Η αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια της Pinocembrin σε ένα μοντέλο προβάτου της πνευμονικής ίνωσης που προκαλείται από τη βλεομυκίνη

Επικοινωνία:tina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ο πρωτεύονφλαβονοειδές, το pinocembrin, πιστεύεται ότι έχει μια ποικιλία ιατρικών χρήσεων που σχετίζονται με το αναφερόμενο αντιοξειδωτικό του,αντιφλεγμονώδη, αντιμικροβιακές και αντικαρκινικές ιδιότητες. Μερικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι αυτό το φλαβονοειδές έχει αντι-ινωτική δράση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε εάν το pinocembrin θα παρεμπόδιζε την ίνωση, θα περιορίσει τη φλεγμονή και θα βελτιώσειπνεύμοναςλειτουργούν σε ένα μεγάλο ζωικό μοντέλο πνευμονικής ίνωσης. Η ίνωση προκλήθηκε σε δύο εντοπισμένα τμήματα πνευμόνων σε καθένα από τα 10 πρόβατα που συμμετείχαν στη μελέτη. Αυτό επιτεύχθηκε μέσω δύο εγχύσεων βλεομυκίνης που χορηγήθηκαν βρογχοσκοπικά σε διάστημα δύο εβδομάδων. Ένα άλλο τμήμα πνεύμονα στο ίδιο πρόβατο αφέθηκε χωρίς θεραπεία και χρησιμοποιήθηκε ως υγιής έλεγχος. Τα ζώα διατηρήθηκαν για λίγο περισσότερο από 5 εβδομάδες μετά την τελική έγχυση της βλεομυκίνης. Το Pino-cembrin, που απομονώθηκε από φύλλα ευκαλύπτου, χορηγήθηκε σε ένα από τα δύο κατεστραμμένα τμήματα του πνεύμονα με βλεομυκίνη σε δόση 7 mg. Αυτή η δόση χορηγήθηκε μία φορά την εβδομάδα για 4-εβδομάδες, ξεκινώντας μία εβδομάδα μετά την τελική έγχυση βλεομυκίνης. Η συμμόρφωση των πνευμόνων (ως μέτρο ακαμψίας) βελτιώθηκε σημαντικά μετά από τέσσερις εβδομαδιαίες χορηγήσεις πινοσεμβρίνης σε τμήματα του πνεύμονα που έχουν υποστεί βλάβη από τη βλεομυκίνη. Υπήρχαν σημαντικά χαμηλότεροι αριθμοί ουδετερόφιλων και φλεγμονωδών κυττάρων στη βρογχοκυψελιδική έκπλυση τμημάτων πνευμόνων που εγχύθηκαν με βλεομυκίνη που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πινοσεμβρίνη. Σε σύγκριση με τα κατεστραμμένα από τη βλεομυκίνη πνευμονικά τμήματα χωρίς φαρμακευτική αγωγή, η χορήγηση πινοσεμβρίνης συσχετίστηκε με σημαντικά χαμηλότερους αριθμούς ανοσοθετικών CD8t και CD4 συν Τ κυττάρων στο πνευμονικό παρέγχυμα. Τα δεδομένα βαθμολόγησης ιστοπαθολογίας έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη συσχετίστηκε με σημαντική βελτίωση στη φλεγμονή και τη συνολική βαθμολογία παθολογίας. Η ανάλυση υδροξυπρολίνης έδειξε ότι η χορήγηση πινοσεμπρίνης δεν μείωσε την αυξημένη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο που προκλήθηκε από τη βλεομυκίνη σε αυτό το μοντέλο. Οι αναλύσεις τμημάτων χρωματισμένων με Trichrome του Masson έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοκεμπρίνη μείωσε σημαντικά την περιεκτικότητα του συνδετικού ιστού σε τμήματα πνευμόνων που εκτέθηκαν σε μπλεομυκίνη σε σύγκριση με πνεύμονες που εγχύθηκαν με μπλεομυκίνη που δεν έλαβαν πινοκεμπρίνη. Οι εντυπωσιακές αντιφλεγμονώδεις και μέτριες αντι-ινωτικές επιδράσεις αναδιαμόρφωσης της χορήγησης πινοσεμβρίνης συνδέονταν πιθανώς με την ικανότητα της ένωσης να βελτιώνει την παθολογία των πνευμόνων και τη λειτουργική συμμόρφωση σε αυτό το ζωικό μοντέλο πνευμονικής ίνωσης.

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερες πληροφορίες

Εισαγωγή

Ο πρωτεύονφλαβονοειδές, pinocembrin, έχει εντοπιστεί και απομονωθεί από έναν αριθμό φυτικών ειδών. Αυτό το βιοδραστικό μόριο πιστεύεται ότι έχει μια ποικιλία ιατρικών χρήσεων που σχετίζονται με το αναφερόμενο αντιοξειδωτικό του,αντιφλεγμονώδη, αντιμικροβιακές και αντικαρκινικές ιδιότητες [1-7]. Είναι σημαντικό ότι το pinocembrin έχει αποδειχθεί ότι έχει αντι-ινωτικές ιδιότητες σε έναν αριθμό διαφορετικών ζωικών μοντέλων ασθενειών. Για παράδειγμα, το pinocembrin μειώνει την κοιλιακή ίνωση [8] σε ένα μοντέλο κατάθλιψης σε αρουραίο και μειώνει την κολπική ίνωση σε ένα μοντέλο εμφράγματος του μυοκαρδίου επίμυος [9]. Ομοίως, σε ένα πειραματικό μοντέλο ηπατικής ίνωσης επαγόμενης από χλωροφόρμιο σε αρουραίους, η από του στόματος χορήγηση πινοσεμβρίνης μείωσε την έκφραση κολλαγόνου και άλφα-SMA (που χρησιμοποιείται ως δείκτης διαφοροποίησης μυοϊνοβλαστών), ως μέτρα ίνωσης [10]. Μια πρόσφατη μελέτη απέδειξε

Το pinocembrin ανακουφίζει την επαγόμενη από τη μπλεομυκίνη ίνωση του δέρματος σε ποντίκια και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των χηλοειδών ινοβλαστών και των πρωτογενών δερματικών ινοβλαστών ποντικού in vitro [11]. Η πινοσεμβρίνη προκάλεσε αυτές τις αντι-ινωτικές επιδράσεις μέσω της προς τα κάτω ρύθμισης των μονοπατιών σηματοδότησης NF-x και TGF- 1/Smad [10,11].

Δεδομένων των γνωστών αντι-ινωτικών επιδράσεων της πινοσεμβρίνης, στοχεύσαμε να εξακριβώσουμε εάν η πινοσεμβρίνη θα παρεμπόδιζε την ίνωση και θα βελτιώσειπνευμονική λειτουργίασε ένα μεγάλο ζωικό μοντέλο πνευμονικής ίνωσης. Το φυσιολογικά και φαρμακολογικά σχετικό μοντέλο για την πνευμονική ίνωση αναπτύχθηκε ως όχημα για τη διερεύνηση του μηχανισμού(ων) της υποκείμενης νόσου για την ανθρώπινη κατάσταση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (IPF)[12,13]. Ήταν επίσης χρήσιμο για τη δοκιμή νέων θεραπειών κατά της πνευμονικής ίνωσης [14-16].

Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF) είναι μια καταστροφική χρόνια πνευμονοπάθεια που χαρακτηρίζεται από προοδευτική ουλή των πνευμόνων λόγω της πληθωρικής συσσώρευσης εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) στο πνευμονικό παρέγχυμα [17]. Η πρόγνωση της IPF είναι πολύ κακή με μόνο 3-5 έτη μέσης επιβίωσης των ασθενών μετά τη διάγνωση [18]. Οι τρέχουσες διαθέσιμες φαρμακολογικές θεραπείες περιορίζονται σε Pirfenidone και Nintedanib, φάρμακα που έχει αποδειχθεί ότι επιβραδύνουν μόνο την εξέλιξη της νόσου, χωρίς να την αναστέλλουν. Επιπλέον, υπάρχουν σημαντικές ανεπιθύμητες παρενέργειες που σχετίζονται με αυτά τα δύο φάρμακα. Επομένως, υπάρχει μια ανικανοποίητη ανάγκη για νέες αποτελεσματικές θεραπείες για αυτήν την πάθηση.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και ασφάλεια της πινοσεμβρίνης σε ένα μοντέλο προβάτου πνευμονικής ίνωσης που προκαλείται από τη βλεομυκίνη που αναπτύχθηκε στο εργαστήριό μας(12). Συγκεκριμένα, διεξήχθη μια μελέτη για να εξακριβωθεί εάν η τοπική χορήγηση πινοσεμβρίνης στους πνεύμονες εξασθένησε σημαντικά την ίνωση, τη φλεγμονή και την ιστοπαθολογία σε συγκεκριμένα τμήματα του πνεύμονα μετά από επαγωγή ίνωσης με βλεομυκίνη. Είναι σημαντικό ότι προσδιορίσαμε εάν η τοπική χορήγηση πινοσεμβρίνης βελτίωσε σημαντικά τη φυσιολογική λειτουργία συγκεκριμένων τμημάτων του πνεύμονα με ίνωση που προκαλείται από τη βλεομυκίνη.

Υλικά και μέθοδοι

Επαγωγή ίνωσης σε τμήματα του πνεύμονα προβάτου

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε συνολικά 10 πρόβατα. Προκαλέσαμε ίνωση σε δύο πνευμονικά τμήματα κάθε προβάτου με παρόμοιο τρόπο με τις προηγούμενες μελέτες μας [12,13]. Χρησιμοποιώντας αυτήν την καθιερωμένη διαδικασία (βλ. λεπτομέρειες παρακάτω) η ίνωση περιορίστηκε σε μικρές, απομονωμένες περιοχές στους πνεύμονες αφήνοντας το υπόλοιπο 90-95 τοις εκατό των υγιών μη προσβεβλημένων πνευμόνων να αναλάβει την κανονική αναπνευστική λειτουργία.

Όλα τα πρόβατα στη μελέτη προκλήθηκαν με 2 απλές δόσεις βλεομυκίνης (3 μονάδες) ανά τμήμα πνεύμονα, με διαφορά 2 εβδομάδων και τα ζώα διατηρήθηκαν για λίγο περισσότερο από 5 εβδομάδες μετά την τελική δόση μπλεομυκίνης. στον δεξιό και τον αριστερό πνεύμονα και στη συνέχεια με αργή έγχυση μέσω της θύρας βιοψίας του βρογχοσκοπίου, η βλεομυκίνη σε δύο τμήματα όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.

Ο χρόνος των εγχύσεων βλεομυκίνης, η δειγματοληψία αίματος, η δειγματοληψία βρογχοκυψελιδικής πλύσης και ο έλεγχος της πνευμονικής λειτουργίας και η εφαρμογή της πινοσεμβρίνης περιγράφονται λεπτομερώς στο Eig2. Όλες οι διαδικασίες πειραματόζωων εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας των ζώων του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης (αριθμός ID έγκρισης ηθικής των ζώων: 2015209.1). Αυτές οι πειραματικές διαδικασίες και τα χρονοδιαγράμματα που σχετίζονται με την εργασία σε ζώα σχεδιάστηκαν για να ανακουφίσουν και να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία των προβάτων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Συγκεκριμένα, ο αριθμός των βρογχοσκοπικών επεμβάσεων μειώθηκε στο ελάχιστο που θα επέτρεπε την επιτυχή ερμηνεία των δεδομένων.

Απομόνωση και δομική επιβεβαίωση της pinocembrin

Το Pinocembrin καθαρίστηκε από εκχυλίσματα μεθανόλης φύλλων που συλλέχθηκαν από τριών ετών Eucalyptus pressiana subsp. δενδρύλλια pressiana αναπτύχθηκαν σε ένα πειραματικό οικόπεδο στην πανεπιστημιούπολη Dookie του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης (36 βαθμοί 23'3" S, 145 βαθμοί 42'52" E). Οι σπόροι που αγοράστηκαν από τη Nindethana Seed Company (King River, Αυστραλία) είχαν συλλεχθεί από το Woodenellup της Δυτικής Αυστραλίας και τα σπορόφυτα ανατράφηκαν και μεταφυτεύθηκαν στο οικόπεδο όπως περιγράφεται στο [19]. Τα δειγματοληπτικά φύλλα στέγνωσαν σε φούρνο στους 5{{40}} βαθμούς για 48 ώρες πριν αλέσουν σε λεπτή σκόνη χρησιμοποιώντας μύλο ΙΚΑ MF10 εφοδιασμένο με πλέγμα l mm. Ο αλεσμένος ιστός (100 g) τοποθετήθηκε σε δακτυλήθρες κυτταρίνης Kinesis XK (Antylia Scientific, Σικάγο, ΗΠΑ) και υποβλήθηκε σε εκχύλιση Soxhlet με 100 τοις εκατό MeOH (200 mL) για 8 ώρες. Τα εκχυλίσματα MeOH στη συνέχεια συμπυκνώθηκαν σε περίπου 50 mL χρησιμοποιώντας περιστροφική εξάτμιση. Δείγματα συμπυκνωμένων εκχυλισμάτων (2 mL) υποβλήθηκαν σε φλας χρωματογραφία σε σύστημα Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Switzerland) εφοδιασμένο με φυσίγγιο FlashPure C18 RP-WP 12 g (Buchi). Το σύστημα διαλυτών που χρησιμοποιήθηκε ήταν μια βαθμίδα ακετονιτριλίου (MeCN) και νερού από 30-100 τοις εκατό MeCN σε 5 λεπτά με χρόνο εξισορρόπησης 1 λεπτό (Σχήμα S1). Το κλάσμα που περιέχει πινοσεμβρίνη ανιχνεύθηκε στα 283 nm και συλλέχθηκε. Κλάσματα από πολλαπλές εκτελέσεις Flash συγκεντρώθηκαν, το MeCN αφαιρέθηκε μέσω περιστροφικής εξάτμισης και η πινοσεμβρίνη ξηράνθηκε χρησιμοποιώντας λυοφιλοποίηση. Η δομή της πινοσεμβρίνης επιβεβαιώθηκε μέσω φασματοσκοπίας ESI-LCMS και NMR όπως περιγράφεται στο [19] σε σύγκριση με ένα εμπορικό πρότυπο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΗΠΑ). Pinocembrin: Ωχροκίτρινοι κρύσταλλοι από MeCN/H, O.UVλmax MeCN（nm）∶ ζώνη-I325 nm, ζώνη-II289 nm. 'H NMR (600 MHz, CDCl）∶δ5,36 (1H,dd,J13,0,3,0 Hz,H-2）,δ2,76(1H,dd,J17,1,3,1Hz,H{ {51}}a）,δ3.02(1H,dd,J17.1,13.1 Hz,H-3b),δ5.92(1H,d,2.2Hz,H-6）, δ5.94 (1H,d, 2.2Hz,H-8) ([M-42-H],19), 151.0037([M-104-H],16),257.0811([M συν Η],100),153.0167([M{-104 συν Η],2). Η καθαρότητα της απομονωμένης πινοκεμβρίνης με βάση τη μάζα ποσοτικοποιήθηκε σε ένα ελάχιστο 96 τοις εκατό χρησιμοποιώντας HPLC-PDA σε σύγκριση με ένα εμπορικό πρότυπο (Σχήμα S2A και S2B).

