Η Προστατευτική Επίδραση των Cistanches Herba στη μυοτοξικότητα που προκαλείται από στατίνες in vitro
Mar 24, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
ένα Ινστιτούτο Κινεζικής Ιατρικής, Το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Σατίν, Νέες Περιοχές, Χονγκ Κονγκ
β State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong
γ Τομέας Κλινικής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής και Θεραπευτικής, Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Σατίν, Νέες Περιοχές, Χονγκ Κονγκ
Αφηρημένη:
Εθνοφαρμακολογική συνάφεια: HerbaΚιστανάκια(HC,Cistanchedeserticola, ήCistancheσωληνοειδής) είναι ένα κινέζικο βότανο που χρησιμοποιείται παραδοσιακά για μυϊκά προβλήματα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το εκχύλισμα HC θα μπορούσε να μειώσει τη μυϊκή βλάβη και να βελτιώσει την αποθήκευση ATP σε αρουραίους μετά την άσκηση. Ωστόσο, η επίδρασή του στη μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από στατίνες δεν έχει ποτέ διερευνηθεί.
Σκοπός:Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί εάν το υδατικό εκχύλισμα HC (HCE) θα μπορούσε να αποτρέψει την επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη τοξικότητα σε κύτταρα σκελετικών μυών αρουραίου L6 και εάν η βερμπασκοσίδη είναι το κύριο βιοδραστικό συστατικό που συμβάλλει στις επιδράσεις
Υλικά και μέθοδοι:Πραγματοποιήθηκε ΜΤΤ για τον προσδιορισμό των επιδράσεων του HCE ({0}}-2000 mg/ml) ή της βερμπασκοσίδης (0-160 mM) σε κύτταρα L6 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σιμβαστατίνη (10 mM). Η δοκιμασία απόπτωσης αννεξίνης V-FITC/PI και η δοκιμασία κασπάσης 3 πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί ο προστατευτικός ρόλος του HCE στον επαγόμενο από τη σιμβαστατίνη κυτταρικό θάνατο και για να αξιολογηθεί εάν το HCE άσκησε την προστατευτική του δράση μέσω της οδού κασπάσης. Η παραγωγή ATP μετρήθηκε για να διερευνηθεί εάν το HCE θα μπορούσε να αποτρέψει τη μείωση που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη στην παραγωγή ATP in vitro.
Αποτελέσματα:Η σιμβαστατίνη αύξησε σημαντικά τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα L6. Το HCE άσκησε σημαντικά μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επαγόμενα από τη σιμβαστατίνη αποπτωτικά κύτταρα, πιθανώς μέσω μιας οδού κασπάσης-3. Η σιμβαστατίνη μείωσε την παραγωγή ΑΤΡ στα κύτταρα L6, η οποία προλήφθηκε δοσοεξαρτώμενα από το HCE. Υπήρχε μόνο μια τάση αλλά όχι σημαντική επίδραση (εκτός από υψηλή δόση) της βερμπασκοσίδης στην προστασία της μυϊκής τοξικότητας που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη.
Συμπεράσματα:Συμπερασματικά, δείξαμε για πρώτη φορά ότι το HCE θα μπορούσε να ασκήσει μια δοσοεξαρτώμενη προστατευτική επίδραση στην επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη τοξικότητα in vitro, η οποία ήταν απίθανη λόγω της παρουσίας βερμπασκοσίδης. Η μελέτη μας πρότεινε την πιθανή χρήση του HC υπό την κατάσταση της μυϊκής τοξικότητας που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη.
Λέξεις-κλειδιά:HerbaΚιστανάκια, ΣτατίνηΧοληστερόλη, Υπερλιπιδαιμία, Μυϊκή τοξικότητα, Βερμπασκοσίδη, Κασπάση-3
1. Εισαγωγή
Οι αναστολείς αναγωγάσης HMG-CoA (στατίνες), που είναι η κατηγορία συνταγογραφούμενων φαρμάκων με τις μεγαλύτερες πωλήσεις στον κόσμο στην ιστορία, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι είναι ωφέλιμοι σε ασθενείς και των δύο φύλων σε διαφορετικές ηλικίες με μέτριο και υψηλό κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου (CVD) (Golomb και Evans, 2008). Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν και εγκρίθηκαν κλινικά διαφορετικές στατίνες, συμπεριλαμβανομένων της πραβαστατίνης, ατορβαστατίνης, φλουβαστατίνης, λοβαστατίνης, πιταβαστατίνης, ροσουβαστατίνης και σιμβαστατίνης. Γενικά, όλες οι στατίνες δρουν μέσω της αναστολής της αναγωγής του HMG-CoA σε μεβαλονικό οξύ κατά το πρώιμο στάδιο της οδού μεβαλονικού για τη μείωση της παραγωγής χοληστερόλης (Kromer and Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). Αν και οι στατίνες είναι συνήθως καλά ανεκτές, μία από τις πιο σημαντικές και γνωστές κλινικές ανεπιθύμητες ενέργειες είναι η τοξικότητα των σκελετικών μυών (ραβδομυόλυση) (Kobayashi