Η Μελέτη για τον Νευροπροστατευτικό Μηχανισμό του Cistanche και του Fomitopsis Pinicola στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες του Μεσεγκεφάλου που προκαλούνται από το MPP plus

Η μελέτη για τον νευροπροστατευτικό μηχανισμό του Cistanche και του Fomitopsis Pinicola σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες του μεσεγκεφάλου που προκαλούνται από το MPP plus

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Καλύτερες στιγμές

Το Fomitopsis Pinicola χαρακτηρίζεται από αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες. Στην παρούσα μελέτη, πρωτογενείς ντοπαμινεργικές κυτταρικές καλλιέργειες που παρασκευάστηκαν από εμβρυϊκό μεσεγκέφαλο ποντικού χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό τηςνευροπροστατευτικόεπιδράσεις και οι πιθανοί μηχανισμοί του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola στον εκφυλισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων που προκαλείται από το MPP plus. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το εκχύλισμα νερού του Fomitopsis Pinicola προστάτευε τους νευρώνες ντοπαμίνης έναντι του MPP plus. Το υδατικό εκχύλισμα Fomitopsis Pinicola έδειξε αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Ο μηχανισμός τουνευροπροστατευτικόΗ επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola μπορεί να σχετίζεται με ανασταλτική στο μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ηνευροπροστατευτικόεπίδραση τουCistancheτο καθιστά «ιδανικό υποψήφιο» για τη βελτίωση των νευρολογικών παθήσεων.Cistancheείναι πλούσιο σε εχινακοσίδες. Το εκχύλισμα τουκιστανάκιΈχει αποδειχθεί ότι επάγει τη σύνθεση νευρικού αυξητικού παράγοντα in vivo και in vitro πειράματα, προάγει την έκκριση σχετικών παραγόντων στον εγκέφαλο και βελτιώνει μια σειρά εγκεφαλικών λειτουργιών που σχετίζονται με τη μνήμη.

Cistancheέχεινευροπροστατευτικόυπάρχοντα

Αφηρημένη

Στόχος: Παρατήρηση τουνευροπροστατευτικόμηχανισμός υδατικού εκχυλίσματος Fomitopsis Pinicola σε απόπτωση που προκαλείται από MPP' των μεσεεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών κυττάρων in vitro. Μέθοδοι: Η αντιοξειδωτική δράση των μυκήτων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο FRAP. Η αντιφλεγμονώδης δράση των μυκήτων ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο απελευθέρωσης ΝΟ που προκαλείται από LPS. Μεσεεγκεφαλικό ντοπαμινεργικόνευρώνεςεπισημάνθηκαν με χρώση ΤΗ για να παρατηρηθεί η επιβίωση του THirνευρώνεςΑποτελέσματα: Στον προσδιορισμό αντιοξειδωτικής δράσης, η ισοδύναμη αντιοξειδωτική ικανότητα Trolox (TEAC) του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitonsis Pinicola προσδιορίστηκε ότι είναι (165,80±7,13) umol εκχυλίσματος Trolox/g Υδάτινα εκχυλίσματα της επεξεργασίας Fomitopsis Pimicola (100,50,25 12,5 μg/ml) μείωσαν σημαντικά τον σχηματισμό ΝΟ. Η MPP* προκάλεσε σημαντική συμπύκνωση χρωματίνης στους πυρήνες των μεσεεγκεφαλικών ντοπαμινεργικώννευρώνεςμε την πυρηνική λύση, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης μειώθηκε σημαντικά και η παραγωγή ROS αυξήθηκε σημαντικά. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου MPPt, οι μορφολογικές αλλαγές των κυτταρικών πυρήνων μετά την απόπτωση αντιστράφηκαν με υδατικό εκχύλισμα Fomtitonsis Pinicola. Το υδατικό εκχύλισμα της επεξεργασίας Fomitopsis Pinicola (50,25,12,5 μg/ml) αύξησε δραματικά το σχετικό δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε σύγκριση με τον έλεγχο MPP' αντίστοιχα. Σε σύγκριση με τον έλεγχο MPPt, το υδατικό εκχύλισμα της επεξεργασίας Fomitonsis Pimicola (50, 25 ug/ml) μείωσε σημαντικά τον σχετικό σχηματισμό ROS αντίστοιχα, Συμπεράσματα∶Το υδατικό εκχύλισμα Fomitopsis Pinicola έδειξε σημαντικήνευροπροστατευτικόεπίδραση στα μεσεεγκεφαλικά ντοπαμινεργικά κύτταρα που προκαλούνται από MPpt. Το υδατικό εκχύλισμα του Fomitopsis Pinicola έδειξε αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Ο μηχανισμός τουνευροπροστατευτικόΗ επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pimicola μπορεί να σχετίζεται με ανασταλτική στο μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες.CistancheΟι γλυκοσίδες μπορούν να βελτιώσουν το επίπεδο μάθησης και μνήμης των ασθενών με νόσο Αλτσχάιμερ, να μειώσουν την περιεκτικότητα σε μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) στον εγκεφαλικό ιστό και να αυξήσουν την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GSH). -Px), δραστηριότητα δισμουτάσης υπεροξειδίου (δισμουτάση υπεροξειδίου, SOD), μειώνουν τη δραστηριότητα εστεράσης ακετυλοχολίνης (εστεράση ακετυλοχολίνης, TChE), ρυθμό απόπτωσης εγκεφαλικών κυττάρων και μειώνουν τη συσσώρευση ασβεστίου στον εγκεφαλικό ιστό.

