνολο διαδοχικών γωνιών άλφα κάθε σωληνοειδούς διαδρομής (μετρούμενα μεταξύ όλων των διαδοχικών τμημάτων). Αυτό το τυχαίο περπάτημα δημιούργησε μια διαδρομή με πανομοιότυπο σύνολο γωνιών άλφα και τυχαιοποιημένες γωνίες βήτα. (γ) Διαγράμματα βιολιού της συνολικής κατανομής των γωνιών βήτα και του αποτελέσματος των MCs στο εγγύς σωληνάριο (PT), λεπτό άκρο (TL) του βρόχου Henle, παχύ ανερχόμενο άκρο (TAL) του βρόχου Henle, άπω περιελιγμένο σωληνάριο (DCT ), και συνδετικό σωληνάριο (CNT). MCs, P <>
ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Οι παραδοσιακές ιστολογικές μέθοδοι είναι περιορισμένες στην ικανότητά τους να ανιχνεύουν παθολογικές αλλαγές που επηρεάζουν το παγκόσμιο σχήμανεφρώνες. Εδώ, παρουσιάζουμε μια ισχυρή προσέγγιση που βασίζεται στην εκκαθάριση ιστών που έχει τη δυνατότητα να αντιμετωπίσει κρίσιμα ερωτήματανεφρόαρχιτεκτονική με άνευ προηγουμένου χωρική λεπτομέρεια κάτω από φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν την ύπαρξη 3 τύπων νεφρώνων, που διαφέρουν ως προς τη θέση, το σχήμα και το μέγεθός τους, σύμφωνα με τις λειτουργικές τους ιδιαιτερότητες. Επιπλέον, δείξαμε ότι το nephronstend βρίσκεται σε επίπεδα και προσαρμόζεται στη χωρική οργάνωση των σκαφών. Παραδόξως, όταν εφαρμόσαμε αυτήν την τεχνική σε ένα μοντέλο κυστικής νεφρικής νόσου, παρατηρήσαμε ότι οι κύστεις αναπτύσσονται σε αλλνεφρόνια, αλλά μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα. Είναι ενδιαφέρον ότι δείξαμε ότι το σχήμα της κύστης ποικίλλει ανάλογα με το τμήμα του νεφρώνα και ότι κατά μήκος του ίδιου νεφρώνα, οι κύστεις παρεμβάλλονται με φυσιολογικά μη διασταλμένα σωληνάρια. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν το πρώτο 3D (Τρισδιάστατο) χαρακτηρισμός της χωρικής διάταξης τωννεφρώνεςκαι αγγεία και κυρίως παρέχουν τη βάση για την κατανόηση μιας παθολογικής διαδικασίας, όπως η ασκυστογένεση.
Ο οπτικός καθαρισμός των νεφρών είναι δύσκολος λόγω των υψηλών επιπέδων αυτοφθορισμού και κυτταρικής πυκνότητας. Συγκρίνοντας διαφορετικά πρωτόκολλα εκκαθάρισης, εντοπίσαμε στο BABB μια ισχυρή τεχνική για την υλοποίηση της απεικόνισης και της ανακατασκευής δομών που βρίσκονται στο βαθύτερο μέρος τουνεφρό, δηλαδή ο μυελός. Επιπλέον, το BABB είναι γρήγορο και επεκτάσιμο και, αφού καθαριστούν, τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν για μήνες πριν από τη λήψη εικόνας. Ένα άλλο βασικό πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι το χαμηλό κόστος της. Οι καθαριστικοί παράγοντες μπορεί να οδηγήσουν σε συρρίκνωση ή μεγέθυνση των δομών.9–17 Ωστόσο, επειδή αυτές οι τροποποιήσεις του μεγέθους των νεφρών είναι ισότροπες, οι σχετικές μετρήσεις δεν αναμένεται να επηρεαστούν ή να προκαταλάβουν την ερμηνεία τους. Ένας από τους πιο σημαντικούς περιορισμούς είναι ο σχολιασμός των δομών που είναι εξαιρετικά χρονοβόρος. Ωστόσο, υπάρχει ένας αυξανόμενος αριθμός τεχνικών που βασίζονται στη βαθιά μάθηση που θα πρέπει να ξεπεράσουν γρήγορα αυτόν τον περιορισμό.
Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις κλασσικές τεχνικές, η μελέτη μας έδειξε ότι οι νεφρώνες διαφέρουν ως προς το σχήμα και το μήκος τους ανάλογα με τη θέση τους. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι τα JN έχουν πιο ανεπτυγμένα σύνθετα PT και μεγαλύτερα σπειράματα και είναι 2 φορές μεγαλύτερα από τα SN. Το αυξημένο μήκος είναι αποτέλεσμα μιας αρμονικής διαδικασίας επειδή η επιμήκυνση επηρεάζει αναλογικά όλα τα τμήματα νεφρώνων. Παρατήρησε επίσης ότι τα JN έχουν μεγαλύτερο HL. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ξεκάθαρα ότι η μικροανατομία των SN και των JNs είναι σημαντικά διαφορετική και ότι τα MN εμφανίζουν ενδιάμεσα χαρακτηριστικά. Είναι ενδιαφέρον ότι οι φυσιολογικές μελέτες το έχουν δείξεινεφρώνεςείναι επίσης λειτουργικά διαφορετικά.2 Τα μορφογενετικά συμβάντα που αποτελούν τη βάση αυτών των διαφορών δεν είναι ακόμη γνωστά. Είναι λοιπόν δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η συγκεκριμένη δομή των JNs μπορεί να εξηγεί την ιδιαιτερότητα των λειτουργιών τους.
Είναι ενδιαφέρον, παρέχοντας για πρώτη φορά το 3D (Τρισδιάστατο) ανακατασκευή τουνεφρώνεςκαι τα γύρω αγγεία τους, ανακαλύψαμε έναν χωρικό περιορισμό μεταξύ των τοξοειδών αγγείων και μιας υποομάδας νεφρώνων. Έτσι, είναι κατανοητό ότι τα αγγεία μπορεί να υπαγορεύουν τον τρόπο με τον οποίο επιμηκύνονται οι νεφρώνες κατά την ανάπτυξη.34,35 Η επιθεώρηση των τρισδιάστατων σχημάτων των νεφρώνων σε συνδυασμό με υπολογιστικές προσομοιώσεις αποκάλυψε επίσης ότι οι νεφρώνες δεν αναμειγνύονται ποτέ και ότι κάθε νεφρώνας τείνει να βρίσκεται σε ένα επίπεδο. Η λειτουργική σημασία αυτής της παρατήρησης μένει να διευκρινιστεί.
Ανάπτυξη κύστης κατά την πολυκυστικήνεφρόΗ ασθένεια είναι ακόμα μια ενδιαφέρουσα διαδικασία. Η NPHP, μια παθολογική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από ανάπτυξη κύστεων, είναι η πιο κοινή γενετική νόσος που προκαλεί νεφρική νόσο τελικού σταδίου σε παιδιά και εφήβους. Είκοσι γονίδια NPHP έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι στιγμής.36 Ανάμεσά τους, το NEK8 κωδικοποιεί ένα μέλος της οικογένειας κινασών που σχετίζεται με ποτέ την αιμάτωση, η οποία παίζει ρόλο στη λειτουργία των βλεφαρίδων και στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.37 Το Nek8 αρχικά χαρακτηρίστηκε ως το γονίδιο που μεταλλάχθηκε σε ποντίκια jck.32 Ιδιαίτερα, η μετάλλαξη στον ίδιο τομέα πρωτεΐνης έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε NPHP9 στους ανθρώπους.38 2Μελέτες πρότειναν ότι η ανάπτυξη κύστεων διαφέρει δραματικά μεταξύ των διαφορετικών μορφών πολυκυστικής νόσου των νεφρών.27,29 Συγκεκριμένα, στην NPHP, οι κύστεις φαίνεται να προέρχονται αποκλειστικά από CD και DCT.31 Αν και είναι ενημερωτικές, αυτές οι ανοσοϊστοχημικές μελέτες δεν μπορούν να αντιταχθούν στην πιθανότητα ότι η απώλεια συγκεκριμένων σωληναριακών δεικτών39 ευθύνεται τεχνητά για αυτήν την παρατήρηση. Έτσι, το our3D (Τρισδιάστατο) η μελέτη παρέχει τα πρώτα σαφή στοιχεία ότι η ανάπτυξη κύστης είναι μια διαδικασία που μπορεί να περιλαμβάνει μόνο συγκεκριμένα τμήματα νεφρών. Είναι ενδιαφέρον ότι αν και η NIMA (Ποτέ στο mitosisgene A)–Σχετική κινάση 8 (NEK8) εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα όλων των τμημάτων του νεφρώνα, η έκφρασή του στις βλεφαρίδες περιορίζεται σε DCT και CD. Επειδή μόνο αυτά τα τμήματα είναι επιρρεπή στην ανάπτυξη κύστεων,31 μπορούμε να υποθέσουμε ότι η διαταραχή της ακτινωτής λειτουργίας NEK8 είναι το κρίσιμο γεγονός για το σχηματισμό κύστεων. Περιέργως, έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι οι ατρακτοειδείς κύστεις βρίσκονται σε συνέχεια με φυσιολογικά μη διασταλμένα σωληνάρια. Το γεγονός ότι μια υπολειπόμενη βλαστική μετάλλαξη οδηγεί σε παθολογικό φαινότυπο μόνο σε ένα υποσύνολο κυττάρων υποδηλώνει ότι ένα δεύτερο συμβάν μπορεί να πυροδοτήσει την ανάπτυξη κύστης σε αυτά τα κύτταρα, όπως προτείνεται για αυτοσωμικά επικρατή πολυκυστικάνεφρόασθένεια.40,41