et al., 2008). Οι ανωμαλίες των σκελετικών μυών μπορεί να κυμαίνονται από καλοήθη μυαλγία έως σοβαρή μυοπάθεια. Ενώ προτείνεται ένας συνδυασμός μηχανισμών και θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για τις μυϊκές αρνητικές επιπτώσεις της στατίνης, οι μιτοχονδριακοί μηχανισμοί πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο (Golomb and Evans, 2008). Το μεβαλονικό δεν είναι μόνο πρόδρομος της χοληστερόλης, αλλά και για άλλες ενώσεις συμπεριλαμβανομένων των σεληνοπρωτεϊνών, της δολιχόλης και της ουβικινόνης (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). Η ικανότητα των στατινών να αναστέλλουν το μεβαλονικό θα ανέστειλε επίσης την παραγωγή σεληνοπρωτεϊνών όπως η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx), που είναι σημαντικά ένζυμα στη διατήρηση του αντιοξειδωτικού αμυντικού μηχανισμού (Kromer and Moosmann, 2009). Οι στατίνες θα μπορούσαν επίσης να οδηγήσουν σε εξάντληση της ουβικινόνης, προκαλώντας μείωση της κατανάλωσης οξυγόνου και της σύνθεσης του ATP (Beltowski et al., 2009). Επιπλέον, αυξανόμενες in vitro και in vivo μελέτες έδειξαν ότι η στατίνη θα μπορούσε επίσης να δράσει άμεσα στα μιτοχόνδρια των ιστών για να επάγει τη μετάβαση της διαπερατότητας της μεμβράνης που εξαρτάται από το Ca2þ (MPT) με τρόπο δοσοεξαρτώμενο (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006 ). Συνδέεται επίσης με αυξημένα είδη αντιδρώντος οξυγόνου (ROS) και μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο και ως εκ τούτου συμβάλλει σε ηπατική και μυϊκή βλάβη (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
HerbaΚιστανάκια, ολόκληρο το αποξηραμένο φυτό του Cistanche deserticola YC Ma, ή το Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (οικογένεια Orobanchaceae), είναι παρασιτικά φυτά που αναπτύσσονται κυρίως στις ερημικές περιοχές της βόρειας και βορειοανατολικής Κίνας (Siu and Ko, 2010).HerbaΚιστανάκιαείναι ένα κινέζικο τονωτικό βότανο που τονώνει το Yang που χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας με συμπτώματα όπως ανικανότητα, στειρότητα, πρόωρη εκσπερμάτιση. Η βαριά και πηχτή φύση του βοτάνου ενυδατώνει επίσης τα έντερα και βοηθά στην ανακούφιση της δυσκοιλιότητας. Είναι επίσης ένα κινέζικο βότανο που παραδοσιακά συνταγογραφείται σε ασθενείς για πόνο στην οσφύ και στα γόνατα και είναι ένα βότανο που χρησιμοποιείται συνήθως σε κινεζικά σκευάσματα για τη θεραπεία μυϊκών προβλημάτων (Siu and Ko, 2010· Xiong et al., 1998). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτό είναι επίσης συνεπές με τις σύγχρονες επιστημονικές μελέτες που απέδειξαν τις δράσεις κατά της κούρασης ενός πλούσιου σε πολυσακχαρίτες και πλούσιου σε φαινυλαιθανοειδή εκχυλίσματοςHerbaΚιστανάκιασε αρουραίους μετά την άσκηση μειώνοντας τη μυϊκή βλάβη και βελτιώνοντας την αποθήκευση ATP (Cai et al., 2010). Πρόσφατη εργασία έδειξε ότι ένα μεθανολικό εκχύλισμα Herba Cistanches θα μπορούσε να ενισχύσει την παραγωγή μιτοχονδριακού ATP (Leung and Ko, 2008). Οι Siu και Ko (2010) απέδειξαν ότιHerbaΚιστανάκιαθα μπορούσε επίσης να ενισχύσει την κατάσταση της μιτοχονδριακής γλουταθειόνης διαμεσολαβώντας τα επίπεδα σύνθεσης γλουταθειόνης και GPx, προστατεύοντας έτσι τους ιστούς από το οξειδωτικό στρες στις καρδιές των αρουραίων. Οι Siu και Ko (2010) έδειξαν επίσης ότιHerbaΚιστανάκιαθα μπορούσε να μειώσει το μιτοχονδριακό περιεχόμενο Ca2þ, μειώνοντας έτσι το MPT που εξαρτάται από το Ca2þ. Επί πλέον,HerbaΚιστανάκιααποδείχθηκε επίσης ότι είναι ισχυρό αντιοξειδωτικό και δεσμευτής ελεύθερων ριζών σε διάφορα όργανα, μειώνοντας το οξειδωτικό στρες και τις δραστηριότητες των ROS in vivo μελέτες (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). Πιο ενδιαφέρον, σε μια προσπάθεια να προσδιοριστεί το ενεργό κλάσμα που συμβάλλει στην αντι-κόπωση δράση τουHerbaΚιστανάκια, βρέθηκε ότι η βερμπασκοσίδη ήταν το κύριο συστατικό στο ενεργό κλάσμα (Cai et al., 2010). Η βερμπασκοσίδη είχε επίσης αποδειχθεί ότι μειώνει τη μυϊκή κόπωση σε φρύνους, πιθανώς λόγω των αντιοξειδωτικών της δράσεων (Liao et al., 1999), υποδηλώνοντας ότι η βερμπασκοσίδη θα μπορούσε να είναι το βιοδραστικό συστατικό που συμβάλλει στις ευεργετικές επιδράσεις του Herba Cistanches.
Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί εάν η χρήση φυτικού υδατικού εκχυλίσματος Cistanches (HCE) θα μπορούσε να μειώσει τη μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη in vitro. Υποτέθηκε ότι η χρήση του HCE θα μπορούσε να διορθώσει τις παρενέργειες της μυϊκής τοξικότητας που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη. Έγινε επίσης προσπάθεια να προσδιοριστεί εάν οι ευεργετικές επιδράσεις τουHerbaΚιστανάκιααποδίδονται στην παρουσία βερμπασκοσίδης.
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Έλεγχος ταυτότητας και προετοιμασία φυτικών υλικών
Ακατέργαστη φυτική ύλη απόHerbaΚιστανάκιααγοράστηκε από έναν διάσημο προμηθευτή στο Guangzhou της Κίνας.HerbaΚιστανάκιαεπαληθεύτηκε χημικά με χρήση χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) σύμφωνα με την Κινεζική Φαρμακοποιία (CP), 2010, με τη βερμπασκοσίδη και την εχινακοσίδη ως χημικούς δείκτες (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Μετά από χημικό έλεγχο ταυτότητας, δείγμα κουπονιού βοτανικούHerbaΚιστανάκιακατατέθηκε στο Μουσείο του Ινστιτούτου Κινεζικής Ιατρικής στο Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (CUHK), με αριθμό δείγματος κουπονιού 2014–3434.
Εν συντομία, 1 kg ακατέργαστου βοτάνου εμποτίστηκε για 1 ώρα, ακολουθούμενη από εκχύλιση δύο φορές με θέρμανση για 1 ώρα υπό αναρροή στους 100 βαθμούς χρησιμοποιώντας 10 απεσταγμένο νερό για κάθε εκχύλιση. Τα υδατικά εκχυλίσματα (HCE) συνδυάστηκαν και διηθήθηκαν. Το διήθημα συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση στους 60 βαθμούς. Το συμπυκνωμένο εκχύλισμα λυοφιλίστηκε μέχρι ξηρού. Το ποσοστό απόδοσης ήταν 50,1 τοις εκατό β/β. Μια μικρή ποσότητα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποσότητας βερμπασκοσίδης και εχινακοσίδης χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης (UPLC). Όλη η εκχυλισμένη σκόνη συσκευάστηκε υπό κενό και αποθηκεύτηκε μέχρι τη χρήση.
2.2. Ανάλυση UPLC του υδατικού εκχυλίσματος
Οι αναλύσεις UPLC πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Waters Acquity Ultra Performance LC (Waters, ΗΠΑ). Όλοι οι διαλύτες που απαιτούνται για τις αναλύσεις UPLC αγοράστηκαν από το Τμήμα Χημείας του Κινεζικού Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. Η βερμπασκοσίδη και η εχινακοσίδη αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο για τον Έλεγχο Φαρμακευτικών και Βιολογικών Προϊόντων, Κίνα. Το διάλυμα δείγματος εγχύθηκε σε στήλη Waters Acquity UPLC BEH C18 (10{{20}} 2,1 mm2 id, μέγεθος σωματιδίων 1,7 mm) με Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column ( 5-2.1 mm2 id, μέγεθος σωματιδίων 1,7 mm). Όλοι οι διαλύτες προδιηθήθηκαν με 0.45 mm δίσκο φίλτρου Millipore (Millipore) και απαερώθηκαν. Η έκλουση βαθμίδωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα συστήματα διαλυτών: κινητή φάση Α – ακετονιτρίλιο. κινητή φάση Β – διπλά απεσταγμένο νερό/μυρμηκικό οξύ (99.9/ 0.1; v/v). Η έκλουση πραγματοποιήθηκε με μια διαδικασία βαθμίδωσης ως εξής: 0-5 λεπτά, 88 τοις εκατό Β. 5–10 λεπτά, από 88 τοις εκατό Β έως 83 τοις εκατό Β. Ο ρυθμός ροής που χρησιμοποιήθηκε ήταν 0,4 ml/min και η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε στα 331 nm σύμφωνα με το CP (2010). Κάθε δείγμα (5 μΙ) εγχύθηκε στη στήλη μετά από διήθηση μέσω διηθητικού δίσκου 0,2 mm. Η ταυτοποίηση των χημικών δεικτών πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας τους χρόνους κατακράτησης και την απορρόφηση UV των άγνωστων κορυφών με εκείνες των προτύπων. Μια καμπύλη βαθμονόμησης σχεδιάστηκε με μια σειρά συγκεντρώσεων βερμπασκοσίδης και εχινακοσίδης (40, 20, 10, 5, 2,5 και 1,25 mg/ml) για ποσοτικοποίηση. Η ποσοτικοποίηση της βερμπασκοσίδης και της εχινακοσίδης εντός του εκχυλίσματος βοτάνων πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Το σύστημα παρακολουθήθηκε από έναν υπολογιστή εξοπλισμένο με το λογισμικό Waters MassLynx για συλλογή δεδομένων, ενοποίηση και ανάλυση.
