Ο αναγνώστης RNA M6 A YTHDF2 ελέγχει την αντικαρκινική και την αντιική ανοσία κυττάρων NK Μέρος 6

Μοντέλο μεταστατικού μελανώματος και πρόκληση MCMV

B16F10 κύτταρα (105) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε ποντικούς. 14 ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία για μεταθανάτια ανάλυση. Οι μεταστατικοί όζοι στον πνεύμονα αναλύθηκαν μακροσκοπικά και μετρήθηκαν. Η κυτταρική σειρά B16F10 παρασχέθηκε από την Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). Τα ποντίκια Ythdf2ΔNK και Ythdf2WT μολύνθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση του στελέχους Smith MCMV (2,5 × 104 PFU), το οποίο αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (VR-1399). Δείγματα περιφερικού αίματος ελήφθησαν μέσω υπογνάθιου παρακέντησης τις ημέρες 0, 4 και 7 μετά τη μόλυνση.

Οι όζοι πνευμονικής μετάστασης αναφέρονται σε οζίδια που σχηματίζονται από κακοήθη καρκινικά κύτταρα από άλλες θέσεις που μεταναστεύουν στους πνεύμονες μέσω του αίματος ή του λεμφικού συστήματος. Για πολλούς ασθενείς, αυτή είναι μια κοινή εκδήλωση καρκίνου του πνεύμονα.

Ωστόσο, αν και τα οζίδια μετάστασης στους πνεύμονες αποτελούν απειλή για τη σωματική υγεία των ασθενών, δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ αυτού και της μνήμης. Επομένως, θα πρέπει να αντιμετωπίζουμε ενεργά τις προκλήσεις του καρκίνου του πνεύμονα και των όζων μετάστασης στους πνεύμονες και να μην αφήνουμε τα αρνητικά συναισθήματα και το άγχος να επηρεάζουν τη σωματική και ψυχική μας υγεία.

Ταυτόχρονα, μπορούμε να διατηρήσουμε και να βελτιώσουμε τη μνήμη μέσω ορισμένων θετικών μεθόδων. Για παράδειγμα, εκτελέστε κάποια εκπαίδευση μνήμης, όπως μαθηματικούς υπολογισμούς, ανάγνωση, ακρόαση μουσικής, παιχνίδια κ.λπ. Επιπλέον, η τήρηση καλών συνηθειών διαβίωσης, όπως η τακτική άσκηση, ο αρκετός ύπνος, η υγιεινή διατροφή κ.λπ. βελτιώσουμε τη μνήμη μας.

Το πιο σημαντικό είναι να διατηρήσετε μια θετική στάση. Ανεξάρτητα από τις δυσκολίες που αντιμετωπίζετε, πρέπει να πιστεύετε στη δύναμή σας και στην ευελιξία του νευρικού σας συστήματος και μέσα από θετικές προσαρμογές και απαντήσεις, τελικά θα ξεπεράσετε με επιτυχία τις δυσκολίες.

Εν ολίγοις, αν και οι μεταστατικοί όζοι στους πνεύμονες αποτελούν απειλή για τη σωματική υγεία, δεν σχετίζονται άμεσα με τη μνήμη. Θα πρέπει να το αντιμετωπίσουμε θετικά και να διατηρήσουμε και να βελτιώσουμε τη μνήμη μας προσαρμόζοντας τον τρόπο ζωής μας και διατηρώντας μια καλή στάση. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στα συμπληρώματα γνώσης για να ενισχύσετε τη μνήμη

Μετρήστε τα ιικά φορτία στο περιφερικό αίμα, τη σπλήνα και το ήπαρ, απομονώθηκε DNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ QIAGEN DNeasy Blood and Tissue για ανάλυση qPCR. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (εμπρός) και MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (αντίστροφα).

Θεραπεία ποντικιού in vivo με IL-15

Για in vivo θεραπεία ποντικού με IL-15, ενέθηκαν Ythdf2ΔNK και Ythdf2WTmice με 2 μg ip ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL-15 (αρ. κατ. 745101; Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου) για 5 ημέρες. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και μάρτυρες υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ευθανασία για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Κυτταρομετρία ροής

Εναιωρήματα μονοκυττάρου παρασκευάστηκαν από ΒΜ, αίμα, σπλήνα, ήπαρ και πνεύμονα ποντικών Ythdf2ΔNK και Ythdf2WT όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wang et al., 2018b). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και η ταξινόμηση κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε LSRFortessa X-20 και FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences), αντίστοιχα.

