Η σχέση μεταξύ της κυκλοοξυγενάσης (COX-2) και της νόσου που προκαλείται από υποξία

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Η ενδοκυτταρική προσταγλανδίνη Ε2 συμβάλλει στον επαγόμενο από υποξία εγγύς σωληναριακό κυτταρικό θάνατο

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Τα εγγύς σωληναριακά κύτταρα (PTC) είναι ιδιαίτερα ευάλωτα στην απόπτωση που προκαλείται από υποξία, ένας σημαντικός παράγοντας γιαΝεφρική Νόσος. Υποθέσαμε εδώ ότι ο θάνατος PTC υπό υποξία προκαλείται από την εξαρτώμενη από την κυκλοοξυγενάση (COX-2) παραγωγή προσταγλανδίνης Ε, (PGE,), η οποία επιβεβαιώθηκε σε ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά HK-2κύτταρα λόγω υποξίας (1 τοις εκατό Ο,)-επαγόμενη απόπτωση (i) αποφεύχθηκε από COX-2(κυκλο-αναστολέας οξυγενάσης) και από ανταγωνιστές των υποδοχέων προσταγλανδίνης (EP) και (ii) συσχετίστηκε με αύξηση της ενδοκυτταρικής PGE, (iPGE,) λόγω του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 -εξαρτώμενης μεταγραφικής προς τα πάνω ρύθμισης της COX{{3 }}(κυκλο-οξυγενάση). Η απόπτωση προλήφθηκε επίσης από αναστολείς του μεταφορέα πρόσληψης προσταγλανδίνης PGT, οι οποίοι έδειξαν ότι η iPGE συμβάλλει στην απόπτωση που προκαλείται από υποξία (αντίθετα, ο θάνατος PTC που προκαλείται από υποξία/επαναοξυγόνωση οφειλόταν αποκλειστικά στην εξωκυτταρική PGE,). Έτσι, το iPGE είναι ένας νέος παράγοντας στην παθογένεση της προκαλούμενης από υποξία σωληναριακής βλάβης και η PGT μπορεί να είναι ένας νέος θεραπευτικός στόχος για την πρόληψη αλλοιώσεων που εξαρτώνται από την υποξία σε νεφρικές παθήσεις.

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η σωληναριακή υποξία είναι ένας σημαντικός παράγοντας τόσο για οξεία όσο και για χρόνιαΝεφρική Νόσος'2 Τα εγγύς σωληναριακά κύτταρα (PTC) είναι ιδιαίτερα ενεργά όσον αφορά την κατανάλωση οξυγόνου λόγω των ενεργειακών απαιτητικών δραστηριοτήτων επαναρρόφησής τους και, κατά συνέπεια, είναι ευάλωτα στην υποξία. Έχει αποδειχθεί ότι η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο σε καλλιεργημένο PTC που εκτίθεται σε υποξία, αλλά οι οδοί σηματοδότησης που είναι υπεύθυνες για την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μηχανισμού δεν έχουν διερευνηθεί. Εμείς και άλλοι βρήκαμε ότι η προσταγλανδίνη Ε, (PGE,), ένας σημαντικός μεσολαβητής λιπιδίων πολλών φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών στηννεφρό, παίζει σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση που οδηγεί σε απόπτωση PTC κατά τη θεραπεία με σισπλατίνη7, λευκωματίνη 8 ή λεπτίνη και γενταμυκίνη. Σε όλες τις περιπτώσεις, η αύξηση της PGE βρέθηκε να εξαρτάται από την ενισχυμένη έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2(COX-2)(κυκλο-οξυγενάση), ένα επαγώγιμο ένζυμο το οποίο, μαζί με το COX-1l, είναι το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στη σύνθεση των προσταγλανδινών. Στον άνθρωπονεφρό, βασική COX-2(κυκλο-οξυγενάση)η έκφραση είναι λιγότερο έντονη από αυτή του COX-1. COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έχει εντοπιστεί σε ποδοκύτταρα και τμήματα του βρόχου του Henle και των νεφρικών αγγείων υπό φυσιολογικές συνθήκες10. Σε παθολογικές καταστάσεις, ωστόσο, η ανοσοαντιδραστικότητα COX-2 μπορεί να βρεθεί σε πολλούς περισσότερους τύπους κυττάρων εντός τουνεφρόσυμπεριλαμβανομένου του PTC, και πιθανώς συμβάλλει σε νεφρική βλάβη. Είναι ενδιαφέρον ότι η υποξία αυξάνει την έκφραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)και/ή την παραγωγή PGE,12-i7 σε πολλούς τύπους κυττάρων. Στην πραγματικότητα, έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι η υποξία ενισχύει την ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε PGE, καθώς και την απελευθέρωσή της στο εξωκυτταρικό μέσο8. Επομένως, είναι θεωρητικά πιθανό ότι η PGE μεσολαβεί στην αποπτωτική επίδραση της υποξίας στο PTC.

Οι περισσότερες μελέτες για την εξαρτώμενη από PGE απόπτωση έχουν επικεντρωθεί ουσιαστικά σε μηχανισμούς που περιλαμβάνουν εξωκυτταρική PGE επειδή είναι ευρέως αποδεκτό ότι η PGE ασκεί τις βιολογικές της επιδράσεις μέσω της ενεργοποίησης των υποδοχέων PGE που είναι συζευγμένες με G-πρωτεΐνη πλάσματος (υποδοχείς προσταγλανδίνης σειράς Ε EP1-4)1. Ωστόσο, σε ορισμένα μοντέλα, η ενδοκυτταρική PGE,(iPGE,) είναι σχετική με τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο720-22. Αυτό σημαίνει ότι για να προκαλέσει απόπτωση, η PGE πρέπει να φτάσει ξανά στο ενδοκυτταρικό μέσο και να ενεργοποιήσει ένα υποσύνολο υποδοχέων EP, οι οποίοι βρίσκονται μέσα στο κύτταρο (υποδοχείς iEP). Επειδή το έργο της σύλληψης της PGE, γίνεται κυρίως από τον μεταφορέα πρόσληψης προσταγλανδίνης (PGT)23-26, η αναστολή της PGT έχει ως αποτέλεσμα την πρόληψη του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από iPGE7.