Λέξεις-κλειδιά: Fomitopsis Pimicola, ντοπαμινεργικόνευρώνεςαπόπτωση, αντιοξειδωτικό, δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, σχηματισμός ROS,Cistanche, Νευροπροστατευτικό

Ιστορικό

Νόσος Πάρκινσονείναι μια νευροεκφυλιστική ασθένεια στον άνθρωπο, η οποία επηρεάζει σοβαρά την υγεία περισσότερων από 6,5 εκατομμυρίων ανθρώπων παγκοσμίως. Ο επιπολασμός των ηλικιωμένων άνω των 65 ετών είναι περίπου 1 2 τοις εκατό [1, 2]. Αν και η ακριβής αιτιολογία και παθογένεια τουΝόσος Πάρκινσονπαραμένει ασαφές, το οξειδωτικό στρες έχει αποδειχθεί ότι είναι βασικός παράγοντας στον εκλεκτικό εκφυλισμό των ντοπαμινεργικώννευρώνεςστο ραβδωτό ραβδωτό σώμα [3, 4]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερβολική παραγωγή ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) προκαλεί μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, συμπεριλαμβανομένου του μειωμένου δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (△Ψm) και της δραστηριότητας των ενζύμων του συμπλέγματος της αναπνευστικής αλυσίδας Ⅰ, καθώς και του ανώμαλου μιτοχονδριακού DNA [5, 6]. Επιπροσθέτως, η ευαισθησία και η επιλεκτικότητα της οδού του μαυριδόρου στο οξειδωτικό στρες μπορεί επίσης να οδηγήσει σε βλάβη του DNA των ντοπαμινεργικώννευρώνεςσε ασθενείς μεΝόσος Πάρκινσον [7].

Εκχύλισμα γλυκοζιτών φαινυλαιθανοειδών σεCistancheΤο deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη σύνθεση των χαρακτηριστικών συμπεριφοράς ποντικών μοντέλου C57 PD που προκαλείται από 1-μεθυλ-4-φαινυλ-1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη, MPTP) και αυξάνει την ουσία nigra tyrosine hydroxylase (tyrosine hydroxylase, TH) έως και περιεκτικότητα σε DA στο ραβδωτό σώμα ασθενών μεΝόσος Πάρκινσον.Επιπλέον, τοκιστανάκιΤο εκχύλισμα γλυκοζίτη φαινυλαιθανόλης έχει καλή ανασταλτική επίδραση στη μείωση της βιωσιμότητας των κοκκωδών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας σε ασθενείς μεΝόσος Πάρκινσονκαι αποτρέπει την επαγόμενη από MPP συν κυτταρική απόπτωση του παρεγκεφαλιδικού κόκκουνευρώνεςαναστέλλοντας την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και της κασπάσης-8. Ο θάνατος, ασκεί την αντιαποπτωτική του δράση.

Το Fomitopsis Pinicola είναι ένας φαρμακευτικός μύκητας που ανήκει στα Polyporaceae και Pseudomonas. Έχει επίπεδη, ελαφρώς πικρή γεύση και έχει φαρμακολογικά αποτελέσματα όπως αντιοξειδωτική, αντιβακτηριακή, αντικαρκινική και ενίσχυση του ανοσοποιητικού [8, 9]. Οι προηγούμενες μελέτες μας έχουν επιβεβαιώσει ότι τα υδατικά εκχυλίσματα του Fomitopsis Pinicola έχουν προστατευτική επίδραση στην επαγόμενη από MPP συν απόπτωση των ντοπαμινεργικών κυττάρων του εμβρυϊκού μέσου εγκεφάλου, η οποία μπορεί να αυξήσει σημαντικά τον αριθμό των ντοπαμινεργικώννευρώνεςκαι μήκους νευραξόνων, και Αύξηση της δραστηριότητας του συμπλόκου ενζύμου της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας Ι[10].