Εικόνα 6 |ΤρισδιάστατοΗ (3D) ανακατασκευή νεφρώνα αποκαλύπτει ότι οι κύστεις αναπτύσσονται μόνο σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα. (α) Αντιπροσωπευτικές τρισδιάστατες εικόνες με απόδοση όγκου κύστης ενός ολόκληρου νεφρώνα (αριστερά πλαίσια) από τα σπειράματα έως τον αγωγό συλλογής στον επιφανειακό φλοιό (μπλε), στον μεσαίο φλοιό (πράσινο) και στην παραμυελική περιοχή (κόκκινο) σε ποντίκια jack. Τμηματοποίηση νεφρώνων (δεξιά πλαίσια) για τους 3 διαφορετικούς τύπουςνεφρώνες. Μπάρα=150 mm. (β) Πιθανότητα εμφάνισης κύστεων στα διαφορετικά τμήματα νεφρώνων σε ποντίκια jack. (Συνεχίζεται)
Εικόνα 6|(Συνέχεια) Ο οριζόντιος άξονας είναι ένα κανονικοποιημένο μήκος νεφρώνων που αντιστοιχεί σε 50 κάδους (εγγύς σωληνάριο [PT], τιρκουάζ· Henleloop [HL], λευκό· άπω περιελιγμένο σωληνάριο [DCT], ροζ· συνδετικό σωληνάριο [CNT], κίτρινο). (γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες αναδόμησης 3D κύστεων με απόδοση όγκου κύστης του ανιόντος άκρου του HL (αριστερά πλαίσια), των DCTs (μεσαία πλαίσια) και των CNTs και των φλοιικών αγωγών συλλογής (CCD) (δεξιά πλαίσια) σε επιφανειακά (άνω πάνελ), μεσαία (μεσαία πάνελ) και παραμυελικούς (κάτω πάνελ) νεφρώνες σε ποντίκια jack. Μπάρα= 50 mm.
Εικόνα 7|Χαρακτηρισμός της κατανομής και του όγκου της κύστης σε όλο το νεφρώνα. (α) Ποσοτικοποίηση του συνολικού όγκου της κύστης (άθροισμα των κύστεων ανά νεφρώνα) για κάθε τμήμα νεφρώνα (βρόχος Henle [HL], λευκό· άπω περιελιγμένο σωληνάριο [DCT], ροζ· συνδετικό σωληνάριο [CNT], κίτρινο) και (β) μήκος του σωληναρίου που καταλαμβάνεται από τις κύστεις για κάθε τύπο νεφρώνα (επιφανειακό: μπλε, μεσαίο: πράσινο, παραμυελικό: κόκκινο) σε ποντίκια. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Tukey-Kramer: παραμυελικός νεφρώνας [JN] έναντι επιφανειακού νεφρώνα [SN]: #P < 0.05;="" jn="" έναντι="" μέσου="" νεφρώνα="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
Παρατηρήσαμε επίσης ότι η διεύρυνση της κύστης είναι πιο κυρίαρχη στα JNs παρά στα SNs, τουλάχιστον λαμβάνοντας υπόψη την κύστη που εντοπίζεται μεταξύ PT και CNT. Συνεχώς, έχει αναφερθεί ότι στο πλαίσιο της σπειραματοσκλήρωσης, οι σπειραματικές βλάβες εντοπίζονται συχνότερα σε JNs παρά σε SNs. Η επιδείνωση είναι μια ενδιαφέρουσα υπόθεση που αξίζει περαιτέρω έρευνα.
Συνοπτικά, περιγράφουμε μια νέα τεχνική εικόναςνεφράσε 3D (Τρισδιάστατο) με επαρκή μοριακή εξειδίκευση και διακριτικότητα για την άμεση καταγραφή της χωρικής και ποσοτικής κατανομής εσωτερικών δομών με ειδική επισήμανση (νεφρώνεςαγγεία και κύστεις). Δεδομένης της ευκολίας, της ταχύτητας και της ικανότητας για άμεσο ποσοτικό προσδιορισμό, αναμένουμε ότι αυτή η τεχνική θα γίνει ένα ισχυρό εργαλείο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των νεφρών.
ΜΕΘΟΔΟΙ
Των ζώων
Όλες οι διαδικασίες για τα ζώα εγκρίθηκαν από τις «Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris» και από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Paris Descartes. Ποντίκια FVB/N δύο μηνών (n=20) χρησιμοποιήθηκαν για τη ρύθμιση της πειραματικής συνθήκης γιανεφρόΗ μελέτη πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια σε 2-αρσενικά ποντίκια jack εβδομάδων (n=4) και συγγενείς μάρτυρες (n=3).