Λαμβάνοντας υπόψη αυτό το υπόβαθρο, στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε εάν ένα COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτώμενη αύξηση των επιπέδων iPGE μεσολαβούν στην απόπτωση που προκαλείται από υποξία σε PTC.

Κάντε κλικ στο βιολογικό Cistanche για νεφρική νόσο

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, crystal violet, blue trypan διαλύματα, βρωμοσουλφοφθαλεΐνη (BRS), 3-(5'-Υδροξυμεθυλ2'-φουρυλ)-1-βενζυλ C1), ινδαζόλη και η ακτινομυκίνη D αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Το Z-VAD-FMK και η celecoxib ήταν από την Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία) και την Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, ΗΠΑ), αντίστοιχα. Το TriReagent αγοράστηκε από τη Vitro (Μαδρίτη, Ισπανία) και οι μεμβράνες PVDF και το αντιδραστήριο λουμινόλης Western blotting αποκτήθηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA). Αντιδραστήριο κατά της εξασθένισης ProLong Gold με 4,{13}}διαμιδίνο{{14 Κιτ ανίχνευσης απόπτωσης }}φαινυλοινδόλη (DAPI), αννεξίνη-V-FITC(ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη)/ιωδιούχο προπίδιο (PI) και ανιχνευτής διοξεικής 2',7'-διχλωροφλουορεσκεΐνης (DCFH-DA) από την Invitrogen (CA, Carlsbad, ΗΠΑ), και Molecular Probes (Όρεγκον, ΗΠΑ), αντίστοιχα. Τα αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές: anti-PGE και anti-COX-2(κυκλο-οξυγενάση)τα αντισώματα ήταν από την Abcam (Cambridge, UK). Το anti-Bax και το anti-Bcl-2 ήταν από την Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA). Το αντίσωμα anti-HIF-la και το -rabbit-Alexa-Fluor 488 ήταν από την BD Biosciences (Palo Alto, CA, ΗΠΑ) και την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), αντίστοιχα. Η σύζευξη αντι- -ακτίνης και κουνελιού κατά της υπεροξειδάσης IgG ποντικού αγοράστηκε από τη Sigma (St.Louis, MO, ΗΠΑ).

Κυτταρική καλλιέργεια και πειραματικές συνθήκες.

Ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα HK-2 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5 τοις εκατό CO, σε 37 βαθμούς Cin DMEM/F12 συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορός (FBS), 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη/αμφοτερικίνη Β και 1 τοις εκατό γλουταμίνη (Invitrogen. Carlsbad, CA, ΗΠΑ) και 1 τοις εκατό ινσουλίνη-τρανσφερίνη-σελήνιο (ThermoFisher. Grand Island, NY, ΗΠΑ). Σε όλα τα πειράματα, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 70-90 τοις εκατό συμβολή και όταν προσκολλήθηκαν πλήρως, καλλιεργήθηκαν υπό υποξικές (1 τοις εκατό οξυγόνο) ή νορμοξικές συνθήκες (21 τοις εκατό οξυγόνο).Υποξίατα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε In vivo200υποξίασταθμός εργασίας (Ruskin Technology, Δυτικό Γιορκσάιρ, Ηνωμένο Βασίλειο). Γιαυποξίαπειράματα /επανοξυγόνωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σευποξίαγια 24 ώρες και, στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν σε κανονικές συνθήκες για έως και 3 ώρες (περίοδος επαναοξυγόνωσης).

Ανάλυση ανοσοφθορισμού της iPGE και ανάλυση Western blot της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)και HIF-1 .

Τα κύτταρα για ανάλυση ανοσοφθορισμού και ανάλυση στυπώματος Western χωρίστηκαν αντίστοιχα σε γυάλινες καλυπτρίδες (4×104 κύτταρα/γυάλινη καλυπτρίδα) ή σε πλάκες έξι φρεατίων (15×104 κύτταρα/φρεάτιο) και επωάστηκαν όπως περιγράφεται στα "Αποτελέσματα". Στη συνέχεια, η ανάλυση ανοσοφθορισμού και ανοσοστύπωσης πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι αραιώσεις κατά του σώματος ήταν: 1/50 για PGE, 1/1000 για COX-2(κυκλο-οξυγενάση)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 και 1/5000 για -ακτίνη. Η ανίχνευση ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία), μέσω της Υπηρεσίας Συνεστιακής Μικροσκοπίας (ICTS 'NANBIOSIS'U17) του Κέντρου Δικτύωσης Βιοϊατρικής Έρευνας για τη Βιομηχανική, Βιοϋλικά και Νανοϊατρική στο BER-BBN( Πανεπιστήμιο Alcal, Μαδρίτη, Ισπανία)

Παροδική επιμόλυνση.

Παροδική επιμόλυνση με siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), τον φορέα έκφρασης θηλαστικού pcDNA3 που περιέχει το cDNA της ανθρώπινης 15-αφυδρογονάσης υδροξυ-προσταγλανδίνης άγριου τύπου (p15-PGDH) ή κατασκευάσματα πλασμιδίου αναφοράς λουσιφεράσης για ανθρώπινη COX-2(κυκλο-οξυγενάση)phPES2-Luc, άνθρωποςυποξίαστοιχείο απόκρισης (HRE)p9HIF1-Luc και R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) και ο προσδιορισμός της δραστικότητας της λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται αλλού27,28.

Αριθμός κυττάρων και μορφολογία κυττάρων/πυρήνων.

Ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά με μια τροποποιημένη μέθοδο χρώσης κρυσταλλικού ιώδους2. Για την ανίχνευση ενδείξεων απόπτωσης, παρατηρήθηκε κυτταρική μορφολογία χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Οι κυτταρικοί πυρήνες εμφανίστηκαν μετά από χρώση DNA με DAPI όπως περιγράφηκε προηγουμένως0. Η τυπική αποπτωτική μορφολογία που εξετάστηκε περιελάμβανε κυτταρική συρρίκνωση, πυρηνική συμπύκνωση και κατακερματισμό και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων. Για ποσοτικοποίηση, έξι πεδία εξετάστηκαν σε κάθε πειραματική συνθήκη με τυφλό τρόπο για να εκτιμηθεί το ποσοστό των πυρήνων με εμφάνιση παρόμοια με την απόπτωση.

Δοκιμασία απόπτωσης κυτταρομετρίας ροής και δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων με δοκιμή αποκλεισμού βαφής μπλε τρυπανίου.

