Πώς το εκχύλισμα Cistanche μειώνει τη φλεγμονώδη υπερπλασία

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Μείωση της φλεγμονώδους υπερπλασίας στο έντερο σε ποντίκια με τάση για καρκίνο του παχέος εντέρου με υδατικό εκχύλισμα Cistanche deserticola

Yamin Jia, 1,2 et al

CistancheΤο deserticola έχει χρησιμοποιηθεί συνήθως στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική για τη θεραπεία πολλών προβλημάτων υγείας, συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου ευερέθιστου εντέρου ή της δυσκοιλιότητας. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να ελέγξει την αποτελεσματικότητα ενός υδατικού εκχυλίσματος C. deserticola στην πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα μοντέλο ποντικού. Το πλούσιο σε πολυσακχαρίτες υδατικό εκχύλισμα του C. deserticola παρασκευάστηκε με βρασμό της σκόνης του στελέχους του σε απεσταγμένο νερό. Τα μηδενικά ποντίκια Tgfb1Rag2 χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικό μοντέλο. Εδώ δείξαμε ότι η χορήγηση υδατικού εκχυλίσματος C. deserticola μείωσε σημαντικά τον αριθμό των βλεννογόνωνυπερπλασίακαι εντερική λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο σε ποντίκια. Αυτή η ευεργετική επίδραση συσχετίστηκε με σημαντική διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος, που αποδεικνύεται από τη μεγέθυνση των σπλήνων με αυξημένο αριθμό σπληνικών μακροφάγων και φυσικών φονικών κυττάρων και με ισχυρότερη κυτταροτοξικότητα των σπληνοκυττάρων. Το in vitro υδατικό εκχύλισμα του C. deserticola ενίσχυσε την κυτταροτοξικότητα των αρχαίων σπληνοκυττάρων έναντι μιας ανθρώπινης κυτταρικής σειράς καρκίνου του παχέος εντέρου και σε καλλιέργειες μακροφάγων ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση της συνθάσης II του νιτρικού οξειδίου και διέγειρε τη φαγοκυττάρωση. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η από του στόματος χορήγηση εκχυλίσματος C. deserticola μειώνειφλεγμονώδηςυπερπλαστικόλοίμωξη από πολύποδες και ελικοβακτηρίδιο σε ποντίκια λόγω της ανοσοδιεγερτικής του δράσης, υποδηλώνοντας ότι το εκχύλισμα C. deserticola μπορεί να έχει τη δυνατότητα να αποτρέψει διαταραχές φλεγμονής του εντέρου συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Πνευματικά δικαιώματα © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Λέξεις-κλειδιά: φυτική ανοσορύθμιση;Cistancheεκχύλισμα; πολυσακχαρίτες; ελικοβακτηρίδιο?φλεγμονώδηςυπερπλασία; καρκίνο του παχέος εντέρου.

Cistancheεκχύλισμαμπορεί να μειώσειΦλεγμονώδηςυπερπλασία

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο τρίτος πιο συχνός καρκίνος στους άνδρες και ο δεύτερος στις γυναίκες παγκοσμίως και κατατάσσεται στην τέταρτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο (8 τοις εκατό όλων των θανάτων από καρκίνο· Ferlay et al., 2010). Επιδημιολογικές μελέτες υποδεικνύουν ότι πολλοί παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με αυτήν την ασθένεια, συμπεριλαμβανομένων γενετικών (π.χ. οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου) (Strate and Syngal, 2005) και διατροφικών παραγόντων (π.χ. κόκκινο κρέας και χαμηλή περιεκτικότητα σε φυτικές ίνες; Chao et al., 2005; Park et al., 2005 al., 2005), καιφλεγμονώδηςασθένειες του εντέρου (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Μέχρι σήμερα, παρά τα πολλά νέα κυτταροτοξικά φάρμακα και τις βελτιωμένες χειρουργικές και ακτινοθεραπευτικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία αυτής της νόσου (Cunningham et al., 2010), ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει ανίατο. περίπου 608.000 θάνατοι από αυτή την ασθένεια υπολογίζονται παγκοσμίως το 2008 (Ferlay et al., 2010). Ως εκ τούτου, χρειάζονται νέες θεραπείες και ένας υποψήφιος είναι η ανοσοθεραπεία. Διάφορες ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις έχουν αξιολογηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου και τα αποτελέσματα μέχρι στιγμής είναι ενθαρρυντικά (Burgdorf et al., 2009). Οι φυτικοί πολυσακχαρίτες έχουν αποδειχθεί ότι έχουν συγκεκριμένες ανοσορυθμιστικές δραστηριότητες (Jiang et al., 2010), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα φυτικά προϊόντα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως ειδικό ανοσοδιεγερτικό ανοσοενισχυτικό κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου.

CistancheΤο deserticola Ma, γνωστό ως Rou Cong Rong στην κινεζική βοτανοθεραπεία, έχει συμπεριληφθεί σε φυτικές συνταγές για πολλά προβλήματα υγείας, όπως η ανικανότητα, η νοσηρή λευκόρροια και το σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου/δυσκοιλιότητα (Jiang and Tu, 2009). Πειραματικές μελέτες έχουν αποκαλύψει διαφορετικές βιολογικές δραστηριότητες από διαφορετικά εκχυλίσματα του C. deserticola. το εκχύλισμα φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών αυτού του βοτάνου έχει δράση κατά της κούρασης σε ποντίκια (Cai et al., 2010) και αναλγητική και αντι-φλεγμονώδηςεπιδράσεις σε τρωκτικά (Lin et al., 2002), ενώ οι πολυσακχαρίτες του διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των Τ- και Β-λεμφοκυττάρων σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα του εκχυλίσματος πολυσακχαριτών του C. deserticola στη διέγερση της ανοσολογικής απόκρισης in vivo δεν έχει ακόμη εξεταστεί.