Προετοιμασία νεφρικών ιστών
Πριν από τη θανάτωση, τα ποντίκια εγχύθηκαν, μέσω ενδοκαρδιακού καθετηριασμού, με 25 ml ηπαρινισμένου αλατούχου ορού (1000 IU/l) ακολουθούμενα από 75 ml 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα πειράματα διεξήχθησαν υπό αναισθησία ξυλαζίνης (Rompun 2 τοις εκατό, Bayer, Leverkusen, Γερμανία, 6 mg/g σωματικού βάρους) και κεταμίνης (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Γαλλία, 120 mg/g σωματικού βάρους).
Για εκκαθαριστικές μελέτες,νεφράστερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 4 ώρες και ενσωματώθηκαν σε 4 τοις εκατό αγαρόζη και 1. Τμήματα πάχους 5-mm που περιβάλλουν το νεφρικό χείλος κόπηκαν και αποθηκεύτηκαν σε PBS στους 4°C.βαθμός. Τα τμήματα των νεφρών πρώτα χρωματίστηκαν και στη συνέχεια καθαρίστηκαν.
Για ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε λεπτές τομές, οι νεφροί στερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης κατά τη διάρκεια της νύχτας και κόπηκαν τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη και 4-mm.
Χρώση
Περιοδικό οξύ-Χρώση Schiff. Το 1,5-χλστνεφρόΟι τομές επωάστηκαν σε καθαρό ή 1:100 PBS-αραιωμένο περιοδικό οξύ-Schiff για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν τον καθαρισμό.
Ανοσοϊστοχημεία σε λεπτές τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη. Τμήματα τεσσάρων μικρομέτρων νεφρών ενσωματωμένων σε παραφίνη θερμάνθηκαν για ανάκτηση αντιγόνου και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 44 μοίρεςμε λεκτίνες συζευγμένες με φθοροχρώμιο για την ανίχνευση των σωληναρίων (συγκολλητίνη ροδαμίνης φιστικιού [RL-1072-5] και συγκολλητίνη φύτρων ροδαμίνης σίτου [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, αραιωμένη στο 1:200) και τμήμα- ειδικό πρωτογενές αντίσωμα για την απεικόνιση διακριτών σωληνοειδών τμημάτων (βιοτινυλιωμένη λεκτίνη Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, αραιωμένο σε 1:100, ποντικό anti-Calbindin D28K[D{-4], Santa Cruz, Heidelberg, Γερμανία, αραιωμένο στο 1:200· κατσίκα αντι-AQP2 [C-17], Santa Cruz, αραιωμένο στο 1:200). Την επόμενη μέρα, οι τομές επωάστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; anti-goat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen, AlexaFluor κατά ποντικού 488 [A{-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; όλα αραιώθηκαν στο 1:500) πριν χρωματιστούν με 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Γαλλία) και προετοιμάστηκαν με χρήση λογισμικού Fiji (έκδοση 1.50). Χρώση λεκτίνης σε παχιές τομές. Το πάχος 1,5-χιλνεφρότα τμήματα επωάστηκαν στους 44 μοίρεςγια 1 μήνα σε Texas Red ή λεκτίνες συζευγμένες με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη: συγκολλητίνη φυστικιού (RL-1072-5) και συγκολλητίνη φύτρων σίτου (RL-1022-5), αραιωμένη σε 1:100 σε 0,1 τοις εκατό αζίδιο PBS και 0,1 τοις εκατό Triton-X. Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν κάθε μέρα για 2 εβδομάδες με PBS πριν τον καθαρισμό.
Cistanche-νεφρική λειτουργία
Οπτική εκκαθάριση
Για καθαρισμό κλίμακας, 1,5-χιλνεφρόοι τομές επωάστηκαν σε ScaleA2 (4 Μ ουρία, 0.1 τοις εκατό Triton X-100, 10 τοις εκατό γλυκερόλη) ή ScaleB4 (8 Murea, 0,1 τοις εκατό Triton X-100 ) για 2 εβδομάδες, έως 1 έτος, στις 4βαθμός.
Για κάθαρση BABB, τμήματα νεφρού 1,5-mm αφυδατώθηκαν σε διαδοχικές εκπλύσεις αιθανόλης σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ) σε αναλογία 1:2 για τουλάχιστον 2 ημέρες στους 4 βαθμούς.
Λήψη εικόνας με μικροσκοπία δύο φωτονίων
Οι ιστοί απεικονίστηκαν με υδατικό πήκτωμα σε ένα ανεστραμμένο πολυφωτονικό μικροσκόπιο (LaVision BioTec) εξοπλισμένο με λέιζερ Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 815 nm στο 8 τοις εκατό της ισχύος. Χρησιμοποιήσαμε ένα 20Xαντικειμενικός στόχος εμβάπτισης στο νερό (XLUMPLFL20XW,Olympus [Τόκιο, Ιαπωνία]· αριθμητικό διάφραγμα, 0.95· απόσταση εργασίας, 2,0 mm). Για την απόκτηση φθορισμού, χρησιμοποιήσαμε έναν μη σαρωμένο ανιχνευτή στο 80 τοις εκατό με φίλτρο ζώνης 593/40 nm.