Τα προσκολλημένα κύτταρα στην πλάκα αποσπάστηκαν με θρυψινοποίηση και, μαζί με τα αποκολλημένα κύτταρα που ανακτήθηκαν προηγουμένως από το μέσο καλλιέργειας, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό.

Το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin-V-FITC/PI επέτρεψε την ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής αποπτωτικών και νεκρωτικών HK-2 κυττάρων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως7. Τα πρώιμα και τα όψιμα αποπτωτικά κύτταρα ήταν θετικά, αντίστοιχα, στη χρώση αννεξίνης V και στα δύο και στην αννεξίνη V χρώση. Τα νεκρωτικά κύτταρα ήταν μόνο θετικά στο PI και τα ζωντανά κύτταρα HK-2 δεν έδειξαν χρώση.

Για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε δοκιμή αποκλεισμού βαφής μπλε τρυπανίου. Τα βιώσιμα κύτταρα (λευκά) και τα νεκρά κύτταρα (μπλε) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός και ένα αιμοκυτταρόμετρο.

Στατιστική ανάλυση.

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM. Υποβλήθηκαν σε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από δοκιμή Bonferroni για πολλαπλές συγκρίσεις. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο P Μικρότερο ή ίσο με 0.05.

Αποτελέσματα

Η υποξία επάγει τον εγγύς σωληναριακό θάνατο των κυττάρων HK-2.

Υποξίαμείωσε τον αριθμό των κυττάρων HK-2, όπως αξιολογήθηκε με την ανάλυση κρυσταλλικού ιώδους (Εικ. la), και επίσης προκάλεσε στρογγυλοποίηση και αποκόλληση των κυττάρων από την πλάκα (Εικ. lb, άνω πλαίσιο). Οπως αναμενόταν,υποξίαπυροδότησε ένα μοντέλο κυτταρικού θανάτου με σαφή μορφολογικά χαρακτηριστικά απόπτωσης (βλ. πυρηνική χρώση με DAPI στο Σχ. lb, κάτω πλαίσιο, αριστερά) όπως συρρίκνωση κυττάρων με σημαντική πυρηνική συμπύκνωση, κατακερματισμός και σχηματισμός σωμάτων που μοιάζουν με αποπτωτικά.ΥποξίαΗ επαγόμενη απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την αύξηση της χρώσης αννεξίνης V-FITC, όπως αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, και την αποτροπή της με τον αναστολέα παν-κασπάσης Z-VAD-FMK (Εικ. lc).ΥποξίαΠροσδιόρισε επίσης μια μείωση στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων αλλά δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντικές αλλαγές στον αριθμό των νεκρωτικών κυττάρων (Εικ. lc, ένθετο).

Εικόνα 1. Η υποξία επάγει τον εγγύς σωληναριακό θάνατο των κυττάρων HK-2.(α) Μειωμένος αριθμός κυττάρων (δοκιμή κρυσταλλικού ιώδους). (β)Μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης. Αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες αντίθεσης φάσης (άνω πίνακα, αρχική μεγέθυνση, 10×) φωτομικρογραφίες χρώσης DAPI (κάτω πίνακας, αρχική μεγέθυνση, 40×). (γ) Αύξηση της απόπτωσης (μελέτες κυτταρομετρίας ροής). Τα κύτταρα Annexin V plus περιλαμβάνουν κύτταρα Annexin V συν /ιωδιούχο προπίδιο (δηλ. πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα με διατηρημένη ακεραιότητα πλασματικής μεμβράνης) και αννεξίνη V συν /ιωδιούχο προπίδιο συν κύτταρα (δηλ. όψιμα αποπτωτικά κύτταρα). Ένθετο: Τύποι κυτταρικών πληθυσμών (η αννεξίνη V-/ιωδιούχο προπίδιο συν τα κύτταρα είναι νεκρωτικά κύτταρα και η αννεξίνη V-/ιωδιούχο προπίδιο-είναι ζωντανά κύτταρα). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των γεγονότων. Γενικές πληροφορίες: (1) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε νορμοξικές (21 τοις εκατό O2) ή υποξικές (1 τοις εκατό Ο,) συνθήκες, όπως υποδεικνύεται στις "Μέθοδοι;. Ο αναστολέας παν-κασπάσης Z-VAD-FMK (25 μM) ήταν προστέθηκε 1 ώρα πριν από την έναρξη της έκθεσης σευποξία. (2)Οι μικροφωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ράβδοι και ράβδοι σφάλματος σε γραφήματα: Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο±SEM 3 διαφορετικών πειραμάτων *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">υποξία;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">υποξίασυν ZVAD.

COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η οδός του υποδοχέα /iPGE,/EP μεσολαβεί στον εγγύς σωληναριακό θάνατο των κυττάρων HK-2 που προκαλείται από υποξία.

Προκειμένου να εκτιμηθεί ο ρόλος του COX-2(κυκλο-οξυγενάση)οδός υποδοχέα /iPGE2/EP σευποξία-προκλήθηκε θάνατος κυττάρων HK-2, πρώτα προεπωάσαμε κύτταρα με celecoxib, ένα COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αναστολέας1; AH6809, ένας ανταγωνιστής των υποδοχέων EP1, EP2 και EP3 ή GW627368X, ένας ανταγωνιστής του υποδοχέα EP433. ή με πράσινο βρωμοκρεσόλη ή βρωμοσουλ-φοφθάλη και στους δύο αναστολείς του PGT435. Το PGT καταρρίφθηκε επίσης μέσω επιμόλυνσης με siRNA.