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό NovoExpress (Agilent Technologies).

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα επισημασμένα με χρωστική φθορισμού αντισώματα από την BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen ή τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ), TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzyme B (QA16A02), perforin (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226 (TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), αννεξίνη V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) και Eomes (WD1928), phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), phospho-Akt (Ser473, #5315), φωσφο-S6 ριβοσωμική πρωτεΐνη ,φωσφο-Stat3 (Tyr705, #9145) και φωσφο-Stat5 (Tyr694,#9539).

Για την αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΚ, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με 5 μΜ CTV (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή πριν από τη μεταφορά τους στον μύα-λήπτη. Η ενδοκυτταρική χρώση των Ki67, Tbet και Eomes πραγματοποιήθηκε με στερέωση και διαπερατότητα με το κιτ χρώσης Foxp3/Transcription Factor (eBioscience).

Για την ανίχνευση φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών, καθαρισμένα κύτταρα ΝΚ σπληνός υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-15 (50 ng/ml) για 1 ώρα και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Phosflow Fix I που ακολουθήθηκε από διαπερατότητα με Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) και χρώση με αντισώματα.

Μεταφορά θετικών κυττάρων

Για την αξιολόγηση της επίδρασης της ανεπάρκειας Ythdf2 στην ωρίμανση των ΝΚ κυττάρων, ένα μείγμα 5 × 106 ΒΜ κυττάρων σε αναλογία 1:1 από ποντίκια CD45.1 ήYthdf2ΔNK CD45.2 συνμεταφέρθηκαν σε Rag2−/−Il2rg−/−ποντίκια. Η ανασύσταση των ληπτών αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής 8 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση.

Για πειράματα ομοιοστατικού πολλαπλασιασμού που προκαλείται από λεμφοπενία, ίσος αριθμός καθαρισμένων σπληνικών ΝΚ κυττάρων από ποντίκια CD45.1 ή Ythdf2ΔNK CD45.2 συνμεταφέρθηκαν σε Rag2−/−Il2rg−/− ποντίκια ακολουθούμενη από αξιολόγηση των σχετικών ποσοστών των μεταφερθέντων WT και Ythdf2ΔΝΚ κυττάρων σε ποντίκια των δεκτών Rag2−/−Il2rg−/− με κυτταρομετρία ροής σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.

Για το μεταστατικό μοντέλο μελανώματος, 106 IL-2–διευρυμένα ΝΚ κύτταρα από Ythdf2ΔNK ή Ythdf2WTmice εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε Rag2−/−Il2rg−/− ποντίκια. 1 ημέρα αργότερα, τα κύτταρα B16F10 (105) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε ποντικούς. 14 ημέρες μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία για μεταθανάτια ανάλυση. Σε ορισμένα πειράματα, τα κύτταρα σημάνθηκαν με CTV (5 μΜ, Invitrogen) για τον εντοπισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πριν από τη μεταφορά.

In vivo προσδιορισμός διακίνησης

Για την ανίχνευση διακίνησης ΝΚ κυττάρων από ΒΜ στο περιφερικό αίμα, 1 μg iv σημασμένο με APC αντισώματος αντι-CD45 εγχύθηκε σε ποντικούς C57BL/6. Δύο λεπτά μετά την έγχυση αντισώματος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ευθανασία αμέσως και τα κύτταρα ΒΜ συλλέχθηκαν για κυτταρομετρία ροής αφού τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντισώματα CD3 και NK1.1. Τα παρεγχυματικά κύτταρα ΝΚ αναγνωρίστηκαν λόγω έλλειψης χρώσης CD45, ενώ τα ημιτονοειδή ΝΚ κύτταρα αναγνωρίστηκαν από την παρουσία σήμανσης CD45. Επομένως, η αναλογία των NK κυττάρων στα ημιτονοειδή (CD45+) προς αυτή στις παρεγχυματικές περιοχές (CD45−) υποδηλώνει τη διακίνηση κυττάρων ΝΚ από το περιφερικό αίμα ΒΜ σε σταθερή κατάσταση.