Σε αυτή τη μελέτη, θα χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο αναγωγικής αντιοξειδωτικής ισχύος του σιδήρου (FRAP) για να παρατηρήσουμε την αντιοξειδωτική ικανότητα των υδατικών εκχυλισμάτων του Fomitopsis Pinicola και να παρατηρήσουμε την αντιφλεγμονώδη δράση της απελευθέρωσης ΝΟ που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS) σε μικρογλοία BV2. Οι επιδράσεις των καλλιεργημένων ντοπαμινεργικών μεσεγκεφάλουνευρώνεςσχετικά με την πυρηνική μορφολογία, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η παραγωγή ROS παρατηρήθηκαν in vitro, έτσι ώστε να αποκαλυφθεί ο προστατευτικός μηχανισμός των ενδομυκήτων στα ντοπαμινεργικάνευρώνες.

Υλικό

Ζώο

Τα 14-ποντίκια ημέρας εγκυμοσύνης, OF1/SPF, από το Αυστριακό Εργαστηριακό Ινστιτούτο Ζώων και Κτηνιατρικής Γενετικής, πειραματίστηκαν με πειραματόζωα σύμφωνα με την Οδηγία της Ευρωπαϊκής Επιτροπής 86/609/EU.

Δείγμα δοκιμής

Το Fomitopsis Pinicola παρήχθη στην Αυστρία και αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Wolf-Dieter Rausch ως Footmitopsis Pinicola. Μετά την κονιοποίηση του Fomitopsis Pinicola, το εκχύλισμα νερού ελήφθη με εκχύλιση με ζεστό νερό και η περιεκτικότητα σε ακατέργαστο πολυσακχαρίτη ήταν 8,95 τοις εκατό.

κυτταρική γραμμή

Κυτταρική σειρά μικρογλοιώματος ποντικού BV2, από το Τμήμα Βιοχημείας του Κτηνιατρικού Πανεπιστημίου της Βιέννης, σε μέσο DMEM (Sigma) που περιέχει 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 τοις εκατό B27 (Gibco), 2 τοις εκατό γλουταμίνη, 37 βαθμού 5 τοις εκατό καλλιέργεια CO2.

μέσο κυτταροκαλλιέργειας

Μέσο BM (βασικό μέσο) στο οποίο το μέσο DMEM συμπληρώθηκε με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 30 mM γλυκόζη, 2 mM γλουταμίνη, 1 τοις εκατό στρεπτομυκίνη και 0,5 τοις εκατό αμφοτερικίνη.

κύρια αντιδραστήρια και όργανα

Το MPP plus είναι προϊόν σίγμα, καθαρότητα μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό. Τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα κατά της υδροξυλάσης της τυροσίνης (TH) είναι όλα προϊόντα της American Vectastain. TPTZ(2.4.6-τερπυριδίνη τριαζίνη), FeCl3·6H2O, FeSO4·7H2O είναι προϊόντα του αμερικανικού διαλύματος ξήρανσης sigma-Aldrich.DAPI. Το διάλυμα βαφής JC-1 και το διάλυμα βαφής C-DCDHF-DA είναι όλα προϊόντα της Invitrogen Molecular Probes. Η αρχική συγκέντρωση διαλύματος ήταν 1 mg/ml, Img/ml και 1 Μ, αντίστοιχα. Μικροσκόπιο φθορισμού, κατασκευασμένο από την εταιρεία Nikon στην Ιαπωνία, μοντέλο TS{17}}F. Φασματοφωτόμετρο για προϊόντα Γερμανίας Pharmacia Biotech, μοντέλα για Novaspec ⅡI.

Cistancheμπορεί να αποτρέψειΝόσος Πάρκινσον

μέθοδος

Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας εκχυλισμάτων με τη μέθοδο FRAP

Μετά την παρασκευή 30 ml υγρού εργασίας FRAP (ρυθμιστικό διάλυμα οξικού 300 mmol/L, διάλυμα TPTZ 10 mmol/L, διαλύματα FeCly 20 mmol/L αναμειγνύονται ομοιόμορφα σε αναλογία όγκου 10:1:1), 450 mu L FRAP προστέθηκε υγρό με διαφορετικές συγκεντρώσεις 60 μΙ υδατικών εκχυλισμάτων Fomitopsis Pinicola και 45 μΙ διπλού εξατμισμένου νερού. Η ανάμειξη στους 37 βαθμούς C αποφεύγει την αντίδραση φωτός μετά από 30 λεπτά και στη συνέχεια προσδιορίζει τις τιμές απορρόφησης στα 593 nm. Η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα κάθε εκχυλίσματος ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Trolox ως πρότυπο. Πραγματοποιήθηκαν τρεις παράλληλες αναλύσεις για κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ισοδύναμο Trolox (TEAC) (mol TEAC/g) ανά γραμμάριο εκχυλίσματος.