Rag2^-/-ποντίκια δεν έχουν ώριμα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα και στο μικτό υπόβαθρο (~97 τοις εκατό 129 S6 και ~3 τοις εκατό CF-1) αναπτύσσουν αυθόρμητα σχετιζόμενη με τη φλεγμονήυπερπλασίαστο έντερο (Engle et al., 1999). Η γενετική εισαγωγή του μηδενικού αλληλόμορφου Tgfb1 (γονίδιο μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα b1 (TGF-b1)) σε αυτό το στέλεχος ποντικών έχει ως αποτέλεσμα περαιτέρω εξέλιξη τηςυπερπλασίαστο αδένωμα και το καρκίνωμα (Engle et al., 2002), και η παθογόνος κολίτιδα που εξαρτάται από τη μικροχλωρίδα απαιτείται για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (Engle et al., 2002), υποδηλώνοντας ότι αυτό το στέλεχος ποντικών παρέχει ένα ιδανικό μοντέλο για η εξέταση μιας πιθανής θεραπείας στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου που προκαλείται από φλεγμονή/ΙΦΝΕ. Σε αυτή τη μελέτη, καταδεικνύουμε για πρώτη φορά την αποτελεσματικότητα του πλούσιου σε πολυσακχαρίτες υδατικού εκχυλίσματος του C. deserticola στη μείωση τηςφλεγμονώδηςυπερπλασίασε αυτό το μοντέλο.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Πλούσιο σε πολυσακχαρίτες υδατικό εκχύλισμα παρασκευάσματος C. deserticola.

Το φυτικό C. deserticola συγκομίστηκε από τον Dr. Y. Guo (Γεωπονικό Πανεπιστήμιο της Κίνας) στην αυτόνομη περιοχή της Εσωτερικής Μογγολίας, στην Κίνα. Η σκόνη ολόκληρων αποξηραμένων στελεχών (300 g) έβρασε σε διπλά απεσταγμένο νερό δύο φορές: πρώτα για 1 ώρα σε 500 mL νερού, ακολουθούμενη από συλλογή του υπερκειμένου και στη συνέχεια για 45 λεπτά σε 400 mL νερού. Τα υπερκείμενα διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman (μέτριας ταχύτητας) μετά από κάθε βρασμό, και συνενώθηκαν μαζί. Το διάλυμα εκχυλίσματος ξηράνθηκε με λυοφιλοποίηση και διατηρήθηκε στους 80 C. Το τελικό προϊόν ήταν περίπου 10 g (απόδοση: -3 τοις εκατό).

Ποντίκια και κυτταροκαλλιέργειες. Ποντίκια με έλλειψη TGF-b1 (Tgfb1 συν /- Rag2^-/-) στο μικτό υπόβαθρο (~97 τοις εκατό 129 S6 και ~3 τοις εκατό CF-1) ελήφθησαν από μια αποικία αναπαραγωγής που διατηρήθηκε υπό συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνους στην εγκατάσταση ζώων στο ερευνητικό κέντρο Jack Bell (Βανκούβερ, BC). Αυτά τα ποντίκια προήλθαν από το αποθετήριο Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου στο Frederick, MD, ΗΠΑ). Τα ποντίκια C57BL/6 J (B6) (αρσενικά, ηλικίας 8-10 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το εργαστήριο Jackson (Bar Harbor, ME, ΗΠΑ). Όλα τα ζώα για τα πειράματα διατηρήθηκαν σε συμβατική στέγαση και δίαιτα (5001 Rodent Diet, LabDiet) μετά τον απογαλακτισμό σε ηλικία 4 εβδομάδων και η θεραπεία με βότανα και η συλλογή δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του Canadian Council on Animal Care
πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί από την υποεπιτροπή για τη χρήση ζώων στο Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας.

Τόσο η κυτταρική σειρά SW480 ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου όσο και η κυτταρική σειρά λευχαιμικών μακροφάγων ποντικού RAW 246.7 αναπτύχθηκαν στο τροποποιημένο Eagle's Medium της Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 1 τοις εκατό fetal bovine ορός (FBS) (πλήρες μέσο DMEM) στους 37-C σε επωαστήρα με υγρασία 5 τοις εκατό CO2/95 τοις εκατό αέρα. Τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν με ήπια συντριβή θραυσμάτων σπλήνας σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), ακολουθούμενο από απομάκρυνση των ερυθροκυττάρων χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό λύσης (0.15 Μ NH4Cl, 1.0 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, ρΗ 6). Μετά από πλύση με PBS ξανά, τα σπληνοκύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS (πλήρες μέσο RPMI).

Cistancheεκχύλισμαμπορεί να μειώσειΦλεγμονώδηςυπερπλασία

Θεραπεία εκχυλίσματος.

Το εκχύλισμα βοτάνων, που ονομάζεταιCistancheεκχύλισμασε αυτή τη μελέτη, τελικά παρασκευάστηκε με ανασύσταση ξηρής σκόνης με αποστειρωμένο διπλά απεσταγμένο νερό και περιείχε 2–3 τοις εκατό (w/w) φαινυλαιθανοειδών, 65–70 τοις εκατό (w/w) πολυσακχαρίτες, και 0.6–1 τοις εκατό (w/w) πρωτεΐνης με βάση τις ακόλουθες αναλύσεις: ο αριθμός των φαινυλαιθανοειδών προσδιορίστηκε με απορρόφηση στα 332 nm χρησιμοποιώντας μια φασματοφωτομετρία που περιγράφηκε προηγουμένως (Ouyang et al., 2005). Η περιεκτικότητα σε πολυσακχαρίτες μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική μέθοδο θειικού οξέος με φαινόλη (Dubois et al., 1956) μετά από καθίζηση με αιθανόλη. και η πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Η δόση του εκχυλίσματος Cistanche ήταν 0,4 g/kg/ημέρα με βάση την πιλοτική μας μελέτη. Η μέση πρόσληψη νερού ανά ενήλικο ποντίκι ανά ημέρα ήταν περίπου 4 mL και εάν 1 mL πόσιμου νερού περιείχε 3 mgCistancheεκχύλισμα, κάθε ποντικός έλαβε από του στόματος χορήγηση 12 mg του εκχυλίσματος την ημέρα. Με βάση το γεγονός ότι το μέσο σωματικό βάρος ενός ενήλικου ποντικού ήταν 30 g, το πόσιμο νερό περιείχε 3 mg/mLCistancheεκχύλισμαέδωσε μια δόση 0,4 g/kg/ημέρα στα ποντίκια. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή δίνοντας πόσιμο νερό και labium που περιείχε 3 mg/mLCistancheεκχύλισμαπου ανανεωνόταν τουλάχιστον μία φορά κάθε δύο ημέρες, από την ηλικία των δύο μηνών για τρεις μήνες σε συμβατικό δωμάτιο της μονάδας φροντίδας ζώων.