Χορήγηση pinocembrin σε τμήματα πνεύμονα προβάτου

Για κάθε εβδομάδα του δοσολογικού σχήματος, 7 mg πινοσεμβρίνης εγχύθηκαν σε ένα μόνο ουραίο τμήμα πνεύμονα σε κάθε πρόβατο που υποβλήθηκε στη δοκιμή (Εικόνα 1). Αυτό το βάρος δόσης της πινοσεμπρίνης βασίστηκε σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη που έδειξε ότι τα 50 mg πινοσεμπρίνης ανά κιλό σωματικού βάρους ήταν η πιο αποτελεσματική δόση για τη βελτίωση των συμπτωμάτων της νόσου σε αυτό το ζωικό μοντέλο [20]. Η δόση πινοσεμβρίνης των 7 mg επέτρεψε το γεγονός ότι μόνο περίπου 150 γραμμάρια πνευμονικού τμήματος ανά πρόβατο υποβλήθηκαν σε αγωγή με περίπου 50 mg/kg. Το βιοδραστικό διαλύθηκε σε 10 τοις εκατό DMSO και χορηγήθηκε μία φορά την εβδομάδα σε περίοδο τεσσάρων εβδομάδων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Για λόγους ελέγχου, το τμήμα του πνεύμονα στον αντίθετο πνεύμονα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός στη βλεομυκίνη, χωρίς φάρμακο, έλεγχος , όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 1. Τα βιοδραστικά μόρια στο όχημα χορηγήθηκαν ως εγχύσεις 5 mL μέσω της θύρας βιοψίας του βρογχοσκοπίου. Σημειώστε ότι για να ακυρωθούν τυχόν μικρές διαφορές (π.χ. φυσιολογικές ή ανατομικές, κ.λπ.) μεταξύ του αριστερού και του δεξιού πνεύμονα, οι εγχύσεις πινοσεμβρίνης τυχαιοποιήθηκαν μεταξύ του αριστερού και του δεξιού ουραίο πνεύμονα. Τα μισά ζώα (n=5 πρόβατα) έλαβαν pinocembrin στο δεξιό ουραίο πνεύμονα, ενώ τα άλλα (n=5 πρόβατα) έλαβαν pinocembrin στα τμήματα του αριστερού ουραίο πνεύμονα. Το δεξιό μεσαίο τμήμα του πνεύμονα αφέθηκε χωρίς θεραπεία και χρησιμοποιήθηκε για υγιή ιστό ελέγχου του πνεύμονα από τον οποίο ελήφθη δείγμα στην αυτοψία (Εικόνα 1).

Διαδικασίες δειγματοληψίας βρογχοκυψελιδικής πλύσης

Για καθεμία από τις βρογχοκυψελιδικές δειγματοληψίες (BAL) στα χρονικά σημεία που παρατίθενται στο Σχήμα 2, το ενδοσκόπιο χειραγωγήθηκε σε ένα συγκεκριμένο τμήμα πνεύμονα για δειγματοληψία, συνήθως περνώντας από περίπου 3 έως 4 κλάδους αεραγωγών. Για τη δειγματοληψία BAL, 10 mL αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού εγχύθηκαν μέσω της θυρίδας βιοψίας του ενδοσκοπίου στο συγκεκριμένο τμήμα του πνεύμονα και στη συνέχεια ανακτήθηκαν σε μια σύριγγα μέσω της ίδιας θύρας. Αυτή η διαδικασία ανέκτησε μεταξύ 3 και 5 mL υγρού BAL. Η μέθοδος δειγματοληψίας συνέλεξε κύτταρα για αναλύσεις από τον μικρό αεραγωγό και τους κυψελιδικούς αυλούς του συγκεκριμένου τμήματος του πνεύμονα στο οποίο πλοηγήθηκε το βρογχοσκόπιο. Τα κύτταρα BAL από κάθε τμήμα φυγοκεντρήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και χρωματίστηκαν για διαφορική μέτρηση κυττάρων φλεγμονωδών κυττάρων με Hem-Quik, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

Έλεγχος και αναλύσεις πνευμονικής λειτουργίας

Η πνευμονική λειτουργία μετρήθηκε στα περιγραφόμενα τμήματα του πνεύμονα στα χρονικά σημεία που υποδεικνύονται στο Σχήμα 2. Η πνευμονική λειτουργία αξιολογήθηκε σε όλα τα δοκιμαστικά τμήματα του πνεύμονα (αριστερός και δεξιός ουραίος λοβός και έσω λοβός σε κάθε πρόβατο). Η λειτουργική ικανότητα των τμημάτων του πνεύμονα μετρήθηκε μέσω του ενδοσκοπίου χρησιμοποιώντας μια δημοσιευμένη διαδικασία [12,13]. Η παράμετρος πνευμονικής λειτουργίας που αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη αναφέρθηκε ως συμμόρφωση στο τμήμα του πνεύμονα (συντομογραφία Cseg). Γενικά, η συμμόρφωση είναι ένα μέτρο του πόσο εύκολο είναι να φουσκώσει ο πνεύμονας. Ένας κακώς συμμορφούμενος πνεύμονας αναφέρεται ως δύσκαμπτος πνεύμονας, ο οποίος είναι συνήθως πιο δύσκολο να φουσκώσει.

Αιμοληψία

Το πλήρες αίμα συλλέχθηκε στην αρχή πριν από την επαγωγή ίνωσης και στο τέλος του πειράματος πριν από την ευθανασία πειραματόζωων όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2 με λήψη αίματος από τη σφαγίτιδα φλέβα σε ένα σωλήνα που περιέχει ηπαρίνη. Το αίμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ανάλυση του αριθμού των κυττάρων του αίματος.

Απομόνωση και αναλύσεις πνευμονικού ιστού

Τα πρόβατα υποβλήθηκαν σε ευθανασία λίγο περισσότερο από 5 εβδομάδες μετά την τελευταία δόση μπλεομυκίνης (αρχές της εβδομάδας 12), όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2. Η ευθανασία προκλήθηκε μέσω υπερδοσολογίας βαρβιτουρικών που δόθηκε ενδοφλέβια σε ml ανά 2 κιλά σωματικού βάρους, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Μετά την ευθανασία, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν και τα στοχευόμενα τμήματα πνεύμονα αναγνωρίστηκαν και αφαιρέθηκαν προσεκτικά από το περιβάλλον Στη συνέχεια, τα επιμέρους τμήματα διογκώθηκαν με ένα μείγμα 1:1 OCT (Βέλτιστη θερμοκρασία κοπής, Tissue-Tek) και αποστειρωμένο διάλυμα PBS, υπό πίεση περίπου 20 cm/H, O[13]. Αρκετές σειριακές εγκάρσιες τομές του Το διογκωμένο τμήμα στερεώθηκε σε φορμαλίνη ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος 10 τοις εκατό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε παραφίνη για ιστοπαθολογική εκτίμηση.Οι υπόλοιπες φέτες πνεύμονα ενσωματώθηκαν σε OCT και καταψύχθηκαν σε κρυοκαλούπια σε βάρκες αλουμινίου που επιπλέουν σε υγρό άζωτο.

Τομές ιστού ενσωματωμένες σε παραφίνη (5 μm) χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη Υ (H&E) για γενική ιστολογία και με χρώση τρίχρωμου Masson για τον εντοπισμό αλλαγών στο περιεχόμενο κολλαγόνου εντός του πνευμονικού παρεγχύματος.

Ανοσοϊστοχημεία

Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημικός εντοπισμός των CD4* και CD8 Τ λεμφοκυττάρων σε κατεψυγμένες τομές. Τομές πνευμονικού ιστού (5 μm) στερεώθηκαν με παγωμένη αιθανόλη. Τα ενδογενή υπεροξείδια αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα Η, Ο, και οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (μονοκλωνικό αντι CD4 ποντικού (καθαρό) και μονοκλωνικό ποντικό αντι CD8 (καθαρό) σε υγρό θάλαμο για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση με πρωτογενή αντισώματα,

Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (κουνελιού αντιποντικού IgG(HRP) (ab6728)) (1:100· Abcam, Μελβούρνη, Αυστραλία) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για να ελεγχθεί η ειδικότητα, συμπεριλήφθηκαν μάρτυρες ισοτύπου κατά τη διάρκεια του IHCrun χρησιμοποιώντας ένα βιολογικά άσχετο αντίσωμα SBU-3 του ίδιου ισοτύπου. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με διάλυμα αιματοξυλίνης Mayer για 20 δευτερόλεπτα. Το σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος οπτικοποιήθηκε με 3,3'-διαμινοβενζιδίνη. Τέλος, τα τμήματα αφυδατώθηκαν μέσω αιθανόλης, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και τοποθετήθηκαν σε DPX.

