Ο αναγνώστης RNA M6 A YTHDF2 ελέγχει την αντικαρκινική και την αντιική ανοσία κυττάρων NK Μέρος 3

Το YTHDF2 απαιτείται για την επιβίωση των κυττάρων ΝΚ, τον πολλαπλασιασμό και τις λειτουργίες τελεστή με τη μεσολάβηση IL-15

Η IL-15 είναι μία από, αν όχι η πιο σημαντική κυτοκίνη για τις πλειοτροπικές λειτουργίες των ΝΚ κυττάρων. Εμείς και άλλοι ανακαλύψαμε προηγουμένως ότι η IL-15 παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμιση της ομοιόστασης των κυττάρων ΝΚ, της επιβίωσης και των λειτουργιών τελεστών (Becknell and Caligiuri, 2005· Carsonet al., 1997· Carson et al., 1994· Wang et al., 2019β· Yu et al., 2013).

Η πλειοτροπία των κυττάρων αναφέρεται στην ικανότητά τους να εκτελούν διαφορετικές λειτουργίες σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Η κυτταρική πλειοτροπία σχετίζεται στενά με την ανοσία επειδή πολλά κύτταρα στο ανοσοποιητικό σύστημα μπορούν να παίξουν ποικίλους διαφορετικούς ρόλους.

Στο ανοσοποιητικό σύστημα, τα Τ κύτταρα είναι ένας πολύ κρίσιμος τύπος κυττάρων. Αναγνωρίζουν και επιτίθενται στα παθογόνα, ενώ ρυθμίζουν επίσης τη δραστηριότητα άλλων κυττάρων του ανοσοποιητικού. Η πλειοτροπία των Τ κυττάρων είναι πολύ σημαντική γιατί όταν το ανοσοποιητικό σύστημα συναντά ένα νέο παθογόνο, τα Τ κύτταρα πρέπει να παίξουν διαφορετικούς ρόλους σε σύντομο χρονικό διάστημα για να ανταποκριθούν αποτελεσματικά. Για παράδειγμα, όταν το ανοσοποιητικό σύστημα αντιμετωπίζει μια βακτηριακή λοίμωξη, τα Τ κύτταρα πρέπει να παίζουν το ρόλο να σκοτώνουν τα βακτήρια και όταν το ανοσοποιητικό σύστημα αντιμετωπίζει μια ιογενή λοίμωξη, τα Τ κύτταρα πρέπει να παίζουν το ρόλο της ρύθμισης άλλων ανοσοκυττάρων.

Επιπλέον, στο ανοσοποιητικό σύστημα, μια κατηγορία κυττάρων που ονομάζονται μακροφάγα έχουν επίσης πλειοτροπικά αποτελέσματα. Μπορούν να φαγοκυτταρώσουν και να διασπάσουν ξένα παθογόνα και μπορούν επίσης να ενεργοποιήσουν άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού για να επιτεθούν σε παθογόνα. Η πλειοτροπία των μακροφάγων είναι σημαντική γιατί πρέπει να παίζουν διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Για παράδειγμα, σε ιογενείς λοιμώξεις, τα μακροφάγα πρέπει να εκκρίνουν κάποιες ουσίες για να καταπολεμήσουν τον ιό, ενώ στις βακτηριακές λοιμώξεις, τα μακροφάγα πρέπει να καταπιούν και να αφομοιώσουν τα βακτήρια για να καθαρίσουν το παθογόνο.

Συνοπτικά, υπάρχει στενή σχέση μεταξύ της κυτταρικής πλειοτροπίας και της ανοσίας. Τα πλειοτροπικά κύτταρα μπορούν να παίξουν διαφορετικούς ρόλους σε περιβάλλοντα μολυσμένα από διαφορετικά παθογόνα, ενισχύοντας έτσι την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να ανταποκρίνεται και βελτιώνοντας την ανοσία του σώματος σε διάφορα παθογόνα. Επομένως, θα πρέπει να δώσουμε προσοχή στην πλειοτροπία των κυττάρων και επίσης να ενισχύσουμε την καλλιέργεια της ανοσίας για τη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη σας

Στην τρέχουσα μελέτη, δείχνουμε ότι το IL-15 ρύθμισε προς τα πάνω τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης του YTHDF2 σε κύτταρα ΝΚ (Εικ. 6 Α και Εικ. 1, D-F). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι το YTHDF2 απαιτείται για την επιβίωση με τη μεσολάβηση της IL-15 και τις λειτουργίες τελεστή των κυττάρων ΝΚ.