Εικόνα 2. COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η οδός του υποδοχέα /iPGE,/EP προκαλεί τον επαγόμενο από υποξία εγγύς σωληναριακό θάνατο των κυττάρων HK-2.(α) Πρόληψη κυτταρικού θανάτου από αναστολείς της οδού. Επάνω πάνελ? Οι ράβδοι δείχνουν το ποσοστό του συνολικού κυτταρικού θανάτου (αριστερά) ή το ποσοστό της αποπτωτικής αννεξίνης V συν κύτταρα (δεξιά). Πριν εκτεθούν σευποξία, τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 3 μM celecoxib (COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αναστολέας）;10 μuM AH6809, (ανταγωνιστής υποδοχέων EP1-3), 10 μΜ GW627368X (ανταγωνιστής υποδοχέα EP4). ή με 50 μΜ πράσινη βρωμοκρεσόλης (BG) ή 25 μΜ βρωμοσουλφοφθαλεΐνη (BrS), δύο αναστολείς PGT. Κάτω πλαίσιο: Αριστερά: Πρόληψη κυτταρικού θανάτου με καταστροφή του PGT μέσω επιμόλυνσης με siRNA (δοκιμή αποκλεισμού κατάδυσης μπλε τρυπανίου). Ένθετο: Αποτελεσματικότητα του knockdown του PGT (ανάλυση Western blot) Δεξιά: Εξάρτηση από τη συγκέντρωση της προληπτικής δράσης του πράσινου βρωμοκρεσόλης (BG). (β)Πρόληψη κυτταρικού θανάτου με διαμόλυνση με φορέα έκφρασης θηλαστικού που περιέχει ένζυμο αδρανοποίησης προσταγλανδίνης 15-υδροξυ-προσταγλανδινική αφυδρογονάση (15-PGDH) cDNA (δοκιμή αποκλεισμού βαφής μπλε τρυπανίου). Ένθετο: Έκφραση {{ 11}}PGDH (ανάλυση στυπώματος Western) σε επιμολυσμένα κύτταρα. (ντο)Υποξίαπροκαλεί μια ευαίσθητη στην PGT αύξηση της iPGE, Αριστερά: PGE, εμφανίζεται ο εξαρτώμενος ανοσοφθορισμός μόνος ή συγχωνευμένος με πυρηνική χρώση με DAPI (αρχική μεγέθυνση, 40×) Δεξιά: Ποσοτική προσέγγιση στις εικόνες που παρουσιάζονται στον αριστερό πίνακα χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. (δ) Ο αναστολέας της ενεργοποίησης του EGFR AG1478 δεν αποτρέπει τον EGFR του κυτταρικού θανάτου HK-2. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με l μM AG1478 πριν υποβληθούν σευποξία. (e) Ο αναστολέας PGT BG δεν τροποποιεί την έκφραση των Bax και Bcl-2 σε κύτταρα HK-2 υπόυποξία(Ανάλυση Western blot). (στ) Πρόληψη τηςυποξία/επαγόμενος από επαναοξυγόνωση κυτταρικός θάνατος από αναστολείς της οδού (δοκιμή αποκλεισμού βαφής μπλε τρυπανίου). Τα κύτταρα προεπωάστηκαν με αναστολείς της οδού και υποβλήθηκαν σευποξίαόπως στο (α). Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε νορμοξία για 3 ώρες. Γενικές πληροφορίες: (1) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε νορμοξικές (21 τοις εκατό Ο,) ή υποξικές (1 τοις εκατό Ο,) συνθήκες, όπως υποδεικνύεται στις "Μέθοδοι". (2)Οι μικροφωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (3) Οι διαλύτες των αναστολέων (luL/mL μέσο) δεν τροποποίησαν την επίδραση τουυποξίαστον κυτταρικό θάνατο (τα αποτελέσματα δεν εμφανίζονται). (4) Ανάλυση Western blot: Ίση πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση με αντίσωμα αντι- -ακτίνης ή αντι-GAPDH. (5)Γραμμές και γραμμή σφάλματος σε γραφήματα: Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο±SEM 3 διαφορετικών πειραμάτων.*P<0.01><0.01>υποξίαήυποξία/επαναοξυγόνωση.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2α,υποξία-ο επαγόμενος εγγύς σωληναριακός κυτταρικός θάνατος αποφεύχθηκε σε όλες τις περιπτώσεις. Η αναστολή της απόπτωσης από τη σελεκοξίμπη έδειξε ότι η COX-2(κυκλο-οξυγενάση)παίζει σχετικό ρόλο σευποξία-επαγόμενος αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος (Εικ. 2α, επάνω πλαίσιο, δεξιά). Πιο συγκεκριμένα, το γεγονός ότι η απόπτωση προλήφθηκε από ανταγωνισμό των υποδοχέων EP δείχνει ότι η απόπτωση προκαλείται από COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτώμενη παραγωγή PGE. Από την άλλη πλευρά, το πιο πιθανό είναι ότι το iPGE, συμβάλλειυποξία-προκάλεσε κυτταρικό θάνατο HK-2 επειδή προλήφθηκε από·(i) αναστολή του PGT(Εικ.2α) ή(i) υπερέκφραση του 15-PGDH(Εικ. 2β), που απενεργοποιεί το iPGE2 μέσω του oxidation25 (σημείωση, η ίδια η διαδικασία επιμόλυνσης αύξησε την ευαισθησία των κυττάρων HK-2 σευποξία: Ο κυτταρικός θάνατος ήταν 45-55 τοις εκατό για επιμόλυνση σε συνθήκες ελέγχου σε σύγκριση με 15-20 τοις εκατό σε μη επιμολυνθέντα κύτταρα). Περαιτέρω υποστήριξη στη συμβολή του iPGE, σευποξία-επαγόμενος κυτταρικός θάνατος HK-2, είναι τα προηγούμενα ευρήματά μας ότιυποξίακαθορίζει μια αύξηση στην περιεκτικότητα των κυττάρων του iPGE,1 και ότι αυτή η αύξηση αποτράπηκε από αναστολείς PGT (Εικ. 2γ).

Οι οδοί σηματοδότησης MAPK μπορεί να προκαλέσουν απόπτωση, επειδή οι υποδοχείς iEP διαενεργοποιούν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR)36, ο οποίος οδηγεί στην ενεργοποίηση των κινασών MAP ERK1/2 και p38 σε κύτταρα HK-20, ρωτήσαμε εάν προ -η επώαση των κυττάρων HK-2 με τον αναστολέα της ενεργοποίησης του EGFR AG1478υποξία-επαγόμενος κυτταρικός θάνατος. Βρήκαμε αρνητικά αποτελέσματα (Εικ. 2δ) και επομένως, είναι απίθανο η μετενεργοποίηση του EGFR να μεσολαβεί στον κυτταρικό θάνατο HK-2υποξία.