Βαθμολογία ιστοπαθολογίας

Η ιστοπαθολογία του πνευμονικού παρεγχύματος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ημι-ποσοτικό σύστημα βαθμολόγησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως[12,13]. Εν συντομία, οι ιστολογικές διαφάνειες ήταν όλες τυφλές, έτσι ώστε ο αξιολογητής να μην γνώριζε τις ομάδες θεραπείας. Για κάθε τμήμα που χρωματίστηκε με H&E, 10 διαδοχικά, μη επικαλυπτόμενα πεδία σε μεγέθυνση x200 βαθμολογήθηκαν με βάση τα κριτήρια βαθμολόγησης για ίνωση, φλεγμονή και συνολικές βαθμολογίες παθολογίας όπως αναφέρθηκαν προηγουμένως [12,13]. Οι περιοχές επιλέχθηκαν μακριά από μεγάλους αεραγωγούς και μεγάλα αιμοφόρα αγγεία. Οι βαθμολογίες και από τα δέκα πεδία υπολογίστηκαν στη συνέχεια για να δώσουν αντιπροσωπευτικές βαθμολογίες για τις παραμέτρους που αξιολογήθηκαν στο τμήμα του πνεύμονα σε τομή.

Η ανάλυση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης κολλαγόνου χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία υδροξυπρολίνης χρησιμοποιήθηκε για την παρέκταση της περιεκτικότητας σε κολλαγόνο και της συγκέντρωσης κάθε τμήματος, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (4,5). Εν συντομία, οι κατεψυγμένοι ιστοί των πνευμόνων από κάθε τμήμα λυοφιλοποιήθηκαν σε ξηρό βάρος, υδρολύθηκαν σε 6Μ HCl και αξιολογήθηκαν για την περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη με μέτρηση της απορρόφησης των ανασυσταθέντων δειγμάτων (σε 0}.1Μ HCl) στα 558 nm χρησιμοποιώντας ένα Beckman Φασματοφωτόμετρο DU-64 (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). Η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη προσδιορίστηκε από μια τυπική καμπύλη trans-L-υδροξυ-L-προλίνης (Sigma-Aldrich). Η περιεκτικότητα σε κολλαγόνο προεκτέθηκε πολλαπλασιάζοντας τις μετρήσεις της υδροξυπρολίνης επί 6,94 (με βάση την υδροξυπρολίνη που αντιπροσωπεύει~14,4 τοις εκατό της σύνθεσης αμινοξέων του κολλαγόνου στους περισσότερους ιστούς [21]) και στη συνέχεια εκφράστηκε ως αναλογία του ξηρού βάρους ιστού για να δώσει συγκέντρωση κολλαγόνου (η οποία εκφράστηκε ως ποσοστό).

Η ανάλυση του περιεχομένου του συνδετικού ιστού για την εκτίμηση του βαθμού ίνωσης ποσοτικοποιήθηκε με την αξιολόγηση των αλλαγών στη συνολική περιεκτικότητα του συνδετικού ιστού εντός του παρεγχυματικού ιστού χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Για να πραγματοποιηθεί αυτή η ανάλυση, τομές παραφίνης ιστών πνεύμονα προβάτου χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας μια χρώση τριχρωμίου Masson που βάφει το συνδετικό ιστό μπλε. Στη συνέχεια, εικόνες του χρωματισμένου με τρίχρωμο τμήμα του πνεύμονα του Masson καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή κάμερα συνδεδεμένη με μικροσκόπιο και υπολογιστή. Δέκα πεδία καταγράφηκαν τυχαία με μεγέθυνση x400 εξαιρουμένων των μεγάλων αιμοφόρων αγγείων και των βρόγχων. Στη συνέχεια, οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus (Έκδοση 6.3 για Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας το «εργαλείο επιλογής χρώματος για τη μέτρηση της περιοχής των ιστών με μπλε χρωματισμό (κολλαγόνο και άλλοι συνδετικοί ιστοί) σε κάθε πεδίο άποψη. Στη συνέχεια, οι τιμές για καθεμία από τις δέκα εικόνες υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για κάθε διαφάνεια. Το κλάσμα της επιφάνειας ιστού με μπλε χρωματισμό εκφράστηκε ως ποσοστό ανά συνολική επιφάνεια πεδίου (ποσοστό της επιφάνειας ιστού με μπλε χρωματισμό ανά συνολική επιφάνεια πεδίου). Η λήψη και η ανάλυση εικόνων πραγματοποιήθηκαν με τυφλό τρόπο σε κωδικοποιημένες διαφάνειες.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism για Windows Έκδοση 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Ηνωμένες Πολιτείες). Οι παράμετροι αξιολογήθηκαν για Gaussian

κατανομή χρησιμοποιώντας το τεστ κανονικότητας D'Agostino και Pearson omnibus. Για παραμετρικά δεδομένα, πραγματοποιήθηκαν ζευγοποιημένες δοκιμές t δύο ουρών για σύγκριση μεταξύ των τμημάτων του πνεύμονα που έλαβαν μόνο μπλεομυκίνη με τα τμήματα ελέγχου που εγχύθηκαν με αλατούχο διάλυμα και των τμημάτων του πνεύμονα που έλαβαν έγχυση μπλεομυκίνη συν πινοκεμπρίνη. Για δεδομένα που δεν πληρούσαν τις παραδοχές για την κατανομή Gauss, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή ταιριασμένων ζευγών Wilcoxon με υπογεγραμμένη κατάταξη. Σε όλες τις περιπτώσεις, μια τιμή p μικρότερη από 0.05 ορίστηκε ως σημαντική διαφορά. Όλες οι τιμές αναφέρονται ως μέσοι όροι (± SEM).

Αποτελέσματα

Υγεία των ζώων και ασφάλεια χορήγησης pinocembrin

Οι έλεγχοι υγείας πραγματοποιούνταν τακτικά καθ' όλη τη διάρκεια των περιόδων θεραπείας και της δοκιμής μέχρι την ευθανασία. Αυτό έγινε για να εξακριβωθεί ότι η θεραπεία με pinocembrin δεν προκάλεσε δυσάρεστα προβλήματα υγείας ή δυσμενείς παρενέργειες στα πρόβατα που υποβλήθηκαν στη δοκιμή. Όλα τα ζώα παρέμειναν υγιή καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας με pinocembrin (εβδομάδα 8 έως εβδομάδα 12, Σχήμα 2). Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, τα ζώα συνέχισαν να κερδίζουν βάρος στο αναμενόμενο φυσιολογικό εύρος για αυτά τα πρόβατα, είχαν φυσιολογικό αριθμό λευκών αιμοσφαιρίων και δεν υπήρχαν κατά τα άλλα δυσμενή συμβάντα για την υγεία.