Το πρώτο βήμα συνίστατο σε λήψη εικόνας μωσαϊκού 2D στη μεσαία στοίβα z με χρήση μη βέλτιστων παραμέτρων λήψης (400 mm X400 mm και 1011X1011 pixel, με 10 τοις εκατό επικάλυψη και γραμμικό μέσο όρο στο 2) για την καθοδήγηση της επιλογής των πιο συναφών κεντρικών πεδίων (Εικόνα S9A ). Αφού ορίστηκαν τα πεδία ενδιαφέροντος XY grid και z, οι παράμετροι προσαρμόστηκαν για να αποκτήσουν εικόνες υψηλής ποιότητας. Μια τέτοια προσέγγιση μείωσε την περιοχή ενδιαφέροντος σε5X12 πεδία ανά στοίβα z. Στη συνέχεια, αποκτήσαμε στοίβες 850 z/οπτικές φέτες (1-χιλ. μέγεθος βήματος) που περιβάλλουν τον νεφρικό χιτώνα στο μεσαίο τμήμα τουνεφρόΕνότητα.
Συρραφή, επεξεργασία και ανίχνευση εικόναςΚάθε στοίβα επιστρώθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε από τον Preibischet al.,43, η οποία επιτρέπει τη συρραφή μιας μεγάλης συλλογής εικόνων χρησιμοποιώντας το πρόσθετο "Grid/Collection stitching" του λογισμικού των Φίτζι (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Επειδή παρατηρήσαμε μια σημαντική αλλαγή μεταξύ 2 γειτονικών εικόνων μετά τη συρραφή, γράψαμε ένα πρόγραμμα προσαρμοσμένης αντιστοίχισης στην Python. Αυτό το πρόγραμμα αντισταθμίζει τη μετατόπιση της εικόνας, επιτρέποντάς μας να ευθυγραμμίσουμε σωστά τις εικόνες (Συμπληρωματικό Σχήμα S9B). Οι διορθωμένες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση Imaris 8.4.2 (Bitplane, Ζυρίχη, Ελβετία). Τα σωληνάρια και τα αγγεία ιχνηλάτησαν τη χειροκίνητη λειτουργία του πακέτου ιχνηλάτη νήματος του Imaris και εντάχθηκαν σε ένα Imaris Xtension που αναπτύξαμε με το MATLAB(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Εγγραφή{{12} Filament_Tool.zip?dl=0) (Συμπληρωματικό Σχήμα S9C). Οι σπειραματοκύστεις και οι κύστεις ανακατασκευάστηκαν τρισδιάστατα χρησιμοποιώντας τη χειροκίνητη λειτουργία της επιφανειακής συσκευασίας του Imaris. Το 3D (Τρισδιάστατο) η χωρική οργάνωση σπειραμάτων εμφανίστηκε χρησιμοποιώντας τη χειροκίνητη λειτουργία του πακέτου σποτ του Imaris.
Μορφομετρία
Το μήκος του σωληνοειδούς τμήματος, το μήκος του νεφρώνα και η ευθύτητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συσκευασία ιχνηλάτη νήματος του Imaris. Σύμφωνα με το λογισμικό Imaris, η ευθύτητα ποσοτικοποιήθηκε ως η αναλογία μεταξύ της απόστασης μεταξύ 2 σημείων και του μήκους της διαδρομής τμήματος του νεφρώνα. Τριάντα ένα PT και 12 ολόκληρανεφρώνεςανακατασκευάστηκαν και μετρήθηκαν σε 3 ποντίκια άγριου τύπου, ενώ 37 PTs και 17 ολικά νεφρόνια ανακατασκευάστηκαν και μετρήθηκαν σε 4 ποντίκια jack. Οι όγκοι της κύστης και των σπειραμάτων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την «επιφανειακή συσκευασία» του Imaris. Τριάντα ένα και 34 σπειράματα μετρήθηκαν σε ποντίκια άγριου τύπου και jack, αντίστοιχα. Εβδομήντα τέσσερις κύστεις μετρήθηκαν συνολικά.
Οι γωνίες "έξω από το επίπεδο" των σωληνοειδών στροφών (που υποδεικνύονται ως "βήτα") μετρήθηκαν μεταξύ του επιπέδου (που ορίζεται από 3 διαδοχικά σημεία) και της κατεύθυνσης με το επόμενο διαδοχικό διάκενο τέταρτου σημείου (Εικόνα 5β). Για να αξιολογήσουμε τη στατιστική σημασία της παρατηρούμενης προκατάληψης, προσομοιώσαμε την κατανομή των γωνιών βήτα με τυχαία περιστροφή γωνιών βήτα (προσομοίωση Monte Carlo) σε δομές που αποτελούνταν από τα ίδια τμήματα με το ίδιο σύνολο γωνιών άλφα.