Σε αρκετά πειραματικά μοντέλα, η μείωση της προερχόμενης από μιτοχόνδρια ATP κατά τη διάρκειαυποξίαπροκαλεί αύξηση της αναλογίας έκφρασης της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bax προς την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, η οποία οδηγεί σε απελευθέρωση του κυτοχρώματος C στο κυτοσόλιο, ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και επακόλουθη διάσπαση και ενεργοποίηση του μεταγενέστερου τελεστή κασπάσες37,38. Ωστόσο, η προεπώαση με αναστολέα PGT BG σε κύτταρα HK-2 υπόυποξίαδεν οδήγησε σε αλλαγές συμβατές με μια αντι-αποπτωτική μετατόπιση στην ισορροπία μεταξύ της έκφρασης του Bc-2 και του Bax(Εικ.2e), που δεν υποστηρίζει έναν ρόλο αυτών των πρωτεϊνών στο κύτταρο HK-2 θάνατος κάτω απόυποξία.

Μετά από έκθεση σε υποξία, επεισόδια επαναοξυγόνωσης (ισχαιμία/τραυματισμός επαναιμάτωσης) μπορεί να προκαλέσουν πρόσθετη κυτταρική βλάβη. Το «παράδοξο» του τραυματισμού της επανοξυγόνωσης μπορεί να γίνει κατανοητό λαμβάνοντας υπόψη ότι τα κύτταρα υφίστανται συγκεκριμένες αλλαγές στις ενζυμικές δραστηριότητες, στη μιτοχονδριακή λειτουργία, στη δομή του κυτταροσκελετού, στη μεταφορά της μεμβράνης και στην αντιοξειδωτική άμυνα ως απόκριση σευποξία, τα οποία στη συνέχεια προδιαθέτουν συλλογικά σε τραυματισμό επανοξυγόνωσης39. Η επαναοξυγονογένεση συμβάλλει στην οξεία νεφρική βλάβη κατά τη διάρκεια ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου, μεταμόσχευσης νεφρού, κυκλοφορικής ανεπάρκειας ή νεφρικής και καρδιαγγειακής χειρουργικής. Σε αυτό το πλαίσιο, η πιθανή θεραπευτική αξία της αναστολής τουυποξία/επαγόμενος από επαναοξυγόνωση εγγύς σωληναριακός κυτταρικός θάνατος μέσω παρέμβασης στην COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η διαδρομή του υποδοχέα /iPGE,/iEP είναι εμφανής. Επομένως, ρωτήσαμε εάν το iPGE μεσολαβεί συγκεκριμέναυποξία-προκαλείται κυτταρικός θάνατος ή επίσης μεσολαβείυποξία/επαγόμενος από την επανοξυγόνωση κυτταρικός θάνατος (ένα in vitro μοντέλο που μιμείται in vivo νεφρική ισχαιμία/ βλάβη επαναιμάτωσης). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2στ, ο κυτταρικός θάνατος (όπως εκτιμήθηκε από τη δοκιμή αποκλεισμού κατάδυσης με μπλε του τρυπανίου) αποτράπηκε με COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αναστολέα celecoxib καθώς και από ανταγωνιστές υποδοχέα EP AH6809 ή GW627368X. Όπως και στο Σχήμα 2α, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το COX-2 παίζει σχετικό ρόλουποξία/επαγόμενος από επανοξυγόνωση κυτταρικός θάνατος και, πιο συγκεκριμένα, ότι ο κυτταρικός θάνατος προκαλείται από COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτώμενη παραγωγή PGE, αφού προλήφθηκε από ανταγωνισμό των υποδοχέων EP. Ωστόσο, επειδή ο κυτταρικός θάνατος δεν προλήφθηκε από αναστολείς PGT πράσινου βρωμοκρεσόλης ή βρωμοσουλφοφθαλεΐνης (Εικ.2στ και Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ), είναι πιο πιθανό ότιυποξίαΟ κυτταρικός θάνατος HK-2 που προκαλείται από /επανοξυγόνωση προκαλείται αποκλειστικά από την εξωκυτταρική PGE.

HIF-1 -εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η γονιδιακή έκφραση συμβάλλει σε αυποξία-επαγόμενη αύξηση της iPGE, στα εγγύς σωληναριακά HK-2 κύτταρα. PGE, η βιοσύνθεση περιλαμβάνει την απελευθέρωση από τα μεμβρανικά γλυκεροφωσφολιπίδια του αραχιδονικού οξέος από τη φωσφολιπάση Α, ακολουθούμενη από τη μετατροπή από τα ισοένζυμα COX του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνη Η και, τέλος, από τον ισομερισμό του προστα αδένα σε Η, σε PGE, από τη συνθάση E. όπως μικροσωμική συνθάση PGE-1 (mPGES-1)19. Το έχουμε βρειυποξία-η επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HK-2 πιθανότατα προκαλείται από COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτώμενη αύξηση της παραγωγής PGE, (Εικ.2). Δεδομένου ότι COX-2(κυκλο-οξυγενάση)είναι ένα ένζυμο του οποίου η έκφραση μπορεί να προκληθεί απόυποξία, υποθέσαμε ότι αυποξία-επαγόμενη αύξηση της PGE, η παραγωγή σε HK-2 κύτταρα μπορεί να είναι συνέπεια μιας αύξησης στην έκφραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση). Για να επιβεβαιώσουμε την υπόθεσή μας, μελετήσαμε (i)την επίδραση τουυποξίασχετικά με την έκφραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)πρωτεΐνη και mRNA και (ii) η επίδραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αναστολέας celecoxib στουποξία-προκάλεσε αύξηση στο iPGE, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότιυποξίαπροσδιορίζεται με παροδικό τρόπο μεταγραφική προς τα πάνω ρύθμιση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση(Εικ. 3a,b)και ότι COX-2(κυκλο-οξυγενάση)η αναστολή αμβλύνει την αύξηση της iPGE, σε κύτταρα HK-2 κάτω απόυποξία(Εικ.3γ). Με ενδιαφέρο,υποξίαπροσδιόρισε επίσης την παροδική ανοδική ρύθμιση της έκφρασης πρωτεΐνης mPGES-1 (Εικ. 3α, ένθετο), αλλά δεν επηρέασε την έκφραση mRNA του mPGES-1 (Εικ. 3β. ένθετο). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυξημένη έκφραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)και το mPGES-1 είναι υπεύθυνο για τουποξία-προκληθείσα αύξηση στο iPGE.

