Ο αναγνώστης RNA M6 A YTHDF2 ελέγχει την αντικαρκινική και την αντιική ανοσία κυττάρων NK Μέρος 2

Το YTHDF2 απαιτείται για την αντιική λειτουργία των ΝΚ κυττάρων

Για να προσδιορίσουμε εάν η ανεπάρκεια Ythdf2 επηρεάζει την αντιϊκή δράση των ΝΚ κυττάρων, εγχύαμε 2,5 × 104 PFU MCMV σε ποντίκια Ythdf2WT και ποντίκια Ythdf2ΔNK.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ποντίκια Ythdf2ΔNK ήταν πιο ευαίσθητα στη μόλυνση από MCMV, όπως φαίνεται από σημαντική απώλεια βάρους και αυξημένους τίτλους ιών στο αίμα, τον σπλήνα και το ήπαρ σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT (Εικ. 3, Α και Β και Εικ. S2, Α και Β) .

Παρατηρήσαμε επίσης σημαντική μείωση στο ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των συνολικών NK κυττάρων στον σπλήνα και στο αίμα των ποντικών Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με εκείνα σε ποντικούς Ythdf2WT μετά τη μόλυνση (Εικ. 3, C και D, και Σχ. S2, C και D). Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι τα κύτταρα ΝΚ από ποντικούςYthdf2ΔNK είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση του Ki67 από τα ποντίκια Ythdf2WT (Εικ. 3, E-G).

Ωστόσο, η βιωσιμότητα των κυττάρων ΝΚ ήταν παρόμοια μεταξύ των ποντικών Ythdf2WT και των ποντικών Ythdf2ΔNK, όπως φαίνεται από τη χρώση με αννεξίνη V (Εικ. S2 E). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια του YTHDF2 σε κύτταρα ΝΚ έχει ως αποτέλεσμα ένα ελάττωμα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρά στην επιβίωση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ιογενούς μόλυνσης. Τα NK κύτταρα αναστέλλουν τη μόλυνση από MCMV μέσω των ενεργοποιητικών υποδοχέωνLy49H και Ly49D και η διαδικασία χαρακτηρίζεται από μια αντιική απόκριση που προκαλείται από περφορίνη ή IFN (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Or. et al., 2010, Sumaria et al., 2009).

Βρήκαμε ότι τα ποντίκια Ythdf2ΔNK είχαν σημαντικά μειωμένα κύτταρα Ly49H+ και Ly49D+ NK στη σπλήνα και στο αίμα σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT μετά τη μόλυνση (Εικ. 3, H–J και Εικ. S2, F–K).

Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι αν και ανά ποσοστό, μόνο τα κύτταρα Ly49D+Ly49H+ έδειξαν διαφορά στα ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT, οι απόλυτοι αριθμοί κυττάρων των Ly49D−Ly49H+ NK κυττάρων, Ly49D+Ly49H− NKD+Ly49 κυττάρων και LY49 ο σπλήνας και το αίμα ήταν όλα σημαντικά μειωμένα στα ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με τα Ythdf2WTποντίκια μετά τη μόλυνση (Εικ. S2, L–W).

Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι ο έλεγχος της μόλυνσης από MCMV από το YTHDF2 φαίνεται να μεσολαβείται κυρίως από κύτταρα Ly49D+Ly49H+ NK. Η παραγωγή γρανζύμου Β και IFN- από κύτταρα ΝΚ σε ποντικούς Ythdf2ΔNK ήταν συγκρίσιμη με αυτή των ποντικών Ythdf2WT (Εικ. S2, X και Y).

Βρήκαμε σημαντικά μειωμένη παραγωγή περφορίνης από ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με αυτή των ποντικών Ythdf2WT τόσο στον σπλήνα όσο και στο αίμα 7 ημέρες μετά τη μόλυνση (Εικ. 3, K-M), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 επηρεάζει κυρίως την αντιϊκή δράση με τη μεσολάβηση της σπερφορίνης έναντι του MCMV στα κύτταρα ΝΚ. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι το YTHDF2 είναι κρίσιμο για την επέκταση των κυττάρων ΝΚ και τη λειτουργία του τελεστή κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από MCMV.