Για τον υπολογισμό της πιθανότητας ανάπτυξης κυστικής βλάβης μαζί με τμήματα νεφρώνα, αντιπροσωπεύσαμε κάθε νεφρώνα με ένα σύνολο σημείων στο χώρο. Κάθε σημείο σημειώθηκε σε σχέση με την παρουσία κύστης έναντι της φυσιολογικής δομής και τον τύπο του τμήματος. Η πιθανότητα σε κάθε τυποποιημένο μήκος (που ορίζεται σε 50 bins) υπολογίστηκε ως η αναλογία μεταξύ του αριθμού των σημείων με κυστικό σχολιασμό και του συνολικού αριθμού σημείων στον κάδο.
Για τον υπολογισμό της μέσης σπειραματικής απόστασης, θεωρήσαμε για κάθε σπείραμα τη μέση σπειραματική ενδιάμεση απόσταση που υπολογίζεται στα πλησιέστερα 5 σπειράματα.
Αναλύσεις δεδομένων και στατιστικές
Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Οι διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης που ακολουθήθηκε, όταν ήταν σημαντικές (P < {{0}}.05),="" με="" τη="" δοκιμή="" tukey-kramer.="" όταν="" συγκρίθηκαν="" μόνο="" 2="" ομάδες,="" χρησιμοποιήθηκε="" το="" τεστ="" mann-whitney.="" οι="" στατιστικές="" αναλύσεις="" πραγματοποιήθηκαν="" χρησιμοποιώντας="" το="" λογισμικό="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" έκδοση="">
ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ
Όλοι οι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Ευχαριστούμε το Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese(LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker για την τεχνική βοήθεια. Ευχαριστούμε τον Pierre Isnard, τη Marie-Claire Gubler και τον Nicolas Kuperwasser για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου. Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Βασιλεία, Sw) , και Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Παρίσι, Γαλλία).
ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ
Οι TB, NG και MZ σχεδίασαν και πραγματοποίησαν τα πειράματα και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι FB, LT, MGT και SG πραγματοποίησαν επίσης κάποια πειράματα και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι MB και CN πραγματοποίησαν τα πειράματα με το ποντίκι. Ο TB και ο MZ συνέβαλαν επίσης στη συγγραφή του χειρογράφου. Ο GF αναθεώρησε το χειρόγραφο. Οι FT και MP παρείχαν το εννοιολογικό πλαίσιο και σχεδίασαν τη μελέτη, επέβλεψαν το έργο και έγραψαν την εργασία.
Cistanche-Τριδιάστατη αρχιτεκτονική νεφρών νεφρών
ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ
Συμπληρωματικό αρχείο (PDF)
Εικόνα S1. Πειραματική ρύθμιση, διαδικασία απόκτησης και επεξεργασία εικόνας.
Εικόνα S2. Όρια σήματος αυτοφθορισμού σε αναλύσεις XY και z.
Εικόνα S3. Μια δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ PT και TL σε 4-mm ενσωματωμένη σε παραφίνηνεφρόενότητες.
Εικόνα S4. Μια δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ TAL και DCT σε τμήματα νεφρού 4-mm ενσωματωμένα σε παραφίνη.
Εικόνα S5. Μια δισδιάστατη εικόνα της μετάβασης μεταξύ DCT και CNT σε τμήματα νεφρού 4-mm ενσωματωμένα σε παραφίνη.
Εικόνα S6. Η τρισδιάστατη ανακατασκευή αποκαλύπτει 3 διαφορετικά σχήματα εγγύς σωληναρίων.
Εικόνα S7.Τρισδιάστατοη ανακατασκευή αποκαλύπτει ότι το μήκος και η κατάτμηση τουνεφρώνεςδεν επηρεάζονται από κύστεις.
Εικόνα S8. Η πυκνότητα των σπειραμάτων σε έλεγχο και κυστικήνεφρά.
Εικόνα S9. Διαδικασία λήψης και επεξεργασία εικόνας μετά τη θεραπεία. Πίνακας S1. Σύγκριση μεθόδων εκκαθάρισης. Συμπληρωματικό αρχείο (Ταινίες)
Ταινία S1. Η χρώση με λεκτίνη βελτιώνει σημαντικά την ανάλυση και την αναλογία σήματος προς φόντο.
Ταινία S2. Ανίχνευση της διαδρομής ενός σωληνίσκου.
Ταινία S3. Τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός καθαρού νεφρού που δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του εγγύς σωληνίσκου και του λεπτού άκρου του βρόχου Henle.
Ταινία S4. Τρισδιάστατη ανακατασκευή ενός καθαρού νεφρού που δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του παχύ ανιόντος άκρου του Henleloop και του άπω περιελιγμένου σωληναρίου.
Ταινία S5.Τρισδιάστατοανακατασκευή ενός εκκαθαρισμένουνεφρόπου δείχνει τη διασταύρωση μεταξύ του άπω περιελιγμένου σωληναρίου και του συνδετικού σωληναρίου.