2.3. Κυτταρικής καλλιέργειας
Η κυτταρική σειρά σκελετικών μυών αρουραίου L6 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υποσυρρέουσα πυκνότητα σε Dulbecco'sModifified Eagle's Medium (DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό v/v εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (P/S) και επωάστηκε στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό αέρα.
Για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις του HCE στη μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από στατίνες, τα κύτταρα L6 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη σε 10 μΜ για 48 ώρες για να προκληθεί τοξικότητα. HCE (σε συγκεντρώσεις 0, 250, 500, 1000 και 2000 ug/ml) ή βερμπασκοσίδης (σε συγκεντρώσεις 0, 20, 40, 80 και 160 μM) προστέθηκαν ως συν-θεραπεία με στατίνη για να προσδιοριστεί εάν η Το φυτικό εκχύλισμα θα μπορούσε να αποτρέψει την τοξικότητα που προκαλείται από τις στατίνες στα κύτταρα των σκελετικών μυών και ότι εάν η βερμπασκοσίδη θα μπορούσε να ασκήσει παρόμοια προστατευτικά αποτελέσματα με το φυτικό υδατικό εκχύλισμα.
Το εκχύλισμα Herba Cistanche προστατευτική επίδραση στην τοξικότητα που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη in vitro
2.4. Κυτταροτοξικότητα in vitro
Κυψέλες L6 (1x105/καλά 0–2000 ug/ml) ή βερμπασκοσίδη (0–160 μM), για 48 ώρες. Στα φρεάτια ελέγχου προστέθηκε απλό μέσο (DMEM). Το φυτικό εκχύλισμα και η ένωση διαλύθηκαν σε DMEM.
Μετά την 48ωρη θεραπεία, το μέσο από όλα τα κύτταρα απορρίφθηκε και 30 ul 5 mg/ml 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,{{{ 8}}βρωμιούχο διφαινυλ-τετραζόλιο (MTT, Sigma, USA) σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω για 3 ώρες στους 37 βαθμούς. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και 100 μΙ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι μωβ κρύσταλλοι φορμαζάνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ. USA). Η απορρόφηση κάθε δείγματος μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Biotek μ-Quant, ΗΠΑ). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το ποσοστό της απορρόφησης ΜΤΤ σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.
2.5. Δοκιμασία χρώσης Annexin-V FITC/PI
Κυψέλες L6 (3 x105/καλά) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σιμβαστατίνη, μαζί με ή χωρίς διάφορες δόσεις HCE ή βερμπασκοσίδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με κιτ αννεξίνης-V FITC σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Trevigen, MD, ΗΠΑ). Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και επωάστηκαν σε 100 υΐ διαλύματος επισήμανσης που περιείχε 1 μΐ συζυγούς αννεξίνης-V FITC και 10 μΙ ΡΙ στο σκοτάδι για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο φθορισμός των δειγμάτων ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson FACSCanto II, ΗΠΑ).
2.6. Δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης 3
Η δραστικότητα της κασπάσης 3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια φθοριομετρική, ανοσοπροσροφητική ενζυμική δοκιμασία (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, κύτταρα L6 (3 105/φρεάτιο) που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σιμβαστατίνη, μαζί με ή χωρίς διάφορες δόσεις βερμπασκοσίδης HCE λύθηκαν χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό λύσης. Η ελεύθερη 7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη (AMC) που δημιουργήθηκε μέσω της πρωτεολυτικής διάσπασης του υποστρώματος από την Κασπάση 3 μετρήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν φθοριομετρικά με μήκος κύματος διέγερσης στα 360 nm και μήκος κύματος εκπομπής στα 460 nm με FLUatimroptarGate αναγνώστη (BMG LABTECH GmbH, Γερμανία).
2.7. Κυτταρική δοκιμασία ATP
Κυψέλες L6 (3x105/καλά) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σιμβαστατίνη, μαζί με ή χωρίς διάφορες δόσεις HCE ή βερμπασκοσίδη. Μετά τη θεραπεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η περιεκτικότητα σε ATP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο χρωματομετρικό κιτ (Abcam, UK) με μέτρηση της περιεκτικότητας σε φωσφορική γλυκερίνη των κυττάρων που λύθηκαν και ανάγνωση στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Biotek μ-Quant, Η.Π.Α. ). Η μέτρηση της παραγωγής ΑΤΡ εκφράστηκε ως ποσοστό σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.