Ιστολογική διαβάθμιση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Στο τέλος της τρίμηνης θεραπείας, τόσο οι ιστοί του λεπτού όσο και του παχέος εντέρου συλλέχθηκαν και άνοιξαν κατά μήκος, ακολουθούμενο από απαλή έκπλυση του περιεχομένου με PBS. Συλλέχθηκαν συνολικά έξι κομμάτια (μήκους 2 cm το καθένα) εντερικού ιστού από κάθε ποντίκι: τρία από το λεπτό έντερο σε εγγύς, μεσαία και άπω σημεία. δύο από το παχύ έντερο σε εγγύς και άπω σημεία και ένα από το τυφλό έντερο. Όλοι οι ιστοί στερεώθηκαν σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Κάθε τμήμα χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) για ιστολογική βαθμολόγηση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η ταξινόμηση της νόσου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τους παθολογικούς χαρακτήρες τουυπερπλασία, αδένωμα ή καρκίνωμα εντός κάθε δείγματος, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Engle et al., 1999) με τρόπο τυφλού τεστ. Ο συνολικός αριθμός κάθε παθολογικής μεταβολής (υπερπλασία, αδένωμα και καρκίνωμα) μετρήθηκαν σε δύο τμήματα του εντερικού ιστού για κάθε ποντίκι.

Cistancheεκχύλισμαμπορεί να μειώσειΦλεγμονώδηςυπερπλασία

Ανίχνευση Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) σε κόπρανα ποντικών.

Για να εξετάσουμε την επίδραση τουCistancheεκχύλισμασχετικά με την ανάπτυξη της παθολογικής μικροχλωρίδας στο έντερο, το H. hepaticus στα κόπρανα προσδιορίστηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με ειδικούς για το είδος εκκινητές 16S rDNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Shames et al., 1995). Περίπου 200 mg φρέσκων κοπράνων διαλύθηκαν σε 1 μL PBS και επωάστηκαν στους 50 βαθμούς για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο (200 mL) συλλέχθηκε και αναμίχθηκε με ίση ποσότητα διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ που περιείχε 5 τοις εκατό (ο/ο) 18,7 mg/mL διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ (Fermentas Canada, Burlington, ON, Canada) σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα πέψης (50 μΜ Tris–HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 τοις εκατό δωδεκυλοθειικό νάτριο) και επωάστηκε στους 70 C για 30 λεπτά. Το DNA στο προκύπτον διάλυμα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QIAprep Miniprep ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (QIAGEN, Mississauga, ON, Καναδάς).
Η ενίσχυση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης του βακτηριακού DNA πραγματοποιήθηκε σε ένα μείγμα που περιείχε {{0}}.75 μL 10 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 0.5 μL 50 mM MgCl2, 0,5 μL από κάθε εκκινητή (νοήση: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG, αντιπαράλληλα: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM το καθένα), 0,5 μL πολυμεράσης Taq, 18,75 μL νουκλεάσης H2O και ελεύθερων 1μL μη ποσοτικοποιημένου διαλύματος DNA κοπράνων. Το μίγμα PCR θερμάνθηκε στους 94 βαθμούς για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 94 βαθμούς για 1 λεπτό, ανόπτηση στους 55 βαθμούς για 1,25 λεπτά και επέκταση στους 72 βαθμούς για 1,5 λεπτό. Η PCR ολοκληρώθηκε με ένα βήμα επιμήκυνσης 10 λεπτών στους 72 βαθμούς. Το προκύπτον προϊόν PCR (25 μL) υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1 τοις εκατό σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-acetate-EDTA (TAE) που περιείχε 0,5 mg/mL βρωμιούχου αιθιδίου και έγινε ορατό υπό υπεριώδες φως.

Προσδιορισμός μακροφάγων και φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ).

Τα ποσοστά των μακροφάγων και των ΝΚ κυττάρων στο εναιώρημα σπληνοκυττάρων προσδιορίστηκαν με ανάλυση διαλογής κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό (FACS). Ένα εκατομμύριο σπληνοκύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS επωάστηκαν με κατάλληλο συνδυασμό αντισωμάτων για διαφορετικούς φαινότυπους κυττάρων σε πάγο: αντι-CD3-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και αντι-CD49b-φυκοερυθρίνη (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Καναδάς) για CD3 CD49b συν ΝΚ κύτταρα, και αντι-ποντικού F4/80 plus αρουραίου ως πρωτεύον αντίσωμα και IgG-FITC έναντι αρουραίου ως δευτερεύον αντίσωμα (eBioscience, San Diego, CA, USA) για F4/80 plus μακροφάγους. Η ένταση του φθορισμού για κάθε τύπο κυττάρου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και αναλύθηκε με σύγκριση με ελέγχους υποβάθρου χρησιμοποιώντας λογισμικό CELLQUEST (BD Biosciences).