Η δοκιμασία απελευθέρωσης ΝΟ χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της αντιφλεγμονώδους δράσης του εκχυλίσματος

Τα κύτταρα λογαριθμικής φάσης BV2 εμβολιάστηκαν σε 48-πλάκες φρεατίων σε συγκέντρωση 1 x 10 βαθμών κυττάρων/ml. Μετά από επώαση για 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2, ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) προστέθηκε για διέγερση, η τελική συγκέντρωση ήταν 1lug/ml. Στη συνέχεια, προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς κάτω από 5 τοις εκατό CO, για 48 ώρες, μετά τις οποίες μετρήθηκε η συγκέντρωση του ΝΟ. Πριν από τη δίκη. Τα αντιδραστήρια Griess Α και Β αφαιρέθηκαν από το ψυγείο στους 4 βαθμούς C και αφέθηκαν να εξισορροπήσουν τη θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα πρότυπα νιτρωδών αραιώθηκαν σειριακά (20,10, 5,2,1 και 0,5 μΜ) για να παραχθούν τυπικές καμπύλες. Προσθέστε 50 μL του αραιωμένου προτύπου και το υπερκείμενο του δείγματος προς δοκιμή (4 επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση), προσθέστε στο 96- πιάτο του πηγαδιού και, στη συνέχεια, προσθέστε 50

uL του διαλύματος Α, επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά στο σκοτάδι και προσθέστε 50 uL του διαλύματος Β. Μετά από επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 550 nm με συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας εντός 30 λεπτών και η απελευθέρωση ΝΟ στο υπερκείμενο υπολογίστηκε σύμφωνα με την τυπική καμπύλη [11]. Ταυτόχρονα, 10 μΙ ΜΤΤ (5 mg/mL σε διάλυμα PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας κυττάρων και καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς για 5 τοις εκατό CO, για 4 ώρες. Αφού απορρίφθηκε το υπερκείμενο, προστέθηκαν 100 uL DMSO σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm μετά την πλήρη διάλυση, για να παρατηρηθεί ο ρυθμός επιβίωσης των κυττάρων.

Καλλιέργεια και ταυτοποίηση πρωτογενών ντοπαμινεργικών κυττάρων μεσεγκεφάλου και φαρμακευτική θεραπεία

Τα έγκυα ποντίκια θυσιάστηκαν και μεταφέρθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα DPBS, τα έμβρυα ποντικών ανατέμθηκαν, ο μεσεγκέφαλος απομονώθηκε, κόπηκε σε μικρά κομμάτια και συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα DPBS που περιείχε 2 ml 0 1 τοις εκατό θρυψίνης και 2 ml {{ 3}}.02 τοις εκατό της DNase L Επωάστε για 7 λεπτά σε υδατόλουτρο 37 μοιρών και στη συνέχεια προσθέστε 2 ml αναστολέα θρυψίνης σε συγκέντρωση 0.125 mg/ml, φυγοκεντρήστε το ιστού στα 100 xg για 4 λεπτά και απορρίψτε το υπερκείμενο. Στη συνέχεια, προστέθηκε μέσο DMEM που περιείχε 0,02 τοις εκατό DNase Ι και τα διαχωρισμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας ΒΜ, σπάρθηκαν σε κυτταρικά πλακίδια επεξεργασμένα με πολυλυσίνη και καλλιεργήθηκαν στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO. Την 10η ημέρα της καλλιέργειας, 10 ΜΜ MPP* προστέθηκε στα καλλιεργημένα πρωτεύοντα κύτταρα νευρώνων για επεξεργασία και στη συνέχεια προστέθηκαν 50,25,12,5 ug/ml υδατικού εκχυλίσματος Fomitopsis Pinicola για επεξεργασία σε 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO, καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τη 12η ημέρα της καλλιέργειας, μερικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση ντοπαμινεργικών νευρώνων και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 30 λεπτά, και στη συνέχεια διαπερατά για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 0,4 τοις εκατό Triton X{{{ 33}}. Μετά από ξέπλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για 3 φορές, μπλοκαρίστηκε με ανασταλτικό διάλυμα ορού αλόγου για 90 λεπτά, στη συνέχεια προστέθηκε πρωτεύον αντίσωμα αντι-ΤΗ όλη τη νύχτα, μετά προστέθηκε βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα για θερμοκρασία δωματίου για 90 λεπτά και τέλος, 3,3 Αναπτύχθηκε «-διαμινοβενζιδίνη (DAB, 5 mg/ml). Τα θετικά για το χρώμα ΤΗ κύτταρα παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο ως ντοπαμινεργικοί νευρώνες.