Αρχικά προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε πιθανούς παράγοντες μεταγραφής κατάντη της σηματοδότησης IL-15 που ρυθμίζουν άμεσα την έκφραση YTHDF2. Αναλύσαμε την Εγκυκλοπαίδεια Στοιχείων DNA χρησιμοποιώντας το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Σάντα Κρουζ, Βάση Δεδομένων Περιήγησης Γονιδιώματος (https://genome.ucsc.edu), η οποία παρέχει προβλέψεις θέσεων δέσμευσης σε ολόκληρο το γονιδίωμα, σε συνδυασμό με το JASPAR (http://jaspar.genereg .καθαρά).

Βρήκαμε ότι το STAT5, το οποίο είναι ένας βασικός παράγοντας κατάντη του IL-15 στα κύτταρα ΝΚ, έχει τέσσερις θέσεις δέσμευσης εντός 2 kb ανάντη της τοποθεσίας έναρξης μεταγραφής (TSS) του Ythdf2, υποδεικνύοντας ότι η IL-15 μπορεί θετικά ρυθμίζουν τη μεταγραφή Ythdf2 σε κύτταρα ΝΚ ποντικού μέσω STAT5.

Χρησιμοποιώντας τον αναστολέα STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), δείξαμε ότι η αναστολή του STAT5 είχε ως αποτέλεσμα μείωση του Ythdf2 τόσο σε επίπεδα mRNA όσο και σε πρωτεϊνικά επίπεδα σε κύτταρα ΝΚ ποντικού (Εικ. S4, A και Β). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω ότι το YTHDF2 είναι ένας μεταγενέστερος παράγοντας που ρυθμίζεται από το STAT5, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια Stat5fl/fl Ncr{10}}iCre (εφεξής θα αναφέρονται ως ποντίκια Stat5ΔNK), όπου το STAT5 διαγράφεται συγκεκριμένα σε κύτταρα NK ποντικιού (Wiedemann et al., 2020).

Αντιμετωπίσαμε κύτταρα σπληνικούNK από ποντίκια Stat5WT και Stat5ΔNK με IL-15. Βρήκαμε ότι το YTHDF2 μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα ΝΚ από Stat5ΔNK ποντίκια σε σύγκριση με κύτταρα ΝΚ από ποντίκια Stat5WT τόσο στο RNA όσο και στα επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. 6, Β και C, και Εικ. S4, C και D).

Η δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης έδειξε ότι τόσο η STAT5a όσο και η STAT5b ενεργοποίησαν απευθείας τη μεταγραφή του γονιδίου Ythdf2 (Εικ. 6, D και E). Τα αποτελέσματα ανοσοκαθίζησης χρωματίνης (ChIP) – qPCR έδειξαν ότι το STAT5 έχει σημαντικό εμπλουτισμό σε τέσσερις θέσεις έναντι του φυσιολογικού ελέγχου IgG, υποδεικνύοντας άμεση δέσμευση σε NK κύτταρα ποντικού (Εικ. 6 F). Μαζί, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η έκφραση YTHDF2 ρυθμίζεται από το STAT5 κατάντη της σηματοδότησης IL-15 σε κύτταρα ΝΚ.

Στη συνέχεια αναρωτηθήκαμε εάν τα κύτταρα NK με ανεπάρκεια Ythdf2- ήταν ελαττωματικά στην απόκρισή τους στην IL-15. Απομονώσαμε σπληνικά κύτταρα ΝΚ από ποντικούς Ythdf2ΔNK και ποντίκια Ythdf2WT και καλλιεργήσαμε themin vitro παρουσία IL-15. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη των ΝΚ κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη στα ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT (Εικ. 6 G). Η σήμανση CellTrace Violet (CTV) έδειξε ότι ο πολλαπλασιασμός των ΝΚ κυττάρων ήταν μειωμένος από την ανεπάρκεια Ythdf2 (Εικ. 6 Η).