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας καλσεΐνης-ακετοξυμεθυλ (καλσεΐνη-ΑΜ).

Η λυτική δράση των δραστικών σπληνοκυττάρων έναντι των κυττάρων-στόχων SW480 αξιολογήθηκε με δοκιμασία κυτταροτοξικότητας καλσεΐνης-ΑΜ χρησιμοποιώντας ένα σύστημα συν-καλλιέργειας όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Neri et al., 2001). Εν συντομία, τα κύτταρα SW480 επισημάνθηκαν με φθορίζουσα χρωστική καλσεΐνη-ΑΜ ως εξής: 1 x 10⁶κύτταρα/mL κυττάρων SW480 σε πλήρες μέσο DMEM επωάστηκαν με 15 μM calcein-AM στους 37 βαθμούς με περιστασιακή ανακίνηση. Μετά από 30 λεπτά επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν εκτενώς με ένα πλήρες μέσο DMEM για να απομακρυνθεί η εξωκυτταρική χρωστική. Τα επισημασμένα με φθορισμό κύτταρα SW480 σε πλήρες μέσο DMEM (0,2 x 10⁶κύτταρα/{{{0}}.25 mL/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίου. Με βάση τις διαφορετικές αναλογίες (12:1, 6:1, 3:1 και 1,5:1) του E (δραστής): T (στόχος), σπληνοκύτταρα σε 0.25 mL πλήρους μέσου RPMI ανά φρεάτιο προστέθηκαν στα φρεάτια με κύτταρα στόχους εις τριπλούν. Οι συνκαλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν αφού η πλάκα περιδινήθηκε στις 2000 rpm για 5 λεπτά. Η απελευθέρωση Calcein-AM στο υπερκείμενο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφθορόμετρο μικροπλάκας (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) σε εκπομπή 527 nm υπό διέγερση στα 485 nm. Τα κύτταρα-στόχοι, που επωάστηκαν με ένα μείγμα 0,25 mL πλήρους μέσου DMEM και 0,25 mL πλήρους μέσου RPMI, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι υποβάθρου ή αυθόρμητης απελευθέρωσης και παρουσία 2 τοις εκατό, το Triton X-100 χρησιμοποιήθηκε ως χειριστήρια μέγιστης απελευθέρωσης. Η κυτταροτοξικότητα των σπληνοκυττάρων υπολογίστηκε ως εξής:

Μέτρηση μονοξειδίου του αζώτου (NO). Το μονοξείδιο του αζώτου που εκκρίνεται από τα κύτταρα οξειδώθηκε γρήγορα σε νιτρώδη στο μέσο καλλιέργειας. Επομένως, οι συγκεντρώσεις νιτρικών στο μέσο προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Griess ως μέτρηση της παραγωγής ΝΟ. Κελιά RAW264.7 (0.25 x 10⁶

κύτταρα/φρεάτιο σε 0.5 mL πλήρους μέσου DMEM) σε 24-πηγαδάκια διεγέρθηκαν μεCistancheεκχύλισμα(50–200 mg/mL) και λιποπολυσακχαρίτης (LPS) (10 ng/mL) ως θετικός μάρτυρας. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, 50 mL υπερκειμένου καλλιέργειας αναμίχθηκαν πρώτα με 50 mL 1 τοις εκατό
σουλφανιλαμίδιο σε φωσφορικό οξύ 5 τοις εκατό σε πλάκες 96-πηγαδιού εις τριπλούν, και επωάστηκαν για 10 λεπτό, στη συνέχεια προστέθηκαν 50 mL διυδροχλωρικής ναφθυλαιθυλενοδιαμίνης 0,1 τοις εκατό σε απεσταγμένο νερό ανά φρεάτιο. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 550 nm μετά από επώαση για 10 λεπτά, και το επίπεδο ΝΟ/νιτρώδους υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις νιτρώδους νατρίου.

Cistancheεκχύλισμαμπορεί να μειώσειΦλεγμονώδηςυπερπλασία

Western blot.

Τα κυτταρικά επίπεδα συνθάσης ΙΙ μονοξειδίου του αζώτου (NOS 2 ή iNOS) εξετάστηκαν με στύπωμα Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Du et al., 2006). Εν συντομία, δείγματα πρωτεΐνης (περίπου 100 mg/δείγμα) κλασματοποιήθηκαν κατά 7 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι ζώνες πρωτεΐνης NOS II ταυτοποιήθηκαν με πρωτογενές πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-NOS II κουνελιού (Ν-20) (αραίωση 1:500· Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) και δευτερεύον αντίσωμα IgG κατσίκας κατά κουνελιού ( 1:10000 αραίωση, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). Το σύμπλεγμα πρωτεΐνης-αντισώματος NOS II οπτικοποιήθηκε με έναν προσδιορισμό ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Αγγλία). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν εκ νέου χρησιμοποιώντας IgG αντι-β-ακτίνης (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ΟΝ, Καναδάς) για επιβεβαίωση της φορτωμένης πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα.

Δοκιμασία φαγοκυττάρωσης. Η φαγοκυττάρωση μετρήθηκε με την ποσότητα των επισημασμένων με φθορισμό σφαιριδίων λατέξ (SigmaAldrich Canada, L-3030, τροποποιημένα με καρβοξυλικά, μέσο μέγεθος 2 mm) που κατακλύζονταν από κύτταρα RAW264.7 όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wu et al., 2{{{ 9}}07). Εν συντομία, κύτταρα RAW264.7 (0.1 106 κύτταρα/0.5 mL/φρεάτιο) σε πλήρες μέσο DMEM σπάρθηκαν σε τρυβλία 24-φρεατίων και διεγέρθηκαν με 100 mg/mLCistancheεκχύλισμαή συμπληρώστε το μέσο DMEM μόνο ως μάρτυρα. Μετά από ολονύκτια διέγερση, 2,5 mL σφαιριδίων φθορίζοντος λατέξ ανά φρεάτιο προστέθηκαν στις καλλιέργειες μακροφάγων και επωάστηκαν για 2 ώρες. Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα αποσπάστηκαν με σιφώνιο μετά από πλύση σε PBS και η ένταση του φθορισμού των φαγοκυτταρικών κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρόμετρο ροής και αναλύθηκε σε σύγκριση με ελέγχους υποβάθρου (χωρίς σφαιρίδια) χρησιμοποιώντας λογισμικό CELLQUEST (BD Biosciences).