RT-qPCR σε πραγματικό χρόνο και ανοσοστύπωμα

Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Mini Kit (QIAGEN) και στη συνέχεια μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με PrimeScript RT Reagent Kitwith gDNA Eraser (Takara Bio) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SYBRGreen PCR Master Mix και ένα σύστημα QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (και τα δύο από την Thermo Fisher Scientific). Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Η ανοσοστύπωση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:METTL3 (αρ. κατ. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (αρ. κατ.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (αρ. κατ. 17479-1-AP. ; Proteintech), YTHDF2 (αρ. κατ. RN123PW; MBL), YTHDF3 (αρ. κατ.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (αρ. κατ. ab195377; Abcam),FTO (αρ. κατ. ab124892; Abcam), MDM2 (αρ. κατ. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (αρ. κατ. PA5-29949; Invitrogen) και -ακτίνη (αρ. κατ. {{20 }}Ig; Proteintech).

προσδιορισμός knockdown siRNA

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90% όπως μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η αποτελεσματικότητα Geneknockdown προσδιορίστηκε με qPCR και ανοσοστύπωμα. 3 ημέρες μετά τη διαμόλυνση, η κυτταρική απόπτωση και ο πολλαπλασιασμός αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται παραπάνω.

Δοκιμασία αναφοράς Luciferase

Η περιοχή του υποκινητή Ythdf2 που κυμαίνεται από –2,000 bp έως +100 bpof του TSS ενισχύθηκε από κύτταρα NK ποντικού και κλωνοποιήθηκε σε apGL4-Βασικό φορέα αναφοράς λουσιφεράσης (Promega) για τη δημιουργία apGL{ {5}}Πλασμίδιο αναφοράς Ythdf2. Τα κύτταρα HEK293T που αγοράστηκαν από την ATCC συνεπιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια αναφοράς pGL4-Ythdf2 καθώς και με πλασμίδια υπερέκφρασης STAT5a ή STAT5b ή ανεπαρκή φορέα, μαζί με ένα πλασμίδιο αναφοράς pRL-TK Renilla (Promega) για ομαλοποίηση της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για λύση 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση και η δραστικότητα της λουσιφεράσης ποσοτικοποιήθηκε φθοριομετρικά με το Σύστημα Διπλής Λουσιφεράσης (Promega). Οι αλληλουχίες εκκινητών για την κλωνοποίηση του προαγωγέα Ythdf2 και των πλασμιδίων υπερέκφρασης STAT5a και STAT5b παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Δοκιμασίες τσιπ

Οι αναλύσεις ChIP πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Pierce Magnetic ChiP (αρ. κατ. 26157, Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ίση ποσότητα ananti-anti-phospho-Stat5 (Tyr694, αρ. κατ. 9351; Cell Signaling Technologies) ή αντίστοιχου φυσιολογικού IgG κουνελιού ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ξεχωριστά για την κατακρήμνιση των διασυνδεδεμένων συμπλεγμάτων DNA-πρωτεΐνης που προέρχονται από 5 × 106 καθαρισμένα πρωτεύοντα ΝΚ κύτταρα ποντικού τα οποία υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με IL{10}} (50 ng/ml) για 1 ώρα. Μετά την αναστροφή της διασύνδεσης, το DNA που ανοσοκαταβυθίστηκε από το ενδεικνυόμενο αντίσωμα δοκιμάστηκε με qPCR. Οι αλληλουχίες όλων των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Ex vivo δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Η ex vivo κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κυττάρων αξιολογήθηκε με τυπικές αναλύσεις 51Crrelease. Οι κυτταρικές σειρές λεμφώματος ποντικού RMA-S (MHC class Ideficient) και RMA (MHC class I επαρκής) κύτταρα, δώρο του Andre'Veillette (Πανεπιστήμιο McGill, Μόντρεαλ, Καναδάς), χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα-στόχοι. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πολυϊνοσινικού:πολυκυτιδυλικού οξέος [πολυ (Ι: C); 200 μg/ποντίκια] για 18 ώρες. Πολυ(Ι:C)-ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚ απομονώθηκαν από τον σπλήνα χρησιμοποιώντας το EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies). Τα καθαρισμένα ΝΚ κύτταρα συγκαλλιεργήθηκαν με κύτταρα στόχους σε αναλογία 5:1, 2,5:1 και 1,25:1 παρουσία IL-2 (50 U/ml).