 Η ανάλυση κατανομής κυτταρικού κύκλου αποκάλυψε σημαντικά αυξημένο κλάσμα ΝΚ κυττάρων από ποντικούς Ythdf2ΔNK στη φάση G0/G1 αλλά ένα σημαντικά μειωμένο κλάσμα NK κυττάρων από ποντίκια Ythdf2ΔNK στη φάση S (Εικ. 6 I), υποδηλώνοντας ότι τα αποτελέσματα της ανεπάρκειας Ythdf2 σε διακοπή φάσης G0/G1 σε κύτταρα ΝΚ.

Επιπλέον, υπήρξε διπλάσια αύξηση στα αποπτωτικά (αννεξίνη V+Sytox-Blue+/−) ΝΚ κύτταρα από ποντικούς Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με αυτά από ποντίκια Ythdf2WT (Εικ. 6 J), υποδεικνύοντας την ελαττωματική επιβίωση των ΝΚ κυττάρων μετά την απώλεια Ythdf2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το YTHDF2 ρυθμίζει την ανταπόκριση των NK κυττάρων στην IL-15 in vitro. Δεδομένου ότι η IL{10}} μεταφράζεται ελάχιστα και εκκρίνεται in vivo σε σταθερή κατάσταση (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), για να διερευνηθεί εάν τα ανεπαρκή NK κύτταρα Ythdf2-είναι ελαττωματικά στην απόκρισή τους σε IL-15 in vivo, αντιμετωπίσαμε ποντίκια με IL-15.

Διαπιστώσαμε ότι τα Ythdf2-ελλιπή έναντι των WT NK κύτταρα έδειξαν σημαντικά μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αυξημένη κυτταρική απόπτωση όταν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με IL-15 (Εικ. 6 K και Εικ. S4, E-J). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι το YTHDF2 ρυθμίζει την ανταπόκριση των ΝΚ κυττάρων στην IL-15, ειδικά υπό ορισμένες συνθήκες με υψηλό επίπεδο IL-15. Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης της IFN-, του γρανζύμου Β και της περφορίνης μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα NKYthdf2ΔNK σε σύγκριση με τα κύτταρα NK Ythdf2WT σε απόκριση στο IL{10}} (Εικ. 6, L-N), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 συμβάλλει επίσης στις λειτουργίες τελεστών ΝΚ κυττάρων που μεσολαβούνται από την IL-15 in vitro.

Συλλογικά, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι το YTHDF2 απαιτείται για την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τις δραστικές λειτουργίες των κυττάρων ΝΚ με τη μεσολάβηση IL-15. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τους μεταγενέστερους μηχανισμούς με τους οποίους το YTHDF2 ρυθμίζει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη λειτουργία του τελεστή NK με τη μεσολάβηση IL-15. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα ΝΚ από ποντίκια Ythdf2ΔNKMice και Ythdf2WT είχαν παρόμοια επίπεδα των υποδοχέων IL-15 CD122 (IL-15R) και CD132 (IL-15R c· Εικ. S4 K). Η σηματοδότηση IL{12}} διαμεσολαβείται από τουλάχιστον τρία κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης σε κύτταρα NK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR και JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Για να διερευνήσουμε ποια οδός σηματοδότησης ρυθμίζεται από το YTHDF2 σε κύτταρα ΝΚ, εξετάσαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των κυττάρων ERK, AKT, S6, STAT3 και STAT5 inNK από ποντικούς Ythdf2ΔNK ή ποντικούς Ythdf2WT μετά από διέγερση με IL-15.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανεπάρκεια Ythdf2 δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση ERK, AKT, S6 και STAT3 κατά τη διέγερση της IL (Εικ. S4, L και M), αλλά ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση STAT5, όπως αποδεικνύεται από τα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης της STAT5 στο Ythdf{{ 7}}ελλειμματικά κύτταρα ΝΚ από αυτά σε κύτταρα ΝΚ από ποντίκιαYthdf2WT (Εικ. 6 O), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 απαιτείται για τη βέλτιστη σηματοδότηση IL-15/STAT5 σε ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚ.

Επειδή δείξαμε ότι το φωσφορυλιωμένο STAT5 κατάντη της IL-15συνδέεται με τον υποκινητή του Ythdf2 (Εικ. 6, D-F) και εδώ αποδείξαμε ότι το YTHDF2 απαιτείται για τη βέλτιστη φωσφορυλίωση STAT5, τα δεδομένα μας προτείνουν έναν βρόχο θετικής ανάδρασης STAT5-YTHDF2 προς τα κάτω της IL-15 που μπορεί να ελέγξει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τις λειτουργίες τελεστών ΝΚ κυττάρων.