Στατιστική ανάλυση.

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση συν - τυπική απόκλιση (SD). Ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ή Student's t-test πραγματοποιήθηκε όπως αρμόζει για τη σύγκριση των δεδομένων μεταξύ των ομάδων. Μια τιμή p < 0,05="" θεωρήθηκε="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαμειώνει τη συχνότητα τωνυπερπλασίακαι H. hepaticus λοίμωξη του εντέρου Κατά την περίοδο της θεραπείας (3 μήνες), το σωματικό βάρος και η πρόσληψη πόσιμου νερού παρακολουθούνταν μία φορά κάθε 2 ημέρες σε ποντικούς της ομάδας που έλαβε εκχύλισμα έναντι της ομάδας που έλαβε θεραπεία με όχημα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά σημειώνεται (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Η ιστολογική ανάλυση, ωστόσο, έδειξε ότι η από του στόματος χορήγηση τουCistancheεκχυλίσματαμείωσε σημαντικά τον αριθμό τωνφλεγμονώδηςυπερπλασίαστο έντερο (Εικ. 1), που αποδεικνύεται από το γεγονός ότι τα ποντίκια που έλαβαν νερό με εκχύλισμα είχαν λιγότεραυπερπλασία(5.00 συν -2.83/ποντίκι, n=15) από όσους πίνουν νερό ή όχημα (7,53 συν -3.09/ποντίκι, n {{9 }}) (απόσπασμα έναντι οχήματος: p=0.0133, t-test). Η διαφορά στον αριθμό του αδενώματος και του καρκινώματος μεταξύ ποντικών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εκχύλισμα και φορέα δεν ήταν στατιστικά σημαντική επειδή μόνο μερικά ποντίκια είχαν αυτά τα στάδια παθολογικών αλλαγών (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Εικόνα 1. Μείωση της συχνότητας υπερπλασίας με θεραπεία με υδατικό εκχύλισμα C. deserticola (Cistancheεκχύλισμα). Τα ποντίκια Tgfb1 plus /-Rag2-/- τρέφονταν μεCistancheεκχύλισμαστο πόσιμο νερό (ομάδα εκχυλισμάτων) σε σύγκριση με εκείνα με απλό πόσιμο νερό μόνο (ομάδα οχημάτων). Οι καρκινικές βλάβες στο έντερο εξετάστηκαν ιστολογικά με χρώση H&E. (Α) Μια τυπική εικόνα του τμήματος υγιούς ιστού. (Β) Μια τυπική εικόνα υπερπλασίας στην τομή, που υποδεικνύεται με ένα βέλος. (Γ) Ο αριθμός της υπερπλασίας στο έντερο κάθε ζώου μετρήθηκε με ιστολογία (ρ=0.0133, εκχύλισμα έναντι φορέα, n=15). Αυτή η φιγούρα είναι διαθέσιμη έγχρωμη στο διαδίκτυο στη διεύθυνση wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Το μικροβιακό περιεχόμενο του εντέρου, ιδιαίτερα η λοίμωξη από H. hepaticus, έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται για την ανάπτυξη όλων των σταδίων καρκίνου του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένης της υπερπλασίας στο Rag2^-/- ποντίκια (Engle et al., 2002· Erdman et al., 2003). Για να εξεταστεί εάν η θεραπεία μεCistancheεκχυλίσματαμειωμένη παθολογική μικροχλωρίδα στο έντερο, παρουσία H. hepaticus στα κόπρανα των ποντικών που έλαβαν θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαπροσδιορίστηκε με PCR σε σύγκριση με μάρτυρες οχήματος. Σε κάθε πείραμα, τρία ποντίκια ανά κλουβί υποβλήθηκαν σε αγωγή με εκχύλισμα Cistanche ή όχημα. Τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν στο τέλος μιας 14- ώρας ολονύκτιας περιόδου μετά τον καθαρισμό του κλωβού. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, το rDNA του H. hepaticus 16S στα κόπρανα ανιχνεύθηκε αποτελεσματικά με την τεχνική PCR. Σε τρία ξεχωριστά πειράματα (Πίνακας 1), μόνο το 20–40 τοις εκατό των δειγμάτων απόCistanche-εκχύλισμα-τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία ανιχνεύθηκαν ως θετικά PCR, ενώ το 60-80 τοις εκατό από τους μάρτυρες φορέα ήταν θετικά (εκχύλισμα έναντι φορέα: p=0.0189, t-test, n=3), γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία με Το εκχύλισμα Cistanche μείωσε την εντερική λοίμωξη από H. hepaticus σε ποντίκια.