m6A-seq

Καθαρισμένα σπληνικά κύτταρα ΝΚ διευρύνθηκαν με IL-2 (1,000 U/ml, αρ. κατ. Bulk Ro 23-6019; Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου) in vitro για 7 ημέρες. Το ολικό RNA απομονώθηκε με αντιδραστήριο TRIZol (Thermo FisherScientific) από 50 εκατομμύρια IL-2-διασταλμένα κύτταρα ΝΚ. Το πολυαδενυλιωμένο RNA εμπλουτίστηκε περαιτέρω από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού mRNA Dynabeads (Invitrogen). Τα δείγματα mRNA κατακερματίστηκαν σε θραύσματα μήκους 100-nt με αντιδραστήρια κατακερματισμού RNA (Invitrogen).

Το τεμαχισμένο mRNA (5 μgmRNA) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκατακρήμνιση m6A χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα m6A (202003, Synaptic) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο του κιτ Magna MeRIP m6A (Merck Millipore). Το RNA εμπλουτίστηκε μέσω του RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) για δημιουργία βιβλιοθήκης με ένα κιτ KAPA RNA HyperPrep (Roche). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις γονιδιωματικής του City of Hope σε μηχάνημα Illumina HiSeq 2500 με λειτουργία απλής ανάγνωσης 50-bp. Οι αναγνώσεις αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα του ποντικιού χρησιμοποιώντας το λογισμικό HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Τα χαρτογραφημένα δείγματα ανοσοκατακρήμνισης και βιβλιοθήκες εισόδου παρέχονται χρησιμοποιώντας το πακέτο R exomePeak (Meng et al., 2014). Τα m6Apeaks οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). Το μοτίβο δέσμευσης m6A αναλύθηκε από το MEME (https://meme-suite.org) και το HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Οι ονομαζόμενες κορυφές σημειώθηκαν με τομή με την αρχιτεκτονική γονιδίων χρησιμοποιώντας το Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (πλάσια αλλαγή)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 εκατομμύρια IL-2–διασταλμένα κύτταρα ΝΚ συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και το κυτταρικό ίζημα λύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 2 vol (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM διθειοθρεϊτόλη, 1:100 κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [Thermo Fisher Scientific] και 400 U/ml SUPERase-In RNase Inhibitor [Thermo Fisher Scientific].

Το προϊόν λύσης επωάστηκε σε πάγο για 5 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε για 15 λεπτά για να καθαρίσει το προϊόν λύσης. Το ένα δέκατο του όγκου του κυτταρολύματος αποθηκεύτηκε ως είσοδος. Το υπόλοιπο κυτταρόλυμα επωάστηκε με 5 μg αντι-YTHDF2 (αρ. κατ. RN123PW; MBL) που συζεύχθηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης Α (αρ. κατ. 10001D, Invitrogen) σε 4 μοίρες για 2 ώρες με ήπια περιστροφή. Στη συνέχεια, τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με 1 ml παγωμένο ρυθμιστικό πλύσης (50 mM HEPES, pH 7,6,200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05% NP-40, 0,5 mM διθειοθρεϊτόλη και 200 ​​U/ml RNase ανασταλτικός παράγοντας).

Τα ανοσοκαταβυθισμένα δείγματα υποβλήθηκαν σε πέψη με πρωτεϊνάση Κ σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης συμπληρωμένο με 1% SDS και 2 mg/ml Πρωτεϊνάση Κ (ThermoFisher Scientific) που επωάστηκε με ανακίνηση στις 1.200 rpm στους 55 βαθμούς για 1 ώρα. Το ολικό RNA εκχυλίστηκε τόσο από το εισερχόμενο όσο και από το ανοσοκαταβυθισμένο RNA με προσθήκη αντιδραστηρίου TRIzol 5 vol ακολουθούμενο από Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