Η χορήγηση Pinocembrin βελτιώνει την έκπτωση της πνευμονικής λειτουργίας που σχετίζεται με την ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης που προκαλείται από τη βλεομυκίνη

Το Σχήμα 3 δείχνει τη λειτουργία των πνευμόνων των διαφορετικών τμημάτων του πνεύμονα μετά από θεραπείες μία φορά την εβδομάδα με pinocembrin για τέσσερις εβδομάδες. Η παράμετρος πνευμονικής λειτουργίας που μετρήθηκε ήταν η συμμόρφωση σε τοπικά πνευμονικά τμήματα και αναφέρεται ως τμηματική συμμόρφωση (Cseg). Γενικά, χαμηλότερα επίπεδα συμμόρφωσης σημαίνουν φτωχότερη λειτουργία στο τμήμα του πνεύμονα (δηλαδή πιο δύσκολο να φουσκώσει και ο πνεύμονας είναι πιο δύσκαμπτος). Όπως αναμενόταν, τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν μόνο τον βλαβερό παράγοντα μπλεομυκίνη, χωρίς πινοσεμβρίνη, είχαν σημαντικά χαμηλότερη μέση τμηματική συμμόρφωση από τα μη θεραπευμένα υγιή πνευμονικά τμήματα ελέγχου (Εικόνα 3Α). Τα τμήματα του πνεύμονα, τα οποία έλαβαν τον βλαπτικό παράγοντα μπλεομυκίνη με χορήγηση πινοσεμπρίνης, είχαν υψηλότερη μέση τμηματική συμμόρφωση, η οποία δεν διέφερε σημαντικά από τα μη υποβληθέντα σε θεραπεία υγιή πνευμονικά τμήματα ελέγχου (Εικόνα 3Α). Μια άλλη αξιολόγηση της πνευμονικής λειτουργίας που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ποσοστιαία αλλαγή στη συμμόρφωση από την αρχική τιμή (Eig 3C). Αυτό μέτρησε την αλλαγή στη συμμόρφωση από την έναρξη της μελέτης (πριν από τις θεραπείες με bleomycin και pinocembrin) έως μετά την ολοκλήρωση της τελικής θεραπείας pinocembrin. Η αξιολόγηση έδειξε ότι η συμμόρφωση στα πνευμονικά τμήματα που έλαβαν θεραπεία με πινοσεμβρίνη είχε βελτιωθεί σημαντικά μετά τις χορηγήσεις πινοσεμβρίνης μία φορά την εβδομάδα κατά τη διάρκεια της 4-εβδομαδιαίας περιόδου θεραπείας (Εικόνα 3C).

Η χορήγηση Pinocembrin μειώνει τη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων που προκαλείται από τη βλεομυκίνη στο υγρό BAL

Το Σχήμα 4 δείχνει δεδομένα κυττάρων BAL μετά από θεραπείες έγχυσης μία φορά την εβδομάδα με pinocembrin για μια περίοδο θεραπείας 4- εβδομάδας. Τα κύτταρα BAL ελήφθησαν δείγματα από τμήματα πνεύμονα κατά τη διάρκεια της εβδομάδας 12 της δοκιμής, δύο ημέρες πριν από τη θανάτωση των προβάτων. Οι μετρήσεις κυττάρων που αξιολογήθηκαν στο υγρό BAL ήταν μόνο ουδετερόφιλα και το άθροισμα των κύριων φλεγμονωδών κυττάρων, που περιελάμβαναν τα ουδετερόφιλα, τα ηωσινόφιλα και τα λεμφοκύτταρα. Όπως αναμενόταν, τα υγιή τμήματα του πνεύμονα ελέγχου, τα οποία δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία, είχαν σχετικά χαμηλό αριθμό φλεγμονωδών κυττάρων στο υγρό BAL (Εικόνα 4).

Αντίθετα, τα τμήματα του πνεύμονα που τραυματίστηκαν από τη βλεομυκίνη, χωρίς πινοσεμβρίνη, είχαν σημαντικά υψηλό αριθμό ουδετερόφιλων και άλλων φλεγμονωδών κυττάρων στο υγρό BAL σε σύγκριση με υγιή τμήματα ελέγχου (Eig 4). Τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν τον επιβλαβή παράγοντα βλεομυκίνη και είχαν θεραπείες με πινοσεμπρίνη, έδειξαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό ουδετερόφιλων και φλεγμονωδών κυττάρων σε σύγκριση με τους αριθμούς κυττάρων που ελήφθησαν δειγματοληπτικά από τμήματα πνεύμονα, τα οποία έλαβαν μόνο μπλεομυκίνη χωρίς πινοσεμπρίνη (Εικόνα 4).

Η επίδραση της πινοσεμπρίνης στα πνευμονικά παρεγχυματικά Τ κύτταρα

Το Σχήμα 5 δείχνει δεδομένα Τ-λεμφοκυττάρων μετά από τέσσερις θεραπείες έγχυσης με πινοσεμβρίνη, που χορηγήθηκαν μία φορά την εβδομάδα. Τα Τ κύτταρα αξιολογήθηκαν στο παρέγχυμα των τμημάτων του πνεύμονα που υποβλήθηκαν σε διαφορετική αγωγή, τα οποία ελήφθησαν δειγματοληψία μετά το θάνατο (εβδομάδα 12). Όπως αναμενόταν, τα υγιή τμήματα του πνεύμονα ελέγχου, τα οποία δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία, είχαν σχετικά χαμηλό αριθμό CD8t και CD4* Τ κυττάρων στο πνευμονικό παρέγχυμα (Εικόνα 5).

Αντίθετα, τα τμήματα του πνεύμονα που τραυματίστηκαν από τη βλεομυκίνη, χωρίς θεραπεία με πινοσεμβρίνη, είχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό CD8 και CD4* Τ κυττάρων στο πνευμονικό παρέγχυμα σε σύγκριση με υγιή τμήματα ελέγχου (Eig 5). Τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν τον βλαπτικό παράγοντα βλεομυκίνη και είχαν θεραπείες με πινοσεμβρίνη, έδειξαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό κυττάρων CD8t και CD4 συν Τ στο παρέγχυμα του πνεύμονα σε σύγκριση με τους αριθμούς κυττάρων που ελήφθησαν δείγματα από τμήματα πνεύμονα, τα οποία έλαβαν μόνο μπλεομυκίνη χωρίς πινοκεμπρίνη (Eig 5 ).

κάθε παράμετρος που δοκιμάστηκε (Eig⑥). Είναι σημαντικό ότι τα τμήματα του πνεύμονα, τα οποία έλαβαν τον τραυματικό παράγοντα βλεομυκίνη και είχαν θεραπείες με πινοκεμπρίνη, είχαν χαμηλότερες μέσες βαθμολογίες για κάθε παράμετρο που αξιολογήθηκε (Eig ⑥). Η θεραπεία με pinocembrin μείωσε σημαντικά τη φλεγμονή και τη συνολική βαθμολογία παθολογίας σε σύγκριση με τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης (Εικ. 6). Ενώ τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν έγχυση μπλεομυκίνης και πινοσεμβρίνης είχαν χαμηλότερες βαθμολογίες ίνωσης σε σύγκριση με τα τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 6).

Οι επιδράσεις της pinocembrin στο περιεχόμενο του συνδετικού ιστού

Οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις των χρωματισμένων με τρίχρωμο τομών του Masson έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε την ποσότητα συνδετικού ιστού που προκλήθηκε από έγχυση μπλεομυκίνης (Εικ7Α). Τα δεδομένα στο Σχήμα 7Β έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε σημαντικά το ποσοστό της κυανής χρώσης σε τμήματα πνευμόνων που εκτέθηκαν σε βλεομυκίνη σε σύγκριση με πνεύμονα που εγχύθηκε με μπλεομυκίνη που δεν έλαβε θεραπεία με πινοσεμβρίνη (Εικ. 7Β). Το Σχήμα ZC δείχνει δεδομένα για τον προσδιορισμό υδροξυπρολίνης για την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο μετά από τέσσερις εβδομαδιαίες θεραπείες με πινοσεμβρίνη. Τα δεδομένα στο Σχήμα 7C συλλέχθηκαν και από τα 10 ζώα στη δοκιμή και έδειξαν ότι η έγχυση μπλεομυκίνης μόνη της (χωρίς πινοσεμβρίνη) αύξησε σημαντικά τη συγκέντρωση πρωτεΐνης κολλαγόνου σε σύγκριση με αντίστοιχες μετρήσεις από υγιή τμήματα ελέγχου του πνεύμονα, τα οποία δεν έλαβαν ούτε μπλεομυκίνη ούτε πινοσεμβρίνη. Η χορήγηση πινοσεμπρίνης, ωστόσο, δεν μείωσε την επαγόμενη από τη βλεομυκίνη αύξηση στη συγκέντρωση κολλαγόνου (Εικ. 7C).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα φυσιολογικά και φαρμακολογικά σχετικό μοντέλο προβάτου για την πνευμονική ίνωση [12,13] για να εξακριβώσει την αποτελεσματικότητα της πινοσεμβρίνης. Συνολικά, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη ήταν αποτελεσματική στη βελτίωση της πειραματικά επαγόμενης πνευμονικής παθολογίας και δεν προκάλεσε δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία και στα δέκα πρόβατα που υποβλήθηκαν στη δοκιμή.