Η θεραπεία με εκχύλισμα Cistanche αυξάνει τον αριθμό των σπληνικών μακροφάγων και των ΝΚ κυττάρων

Η ανοσολογική απόκριση παίζει βασικό ρόλο στην εξάλειψη της μόλυνσης από ελικοβακτηρίδιο. Για να εξεταστεί ανCistanche εκχύλισμαΗ θεραπεία επηρέασε το ανοσοποιητικό σύστημα σε αυτά τα επιρρεπή σε καρκίνο του παχέος εντέρου ποντίκια, το μέγεθος των σπλήνας (12 ποντίκια σε κάθε ομάδα) και ο αριθμός των σπληνοκυττάρων (έξι ποντικοί που επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε ομάδα) προσδιορίστηκε στο τέλος της θεραπείας. Οι σπλήνες 12 ποντικών σε κάθε ομάδα ζυγίστηκαν, ενώ τα άλλα τρία ποντίκια στο αρχικό πείραμα δεν συμπεριλήφθηκαν. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2,Cistanche-εκχύλισμα-τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία (0.055 συν -0.022 g/σπληνός) ήταν βαρύτερα από ό,τι στην ομάδα του οχήματος (0,038 συν -0.01 g/σπληνός· εκχύλισμα έναντι οχήματος: p=0.04, t-test). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από μια αύξηση στον αριθμό των σπληνοκυττάρων σε ποντικούς που έλαβαν θεραπείαCistancheεκχύλισμα, υποδεικνύεται με 7,095 συν -1,353 (x10⁶ κύτταρα/σπληνός) σε σύγκριση με 2.941 συν -1.492 (x10⁶κύτταρα/σπληνός) ποντίκια ελέγχου εντός οχήματος (εκχύλισμα έναντι φορέα: p=0.002, t-test).

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω εάνCistancheεκχύλισμαη θεραπεία επηρέασε έναν συγκεκριμένο υποτύπο σπληνοκυττάρων σε ποντίκια, τον αριθμό των σπληνικών κυττάρων ΝΚ (CD3^-CD49b^συνκύτταρα) και μακροφάγα (FT/80^συνκύτταρα) μετρήθηκαν με ανάλυση FACS. Το ποσοστό του CD3^-CD49b^συνκύτταρα στα σπληνοκύτταρα τουCistanche-εκχύλισμα-τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία (32,06 συν -2,13 τοις εκατό ) δεν διέφεραν σημαντικά από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με όχημα (28,47 συν -2,74 τοις εκατό ; εκχύλισμα έναντι φορέα: p=0. 3741, t-test, n=6), αλλά ο συνολικός αριθμός των ΝΚ κυττάρων στον σπλήνα τουCistanche-εκχύλισμα-ποντίκια που έλαβαν θεραπεία (2,22 συν - 0.44x10⁶/spleen) ήταν υψηλότερη από αυτήν την ομάδα ελέγχου εντός οχήματος (0.83 συν -0.17x10⁶/σπλήνα; εξαγωγή έναντι οχήματος: p=0.01, t-test, n=6; Εικ. 3Β). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην εξέταση σπληνικών κυττάρων FT/80 plus. όπως και στον πληθυσμό σπληνικών κυττάρων ΝΚ, η διαφορά στο ποσοστό των σπληνικών κυττάρων FT/80 plus μεταξύ ποντικών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εκχύλισμα (35,25 συν -7,28 τοις εκατό ) και ποντικών ελέγχου φορέα (31,74 συν -5). 07 τοις εκατό ) δεν ήταν σημαντικό (εκχύλισμα έναντι φορέα: p=0.407, n=6), αλλά ο συνολικός αριθμός σπληνικών μακροφάγων στην ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με εκχύλισμα (2.439 συν -0 .452x10⁶κύτταρα/σπληνός) ήταν υψηλότερο από αυτό στις ομάδες ελέγχου (1.114 συν -0.685x10⁶κύτταρα/σπληνός? εξαγωγή έναντι οχήματος: p=0.001, t-test, n=6; Εικ. 3D). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαμπορεί να αυξήσει τον συνολικό αριθμό, αλλά όχι το ποσοστό ή την αναλογία, των υποτύπων δραστικών σπληνοκυττάρων, ΝΚ κυττάρων και μακροφάγων στους σπλήνες.

Εικόνα 3. Αύξηση του αριθμού των σπληνικών ΝΚ κυττάρων και των μακροφάγων με τη θεραπεία μεCistancheεκχύλισμα. Τα NK κύτταρα ή τα μακροφάγα σε εναιώρημα σπληνοκυττάρων προσδιορίστηκαν με ανάλυση FACS με συνδυαστική χρώση αντισώματος FITC-anti-CD3e και κυτταρικού δείκτη APC-anti-CD49b/Pan-NK (για κύτταρα ΝΚ) ή με μία μόνο χρώση FITC-αντι- FT/80 (για μακροφάγα). (Α) Ένα αντιπροσωπευτικό γράφημα του ποσοστού των σπληνικών ΝΚ κυττάρων (CD3^-CD49b^συν) στα σπληνοκύτταρα ποντικών που έλαβαν θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαέναντι οχήματος. (Β) Ο συνολικός αριθμός κυττάρων ΝΚ ανά σπλήνα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος συν -SD σε κάθε ομάδα (p= 0.01, n= 6). (Γ) Ένα αντιπροσωπευτικό γράφημα του ποσοστού των σπληνικών μακροφάγων (FT/80 συν ) στα σπληνοκύτταρα ποντικών που έλαβαν θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαέναντι οχήματος. (Δ) Ο συνολικός αριθμός μακροφάγων ανά σπλήνα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος συν -SD σε κάθε ομάδα (p= 0.001, n=6).