Παρατήρηση πυρηνικής μορφολογίας

Τα κύτταρα MPP plus και τα επεξεργασμένα με φάρμακο σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, στη συνέχεια θραύθηκαν με 0,4 τοις εκατό Triton X-100 για 30 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν με διάλυμα χρώσης DAPI σε τελική συγκέντρωση 1 ug/ml για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η μορφολογία του πυρήνα παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 340 nm και επιλέχθηκαν τυχαία 4 πεδία για κάθε φρεάτιο.

Ανίχνευση δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης

Κύτταρα MPP plus και επεξεργασμένα με φάρμακο προστέθηκαν στο JC-1 dve σε τελική συγκέντρωση 10 μg/ml και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 15 λεπτά. Οι αλλαγές στην ένταση του φθορισμού παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού σε φως διέγερσης 488 nm και 568 nm αντίστοιχα. Η αλλαγή στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε από την αναλογία της έντασης φθορισμού στα 568 nm προς την ένταση φθορισμού στα 488 nm.

Δοκιμή παραγωγής ROS

MPP plus και κατεργασμένα με φάρμακο κύτταρα προστέθηκαν στο C-DCDHF-DA dve σε τελική συγκέντρωση 10 mM και μετά από επώαση στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά, το διάλυμα καλλιέργειας απορρίφθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ένα άχρωμο μέσο DMEM . Χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο φθορισμού για την παρατήρηση της αλλαγής της έντασης του φθορισμού. Το μήκος κύματος διέγερσης ήταν 488 nm και επιλέχθηκαν τυχαία 4 οπτικά πεδία για κάθε φρεάτιο. Ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων στο φως διέγερσης δεν ήταν μεγαλύτερος από 5 δευτερόλεπτα.

Αποτελέσματα

Αντιοξειδωτική ικανότητα του Fomitopsis Pinicola

Το Fomitopsis Pinicola έχει προφανή αντιοξειδωτική δράση και το υδατικό του εκχύλισμα έχει αντιοξειδωτική ικανότητα (165,80±7,13)μmol εκχυλίσματος TEACh.

Αντιφλεγμονώδης δράση του Fomitopsis Pinicola

Μετά από κύτταρα BV2 που επήγαγαν LPS, η απελευθέρωση ΝΟ αυξήθηκε σημαντικά, η οποία ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη της φυσιολογικής ομάδας ελέγχου. Μετά το υδατικό εκχύλισμα του Fomitopsis Pinicola, η απελευθέρωση ΝΟ μειώθηκε σημαντικά, μεταξύ των οποίων 100,50, 25, υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας δόσης 12,5 μg/ml και της ομάδας LPS (Εικ. 1). Μετά από κύτταρα BV2 που προκάλεσαν LPS, το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερο από αυτό της φυσιολογικής ομάδας ελέγχου. Μετά τη δράση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pimicola, η ομάδα δόσης 100 ug/ml είχε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων και υπήρξε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα LPS. Η ομάδα δόσης 50,25,12,5 ug/ml δεν είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 1, Σχήμα 2).

Ταυτοποίηση ντοπαμινεργικών νευρώνων του μεσεγκεφάλου σε εμβρυϊκούς αρουραίους

Μετά την ειδική χρώση TH των καλλιεργημένων νευρώνων μεσεγκέφαλου εμβρύου αρουραίου, οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες έδειξαν ένα καθαρό καστανοκίτρινο χρώμα και η χρώση των κυτταρικών σωμάτων και αξόνων ήταν σαφώς ορατή, γεγονός που απέδειξε ότι οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες καλλιεργήθηκαν με επιτυχία (Εικόνα 3). .

Σχήμα 1 Επιδράσεις των υδατικών εκχυλισμάτων του Fomitopsis Pinicola στην απελευθέρωση ΝΟ σε κύτταρα BV2

που προκαλείται από το LPS

Σημείωση: σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου, **p < {{0}}.01;="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" lps,="" ##p="">< 0,01,="" #p=""><>

Σχήμα 2 επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola στο ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων BV2

Σημείωση: σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου, **p < 0.01;="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" lps,=""><>

Σχήμα 3 Χρώση νευρώνων DA μεσημασμένου μεσεγκεφάλου TH

Επίδραση του Fomitopsis Pinicola στην πυρηνική μορφολογία Το DAPI,4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, είναι μια κατάδυση φθορισμού που διεισδύει στην κυτταρική μεμβράνη και συνδέεται παράξενα με το DNA. Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος έδειξαν ότι οι πυρήνες των ντοπαμινεργικών νευρώνων στην φυσιολογική ομάδα ελέγχου παρέμειναν σχεδόν άθικτοι και η χρωματίνη ήταν ομοιόμορφη. Η ομάδα ελέγχου MPP συν έδειξε σημαντική συμπύκνωση χρωματίνης, λύση πυρηνικής μεμβράνης και πυρηνική λύση. Μετά τη δράση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola, η μορφολογία του πυρήνα ήταν σχετικά άθικτη και τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης μειώθηκαν (Εικόνα 4).