Ταινία S6. Το σχήμα και το μέγεθος των εγγύς σωληναρίων διαφέρει ανάλογα με το βάθος τους.
Ταινία S7. Τρισδιάστατη ανακατασκευή νεφρώνων σε μάρτυρα.
Ταινία S8. Ανίχνευση της διαδρομής ενός αγγείου από ένα τοξοειδές αγγείο σε ακτινωτό αγγείο του κορμού.
Ταινία S9. Τα τοξοειδή αγγεία διαμορφώνουν το σχήμα των παραμυελών εγγύς σωληναρίων.
Ταινία S10.Νεφρώνεςτείνουν να ξαπλώνουν σε ένα αεροπλάνο.
Ταινία S11. Η τρισδιάστατη ανακατασκευή του νεφρώνα δείχνει ένα συγκεκριμένο μοτίβο για την ανάπτυξη κύστης.
Ταινία S12.ΤρισδιάστατοΗ κατάτμηση νεφρώνα αποκαλύπτει ότι οι κύστεις αναπτύσσονται σε συγκεκριμένα τμήματα νεφρώνα.
Ταινία S13. Χωρική διάταξη και αλληλεπίδραση τωννεφρώνεςκαι αγγεία σε πολυκυστικόνεφρό.
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ
1. Πλούσιο AR. Μια μη περιγραφείσα μέχρι τώρα ευπάθεια των παραμυελικών σπειραμάτων στη λιποειδή νέφρωση. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957, 100:173-186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Ετερογένεια της νεφρονανατομίας. Kidney Int Suppl. 1987, 20: S25–S39.
3. Christensen ΕΙ, Grann Β, Kristoffersen ΙΒ, et al.Τρισδιάστατοανακατασκευή του νεφρώνα του αρουραίου. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn Η, Jensen KB, et αϊ. Ψηφιακή τρισδιάστατη ανακατασκευή και υπερδομή του εγγύς σωληναρίου του ποντικιού. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn Η, et αϊ. Τρισδιάστατη ανακατασκευή του νεφρώνα του ποντικιού. J Am Soc Nephrol. 2006; 17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Μπορούμε να δούμε καθαρά τώρα: οπτική εκκαθάριση καινεφρόμορφομετρία. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Τεχνικές εκκαθάρισης και επισήμανσης για μεγάλης κλίμακας βιολογικούς ιστούς. ΜοΙ Cells. 2016; 39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Λειψία, Γερμανία: S. Hierzel; 1914.
9. Hama Η, Kurokawa Η, Kawano Η, et αϊ. Κλίμακα: μια χημική προσέγγιση για απεικόνιση φθορισμού και ανακατασκευή του διαφανούς εγκεφάλου του ποντικιού. Nat Neurosci. 2011; 14:1481–1488.
10. Ertürk Α, Becker Κ, Jährling Ν, et al.Τρισδιάστατοαπεικόνιση οργάνων που έχουν καθαριστεί με διαλύτη χρησιμοποιώντας 3DISCO. Nat Protoc. 2012; 7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali Ρ, et al. ClearT: μέθοδος καθαρισμού χωρίς απορρυπαντικό και διαλύτες για νευρωνικούς και μη νευρωνικούς ιστούς. Ανάπτυξη. 2013, 140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Οπτικός καθαρισμός σταθερών δειγμάτων εγκεφάλου χρησιμοποιώντας SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014; 66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY για χαρτογράφηση του νευρικού συστήματος. NatMethods. 2013; 10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY για ταχεία και υψηλής ανάλυσης απεικόνιση ανέπαφων ιστών. Nat Protoc. 2014; 9:1682–1697.
15. Yang Β, Treweek JB, Kulkarni RP, et αϊ. Φαινότυπος μονοκυττάρου μέσα σε διαφανή άθικτο ιστό μέσω καθαρισμού ολόκληρου του σώματος. Κύτταρο. 2014; 158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Απεικόνιση ολόκληρου του εγκεφάλου με ανάλυση ενός κυττάρου με χρήση χημικών κοκτέιλ και υπολογιστικής ανάλυσης. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo Τ, Asayesh Α, Morrison Η, et αϊ. Τομογραφική μοριακή απεικόνιση και τρισδιάστατη ποσοτικοποίηση σε όργανα ενηλίκου ποντικού. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et αϊ. Πολυφωτονική μικροσκοπία οργάνων καθαρισμένου ποντικού. J Biomed Opt. 2010; 15:036017.
19. Renier Ν, Wu Z, Simon DJ, et αϊ. iDISCO: μια απλή, γρήγορη μέθοδος για την ανοσοσήμανση μεγάλων δειγμάτων ιστού για απεικόνιση όγκου. Κύτταρο. 2014; 159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Βελτιωμένη εφαρμογή της τεχνολογίας καθαρισμού ηλεκτροφορητικού ιστού, CLARITY, σε άθικτα στερεά όργανα συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, του παγκρέατος, του ήπατος,νεφρό, πνεύμονα και έντερο. BMC Dev Biol. 2014; 14:1–7.