Εικόνα 3. HIF-la-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η γονιδιακή έκφραση συμβάλλει στην επαγόμενη από την υποξία αύξηση της iPGE, στα εγγύς σωληναριακά κύτταρα HK-2.(α)Η έκφραση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)η πρωτεΐνη αυξάνεται παροδικά κατάυποξία(Ανάλυση Western blot). Ένθετο: Η έκφραση της πρωτεΐνης mPGES-1 επίσης ρυθμίζεται παροδικά προς τα πάνω απόυποξία. (β) Έκφραση COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Το mRNA αυξάνεται παροδικά κατάυποξία. Ένθετο: Η έκφραση του mRNA mPGES-1 δεν επηρεάζεται απόυποξία. (γ)Πρόληψη με celecoxib, ένα COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αναστολέα, της αύξησης της iPGE, που προκαλείται απόυποξία. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 3 μΜ celecoxib. Αριστερά∶PGE, εμφανίζεται ο εξαρτώμενος ανοσοφθορισμός μόνος ή συγχωνευμένος με πυρηνική χρώση με DAPI (αρχική μεγέθυνση, 40×). Δεξιά: Ποσοτική προσέγγιση των εικόνων που παρουσιάζονται στον αριστερό πίνακα χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. (δ) Συμβολή μεταγραφικών μηχανισμών. Αριστερά: Ο μεταγραφικός αναστολέας ακτινομυκίνη D(Act. D) αποτρέπει αυποξία-επαγόμενη αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση πρωτεΐνης (ανάλυση στυπώματος Western). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για lh με 1 ug/ml Act. Δ πριν εκτεθούν σευποξίαγια 3 ώρες Δεξιά: Αύξηση της δραστηριότητας ενός COX-2(κυκλο-οξυγενάση)κατασκεύασμα ρεπόρτερ. (ε) Ο αναστολέας του HIF-la YC-1 αποτρέπειυποξία-επαγόμενη μεταγραφική COX-2(κυκλο-οξυγενάση)ανοδική ρύθμιση. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 0,5 uM YC-1. Αριστερά: Πρόληψη COX-2(κυκλο-οξυγενάση)ανοδική ρύθμιση. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σευποξίαγια 8 ώρες. Κέντρο: Πρόληψη της αύξησης της δραστηριότητας ενός COX-2(κυκλο-οξυγενάση)κατασκεύασμα ρεπόρτερ. Δεξιά: Αναστολή της δραστηριότητας μιας δομής αναφοράς που βασίζεται σε HRE. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σευποξίαγια 8 ώρες.(στ) Ο αναστολέας HIF-la YC-1 αυξάνει τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (μελέτες κυτταρομετρίας ροής). Πριν εκτεθούν σευποξία, τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 1 ώρα με 0,5 μM YC-1. Το Inset∶ YC-1 αναστέλλει τουποξία-επαγόμενη αύξηση στην έκφραση HIF-1 (ανάλυση Western blot). Γενικές πληροφορίες: (1) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε νορμοξικές (21 τοις εκατό Ο,) ή υποξικές (1 τοις εκατό Ο,) συνθήκες, όπως υποδεικνύεται στις "Μέθοδοι". (2)Οι μικροφωτογραφίες είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (3) Ανάλυση Western blot: Ίση πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση με ένα αντίσωμα κατά της ακτίνης (4) Ράβδοι και ράβδοι σφάλματος σε γραφήματα: Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο±SEM 3 διαφορετικών πειραμάτων *P<0.01 vs.="" other="">

Για να εξετάσουμε περαιτέρω τη συμβολή των μεταγραφικών μηχανισμών στην αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση πρωτεΐνης υπόυποξία, έκφραση COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αξιολογήθηκε σε κύτταρα HK-2, τα οποία προεπωάστηκαν με τον αναστολέα μεταγραφής ακτινομυκίνη D πριν υποβληθούν σευποξίαγια 5 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3δ,υποξία-επαγόμενη αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η έκφραση πρωτεΐνης παρεμποδίστηκε από την ακτινομυκίνη D. Επιπλέον,υποξίαπροσδιόρισε επίσης μια αύξηση στη δραστηριότητα ενός COX-2(κυκλο-οξυγενάση)κατασκεύασμα προαγωγέα που είχε προηγουμένως επιμολυνθεί σε κύτταρα HK-2 (Εικ.3δ δεξιά). Συνολικά, τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχ. 3δ υποδηλώνουν ότι οι μεταγραφικοί μηχανισμοί συμβάλλουν στο αυποξία-επαγόμενη αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση πρωτεΐνης. Ωστόσο, υπήρχε ασυμφωνία μεταξύ του χρονισμού της ενεργοποίησης του προαγωγέα COX-2 και του χρονισμού της μέγιστης COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Έκφραση mRNA: ενώ η παροδική αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Η έκφραση mRNA ήταν μέγιστη μετά από 2 ώρες (Εικ. 3β), ο προαγωγέας COX-2 ενεργοποιήθηκε μετά από 3 ώρες (Εικ. 3d), το οποίο πιθανώς αντανακλά τη συμβολή των μετα-μεταγραφικών μηχανισμών στην αύξηση της COX{{6 }}(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση 4. Συνεπώς, εικάζουμε ότι COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Το mRNA σταθεροποιείται υπόυποξία, το οποίο θα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα COX-2(κυκλο-οξυγενάση)Έκφραση mRNA χωρίς καμία συμβολή (αυτή τη στιγμή) στην αυξημένη δραστηριότητα του COX-2(κυκλο-οξυγενάση)υποστηρικτής. Ωστόσο, είναι επίσης πιθανό ότι μια χρονική υστέρηση μεταξύ της ενεργοποίησης του προαγωγέα και της συσσώρευσης μετρήσιμου υποστρώματος μπορεί επίσης να συμβάλει στην ασυμφωνία μεταξύ του χρονισμού της ενεργοποίησης του προαγωγέα COX-2 και του χρονισμού της μέγιστης COX{{1 }}(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση mRNA.