Η θεραπεία με εκχύλισμα Cistanche διεγείρει την κυτταροτοξικότητα των σπληνοκυττάρων in vivo και in vitro

Η ανοσοαπόκριση εξαρτιόταν όχι μόνο από τον αριθμό των σπληνοκυττάρων αλλά και από τη λειτουργία τους, όπως η κυτταροτοξικότητα. Η επίδραση τουCistancheεκχύλισμαΗ θεραπεία για τη λειτουργία των σπληνοκυττάρων (δηλαδή κυτταροτοξικότητα) εξετάστηκε σε συνκαλλιέργειες με κύτταρα SW480. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, η κυτταροτοξικότητα των σπληνοκυττάρων από ποντικούς που έλαβαν θεραπεία μεCistancheεκχύλισμαήταν υψηλότερο από αυτό των κυττάρων από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με όχημα, υποδεικνύεται από 39,38 συν -2.64 τοις εκατό της απελευθέρωσης καλσεΐνης-ΑΜ στις συνκαλλιέργειες σπληνοκυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εκχύλισμα με κύτταρα SW480 σε 6 αναλογία :1, 51,11 συν -2,6 τοις εκατό σε αναλογία 3:1 και 57,33 συν -2,53 τοις εκατό σε αναλογία 1,5:1, σε σύγκριση με 27.75- 0.18 τοις εκατό στις συνκαλλιέργειες σπληνοκυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα με κύτταρα SW480 σε αναλογία 6:1, 40.97 =-2.85 τοις εκατό σε αναλογία 3:1 και 45,16 συν -0.18 τοις εκατό σε Αναλογία 1,5:1 (απόσπασμα έναντι οχήματος: p < 0,0001,="" αμφίδρομη="" anova).="" για="" περαιτέρω="" επιβεβαίωση="" της="" διεγερτικής="" δράσης="">Cistancheεκχύλισμασχετικά με την κυτταροτοξικότητα των σπληνοκυττάρων, την κυτταροτοξικότητα τωνCistanche-εκχύλισμα-Σληνοκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή από ποντικούς Β6, που περιείχαν λειτουργικά Τ και Β κύτταρα, εξετάστηκαν στις συνκαλλιέργειες με κύτταρα SW480. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, η προσθήκη τουCistancheεκχύλισμα(100 mg/mL) αύξησε σημαντικά την απελευθέρωση καλσεΐνης-ΑΜ στις συνκαλλιέργειες με τρόπο εξαρτώμενο από τα σπληνοκύτταρα: 57,64 συν -3.41 τοις εκατό σε αναλογία 12:1, 52,25 συν { {11}},77 τοις εκατό σε αναλογία 6:1 και 45,72 συν -2,43 τοις εκατό σε αναλογία 3:1, σε σύγκριση με 14,36 συν -0,05 τοις εκατό σε αναλογία 12:1 , 20,67 συν -2,03 τοις εκατό σε αναλογία 6:1 και 23,1 συν -3,73 τοις εκατό σε αναλογία 3:1 σε μη διεγερμένες συνκαλλιέργειες (εκχύλισμα έναντι φορέα: p < 0,0001,="" δύο="" -τρόπος="" anova).="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" δείχνουν="">Cistancheεκχύλισμαδιεγείρει τη λυτική δραστηριότητα των σπληνοκυττάρων. Ο λόγος για τον οποίο παρατηρήθηκε λιγότερη κυτταροτοξικότητα όταν προστέθηκαν περισσότερα δραστικά σπληνοκύτταρα είναι άγνωστος. Μια πιθανότητα ήταν ότι το επίπεδο απελευθέρωσης καλσεΐνης-ΑΜ σε αυτό το σύστημα συν-καλλιέργειας μπορεί να μην αντικατοπτρίζει ακριβώς τον κυτταρικό θάνατο-στόχο επειδή η καλσεΐνη-ΑΜ θα μπορούσε να επαναρροφηθεί από τα δραστικά σπληνοκύτταρα μετά από μια μακρά περίοδο επώασης.

Το εκχύλισμα Cistanche ενεργοποιεί τα μακροφάγα

Η ενεργοποίηση των μακροφάγων είναι μία από τις κρίσιμες ανοσολογικές απαντήσεις κατά της μόλυνσης και της ανάπτυξης όγκων (Mantovani et al., 2002, 2008). Για να αποκαλυφθεί περαιτέρω η εικόνα των μηχανισμών με τους οποίουςCistancheεκχύλισμαθεραπεία μείωσε την εντερική υπερπλασία και το μικροβιακό περιεχόμενο, η επίδραση τουCistancheεκχύλισμασχετικά με την παραγωγή ΝΟ και τη φαγοκυττάρωση των μακροφάγων, εξετάστηκαν κύτταρα RAW264.7. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η έκφραση πρωτεΐνης του NOS II ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε καλλιέργειες μετά από επώαση μεCistancheεκχύλισμα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από την αύξηση της παραγωγής ΝΟ σεΔιεγείρεται από εκχύλισμα κιστάνςκαλλιέργειες (Εικ. 5Β), που αποδεικνύεται από 3,88 συν -0,13 mM νιτρωδών σε 50 mg/mLCistancheεκχύλισμαδιεγέρθηκαν κυτταρικές καλλιέργειες RAW264.7 σε σύγκριση με 0.11 συν -0.12 mM νιτρωδών σε μη διεγερμένες καλλιέργειες ελέγχου (μονόδρομη ANOVA, p<>