Επίδραση του Fomitopsis Pinicola στο δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης

Μετά την επαγωγή MPP plus, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης των ντοπαμινεργικών νευρώνων μειώθηκε σημαντικά, το οποίο ήταν σημαντικά διαφορετικό από αυτό της φυσιολογικής ομάδας ελέγχου (P<0.01). after="" the="" action="" of="" the="" aqueous="" extract="" of="" fomitopsis="" pinicola,="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" decreased="" after="" mpp+="" induction.="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mitochondrial="" membrane="" potential="" in="" the="" 50,="" 25,="" and="" 12.5ug/ml="" dose="" groups="" compared="" with="" the="" mpp+="" control="" group=""><0.01,><0.05)(figure>

Επίδραση του Pseudomonas Sinensis στην παραγωγή ROS

Μετά την επαγωγή MPP plus, η παραγωγή ROS των ντοπαμινεργικών νευρώνων αυξήθηκε σημαντικά. η οποία ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη της κανονικής ομάδας ελέγχου (Π<0.01). after="" the="" action="" of="" the="" aqueous="" extract="" of="" fomitopsis="" pinicola,="" the="" ros="" increased="" after="" mpp+induction.="" the="" reduction="" of="" ros="" production="" in="" the="" 50="" and="" 25="" ug/ml="" dose="" groups="" was="" significantly="" different="" from="" the="" mpp+control="" group=""><0.01)(figure 6,="" figure="">

Εικόνα 4. Απεικόνιση χρώσης φθορισμού DAPI νευρώνων DA στο μεσεεγκεφαλικό

Σχήμα 5 Η επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola στο μιτοχόνδριο που προκαλείται από MPP plus

το δυναμικό της μεμβράνης των μεσεεγκεφαλικών νευρώνων DA

Σημείωση: Σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου, **P < {{0}}.01;="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου="" mpp="" plus,="" #="" #="" p="">< 0,01,="" #="">

0.05.

Εικόνα 6. Χρώση φθορισμού C-DCDHF-DA νευρώνων DA στο μεσεγκεφαλικό

Σχήμα 7 επιδράσεις των υδατικών εκχυλισμάτων του Fomitopsis Pinicola στην επαγόμενη από MPP συν μεσεεγκεφαλική DA

παραγωγή ROS νευρώνων

Σημείωση: σε σύγκριση με την κανονική ομάδα ελέγχου, **P < {{0}}.01;="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου="" mpp="" plus,="" #="" #="" p=""><>

συμπέρασμα

Ο εκφυλισμός των ντοπαμινεργικών νευρώνων (νευρώνες DA) στον μεσεγκέφαλο χάνεται και το σώμα Lewy στο κυτταρόπλασμα των υπολειπόμενων νευρώνων είναι το κύριο χαρακτηριστικό τουΝόσος Πάρκινσον.Τα κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνουν κυρίως στατικό τρόμο, βραδυκινησία, υπερμυοτονία, αστάθεια στάσης, κ.ά. Επί του παρόντος, η θεραπεία τουΝόσος Πάρκινσονεξακολουθεί να κυριαρχείται από τη θεραπεία υποκατάστασης ντοπαμίνης. Αν και μπορεί να βελτιώσει τα συμπτώματα των ασθενών, δεν εμποδίζει την ανάπτυξη της νόσου. Η μακροχρόνια εφαρμογή θα προκαλέσει πολλές ανεπιθύμητες ενέργειες [12], επομένως η μελέτη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων είναι επιτακτική. Μελέτες έχουν δείξει ότι το οξειδωτικό στρες και τα επίπεδα οξειδωμένης ντοπαμίνης είναι σημαντικές αιτίες επιλεκτικής βλάβης των ντοπαμινεργικών νευρώνων [13] και ορισμένα φυσικά αντιοξειδωτικά όπως η κερκετίνη, η κουρκουμίνη, οι πολυφαινόλες τσαγιού κ.ά. έχουν επιβεβαιωθεί ότι είναι ντοπαμίνη που προκαλείται από νευρικούς παράγοντες. Η νευρωνική βλάβη έχει εμφανή προστατευτικά αποτελέσματα [14-16], επομένως είναι πολλά υποσχόμενος ο έλεγχος φαρμάκων για τη θεραπείαΝόσος Πάρκινσοναπό παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα με αντιοξειδωτική φαρμακολογική δράση.