Η βιβλιοθήκη cDNA δημιουργήθηκε με ένα κιτ KAPA RNA HyperPrep (Roche) και αναλύθηκε η αλληλουχία σε μια πλατφόρμα Illumina HiSeq 2500. Τα κορυφαία αποτελέσματα κλήσεων με βιβλιοθήκες ανοσοκατακρήμνισης και εισόδου δημιουργήθηκαν από το πακέτο R RIPSeeker (Li et al., 2013). Ο HOMER χρησιμοποιήθηκε για να βρει μοτίβα της κατανομής δεδομένων σε περιοχές αιχμής. Οι ονομαζόμενες κορυφές σημειώθηκαν με τομή με την αρχιτεκτονική γονιδίου και μεταγραφής χρησιμοποιώντας το ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

δοκιμασία σταθερότητας mRNA

Καθαρισμένα σπληνικά κύτταρα ΝΚ από ποντικούς Ythdf2ΔNK και Ythdf2WT καλλιεργήθηκαν με IL-15 (50 ng/ml). 3 ημέρες μετά την καλλιέργεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ακτινομυκίνη D (5 μg/ml, αρ. κατ. Α9415, Sigma) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Κύτταρα χωρίς επεξεργασία χρησιμοποιήθηκαν στις 0 h. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στον υποδεικνυόμενο χρόνο και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα για qPCR. Ο χρόνος ημιζωής του mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως από τους Weng et al. (2018). Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Ηλεκτρονική ανάλυση βάσης δεδομένων

Χρησιμοποιήσαμε τον διαδικτυακό πόρο BioGPS (http://biogps.org) για να αναλύσουμε την ειδική για ιστό έκφραση του Ythdf2. Τα σύνολα RNA-seqdata ήταν από το GEO υπό αρ. εισαγωγής. GSE106138, GSE113214 και GSE25672. Εξήχθησαν κανονικοποιημένα δεδομένα από αναλύσεις RNA-seq και η γονιδιακή έκφραση z-score οπτικοποιήθηκε με τη λειτουργία Heatmap.2 εντός της gplots Rlibrary

Στατιστική

Οι μη ζευγαρωμένες δοκιμές t Student (με δύο ουρές) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Η μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA εκτελέστηκε όταν συγκρίθηκαν τρεις ή περισσότερες ανεξάρτητες ομάδες. Οι τιμές P προσαρμόστηκαν για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Holm-Sˇ´ıdak. P < 0.05 θεωρήθηκε σημαντικό. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; και ***, P < 0,001.

Διαδικτυακό συμπληρωματικό υλικό

Το Σχ. S1 δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης του YTHDF2 σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ΝΚ ως απόκριση στη διέγερση της IL-15, τη μόλυνση από MCMV και την εξέλιξη του όγκου. τη δημιουργία ποντικών με ειδική για NKcell διαγραφή του Ythdf2. Το Σχ. S2 δείχνει τους τίτλους του ιού στη σπλήνα και το ήπαρ από ποντικούς μολυσμένους με MCMV και το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των Ly49H+ και/ή Ly49D+ NK κυττάρων σε ποντικούς μολυσμένους με MCMV. Το Σχ. S3 δείχνει τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την ωρίμανση και την έκφραση των ενεργοποιητικών και ανασταλτικών υποδοχέων κυττάρων ΝΚ από ποντικούς Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK. Το Σχήμα S4 δείχνει τη ρύθμιση της έκφρασης YTHDF2 με σηματοδότηση IL-15-STAT5 και την έκφραση των συστατικών των υποδοχέων IL-15, την οδό PI3K–AKT και την οδό MEK–ERK σε κύτταρα NK από Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK ποντίκια. Το Σχήμα S5 δείχνει προσδιορισμούς αλληλουχίας RNA, m6A-seq και RIP-seq σε επίπεδο μεταγραφώματος σε κύτταρα ΝΚ. Ο Πίνακας S1 παραθέτει τους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη.