Το YTHDF2 ελέγχει την ομοιόσταση των ΝΚ κυττάρων και την τελική ωρίμανση σε σταθερή κατάσταση

Τα παραπάνω ευρήματα ότι η ανεπάρκεια Ythdf2 σε κύτταρα ΝΚ ενίσχυσε τις μεταστάσεις όγκου και βλάπτει την ικανότητα των κυττάρων ΝΚ να ελέγχουν τη μόλυνση από MCMV μας ενθάρρυναν να διερευνήσουμε εάν το YTHDF2 απαιτείται για τη διατήρηση των ΝΚ κυττάρων σε σταθερή κατάσταση.

Όπως φαίνεται στην Εικ. 4 Α, η συχνότητα και ο απόλυτος αριθμός των ΝΚ κυττάρων μειώθηκαν σημαντικά στο περιφερικό αίμα, τον σπλήνα, το ήπαρ και τον πνεύμονα αλλά όχι στον μυελό των οστών (BM) των ποντικών Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT.

Ωστόσο, δεν υπήρξαν σημαντικές αλλαγές μεταξύ των κοινών λεμφοειδών προγόνων, των προγονικών κυττάρων προ-ΝΚ και των εκλεπτυσμένων προγονικών κυττάρων ΝΚ (NKP) στο BM (Fathman et al., 2011) μεταξύ Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK ποντικών (Εικ. S3 A), υποδεικνύοντας ότι Το YTHDF2 μπορεί να μην επηρεάσει την πρώιμη ανάπτυξη των ΝΚ κυττάρων στο μοντέλο μας.

Για να διερευνήσουμε τους πιθανούς μηχανισμούς που ευθύνονται για τη μείωση των κυττάρων ΝΚ σε ποντικούς Ythdf2ΔNK, διερευνήσαμε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη βιωσιμότητα και την ικανότητα διακίνησης κυττάρων ΝΚ μετά τη διαγραφή του Ythdf2 σε σταθερή κατάσταση. Το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων ΝΚ κυττάρων ήταν συγκρίσιμο μεταξύ ποντικών Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK, όπως αποδεικνύεται από τη χρώση Ki67 (Εικ. S3 B).

Η βιωσιμότητα των NKcells ήταν επίσης ισοδύναμη μεταξύ ποντικών Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK, όπως φαίνεται από τη χρώση με αννεξίνη V (Εικ. S3 C). Για να ελεγχθεί εάν το YTHDF2 επηρεάζει την έξοδο των ΝΚ κυττάρων από το BM στην περιφέρεια, τα ποντίκια Ythdf2WT και Ythdf2ΔNK εγχύθηκαν ενδοφλεβίως με ένα αντίσωμα antiCD45 για να επισημάνουν τα ανοσοκύτταρα και θυσιάστηκαν μετά από 2 λεπτά και τα ΒΜ κύτταρα τους αναλύθηκαν.

Αυτό μας επέτρεψε να ποσοτικοποιήσουμε τον αριθμό των ΝΚ κυττάρων στις ημιτονοειδείς έναντι των παρεγχυματικών περιοχών του ΒΜ, ένας δείκτης διακίνησης ΝΚ κυττάρων από ΒΜ στο περιφερικό αίμα σε σταθερή κατάσταση (Leong et al., 2015). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση στη συχνότητα των CD45+ NK κυττάρων σε ποντίκια Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με τα ποντίκια Ythdf2WT στα ημιτόνια (Εικ. 4 B), υποδεικνύοντας ότι η ανεπάρκεια Ythdf2 επηρεάζει την έξοδο των κυττάρων ΝΚ από το BM στο σύστημα κυκλοφορίας in vivo .

Τα ανοσοκύτταρα υφίστανται ομοιοστατικό πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της λεμφοπενίας που προκαλείται από ορισμένες ιογενείς λοιμώξεις ή προκαλείται από χημειοθεραπεία (Sun et al., 2011). Αν και διαπιστώσαμε ότι το YTHDF2 είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των ΝΚ κυττάρων σε σταθερή κατάσταση, παρατηρήσαμε σημαντική μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από MCMV (Εικ. 3, E-G). Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε τον ρόλο του YTHDF2 στη ρύθμιση του ομοιοστατικού πολλαπλασιασμού των ΝΚ κυττάρων σε ένα λεμφοπενικό περιβάλλον in vivo.

Συνμεταφέραμε ίσο αριθμό σπληνικών κυττάρων ΝΚ από ποντίκια CD45.2 Ythdf2ΔNK ή συγγενή ποντίκια CD45.1 σε ποντίκια Rag2−/−Il2rg−/− με έλλειψη λεμφοκυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων ΝΚ προήλθε από ποντίκια ελέγχου CD45.1WT παρά από ποντίκια CD45.2 Ythdf2ΔNK την ημέρα 3 μετά τη μεταφορά κυττάρων (Εικ. S3 D).

Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η μείωση των κυττάρων ΝΚ από ποντικούς Ythdf2ΔNK οφειλόταν σε εξασθενημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. S3 E) αλλά όχι σε απόπτωση κυττάρων (Εικ. S3 F), υποδηλώνοντας ότι το YTHDF2 οδηγεί τον ομοιοστατικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΝΚ in vivo υπό λεμφοπενικές συνθήκες.

Περαιτέρω διαφοροποίηση των κυττάρων ΝΚ ποντικού μπορεί να ταξινομηθεί σε ανώριμα (CD11b-CD27+), ενδιάμεσα ώριμα (CD11b+CD27+) και τελικά ώριμα (CD11b+CD27-) στάδια με βάση τα επίπεδα CD11b και CD27 ( Chiossone et al., 2009· Geiger and Sun, 2016).

Βρήκαμε ότι η έκφραση Ythdf2 αυξήθηκε με την ωρίμανση και ότι τα CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− εμφάνισαν τα χαμηλότερα, ενδιάμεσα και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Ythdf2, αντίστοιχα (Εικ. S3 G), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 μπορεί να εμπλέκεται στην ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε τον ρόλο του YTHDF2 στην ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ που ορίζεται από τους δείκτες επιφανείας των κυττάρων CD11b και CD27.

Βρήκαμε ότι η απώλεια του Ythdf2 σε NK κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στη συχνότητα των τελικών ώριμων ΝΚ κυττάρων και/ή αύξηση των ανώριμων και ενδιάμεσων ώριμων ΝΚ κυττάρων στον σπλήνα, το ήπαρ, τον πνεύμονα και το αίμα, αλλά όχι στη ΒΜ (Εικ. 4 C και Εικ. S3 H), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 ρυθμίζει θετικά την ωρίμανση των τερματικών ΝΚ κυττάρων. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, τα επίπεδα του KLRG1, που είναι ο τελικός δείκτης ωρίμανσης των κυττάρων ΝΚ, ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ποντίκια Ythdf2ΔNK στον σπλήνα, το ήπαρ και τον πνεύμονα, αλλά όχι με το BM σε σύγκριση με αυτό των ποντικών Ythdf2WT στα αντίστοιχα όργανα ή διαμερίσματα ιστού (Εικ. 4 Δ).

Για να προσδιορίσουμε εάν ο μειωμένος αριθμός ώριμων κυττάρων ΝΚ από την έλλειψη Ythdf2 είναι εγγενής, δημιουργήσαμε χίμαιρες σε ποντίκια Rag2−/−Il2rg−/− με έγχυση ΒΜ κυττάρων από ποντίκια CD45.1 WT και CD45.2 Ythdf2ΔNK, αναμεμειγμένα σε 1:1 αναλογία. Όπως φαίνεται από την κυτταρομετρία ροής σε 8 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, μια μειωμένη αναλογία τερματικών ώριμων ΝΚ κυττάρων προήλθε από κύτταρα CD45.2 Ythdf2ΔNK BM από εκείνα από κύτταρα ελέγχου CD45.1 WT (Εικ. 4 Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι η τελική ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ ελέγχεται από το YTHDF2 είναι ενδοκυτταρικό.

Οι παράγοντες μεταγραφής T-box Eomes και Tbet είναι κρίσιμοι για την ωρίμανση των NKcell (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012). Η ενδοκυτταρική χρώση αποκάλυψε σημαντική μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης των Eomes σε κύτταρα ΝΚ από ποντικούς Ythdf2ΔNK σε σύγκριση με ποντικούς Ythdf2WT (Εικ. S3 I). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης και mRNA των Eomes συνέβη ειδικά σε τερματικά ώριμα (CD11b+CD27-) ΝΚ κύτταρα (Εικ. S3, J-L).

Ωστόσο, σε αντίθεση με το Eomes, η έκφραση του Tbet ήταν ισοδύναμη σε κύτταρα ΝΚ μεταξύ ποντικών Ythdf2ΔNK και Ythdf2WT (Εικ. S3, I και K), υποδεικνύοντας ότι το YTHDF2 πιθανώς ρυθμίζει την τελική ωρίμανση των NKcell στοχεύοντας το Eomes.