2.8. Στατιστική ανάλυση
Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος 7SD, Prism 5 for Window (έκδοση 5.{3}}c, GraphPad Software, Inc., USA) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ όλων των ομάδων αξιολογήθηκαν με μονόδρομη ANOVA, ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni. Μια πιθανότητα po0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
3. Αποτελέσματα
3.1. Ανάλυση UPLC του υδατικού εκχυλίσματος Herba Cistanches
Το Σχήμα S1A έδειξε το προφίλ UPLC ενός τυπικού μίγματος που περιέχει εχινακοσίδη και βερμπασκοσίδη. Τα σημεία χρόνου κατακράτησης καθενός από αυτούς τους δείκτες συγκρίθηκαν με το προφίλ UPLC τουHerbaΚιστανάκιαυδατικό εκχύλισμα (Εικ. S1B). Η ποσότητα εχινακοσίδης και βερμπασκοσίδης εντόςHerbaΚιστανάκιαΤο υδατικό εκχύλισμα βρέθηκε να είναι {{0}},45 τοις εκατό w/w και 0,085 τοις εκατό w/w, αντίστοιχα.
3.2. Επίδραση HCE και βερμπασκοσίδης στην in vitro κυτταροτοξικότητα της σιμβαστατίνης σε κύτταρα σκελετικών μυών L6
Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η σιμβαστατίνη προκάλεσε σημαντική κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα L6 όπως αντικατοπτρίζεται από τη σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων L6 στα 10 mM σιμβαστατίνης. Η θεραπεία με HCE ανάλογα με τη δόση και σημαντικά απέτρεψε την επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη κυτταροτοξικότητα στα 500, 1000 και 2000 mg/ml. Η βερμπασκοσίδη άσκησε μια τάση βελτίωσης της βιωσιμότητας των κυττάρων L6 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σιμβαστατίνη. Ωστόσο, καμία από τις συγκεντρώσεις δεν είχε φτάσει σε στατιστική σημασία (Εικ. 1Β).
Εικ. 1. Προστατευτική δράση του (α) HCE. και (β) βερμπασκοσίδη στην επαγόμενη από σιμβαστατίνη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα L6. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσους όρους 7SD (n¼3). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ της θεραπείας με σιμβαστατίνη μόνη της και της ομάδας ελέγχου που χρησιμοποιεί το Student's t-test: ### po0.{{10}}01. Σημαντική διαφορά μεταξύ όλων των ομάδων που έλαβαν σιμβαστατίνη με ή χωρίς συν-θεραπεία με HCE βερμπασκοσίδη χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.
3.3. Επίδραση του HCE και της βερμπασκοσίδης στον επαγόμενο από τη σιμβαστατίνη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα σκελετικών μυών L6
Για να εξεταστεί ο τρόπος κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη και να προσδιοριστεί ο προστατευτικός ρόλος του HCE ή της βερμπασκοσίδης στον επαγόμενο από τη σιμβαστατίνη κυτταρικό θάνατο, η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων ανιχνεύθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου (PI). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σιμβαστατίνη προκάλεσε σημαντική αύξηση στο ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (Annexin V-FITC θετικό και PI αρνητικό, Q4-2) και όψιμων αποπτωτικών/νεκρών κυττάρων (Annexin V-FITC θετικό και PI-θετικό, Q2- 2) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η ταυτόχρονη θεραπεία με HCE μείωσε την αναλογία πρώιμων αποπτωτικών και όψιμων αποπτωτικών/νεκρών κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο έως και 1000 mg/ml (Εικ. 2Α). Αυτή η προστατευτική δράση παρατηρήθηκε επίσης σε ομάδες συν-θεραπείας με βερμπασκοσίδη. Ωστόσο, καμία από τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν δεν είχε στατιστική σημασία (Εικ. 2Β).
Εικ. 2. Επίδραση της σιμβαστατίνης με ή χωρίς συν-αγωγή με HCE ή βερμπασκοσίδη στην εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης σε κύτταρα L6. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Annexin-V FITC και I και ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής
3.4. Επίδραση HCE και βερμπασκοσίδης στη δραστηριότητα της κασπάσης 3 σε κύτταρα σκελετικών μυών L6 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σιμβαστατίνη
Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η 10 mM σιμβαστατίνη προκάλεσε σημαντικά τη δραστηριότητα της κασπάσης 3 σε κύτταρα L6, υποδηλώνοντας την απόπτωση που προκάλεσε η σιμβαστατίνη στα κύτταρα L6 μέσω του καταρράκτη κασπάσης. Ωστόσο, σε κύτταρα L6 που υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με σιμβαστατίνη και HCE, η HCE εξαρτώμενη από τη δόση και μείωσε σημαντικά τη δραστηριότητα της κασπάσης 3, υποδηλώνοντας την ικανότητα της HCE να αποτρέπει την επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη απόπτωση μέσω του καταρράκτη κασπάσης. Από την άλλη πλευρά, αν και η βερμπασκοσίδη άσκησε επίσης μια τάση μείωσης της επαγόμενης από τη σιμβαστατίνη αύξησης στη δραστηριότητα του ενζύμου της κασπάσης 3, μόνο η συγκέντρωση στα 160 mM έφτασε σε στατιστική σημασία (Εικ. 3Β).