κάθε παράμετρος που δοκιμάστηκε (Εικ⑥). Είναι σημαντικό ότι τα τμήματα του πνεύμονα, τα οποία έλαβαν τον τραυματικό παράγοντα βλεομυκίνη και είχαν θεραπείες με πινοκεμπρίνη, είχαν χαμηλότερες μέσες βαθμολογίες για κάθε παράμετρο που αξιολογήθηκε (Eig ⑥). Η θεραπεία με pinocembrin μείωσε σημαντικά τη φλεγμονή και τη συνολική βαθμολογία παθολογίας σε σύγκριση με τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης (Εικ. 6). Ενώ τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν έγχυση μπλεομυκίνης και πινοσεμβρίνης είχαν χαμηλότερες βαθμολογίες ίνωσης σε σύγκριση με τα τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 6).

Οι επιδράσεις της pinocembrin στο περιεχόμενο του συνδετικού ιστού

Οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις των χρωματισμένων με τρίχρωμο τομών του Masson έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε την ποσότητα συνδετικού ιστού που προκλήθηκε από έγχυση μπλεομυκίνης (Εικ7Α). Τα δεδομένα στο Σχήμα 7Β έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε σημαντικά το ποσοστό της κυανής χρώσης σε τμήματα πνευμόνων που εκτέθηκαν σε βλεομυκίνη σε σύγκριση με πνεύμονα που εγχύθηκε με μπλεομυκίνη που δεν έλαβε θεραπεία με πινοσεμβρίνη (Εικ. 7Β). Το Σχήμα ZC δείχνει δεδομένα για τον προσδιορισμό υδροξυπρολίνης για την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο μετά από τέσσερις εβδομαδιαίες θεραπείες με πινοσεμβρίνη. Τα δεδομένα στο Σχήμα 7C συλλέχθηκαν και από τα 10 ζώα στη δοκιμή και έδειξαν ότι η έγχυση μπλεομυκίνης μόνη της (χωρίς πινοσεμβρίνη) αύξησε σημαντικά τη συγκέντρωση πρωτεΐνης κολλαγόνου σε σύγκριση με αντίστοιχες μετρήσεις από υγιή τμήματα ελέγχου του πνεύμονα, τα οποία δεν έλαβαν ούτε μπλεομυκίνη ούτε πινοσεμβρίνη. Η χορήγηση πινοσεμπρίνης, ωστόσο, δεν μείωσε την επαγόμενη από τη βλεομυκίνη αύξηση στη συγκέντρωση κολλαγόνου (Εικ. 7C).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα φυσιολογικά και φαρμακολογικά σχετικό μοντέλο προβάτου για την πνευμονική ίνωση [12,13] για να εξακριβώσει την αποτελεσματικότητα της πινοσεμβρίνης. Συνολικά, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη ήταν αποτελεσματική στη βελτίωση της πειραματικά επαγόμενης πνευμονικής παθολογίας και δεν προκάλεσε δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία και στα δέκα πρόβατα που υποβλήθηκαν στη δοκιμή.

Οι επιδράσεις του pinocembrin στην ιστοπαθολογία

Το Eig6 δείχνει δεδομένα μοριοδότησης ιστοπαθολογίας μετά από τέσσερις θεραπείες μία φορά την εβδομάδα με pinocembrin. Οι ιστοπαθολογικές παράμετροι που βαθμολογήθηκαν ήταν η φλεγμονή, η ίνωση και η συνολική παθολογία. Όπως ήταν αναμενόμενο για έναν φυσιολογικό υγιή πνεύμονα, τα τμήματα του πνεύμονα ελέγχου που παρέμειναν χωρίς θεραπεία, είχαν χαμηλές βαθμολογίες για κάθε παθολογική παράμετρο που αξιολογήθηκε (Εικ. 6). Αντίθετα, τα τμήματα του πνεύμονα που τραυματίστηκαν από τη βλεομυκίνη, χωρίς θεραπεία με πινοσεμβρίνη, είχαν σημαντικά υψηλές μέσες βαθμολογίες για

κάθε παράμετρος που δοκιμάστηκε (Eig⑥). Είναι σημαντικό ότι τα τμήματα του πνεύμονα, τα οποία έλαβαν τον τραυματικό παράγοντα βλεομυκίνη και είχαν θεραπείες με πινοκεμπρίνη, είχαν χαμηλότερες μέσες βαθμολογίες για κάθε παράμετρο που αξιολογήθηκε (Eig ⑥). Η θεραπεία με pinocembrin μείωσε σημαντικά τη φλεγμονή και τη συνολική βαθμολογία παθολογίας σε σύγκριση με τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης (Εικ. 6). Ενώ τα τμήματα του πνεύμονα που έλαβαν έγχυση μπλεομυκίνης και πινοσεμβρίνης είχαν χαμηλότερες βαθμολογίες ίνωσης σε σύγκριση με τα τμήματα που έλαβαν μόνο έγχυση βλεομυκίνης, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 6).

Οι επιδράσεις της pinocembrin στο περιεχόμενο του συνδετικού ιστού

Οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις των χρωματισμένων με τρίχρωμο τομών του Masson έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε την ποσότητα συνδετικού ιστού που προκλήθηκε από έγχυση μπλεομυκίνης (Εικ7Α). Τα δεδομένα στο Σχήμα 7Β έδειξαν ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε σημαντικά το ποσοστό της κυανής χρώσης σε τμήματα πνευμόνων που εκτέθηκαν σε βλεομυκίνη σε σύγκριση με πνεύμονα που εγχύθηκε με μπλεομυκίνη που δεν έλαβε θεραπεία με πινοσεμβρίνη (Εικ. 7Β). Το Σχήμα ZC δείχνει δεδομένα για τον προσδιορισμό υδροξυπρολίνης για την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο μετά από τέσσερις εβδομαδιαίες θεραπείες με πινοσεμβρίνη. Τα δεδομένα στο Σχήμα 7C συλλέχθηκαν και από τα 10 ζώα στη δοκιμή και έδειξαν ότι η έγχυση μπλεομυκίνης μόνη της (χωρίς πινοσεμβρίνη) αύξησε σημαντικά τη συγκέντρωση πρωτεΐνης κολλαγόνου σε σύγκριση με αντίστοιχες μετρήσεις από υγιή τμήματα ελέγχου του πνεύμονα, τα οποία δεν έλαβαν ούτε μπλεομυκίνη ούτε πινοσεμβρίνη. Η χορήγηση πινοσεμπρίνης, ωστόσο, δεν μείωσε την επαγόμενη από τη βλεομυκίνη αύξηση στη συγκέντρωση κολλαγόνου (Εικ. 7C).