Το HIF-1 είναι ένας ετεροδιμερής μεταγραφικός παράγοντας που αποτελείται από την εξαρτώμενη από το οξυγόνο -υπομονάδα και τη συστατικά εκφρασμένη -υπομονάδα. Υπόυποξία, το HIF-l συσσωρεύεται και εισέρχεται στον πυρήνα, όπου δημιουργεί τον μεταγραφικό παράγοντα HIF-1 μετά από διμερισμό με HIF-1 . Στη συνέχεια, το HIF-1 προωθεί την έκφραση των γονιδίων-στόχων του δεσμεύοντας σευποξία- αποκρινόμενα στοιχεία (HREs) που υπάρχουν στη ρυθμιστική τους περιοχή και στη συνέχεια ενορχηστρώνουν τις κυτταρικές προσαρμοστικές αποκρίσεις στη μάχηυποξία 3. Δεδομένου ότιυποξίαμπορεί να ενεργοποιήσει το COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφρασης με HIF-1-εξαρτώμενο τρόπο μέσω ενός λειτουργικού HRE που υπάρχει στην αλληλουχία προαγωγέα COX-22, εξετάσαμε τον ρόλο του HIF-l σευποξία-επαγόμενη αύξηση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)έκφραση. Εξετάσαμε επίσης τη δραστηριότητα ενός κατασκευάσματος προαγωγέα COX-2 που έχει διαμολυνθεί σε κύτταρα HK-2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3ε, προεπώαση με το HIF-1ένας αναστολέας YC-1, ο οποίος αμβλύνθηκευποξία-επαγόμενη αύξηση της έκφρασης HIF-la και της δραστηριότητας ενός κατασκευάσματος αναφοράς HRE, είχε ως αποτέλεσμα την πρόληψη της αύξησης και της έκφρασης της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)και δραστηριότητα του COX-2(κυκλο-οξυγενάση)κατασκεύασμα προαγωγέα στο Χονγκ Κονγκ-2 που υποβάλλεται σευποξία. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3α-ε υποστηρίζουν την ιδέα ότι η HIF-1 -εξαρτώμενη μεταγραφική ανοδική ρύθμιση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)είναι υπεύθυνος για τηνυποξία-προκληθείσα αύξηση στο iPGE2.

Αν και οι συνέπειες της ενεργοποίησης του HIF-1α επίυποξία-η επαγόμενη απόπτωση είναι αμφιλεγόμενη (πιθανώς επειδή μπορεί να εξαρτάται από το πλαίσιο), αναλύσαμε (προκαταρκτικά) τον ρόλο του HIF-1a στο πειραματικό μας σύστημα. Εφόσον έχουμε βρει προηγουμένως ότι η παρέμβαση στο COX-2(κυκλο-οξυγενάση)/iPGE, η οδός του υποδοχέα EP αναστέλλει την αύξηση της έκφρασης HIF-la που προκαλείται απόυποξία8,56 ρωτήσαμε εάν η αναστολή του HIF-la έχει ως αποτέλεσμα την πρόληψη τουυποξία-επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων HK-2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3στ, η προεπώαση με YC-1, έναν αναστολέα HIF-l, στην πραγματικότητα αυξήθηκευποξία-προκαλούμενη απόπτωση. Επομένως, είναι απίθανο το HlF-la

Συζήτηση

Ιστόςυποξίαθεωρείται ότι είναι κρίσιμης σημασίας για την παθοφυσιολογία τόσο της χρόνιας νεφρικής νόσου όσο και της οξείας νεφρικής βλάβης, καθώς είναι το PTC το πιο ευαίσθητο τμήμα των νεφρικών σωληναρίων έναντιυποξία. Εδώ εξετάσαμε τον ρόλο της PGE, στη ζημιά που προκλήθηκε απόυποξίασε ανθρώπινο PTC και διαπίστωσε ότι η αυξημένη παραγωγή iPGE προήλθε από την ανοδική ρύθμιση της COX που εξαρτάται από το HIF-la-2(κυκλο-οξυγενάση)γονιδιακή έκφραση και αυξημένη έκφραση του mPGES-1, συμβάλλει στηνυποξία-προκάλεσε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HK-2. Δεδομένου ότι η σωληναριακή υποξία είναι ένας σημαντικός παράγοντας τόσο για την οξεία όσο και για τη χρόνια νεφρική νόσο-2, αυτά τα αποτελέσματα επισημαίνουν τον μεταφορέα προσταγλανδίνης PGT ως νέο θεραπευτικό στόχο στις νεφρικές παθήσεις.

Υποξίαόχι μόνο αυξάνει το iPGE αλλά και την απελευθέρωσή του στο εξωκυτταρικό μέσο8 έτσι ώστε η εκκρινόμενη (εξωκυτταρική)PGE, μπορεί επίσης να παίξει ρόλο στηνυποξία-επαγόμενη απόπτωση (για παράδειγμα, πυροδότηση αποπτωτικών καταρρακτών μέσω της κανονικής ενεργοποίησης των υποδοχέων ΕΡ που βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη). Δύο προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο κυτταρικός θάνατος κάτω απόυποξίαοφειλόταν επίσης σε COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτημένη παραγωγή PGE,1345. Από την άλλη πλευρά, σε ορισμένους τύπους κυττάρων (ινοβλάστες, μικρογλοία, νευρώνες και κυτταρικές σειρές οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας), η απόπτωση που προκαλείται από PGE προκαλείται από την εξαρτώμενη από PGE ενεργοποίηση των EP-υποδοχέων46-48. Το βρήκαμε εδώυποξίαΗ επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων HK-2 αποτράπηκε επίσης από τον ανταγωνισμό των υποδοχέων ΕΡ (Εικ. 2α, επάνω πλαίσιο, δεξιά). Επειδή όμως οι υποδοχείς EP έχουν κλασικά περιγραφεί ως υποδοχείς της πλασματικής μεμβράνης—έτσι ώστε να είναι απρόσιτοι για iPGE2-υποθέτουμε ότι οι υποδοχείς EP που μεσολαβούν στην αποπτωτική δράση της iPGE, σε υποξικά κύτταρα HK-2 είναι υποσύνολο που βρίσκεται ενδοκυτταρικά (δηλ. υποδοχείς iEP).