Εικ. 3. Προστατευτική δράση του (α) HCE. και (β) βερμπασκοσίδη στην επαγόμενη από σιμβαστατίνη ενζυματική δραστηριότητα κασπάσης 3 σε κύτταρα L6. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο 7SD (n¼3–5). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ της θεραπείας με σιμβαστατίνη μόνο και των ομάδων ελέγχου χρησιμοποιώντας το Student's t-test: ###po0.001. Σημαντική διαφορά μεταξύ όλων των ομάδων που έλαβαν σιμβαστατίνη με ή χωρίς συν-θεραπεία HCE ή βερμπασκοσίδη με χρήση μονόδρομης ANOVA: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. Επίδραση του HCE στην επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη μείωση στην παραγωγή ATP σε κύτταρα σκελετικών μυών L6
Η σιμβαστατίνη (10 mM) μείωσε σημαντικά την παραγωγή ATP στα κύτταρα L6 κατά περίπου 60 τοις εκατό σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 4Α). Η συν-θεραπεία με HCE εξαρτώμενη από τη δόση εξασθένησε τη μείωση της παραγωγής ΑΤΡ σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σιμβαστατίνη, από τα οποία μόνο οι συγκεντρώσεις στα 500, 1000 και 2000 mg/ml είχαν φτάσει σε στατιστική σημασία. Από την άλλη πλευρά, αν και η βερμπασκοσίδη άσκησε μια τάση να αποκαταστήσει την παραγωγή ΑΤΡ στα 50 mg/ml, δεν έφτασε σε στατιστική σημασία (Εικ. 4Β).
Εικ. 4. Προστατευτική επίδραση (α) HCE και (β) βερμπασκοσίδης στην επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη μείωση στην παραγωγή ΑΤΡ σε κύτταρα L6. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο όρο 7SD (n¼3–5). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ της θεραπείας με σιμβαστατίνη μόνο και των ομάδων ελέγχου χρησιμοποιώντας το Student's t-test: ###po0.001. Σημαντική διαφορά μεταξύ όλων των ομάδων που έλαβαν σιμβαστατίνη με ή χωρίς συν-θεραπεία HCE ή βερμπασκοσίδη χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA: *po0,05, **po0,01.
4. Συζήτηση
Με τον αυξανόμενο επιπολασμό της καρδιαγγειακής νόσου (CVD) και των ασθενών που διαγιγνώσκονται με υπερχοληστερολαιμία παγκοσμίως, η χρήση στατινών έχει γίνει πιο κοινή. Αν και οι στατίνες είναι γενικά πολύ καλά ανεκτές, ο μυϊκός τραυματισμός είναι μια συχνά αναφερόμενη παρενέργεια που σχετίζεται με τη χρήση στατινών, η οποία μπορεί να εμφανιστεί οξεία εβδομάδες ή μήνες μετά την έναρξη του φαρμάκου (Fine, 2003). Τα μυϊκά συμπτώματα μπορεί να ποικίλλουν από ήπια προβλήματα, για παράδειγμα, πόνο, ευαισθησία ή αδυναμία με ή χωρίς αύξηση της κρεατινικής κινάσης (CK), έως την πιο σοβαρή κατάσταση της ραβδομυόλυσης (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). Λόγω της εμφάνισης αυτών των παρενεργειών και του ότι δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από στατίνες, οι στατίνες παραμένουν ανεπαρκώς χρησιμοποιούμενες. Σε μια ευρεία έρευνα σε 10.409 Γάλλους που διεξήχθη μέσω τηλεφωνικής συνέντευξης, το 10 τοις εκατό των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με στατίνες ανέφεραν μυϊκά συμπτώματα, από τα οποία το 30 τοις εκατό αυτών των συμπτωματικών ασθενών οδήγησαν σε διακοπή της θεραπείας (Rosenbaum et al., 2013).
Έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι το εκχύλισμα νερού τουHerbaΚιστανάκια, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο παραδοσιακό κινέζικο βότανο, θα μπορούσε να ασκήσει προστατευτική δράση έναντι της επαγόμενης από τη σιμβαστατίνη τοξικότητας in vitro σε κύτταρα σκελετικών μυών L6, υποδηλώνοντας τη δυνατότηταHerbaΚιστανάκιαυδατικό εκχύλισμα (HCE) για τον προστατευτικό του ρόλο μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από στατίνες, η οποία είναι μια αναγνωρισμένη συχνή παρενέργεια σε ασθενείς που λαμβάνουν στατίνες. Η ισχυρή ικανότητα του HCE να προστατεύει από τη μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από στατίνες θα ήταν επομένως μεγάλη.