Η ανάλυση σε επίπεδο μεταγραφήματος προσδιορίζει το Tardbp ως στόχο YTHDF2 σε κύτταρα ΝΚ

Για να αντιμετωπιστεί ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο το YTHDF2 ρυθμίζει τα κύτταρα ΝΚ, εκτελέσαμε πρώτα τον προσδιορισμό αλληλουχίας RNA (seq) σε IL-2–διευρυμένα κύτταρα Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK NK. Η διαγραφή του Ythdf2 σε κύτταρα ΝΚ οδήγησε σε 617 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων 252 γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω και 365 γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα κάτω (Εικ. S5 A).

Η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (GO) έδειξε ότι τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε διαδικασίες κυτταρικού κύκλου, κυτταρικής διαίρεσης και κυτταρικής διαίρεσης, συμπεριλαμβανομένης της μιτωτικής κυτοκίνησης, του διαχωρισμού χρωμοσωμάτων, της ατράκτου, του νουκλεοσώματος, του μέσου σώματος και του χρωμοσώματος (Εικ. 7). ΕΝΑ).

Η ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) έδειξε σημαντικό εμπλουτισμό των στόχων E2F, των συνόλων γονιδίων χαρακτηριστικών σημάτων G2/Mcheckpoint και μιτωτικής ατράκτου σε κύτταρα Ythdf2ΔNKNK (Εικ. S5 B). Τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και την κυτταρική διαίρεση, συμπεριλαμβανομένων των Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 και Plk1 (Bertoli et al., 2013), μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα ΝΚ από ποντίκια Ythdf2ΔNK (Εικ. ).

Τα γονίδια διαχωρισμού ατράκτου και χρωμοσωμάτων όπως Anln, Aspm, Birc5, Bubb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 και Tpx2 (Gorbsky, 2015) επίσης ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω σε κύτταρα NK από ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με κύτταρα NKWT από Ythdf.

Επιπλέον, τα γονίδια κυτταρικής επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένων των Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) και Rffl (Yanget al., 2007), μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα ΝΚ από ποντίκιαYthdf2ΔNK (Εικ. 7 Δ). Τα γονίδια λειτουργίας τελεστών κυττάρων ΝΚ, συμπεριλαμβανομένων των Klrk1, Ncr1, CD226 και Gzma (Bezman et al., 2012), επίσης υπορυθμίστηκαν σημαντικά σε κύτταρα ΝΚ από ποντικούς Ythdf2ΔNK (Εικ. 7 D).

Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τους χαρακτηρισμένους ρόλους μας του YTHDF2 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΚ, της επιβίωσης και των λειτουργιών τελεστών. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε m6A-seq σε IL-2–διευρυμένα NK κύτταρα από Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK ποντίκια. Η ανάλυση του κύριου συστατικού έδειξε ότι τρία βιολογικά αντίγραφα κάθε γονότυπου συγκεντρώθηκαν μαζί (τα δεδομένα δεν φαίνονται), υποδηλώνοντας καλή επαναληψιμότητα των δειγμάτων m6A-seq.

Η ανάλυση υπεργεωμετρικής βελτιστοποίησης εμπλουτισμού μοτίβου (HOMER) εντόπισε το συναινετικό μοτίβο m6A (GGAC), υποδεικνύοντας τον επιτυχή εμπλουτισμό των τροποποιημένων μεταγραφών m6A (Εικ. 7 Ε). Οι τροποποιήσεις m6A εντοπίστηκαν κυρίως σε μεταγραφές που κωδικοποιούν πρωτεΐνη και οι κορυφές εμπλουτίστηκαν στις 59 αμετάφραστες περιοχές (UTR) και 39UTR, ειδικά γύρω από τα κωδικόνια έναρξης και λήξης (Εικ. 7 F και Σχήμα S5 C).

Η ανάλυση εμπλουτισμού με GO των γονιδίων με κορυφές m6A αποκάλυψε ότι οι περισσότερες μεταγραφές με σήμανση m6A σε κύτταρα ΝΚ εμπλουτίστηκαν σε μονοπάτια που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com