Σε αυτή τη μελέτη, το FRAP χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των υδατικών εκχυλισμάτων του Fomitopsis Trolox Pinicola, χρησιμοποιώντας (6-υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλοχρωμάνιο)2- καρβοξυλικό οξύ) βρέθηκε να έχει σημαντική αντιοξειδωτική δράση. Η αντιφλεγμονώδης δράση των υδατικών εκχυλισμάτων που ανιχνεύθηκε είναι η μέθοδος απελευθέρωσης ΝΟ μικρογλοίας BV2 που προκαλείται από το Pinicolawas Fomitopsis dby λιποπολυσακχαρίτη και δεν υπήρξε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεντρώσεις κάτω από 100 ug/ml, υποδεικνύοντας ότι στα νευρογλοιακά κύτταρα είχαν σημαντική αντι- φλεγμονώδεις επιδράσεις και δεν έχουν σημαντική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων.

Το οξειδωτικό στρες αναφέρεται στην ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής και της αποβολής των ελεύθερων ριζών οξυγόνου στο σώμα. Είναι ένα πρώιμο συμβάν στη διαδικασία νευρωνικού εκφυλισμού-απόπτωσης. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο εγκεφαλικός ιστός είναι πλούσιος σε φωσφολιπίδια και ακόρεστα λιπαρά οξέα, τα οποία είναι και τα δύο ευαίσθητα στο οξειδωτικό στρες. Σε ασθενείς μεΝόσος Πάρκινσον, η μηλοδιαλδεΰδη, ο δείκτης υπεροξείδωσης των λιπιδίων, στο ραβδωτό σώμα είναι σημαντικά αυξημένος, ενώ η συγκέντρωση των πολυακόρεστων. Τα λιπαρά οξέα μειώθηκαν σημαντικά [17], η περιεκτικότητα σε γλουταθειόνη (GSH) μειώθηκε και η λειτουργία του συμπλέγματος μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας I ήταν μειωμένη[18,19]. Το MPP plus είναι ένας μεταβολίτης του νευροτοξικού παράγοντα MPTP στο σώμα, ο οποίος μπορεί να δημιουργήσει ελεύθερες ρίζες στο σώμα, να αναστείλει τη μιτοχονδριακή λειτουργία, να καταστρέψει τους νευρώνες DA στη μέλαινα ουσία και να αναπτύξει συμπτώματαΝόσος Πάρκινσονσε ζωικά μοντέλα. Το ΝΟ εμπλέκεται επίσης στον μηχανισμό βλάβης του MPP plus. Το υπερβολικό ΝΟ διαχέεται στους νευρώνες DA, οι οποίοι μπορούν να νιτρώσουν με τη σουλφυδρυλική θέση του ενζύμου και να αναστείλουν τη δραστηριότητα του συμπλέγματος της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας του ενζύμου Ι [20,21].

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι μετά από το MPP plus που προκάλεσε πρωτογενείς καλλιεργημένους νευρώνες DA, ο πυρήνας έδειξε εμφανή απόπτωση, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης μειώθηκε και η παραγωγή ROS αυξήθηκε σημαντικά, υποδεικνύοντας ότι το MPP plus μπορεί να προκαλέσει απόπτωση των νευρώνων DA αναστέλλοντας το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες. Το υδατικό εκχύλισμα του Fomitopsis Pinicola a μπορεί να βελτιώσει τη μορφολογία των ντοπαμινεργικών νευρώνων μετά από επαγωγή MPP συν, να αυξήσει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης και να μειώσει την παραγωγή ROS, υποδεικνύοντας ότι το υδατικό εκχύλισμα του Fomitopsis Pinicola αναστέλλει τη βλάβη των νευρώνων DA του μέσου εγκεφάλου που έχουν καταστραφεί από νευρικούς παράγοντες. σχετίζεται με την αντιοξείδωση και την αναστολή της παραγωγής ΝΟ και προστατεύει τους νευρώνες αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες του μιτοχονδρίου.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Khan AU, Akram M, Daniyal M, et al. Επίγνωση και τρέχουσα γνώση της νόσου Πάρκινσον: Μια νευροεκφυλιστική διαταραχή. Int J Neurosci 2018, 8: 1-64.

2. Klingelhoefer L, Reichmann H. Parkinson's disease ως πολυσυστημική διαταραχή. J Neural Transm (Βιέννη) 2017, 124: 709-713.

3. Choi DH, Cristóvão AC, Guhathakurta S, et al. Το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την οξειδάση NADPH 1- οδηγεί σε θάνατο νευρώνων ντοπαμίνης στη νόσο του Πάρκινσον. Antioxid Redox Signal 2012, 16: 1033-1045.