Σύμφωνα με την παραδοσιακή θεωρία στο TCM, το Yang σχετίζεται με τον μεταβολισμό της μιτοχονδριακής ενέργειας στο σώμα και η συνταγογράφηση βοτάνων που τονώνουν το Yang βρέθηκε ότι ενισχύουν τη δημιουργία μιτοχονδριακού ATP (Ko and Leung, 2007). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε μείωση στην παραγωγή ΑΤΡ σε σκελετικά μυϊκά κύτταρα L6 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σιμβαστατίνη και αυτή η μείωση στην παραγωγή ΑΤΡ βελτιώθηκε σημαντικά με τη συν-θεραπεία με HCE. Στη μελέτη μας, χρησιμοποιώντας κύτταρα σκελετικών μυών L6 αρουραίου, δείξαμε μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη. Αυτή η μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων βελτιώθηκε σημαντικά με τη συν-θεραπεία τουHerbaΚιστανάκιαμε δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Αν και ο ακριβής μηχανισμός της μυϊκής τοξικότητας που προκαλείται από τις στατίνες δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, η απόπτωση των υγιών σκελετικών μυοκυττάρων που προκαλείται από τις στατίνες προτάθηκε ως ένας παράγοντας που συμβάλλει στην πρόκληση μυοπάθειας, η πιο κοινή παρενέργεια που βιώνουν οι χρήστες στατινών (Dirks and Jones, 2006). . Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στα αποπτωτικά κύτταρα που προκαλούνται από τη σιμβαστατίνη, η οποία συσχετίστηκε με σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3. Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν επίσης με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες έδειξαν ότι διάφορες στατίνες θα μπορούσαν να προκαλέσουν απόπτωση σε σκελετικούς μυοβλάστες, μυοσωληνάρια και σε διαφοροποιημένα πρωτεύοντα κύτταρα ανθρώπινου σκελετικού μυός μέσω της ενεργοποίησης των δραστηριοτήτων κασπάσης-9 και κασπάσης-3 (Dirks και Jones, 2006). Το HCE μας μπόρεσε να αποτρέψει αυτήν την επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη αύξηση στην απόπτωση που ενεργοποιήθηκε από κασπάση-3 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.
HerbaΚιστανάκια
Επιπλέον, η προηγούμενη βιβλιογραφία πρότεινε ότι η βερμπασκοσίδη είναι ένα από τα κύρια ενεργά συστατικά μέσαHerbaΚιστανάκια. Η βερμπασκοσίδη, γνωστή και ως ακτεοσίδη, ανήκει στο μέλος των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών, μιας φυσικής ομάδας πολυφαινολικών ενώσεων που είναι διαλυτές στο νερό (Liao et al., 1999). Προηγουμένως, είχε αποδειχθεί ότι η βερμπασκοσίδη είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό που θα μπορούσε να επιδείξει ισχυρές δραστηριότητες δέσμευσης και αντιοξειδωτικών ROS (Liao et al., 1999). Στη μελέτη μας, για να προσδιορίσουμε εάν η βερμπασκοσίδη είναι το κύριο συστατικό στο HCE μας που συμβάλλει στις παρατηρούμενες ευεργετικές επιδράσεις, δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της βερμπασκοσίδης σε συγκεντρώσεις 0–160 mM. Δεδομένου ότι έχουμε αποδείξει ότι το HCE μας είναι ενεργό στο εύρος συγκεντρώσεων 250–2{000 mg/ml, με βάση τα αποτελέσματα HPLC που πρότειναν ότι το HCE μας περιείχε βερμπασκοσίδη σε συγκέντρωση 0,085 τοις εκατό κατά βάρος /wt, η ενεργή συγκέντρωση της βερμπασκοσίδης θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 0,2125–1,7 mg/ml (δηλ. 0,34–2,72 mM), πρέπει η βερμπασκοσίδη να είναι το δραστικό συστατικό; Ωστόσο, αποτύχαμε να παρατηρήσουμε μια σημαντική ευεργετική επίδραση της βερμπασκοσίδης με το εύρος συγκέντρωσης που δοκιμάστηκε, αν και παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη τάση για μια ευεργετική επίδραση της βερμπασκοσίδης στα κύτταρα σκελετικών μυών L6. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ευεργετική επίδραση του HCE μας που παρατηρείται στα σκελετικά κύτταρα L6 είναι απίθανο να αποδοθεί στην επίδραση μόνο της βερμπασκοσίδης, υποδηλώνοντας ότι συστατικά άλλα από τη βερμπασκοσίδη θα μπορούσαν να είναι υπεύθυνα για τις παρατηρούμενες ευεργετικές επιδράσεις. Είναι επίσης πιθανό η βερμπασκοσίδη να αλληλεπιδράσει με άλλες βιοδραστικές ενώσεις εντός του εκχυλίσματος για να συμβάλει στα ευεργετικά αποτελέσματα. Πρόσθετα πειράματα που χρησιμοποιούν κλασμάτωση καθοδηγούμενη από βιοδοκιμασία θα είναι χρήσιμα για την παροχή περαιτέρω πληροφοριών σχετικά με την ανακάλυψη των βιοδραστικών συστατικών που είναι υπεύθυνα για τη συμβολή στις παρατηρούμενες προστατευτικές επιδράσεις του HCE στη μυϊκή τοξικότητα που προκαλείται από τη σιμβαστατίνη.
Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το HCE θα μπορούσε να ασκήσει ισχυρά προστατευτικά αποτελέσματα στην επαγόμενη από τη σιμβαστατίνη μείωση της βιωσιμότητας των μυϊκών κυττάρων in vitro. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν τα προκαταρκτικά στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το υδατικό μας εκχύλισμα HC μπορεί να είναι θεραπευτικής αξίας ως λειτουργικό τρόφιμο ή θρεπτικό σε υπερλιπιδαιμικούς ασθενείς που απαιτείται να αποσυρθούν από τη θεραπεία με στατίνες λόγω μυοτοξικότητας που προκαλείται από στατίνες.
Ευχαριστίες Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Γραφείο Τροφίμων και Υγείας HKSAR, Ταμείο Υγείας και Ιατρικής Έρευνας αρ. 11120831.
βιβλιογραφικές αναφορές
Armitage, J., 2007. Η ασφάλεια των στατινών στην κλινική πράξη. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Ανεπιθύμητες ενέργειες των στατινών – μηχανισμοί και συνέπειες. Curr. Drug Saf. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. Η δράση κατά της κόπωσης του εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινυλαιθανοειδή από Cistanche deserticola. Phytother. Res. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Απόπτωση και σκελετική μυοπάθεια που προκαλείται από στατίνες. Είμαι. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Μυϊκή τοξικότητα που σχετίζεται με στατίνες. Clin. Pharmacol. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Ανεπιθύμητες ενέργειες στατίνης: ανασκόπηση της βιβλιογραφίας και στοιχεία για έναν μιτοχονδριακό μηχανισμό. Είμαι. J. Cardiovasc. Drugs 8, 373-418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Safety of statins: an update. Εκεί. Adv. Drug Saf. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Τοξικότητα στατινών σε μιτοχόνδρια σκελετικών μυών αρουραίου. Κύτταρο. ΜοΙ. Life Sci. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. Ενίσχυση της ικανότητας παραγωγής ATP, της αντιοξειδωτικής δραστηριότητας και των ανοσοτροποποιητικών δραστηριοτήτων από κινέζικα τονωτικά βότανα Yang και Yin. Πηγούνι. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Η συμπλήρωση διττανθρακικών ως προληπτικός τρόπος σε μυϊκή βλάβη που προκαλείται από στατίνες. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Η ηπατική βλάβη που προκαλείται από στατίνες περιλαμβάνει διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ βιοσυνθετικών οδών χοληστερόλης και σεληνοπρωτεΐνης. ΜοΙ. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. Το εκχύλισμα Herba Cistanche ενισχύει τη δημιουργία μιτοχονδριακού ATP σε καρδιές αρουραίου και κύτταρα H9C2. Pharm. Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Επιβράδυνση της κόπωσης των σκελετικών μυών από τους δύο φαινυλοπροπανοειδείς γλυκοσίδες: βερμπασκοσίδη και μαρτενσίτη από Pedicularis plicata Maxim. Phytother. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Study on Chemical Constituents of Cistanche deserticola Ma. και Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Πηγούνι. Παράδοση. Βότανο. Drugs 26, 143.
Επιτροπή Φαρμακοποιίας, 2010. Η Φαρμακοποιία της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Chemical Industry Press, Πεκίνο.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Διακοπή της θεραπείας με στατίνες λόγω μυϊκών παρενεργειών: μια έρευνα στην πραγματική ζωή. Nutr. Metab. Καρδιοαγγειακή. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. Το εκχύλισμα Herba Cistanche ενισχύει την κατάσταση της μιτοχονδριακής γλουταθειόνης και την αναπνοή σε καρδιές αρουραίου, με πιθανή επαγωγή πρωτεϊνών αποσύνδεσης. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Υδατοδιαλυτή ένωση υδατανθράκων από τα σώματα τωνHerbaΚιστανάκια: απομόνωση και η σαρωτική του δράση στις ελεύθερες ρίζες στο δέρμα. Υδατάνθρακες. Πολυμ. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Μυοπάθεια που σχετίζεται με τις στατίνες. JAMA 289, 1681–1690.
Βακλαβάς, Χ., Χατζηζήσης, Υ.Σ., Ζιάκας, Α., Ζαμπούλης, Χ., Γιαννόγλου, Γ.Δ., 2009. Μοριακή βάση της μυοπάθειας που σχετίζεται με τις στατίνες. Αθηροσκλήρωση 202, 18-28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Οι στατίνες επάγουν τη μετάβαση της μιτοχονδριακής διαπερατότητας που εξαρτάται από το ασβέστιο. Toxicology 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, Κ., Tezuka, Υ., Tani, Τ., Namba, Τ., Kadota, S., 1998. Ηπατοπροστατευτική δραστηριότητα φαινυλαιθανοειδών από Cistanche deserticola. Planta Med. 64, 120–125.