21. Iversen BM, Amann Κ, Kvam FI, et al. Η αυξημένη σπειραματική τριχοειδική πίεση και το μέγεθος μεσολαβούν στη σπειραματοσκλήρωση στον παραμυελώδη φλοιό SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Απεικόνιση του νεφρού: από το φως στη μικροσκοπία υπερ-ανάλυσης. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Επικύρωση τρισδιάστατης μεθόδου μέτρησης και ταξινόμησης ποδοκυττάρων σε ολόσπειρα. J Am Soc Nephrol. 2016; 27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Ο ρόλος τουτρισδιάστατηαρχιτεκτονική στον μηχανισμό συγκέντρωσης ούρων του έσω νεφρικού μυελού. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Οπτική κάθαρση στο νεφρό αποκαλύπτει αναδιαμόρφωση των σωληναρίων που προκαλείται από κάλιο. Cell Rep. 2018; 25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel Μ, Platonova Ε, et αϊ. Η συνδυασμένη δομική και λειτουργική απεικόνιση του νεφρού αποκαλύπτει μείζονες αξονικές διαφορές ενδοκυττάρωση του εγγύς σωληναριού. J Am Soc Nephrol. 2018; 29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et αϊ. Πολυκυστικήνεφρόνόσος. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.
29. Wilson PD. Πολυκυστική νεφρική νόσο. N Engl J Med. 2004; 350:151-164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Αλλαγές στο μοτίβο γλυκοζυλίωσης κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του νεφρού ποντικού όπως αποκαλύφθηκε με συζεύκτες λεκτίνης. J Histochem Cytochem. 1987; 35:55-65.
31. Smith LA, Bukanov ΝΟ, Husson Η, et al. Ανάπτυξη της νόσου του πολυκυστικού νεφρού σε νεαρά ποντίκια με κυστικό νεφρό: πληροφορίες σχετικά με την παθογένεση, τις ανωμαλίες του βλεννογόνου και τα κοινά χαρακτηριστικά με την ανθρώπινη ασθένεια. J AmSoc Nephrol. 2006; 17:2821-2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et αϊ. Ένα ελάττωμα σε μια νέα κινάση της οικογένειας Nek προκαλεί κυστική νεφρική νόσο στο ποντίκι και στο ζέβρα. Ανάπτυξη.2002;129:5839–5846.
33. Franke Μ, Baeßler Β, Bechtel J, et al. Χαρτογράφηση μαγνητικού συντονισμού Τ2 και απεικόνιση με στάθμιση διάχυσης για έγκαιρη ανίχνευση κυστεογένεσης και ανταπόκρισης στη θεραπεία σε μοντέλο ποντικού πολυκυστικής νεφρικής νόσου.ΝεφρόInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Μοριακοί καθοριστικοί παράγοντες του νεφρώνα αγγειακή εξειδίκευση στονεφρό. Nat Commun. 2019; 10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Ενδοθηλιακή-επιθηλιακή επικοινωνία σε πολυκυστικάνεφρόασθένεια: ρόλος της σηματοδότησης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα. Σήμα κυψέλης. 2020; 72: 109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Πολλά γονίδια-ένα νοσήματα;Γενετική της νεφρονοφθίσεως (NPHP) και διαταραχές που σχετίζονται με το NPHP.Front Pediatr. 2017; 5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από την οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών NEK. J Cell Sci. 2012; 125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Οι μεταλλάξεις NEK8 επηρεάζουν τον ακτινωτό και κεντροσωματικό εντοπισμό και μπορεί να προκαλέσουν νεφρονοφθίση. J Am SocNephrol. 2008; 19:587-592.
39. Wilson PD. Αρικο-βασική πολικότητα σε επιθήλιο πολυκυστικής νεφρικής νόσου. Biochim Biophys Acta. 2011; 1812: 1239-1248.
40. Happé Η, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Ο τοξικός σωληναριακός τραυματισμός στα νεφρά από ποντίκια διαγραφής Pkd1-επιταχύνει την κυστογένεση που συνοδεύεται από απορρυθμισμένη πολικότητα επίπεδων κυττάρων και κανονικές οδούς σηματοδότησης Wnt. Hum Mol Genet. 2009; 18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Ένας κρίσιμος αναπτυξιακός διακόπτης ορίζει την κινητική του σχηματισμού νεφρικής κύστης μετά την απώλεια του Pkd1. Nat Med. 2007, 13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mechanism of the uniquesusceptibility of deep cortical glomeruli of maturingνεφράσε σοβαρή εστιακή σπειραματική σκλήρυνση. Pediatr Res. 1990; 28:270-276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Παγκόσμια βέλτιστη ραφή από κεραμίδια 3D (Τρισδιάστατο) μικροσκοπικές λήψεις εικόνων. Βιοπληροφορική. 2009, 25:1463–1465.