4. Asaithambi A, Ay M, Jin H, et al. Η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης D1 (PKD1) προάγει τη ντοπαμινεργική νευρωνική επιβίωση κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από 6-OHDA. PLoS One, 2014, 9: e96947.

5. Berndt Ν, Bulik S, Holzhütter HG. Kinetic Modeling of the Mitochondrial Energy Metabolism of Neuronal Cells: The Impact of Reduced -Ketoglutarate Dehydrogenase Activities on ATP Production and Generation of Reactive Oxygen Species. Int J Cell Biol 2012, 2012: 757594.

6. Yan MH, Wang X, Zhu X. Μιτοχονδριακά ελαττώματα και οξειδωτικό στρες στη νόσο του Αλτσχάιμερ και στη νόσο του Πάρκινσον. Free Radic Biol Med 2013, 62: 90-101.

7. Guo C, Sun L, Chen X, Zhang D. Οξειδωτικό στρες, μιτοχονδριακή βλάβη και νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Neural Regen Res 2013, 8: 2003-2014.

8. Hao L, Sheng Z, Lu J, et αϊ. Χαρακτηρισμός και αντιοξειδωτική δράση εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών από το Fomitopsis Pinicola. Carbohydr Polym, 2016, 141: 54-59.

9. Shah F, Mali T, Lundell TK. Polyporales Brown Rot Species Fomitopsis Pinicola: Προφίλ δραστηριότητας ενζύμου, παραγωγή οξαλικού οξέος και Fe3 plus -Μείωση της έκκρισης μεταβολίτη.Appl Environ Microbiol, 2018, 84: e02662-17.

10. Guo SS, Wolf D. Μελέτη για τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις του υδατικού εκχυλίσματος του Fomitopsis Pinicola σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες in vitro. Chin J Pharmacovigil 2018, 15: 582-586.

11. Khaled Radad, Rudolf Moldzio, Wolf-Dieter Rausch. Τοξικότητα Η μινοκυκλίνη προστατεύει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες από τη μακροχρόνια ροτενόνη. Can J Neurol Sci 2010, 37: 81-85.

12. Rizek P, Kumar N, Jog MS.An update για τη διάγνωση και τη θεραπεία της νόσου του Parkinson. MAJ 2016, 188: 1157-1165.

13. Crotty GF, Ascherio A, Schwarzschild MA. Στόχευση ουρικού οξέος για μείωση του οξειδωτικού στρες στη νόσο του Πάρκινσον. Exp Neurol 2017, 298: 210-224.

14. Ay Μ, Luo J, Langley Μ, et αϊ. Μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τις προστατευτικές επιδράσεις της κερκετίνης έναντι της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και του προοδευτικού ντοπαμινεργικού νευροεκφυλισμού σε κυτταροκαλλιέργεια και μοντέλα διαγονιδιακών ποντικών MitoPark της νόσου του Πάρκινσον. J Neurochem 2017, 141: 766-782.

15. Wang MS, Boddapati S, Emadi S, et αϊ. Η κουρκουμίνη μειώνει την επαγόμενη από την άλφα-συνουκλεΐνη κυτταροτοξικότητα στο κυτταρικό μοντέλο της νόσου του Πάρκινσον. BMC Neurosci 2010, 11: 57.

16. Weinreb Ο, Amit Τ, Mandel S, et al. Νευροπροστατευτικοί μοριακοί μηχανισμοί της (-)-επιγαλλοκατεχίνης-3-γαλλικής: ένα ανακλαστικό αποτέλεσμα των αντιοξειδωτικών, χηλικών και νευριτογόνων ιδιοτήτων του σιδήρου. Genes Nutr 2009, 4: 283-296.

17. Dawson TM, Ko HS, Dawson VL. Γενετικά ζωικά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον. Neuron 2010, 66:646-61.

18. Bodis-Wollner. Αμφιβληστροειδοπάθεια στη νόσο του Πάρκινσον. J Neural Transm (Βιέννη) 2009, 116: 1493-1501.

19. Hisahara S, Shimohama S. Προκαλούμενα από τοξίνες και γενετικά ζωικά μοντέλα της νόσου του Parkinson. Parkinson's Dis. 2010, 2011: 951709.

20. Yang S, Liu Τ, Li S, et αϊ. Συγκριτική πρωτεομική ανάλυση εγκεφάλου ποντικών που γερνούν φυσικά. Neuroscience 2008, 154: 1107-1120.

21. Gautier CA, Corti O, Brice Α. Μιτοχονδριακές δυσλειτουργίες στη νόσο του Πάρκινσον. Rev Neurol (Παρίσι) 2014, 170:339-343.