Διαθεσιμότητα δεδομένων

Τα δεδομένα RNA-seq, m6A-seq και RIP-seq κατατέθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας GEO με αρ. GSE174027. Τα υπόλοιπα δεδομένα που υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα από τους αντίστοιχους συγγραφείς κατόπιν αιτήματος.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458, and CA210087), το Leukemia and Lymphoma Society ({{7}DIGENER2 για το Ινστιτούτο Καλιφόρνιας{7}Re{VID}) 9}}), και το Exceptional Project Award 2021 Breast Cancer Alliance. Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε επίσης εν μέρει από ένα βραβείο USDA (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Συνεισφορές των συγγραφέων: οι S. Ma, J. Yu και MA Caligiuri συνέλαβαν και σχεδίασαν το έργο. S. Ma, J. Yan, J. Zhang και J. Ο Yu πραγματοποίησε πειράματα ή/και αναλύσεις δεδομένων. Οι Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun και J. Chen συνεισέφεραν με αντιδραστήρια και υλική υποστήριξη. Οι S. Ma, J. Yu, J. Chen και MA Caligiuri έγραψαν, αναθεώρησαν και/ή αναθεώρησαν την εργασία. Όλοι οι συγγραφείς συζήτησαν τα αποτελέσματα και σχολίασαν το χειρόγραφο.

Αποκαλύψεις: Ο J. Chen ανέφερε "άλλο" από την Genovel BiotechCorp. εκτός της υποβληθείσας εργασίας και είναι επιστημονικός ιδρυτής της Genovel Biotech Corp. και επιστημονικός σύμβουλος φυλετικής ογκολογίας. Δεν αναφέρθηκαν άλλες αποκαλύψεις.

βιβλιογραφικές αναφορές

1.Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill και LL Lanier. 2002. Άμεση αναγνώριση του κυτταρομεγαλοϊού μέσω ενεργοποίησης και αναστολής υποδοχέων NKcell. Επιστήμη. 296:1323–1326.

2. Ayala, YM, T. Misteli, and FE Baralle. 2008. Το TDP-43 ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του αμφιβληστροειδοβλαστώματος μέσω της καταστολής της εξαρτώμενης από κυκλίνη έκφρασης κινάσης 6. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ. 105:3785–3789.

3.Barbieri, I., K. Tzelepis, L. Pandolfini, J. Shi, G. Millan-Zambrano, SC Robson, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han, et al. 2017. Το METTL3 που δεσμεύεται από τον υποκινητή διατηρεί τη μυελοειδή λευχαιμία με έλεγχο μετάφρασης που εξαρτάται από το m6A. Φύση. 552:126-131.

4.Becknell, B., and MA Caligiuri. 2005. Η ιντερλευκίνη-2, η ιντερλευκίνη-15 και οι ρόλοι τους σε ανθρώπινα φυσικά κύτταρα φονέων. Adv. Immunol. 86:209–239.

5. Bertoli, C., JM Skotheim, and RA de Bruin. 2013. Έλεγχος της μεταγραφής του κυτταρικού κύκλου κατά τις φάσεις G1 και S. Nat. Rev. ΜοΙ. Cell Biol. 14:518–528.

6.Bezman, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath και LL Lanier. Immunological Genome Project Consortium. 2012. Μοριακός ορισμός της ταυτότητας και της ενεργοποίησης των φυσικών φονικών κυττάρων. Nat. Immunol. 13:1000–1009.

7. Carson, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein και MA Caligiuri. 1994. Η ιντερλευκίνη (IL) 15 είναι μια νέα κυτοκίνη που ενεργοποιεί ανθρώπινα φυσικά κύτταρα φονέων μέσω συστατικών του υποδοχέα IL-2. J. Εχρ. Med. 180:1395–1403.

8. Carson, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann και MA Caligiuri. 1997. Ένας πιθανός ρόλος της ιντερλευκίνης-15 στη ρύθμιση της επιβίωσης των ανθρώπινων φυσικών κυττάρων φονέων. J. Clin. Επενδύω. 99:937–943.

9.Chan, CJ, MJ Smyth και L. Martinet. 2014. Μοριακοί μηχανισμοί ενεργοποίησης φυσικών κυττάρων φονέων σε απόκριση στο κυτταρικό στρες. Cell DeathDiffer. 21:5–14.

10. Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H.Wang, L. Yi, et αϊ. 2016. Συνδυαστική θεραπεία EGFR-CAR NK κυττάρων και ογκολυτικού ιού απλού έρπητα 1 για εγκεφαλικές μεταστάσεις καρκίνου του μαστού. Oncotarget. 7:27764–27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com