Σε αντίθεση με τον ρόλο του iPGE2 στουποξία-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HK-2, βρήκαμε ότι μεσολαβεί μόνο η εξωκυτταρική PGEυποξίαΟ κυτταρικός θάνατος HK-2 που προκαλείται από /επαναοξυγόνωση επειδή δεν αποφεύχθηκε από αναστολείς της PGT (Εικ. 2στ). Αν και οι παθολογικοί μηχανισμοί της κυτταρικής βλάβης μετάυποξία/επαναοξυγόνωση δεν είναι πλήρως κατανοητές, είναι αποδεκτό ότι ο κυτταρικός θάνατος συμβαίνει σε μεγάλο βαθμό μέσω της παραγωγής υπερβολικών αντιδρών ειδών οξυγόνου (ROS). Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα κύτταρα HK-249,50. Ωστόσο, αν καιυποξίαμπορεί επίσης να αυξήσει την παραγωγή ROS, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι το ROS παίζει ρόλουποξία-προκάλεσε θάνατο των κυττάρων HK-2. Αυτό υποδηλώνει ότι οι θανατηφόρες επιδράσεις της υποξίας και της υποξίας/επανοξυγόνωσης στα κύτταρα HK-2 προκαλούνται από διαφορετικούς μηχανισμούς, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει γιατί το BG και το BS είναι προστατευτικά έναντιυποξίααλλά όχι κατάυποξία/επαναοξυγόνωση. Κατά συνέπεια, η αναστολή της PGT μπορεί να προσφέρει θεραπευτικά οφέλη στο PTC έναντι του κυτταρικού τραυματισμού που προκαλείται από την υποξία αλλά όχι κατά της επιβλαβούς επίδρασης τουυποξία/επαναοξυγόνωση.

HIF-1 -εξαρτώμενη ανοδική ρύθμιση COX-2(κυκλο-οξυγενάση)ήταν ένα κρίσιμο γεγονός γιαυποξία-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HK-2 (Εικ.3ε). Ωστόσο, η παρατήρησή μας ότι ο αναστολέας HIF YC-1 ενίσχυσε τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο(Εικ.3στ) είναι μπερδεμένη, αν και προηγούμενες αναφορές έχουν ήδη δείξει παρόμοια αποτελέσματα1. Μια πιθανή εξήγηση είναι ένα υποθετικό σενάριο στο οποίο το HIF-la όχι μόνο μεσολαβεί στην προ-αποπτωτική ανοδική ρύθμιση της COX-2(κυκλο-οξυγενάση)αλλά και την ανοδική ρύθμιση των προστατευτικών μορίων. Πράγματι, το HIF-1-ρύθμισε την έκφραση των προστατευτικών μορίων έναντιυποξίαόπως μακρύ μη κωδικοποιητικό RNA DARS-AS1'και microRNA-2103 έχει βρεθεί ειδικά σε κύτταρα HK-2. Ωστόσο, αν και αυτά τα αποδεικτικά στοιχεία υποστηρίζουν το υποθετικό μας σενάριο, θα πρέπει να γίνουν συγκεκριμένα πειράματα για να το επιβεβαιώσουν.

Διερεύνηση της απόκρισης των νεφρικών κυττάρων σευποξίαμπορεί να βελτιώσει την κατανόησή μας για την παθολογία των νεφρών. Έχουμε μελετήσει, αν και με προκαταρκτικό τρόπο, το ρόλο της αύξησης της αναλογίας έκφρασης της προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bax προς την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 στηνυποξία-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HK-2. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αναστολή της PGL δεν οδήγησε σε αλλαγές συμβατές με μια αντι-αποπτωτική μετατόπιση στην ισορροπία μεταξύ της έκφρασης του Bcl-2 και του Bax(Εικ. 2e), το οποίο δεν υποστηρίζει το ρόλο αυτών των πρωτεϊνών στην Ο εξαρτώμενος από iPGE θάνατος κυττάρων HK-2 κάτω απόυποξία. Από όσο γνωρίζουμε, υπάρχουν μόνο δύο μελέτες σχετικά με την επίπτωση του άξονα Bcl{{0}}/Bax στην απόπτωση που προκαλείται από υποξία σε PTC και αμφότερες αφορούσαν ανοξικές ή σχεδόν ανοξικές συγκεντρώσεις Ο5 . Όταν το PTC εκτέθηκε σε 0,2 τοις εκατό Ο., η έκφραση Bax παρέμεινε αμετάβλητη και η απόπτωση συνδέθηκε με μειωμένο βαθμό έκφρασης Bcl-2. Ωστόσο, η έκφραση του Bcl-2 δεν επηρεάστηκε από 1 τοις εκατό Ο, παρά το παρουσία απόπτωσης, η οποία συμπίπτει με τα αποτελέσματά μας. Επομένως, άλλοι μηχανισμοί που δεν περιλαμβάνουν απαραίτητα ποσοτικές αλλαγές στην έκφραση Bcl-2 ή Bax θα πρέπει να ληφθούν υπόψη: για παράδειγμα, η πρόκληση απόπτωσης σε καλλιεργημένα κύτταρα γλοιώματος από το iPGE2 απαιτεί μόνο Η φυσική του σχέση με το Bax, που πυροδοτεί τη μετατόπιση του Bax στα μιτοχόνδρια202. Επομένως, ο μηχανισμός μέσω του οποίου το iPGE συμβάλλει στην απόπτωση των κυττάρων HK{11}} αξίζει περαιτέρω μελέτη.

Η ομάδα μας βρήκε ότι ένα COX-2(κυκλο-οξυγενάση)-εξαρτώμενη αύξηση της iPGE, μεσολαβεί στον αποπτωτικό θάνατο σε κύτταρα HK-2 που εκτίθενται σε σισπλατίνη, αποπτωτικά σώματα7" καιυποξία(τα τρέχοντα αποτελέσματά μας). Επειδή η PGE, απελευθερώνεται γρήγορα προς τα έξω του κυττάρου μετά την svnthesized2, η μεταφορά της προς τα μέσα από το PGl παίζει κρίσιμο ρόλο στην απόπτωση που προκαλείται από iPGE στα HK-2 κύτταρα. Επομένως, όποτε αυτή η βλάβη PTC προκαλείται από iPGE, η θεραπεία με αναστολείς της PGT μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπευτική προσέγγιση με πιθανές εφαρμογές όπως η πρόληψη της βλάβης PTC που προκαλείται από σισπλατίνη, η αναστολή της διάδοσης του τραυματισμού των σωληνώσεων μέσω αποπτωτικών σωμάτων ή ο περιορισμός της βλαβερή επίδραση τουυποξίαστο PTC.