Η αποτελεσματικότητα του pinocembrin στη βελτίωση πολλών παραμέτρων της νόσου σε ένα μοντέλο προβάτου πειραματικής πνευμονοπάθειας

Στην τρέχουσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το pinocembrin ήταν σε θέση να βελτιώσει αρκετές παραμέτρους της νόσου στο μοντέλο προβάτου της πνευμονικής ίνωσης. Τα κύρια ευρήματά μας ήταν ότι η χορήγηση πινοσεμβρίνης μπόρεσε να βελτιώσει τη λειτουργία των πνευμόνων, να μειώσει τη φλεγμονή των πνευμόνων και να μειώσει τις συνολικές βαθμολογίες παθολογίας, οι οποίες προκλήθηκαν από τραυματισμό από μπλεομυκίνη. Είναι σημαντικό ότι οι στατιστικές αναλύσεις των δεδομένων αποκάλυψαν ότι αυτές οι ενδείξεις της νόσου βελτιώθηκαν σημαντικά σε πνευμονικά τμήματα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πινοσεμβρίνη σε σύγκριση με τα αντίστοιχα δεδομένα από τραυματισμένα με βλεομυκίνη και μη θεραπευμένα τμήματα πνεύμονα.

Στο μοντέλο προβάτου της πνευμονικής ίνωσης που προκαλείται από τη βλεομυκίνη, ο τραυματισμός της βλεομυκίνης προκαλεί απώλεια εντοπισμένης πνευμονικής συμμόρφωσης (ένα μέτρο ακαμψίας των πνευμόνων) σε τμήματα πνευμόνων που έχουν εγχυθεί με βλεομυκίνη [12-14,16,22,23]. Στην τρέχουσα μελέτη , διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη βελτίωσε σημαντικά τη λειτουργική συμμόρφωση στα τμήματα των πνευμόνων που τραυματίστηκαν από τη βλεομυκίνη. Αυτό έδειξε ότι η θεραπεία με pinocembrin σε τραυματισμένα τμήματα του πνεύμονα είχε ως αποτέλεσμα αυτά τα τμήματα να λειτουργούν σε υψηλότερα επίπεδα από ό,τι εάν αφεθούν χωρίς θεραπεία.

Στην τρέχουσα μελέτη, η ταυτοποίηση φλεγμονωδών κυττάρων πλύσης πνεύμονα που ανακτήθηκαν από τμήματα πνεύμονα έδειξε ότι η θεραπεία με πινοσεμβρίνη μείωσε σημαντικά τον αριθμό των φλεγμονωδών κυττάρων που καταλαμβάνουν τους οριακούς χώρους των κυψελίδων και των μικρών αεραγωγών. Ο κύριος τύπος φλεγμονώδους κυττάρου που μειώθηκε στο υγρό πλύσης πνεύμονα ήταν τα ουδετερόφιλα, τα οποία μειώθηκαν από 7,4 τοις εκατό των συνολικών κυττάρων BAL στα τμήματα πνεύμονα χωρίς θεραπεία με φάρμακα σε 3,7 τοις εκατό στα τμήματα του πνεύμονα που είχαν τραυματιστεί με βλεομυκίνη που υποβλήθηκαν σε αγωγή με πινοσεμβρίνη. Η σχετιζόμενη με την πινοσεμβρίνη μείωση των CD4 και CD8 Τ κυττάρων στο πνευμονικό παρέγχυμα ήταν απολύτως συνεπής με τη μείωση των φλεγμονωδών κυττάρων που ανακτήθηκαν από το υγρό έκπλυσης πνεύμονα των τμημάτων του πνεύμονα που εκτέθηκαν σε πινοσεμβρίνη και μπλεομυκίνη. Τα CD4 και CD8 συν Τ κύτταρα είναι σημαντικά συστατικά στους κυτταρικούς βραχίονες πολλών ανοσολογικών αποκρίσεων. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι το pinocembrin είχε ισχυρές αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες στο μοντέλο της νόσου που μελετήθηκε.

Όσον αφορά τις βαθμολογίες ιστοπαθολογίας, οι μέσες βαθμολογίες φλεγμονής και συνολικής παθολογίας βελτιώθηκαν στα τραυματισμένα τμήματα του πνεύμονα μετά τη θεραπεία με pinocembrin. Είναι σημαντικό ότι αυτές οι ενδείξεις, ήταν στατιστικά χαμηλότερες στους κατεστραμμένους πνεύμονες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πινοσεμβρίνη, σε σύγκριση με τους πειραματικά τραυματισμένους πνεύμονες χωρίς θεραπεία με πινοσεμβρίνη. Ενώ οι μέσες βαθμολογίες παθολογίας της ίνωσης ήταν χαμηλότερες στους κατεστραμμένους πνεύμονες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πινοσεμβρίνη, σε σύγκριση με τους πειραματικά τραυματισμένους πνεύμονες χωρίς θεραπεία με πινοσεμβρίνη, αυτές δεν είχαν στατιστική σημασία.

Καθώς τα δεδομένα βαθμολογίας της παθολογίας της ίνωσης δεν ήταν οριστικά για την πινοσεμβρίνη, ο προσδιορισμός υδροξυπρολίνης διεξήχθη σε δείγματα ιστού από τα διαφορικά επεξεργασμένα τμήματα πνεύμονα. Ο προσδιορισμός υδροξυπρολίνης μετρά το επίπεδο κολλαγόνου σε ένα δείγμα πρωτεΐνης και είναι ένα μέτρο ανάγνωσης χρυσού προτύπου για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων ίνωσης στους ιστούς. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι η πινοσεμβρίνη δεν μείωσε την εναπόθεση εξωκυτταρικού κολλαγόνου που σχετίζεται με τραυματισμό της βλεομυκίνης. Η ανάλυση τριχρωμίας του Masson (άλλο μέτρο ανάγνωσης που χρησιμοποιείται συχνά για την αξιολόγηση της έκτασης της ίνωσης) έδειξε ότι το ποσοστό της μπλε χρώσης (δηλαδή μέτρο της περιεκτικότητας του συνδετικού ιστού) ήταν σημαντικά χαμηλότερο σε τομές πνεύμονα που εκτέθηκαν σε βλεομυκίνη και σε θεραπείες με πινοσεμβρίνη σε σύγκριση με εκτεθειμένες σε μπλεομυκίνη πνευμονικές τομές που δεν έλαβαν φαρμακευτική αγωγή. Συνολικά, τα δεδομένα τόσο από τις δοκιμές υδροξυπρολίνης όσο και από τις δοκιμασίες τριχρωμίου του Masson έδειξαν ότι η πινοσεμβρίνη είχε την ικανότητα να μειώνει ορισμένες πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας (που φαίνεται από τα δεδομένα τριχρωμίας του Masson), αλλά όχι απαραίτητα το κολλαγόνο (όπως επιβεβαιώνεται από τα δεδομένα υδροξυπρολίνης). Συνολικά, τα δεδομένα από τις βαθμολογίες ίνωσης, το τρίχρωμο Masson και τις δοκιμές υδροξυ-προλίνης έδειξαν ότι η πινοσεμβρίνη είχε μόνο μέτριες αντι-ινωτικές και αντι-αναδιαρθρωτικές ιδιότητες.

Είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι πολλές βιοδραστικές ενώσεις έχουν αντιφλεγμονώδεις καθώς και αντι-ινωτικές ιδιότητες μέσω της τροποποίησης αρκετών προφλεγμονωδών και προφλεγμονωδών βιοδεικτών όπως TNF, TGF-ενδοθηλίνη-1, IFN-y, ιντερλευκίνες, VEGF, FGF -2, PDGF MMP-9, TIMPs, NF-kB και κολλαγόνο-Ι [24]. Επιπλέον, είχε βρεθεί ότι η χορήγηση αντιφλεγμονωδών ενώσεων σε μοντέλα πνευμονικής ίνωσης ποντικών με έγχυση βλεομυκίνη συχνά είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της ινωτικής παθολογίας. Αυτό ίσχυε ιδιαίτερα εάν τα αντιφλεγμονώδη μόρια εφαρμόστηκαν νωρίς μετά την έκθεση στη βλεομυκίνη κατά τη διάρκεια του φλεγμονώδους (προ-ινωτικού) σταδίου της παθολογίας σε αυτά τα μοντέλα [25]. Είναι σημαντικό όμως, όταν πολλά από αυτά τα αντιφλεγμονώδη μόρια δοκιμάστηκαν στην κλινική για τη θεραπεία ινωτικών παθήσεων, βρέθηκε ότι ήταν αναποτελεσματικά [25]. Το pinocembrin ανέστειλε επίσης τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες TNF-c, IL-1 και IL-6 και μείωσε τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις μέσω της κατάθλιψης της οδού σηματοδότησης NF-K 9, 10. Περαιτέρω μηχανιστικές μελέτες με LPS ποντικού και βλεομυκίνη Τα μοντέλα πρότειναν ότι ο TLR4 (υποδοχέας 4 που μοιάζει με toll) και τα φλεγμονοσώματα συνδέονται αιτιολογικά με την καταστολή της πινοκεμβρίνης του φλεγμονώδους σήματος NF-K [2]. Όπως συμβαίνει με όλα τα επαγόμενα από τη βλεομυκίνη μοντέλα πνευμονικής ίνωσης, ο χρόνος της φαρμακευτικής παρέμβασης είναι κρίσιμος για τον προσδιορισμό της σχετικής αντι-ινωτικής και αντιφλεγμονώδους συμβολής της θεραπείας [25. Ο χρόνος της θεραπείας με πινοσεμβρίνη στην τρέχουσα μελέτη ήταν 7 ημέρες μετά την τελική έγχυση βλεομυκίνης, η οποία βρίσκεται στην αρχή της ινωτικής φάσης σε αυτό το μοντέλο[12,13]. Αν και η φλεγμονή ήταν πολύ χαμηλότερη σε αυτό το χρονικό σημείο-7 της ημέρας, παρ' όλα αυτά ήταν παρούσα, επομένως δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι ορισμένες από τις αδύναμες αντι-ινωτικές επιδράσεις της pinocembrin οφείλονταν στις αντιφλεγμονώδεις δραστηριότητές της.

Προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε αυτό το μοντέλο προβάτου πνευμονικής ίνωσης για να αξιολογήσουμε το θεραπευτικό δυναμικό δύο άλλων φαρμάκων, τα αποτελέσματα των οποίων μπορεί να είναι χρήσιμα για τη σύγκριση των επιδράσεων της πινοσεμβρίνης που βρέθηκαν στην τρέχουσα μελέτη. Δοκιμάσαμε έναν αναστολέα του διαύλου ιόντων KCa3.1 που ονομάζεται senicapoc [15,16] και διερευνήσαμε επίσης την αποτελεσματικότητα του εγκεκριμένου από την FDA φαρμάκου πιρφενιδόνη στο μοντέλο[14]. Τα δημοσιευμένα σχέδια της μελέτης ήταν ουσιαστικά παρόμοια με την τρέχουσα μελέτη pinocembrin, με κάθε μελέτη να χρησιμοποιεί 10 πρόβατα ανά ομάδα. Οι περίοδοι θεραπείας με φάρμακα ήταν παρόμοιας διάρκειας, τέσσερις έως πέντε εβδομάδες για κάθε φάρμακο. Η κύρια διαφορά ήταν ότι στις μελέτες senicapoc και pirfenidone, τα φάρμακα χορηγήθηκαν από το στόμα, ενώ η pinocembrin χορηγήθηκε ενδοπνευμονικά σε τοπικά πνευμονικά τμήματα. Επιπλέον, ολόκληρος ο πνεύμονας δεν έλαβε pinocembrin στην τρέχουσα μελέτη, ενώ ολόκληρος ο πνεύμονας εκτέθηκε σε φάρμακα στις δοκιμές pirfenidone και senicapoc. Οι αναλύσεις των δεδομένων μεταξύ αυτών των μελετών αποκαλύπτουν ότι τα επίπεδα βελτιώσεων στους δείκτες ασθένειας της συμμόρφωσης των πνευμόνων, των συνολικών βαθμολογιών παθολογίας και της φλεγμονής ήταν σε παρόμοιο επίπεδο για τη δοκιμή pinocembrin σε σύγκριση με τις άλλες δοκιμές φαρμάκων που πραγματοποιήθηκαν με το μοντέλο προβάτου. Το ένα σημαντικό σημείο διαφοράς μεταξύ αυτών των μελετών ήταν ότι στις προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες, η χορήγηση πιρφενιδόνης ή senicapoc είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές μειώσεις στη συγκέντρωση πρωτεΐνης κολλαγόνου, όπως αξιολογήθηκε από τον προσδιορισμό υδροξυπρολίνης [14, 16] Συνολικά, η σύγκριση μεταξύ των δοκιμασμένων Τα φάρμακα υποδηλώνουν ότι η σημαντική βελτίωση στη λειτουργία και την παθολογία του πνεύμονα είναι κυρίως μέσω των αντιφλεγμονωδών επιδράσεων της pinocembrin και σε μικρότερο βαθμό λόγω των αντι-ινωτικών της δράσεων.

Στην τρέχουσα μελέτη, οι τέσσερις δόσεις των 7 mg πινοσεμπρίνης που χορηγήθηκαν στους πνεύμονες σε εβδομαδιαία διαστήματα βρέθηκε ότι ήταν καλά ανεκτές και δεν ήταν ανεπιθύμητες παρενέργειες. Αυτό συμφωνεί με δεδομένα από μια τυχαιοποιημένη διπλά-τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο δοκιμή με 58 υγιείς ασθενείς, η οποία έδειξε ότι η ενδοφλέβια ένεση πινοσεμπρίνης ήταν καλά ανεκτή έως και 120 mg την ημέρα [26]. Η δοκιμή αξιολόγησε τόσο τα σχήματα εφάπαξ όσο και πολλαπλών δόσεων και διαπίστωσε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές ανησυχίες για την ασφάλεια που θα απέκλειαν οποιαδήποτε μελλοντική κλινική εξέλιξη της χορήγησης πινοσεμβρίνης μέσω ένεσης [26]. Τα δεδομένα στην τρέχουσα μελέτη έδειξαν ότι η άμεση ενδοπνευμονική χορήγηση πινοσεμπρίνης δεν ήταν μόνο ασφαλής και βιώσιμη, αλλά υποστήριξε επίσης την ιδέα ότι αυτό το φλαβονοειδές μπορεί να είναι χρήσιμο για τη θεραπεία ορισμένων φλεγμονωδών ασθενειών του πνεύμονα. Το άσθμα είναι μια σημαντική αλλεργική νόσος των αεραγωγών που θα ήταν επιδεκτική χορήγησης pinocembrin στους πνεύμονες. Προκαταρκτικά στοιχεία που υποστηρίζουν τις αντιασθματικές επιδράσεις του pinocembrin έχουν δειχθεί σε μια μελέτη όπου οι ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις pinocembrin ανέστειλαν την αλλεργική νόσο των αεραγωγών σε ποντίκια [20]. Θα μπορούσε, επομένως, εύλογα να αναμένεται ότι η τοπική χορήγηση της πινοσεμβρίνης αποκλειστικά στους πνεύμονες θα ήταν πιο αποτελεσματική στη θεραπεία καταστάσεων που μοιάζουν με άσθμα στην κλινική.

συμπέρασμα

Συμπερασματικά, τα ισχυρά και σημαντικά δεδομένα που προέκυψαν από αυτήν τη μελέτη ήταν συνεπή με το pinocembrin να είναι βιοδραστικό και να βελτιώνει τις βασικές παραμέτρους της νόσου στο πλαίσιο του ζωικού μοντέλου. Οι εντυπωσιακές αντιφλεγμονώδεις και μέτριες αντι-ινωτικές επιδράσεις αναδιαμόρφωσης της χορήγησης pinocembrin πιθανότατα συνδέονταν με την ικανότητά της να βελτιώνει την παθολογία των πνευμόνων και τη λειτουργική συμμόρφωση.