Η φαγοκυττάρωση είναι μια κυτταρική διαδικασία κατάποσης στερεών σωματιδίων, όπως τα βακτήρια. Όπως φαίνεται στα Σχ. 5Γ και Δ, η προσθήκη τουCistancheεκχυλίσματαδιεγέρθηκε η φαγοκυττάρωση των μακροφάγων, όπως υποδεικνύεται από περισσότερα φαγοκυτταρικά κύτταρα (9,8 συν -0,1 τοις εκατό ) που βρέθηκαν σεCistanche-εκχύλισμα-διεγερμένες καλλιέργειες μακροφάγων σε σύγκριση με εκείνες (5,2 συν -0,4 τοις εκατό ) σε καλλιέργειες διεγερμένες από όχημα (εκχύλισμα έναντι φορέα: p=0.0007, t-test, n=3) μετά από επώαση 2 ωρών. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότιCistancheεκχύλισμαμπορεί να ενεργοποιήσει άμεσα τα μακροφάγα με την αύξηση της ρύθμισης της τοπικής παραγωγής ΝΟ και τη διέγερση της φαγοκυττάρωσης των μακροφάγων στο έντερο των ποντικών.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η παρούσα μελέτη καταδεικνύει για πρώτη φορά ότι η από του στόματος χορήγησηCistancheεκχύλισμαμειώνει σημαντικά τη συχνότητα της υπερπλασίας και της λοίμωξης από H. hepaticus στο έντερο ποντικών με τάση για καρκίνο του παχέος εντέρου. Η ευεργετική επίδραση τουCistancheεκχύλισμαΗ θεραπεία σχετίζεται με αύξηση του αριθμού και της κυτταροτοξικότητας των σπληνικών ΝΚ κυττάρων και των μακροφάγων. In vitro προσθήκη τουCistancheεκχύλισμαδιεγείρει την παραγωγή ΝΟ και τη φαγοκυττάρωση στα μακροφάγα. Ανεπαρκής TGF-b1 Rag2^-/-ποντίκια έχουν αποδειχθεί ότι αναπτύσσουν καρκίνο του παχέος εντέρου (υπερπλασία, αδένωμα ή αδενοκαρκίνωμα) από 3 έως 6 μηνών και έχει αποδειχθεί ότιφλεγμονώδηςΟι εστίες συνδέονται πάντα με αυτές τις ογκογενείς βλάβες (Engle et al., 1999). Περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι σε αυτά τα ποντίκια απαιτείται ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου για την παρουσία της μόλυνσης από παθογόνο μικροβιακή χλωρίδα, επειδή ο καρκίνος του παχέος εντέρου εξαλείφεται πλήρως με τη στέγαση των ποντικών σε συνθήκες χωρίς μικρόβια (Engle et al., 2002) και H. hepaticus Η μόλυνση προκαλεί επίσης κολίτιδα και καρκίνωμα του παχέος εντέρου στο Rag2-/-ποντίκια (Erdman et al., 2003). Ομοίως, στους ανθρώπους, η μικροβιακή κατάσταση και η ανοσία του ξενιστή είναι οι βασικοί παράγοντες για την εξέλιξη της IBD (Fiocchi, 1998) και το γαστρικό καρκίνωμα έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με χρόνια μόλυνση ή φλεγμονή που προκαλείται από το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (Parsonnet et al., 1991· El-Omar και Malfertheiner, 2001). Τα ευρήματα από αυτές τις μελέτες υποδηλώνουν ότι η γαστρεντερική λοίμωξη μπορεί να διαδραματίσει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου. Έτσι, η στόχευση της γαστρεντερικής λοίμωξης μπορεί να γίνει μια θεραπευτική στρατηγική για την πρόληψη ή τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και της IBD. Η μελέτη μας καταδεικνύει για πρώτη φορά ότι η από του στόματος χορήγηση τουCistancheεκχύλισμαμειώνει τη συχνότητα τωνφλεγμονώδηςυπερπλασίαστο έντερο και τον αριθμό του H. hepaticus στα κόπρανα σε ποντικούς με έλλειψη TGF-b1. Η ευεργετική επίδραση τουCistanche εκχύλισμαμπορεί να οφείλεται στην ενεργοποίηση των μακροφάγων, όπως φαίνεται από την αύξηση τόσο της παραγωγής ΝΟ όσο και της φαγοκυττάρωσης μετά από θεραπεία μεCistancheεκχύλισμα(Εικ. 5), που μπορεί να περιορίσει την εντερική παθογόνο μικροχλωρίδα συμπεριλαμβανομένου του ελικοβακτηριδίου (Mantovani et al., 2002, 2008). Ως συνέπεια, η βλάβη τουφλεγμονώδηςυπερπλασίαμειώθηκε.

Μια ποικιλία βιοδραστικών ενώσεων έχει εντοπιστεί στα εκχυλίσματα του C. deserticola, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και πολυσακχαριτών (Jiang and Tu, 2009). Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες είναι κυτταροπροστατευτικές, υποδεικνύεται από το γεγονός ότι αυτές οι ενώσεις εμποδίζουν τον κυτταρικό θάνατο σε καλλιεργημένα ηπατοκύτταρα και νευρώνες παρεγκεφαλιδικών κόκκων (Xiong et al., 1998· Pu et al., 2003). Ενώ οι πολυσακχαρίτες διεγείρουν τον επαγόμενο από μιτογόνο πολλαπλασιασμό των Τ- και Β-λεμφοκυττάρων (Wu and Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Έχει τεκμηριωθεί καλά ότι οι φυτικοί πολυσακχαρίτες ρυθμίζουν την ανοσολογική απόκριση (Jiang et al., 2010).Cistancheεκχύλισμαπεριέχει 2-3 τοις εκατό φαινυλαιθανοειδών και 65-70 τοις εκατό πολυσακχαριτών, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανοσοτροποποιητική δράση τουCistancheεκχύλισμαΗ θεραπεία μπορεί να οφείλεται στην ανοσορυθμιστική δράση των πολυσακχαριτών, της πλειονότητας των βιοδραστικών ουσιών στο εκχύλισμα Cistanche. Ωστόσο, τα ανοσοκύτταρα-στόχοι του (π.χ. μακροφάγα ή κύτταρα ΝΚ, ή και τα δύο) και οι μοριακές οδοί απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η χορήγηση φυτικού φαινυλαιθανοειδούς ακετονιδίου, ενός από τα βιοενεργά φαινυλαιθανοειδή στο εκχύλισμα του C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang and Tu, 2009), έχει ευεργετική επίδραση στη μείωση της δεξτράνης Κολίτιδα που προκαλείται από θειικό νάτριο σε ποντίκια (Hausmann et al., 2007), αποδεικνύοντας ότι τα φαινυλαιθανοειδή (2-3 τοις εκατό) στοCistancheεκχύλισμαμπορεί να συμβάλει τουλάχιστον εν μέρει στην αποτελεσματικότητά του στη μείωση τουφλεγμονώδηςυπερπλασία, το οποίο απαιτεί επίσης αξιολόγηση στο μέλλον.
Συμπερασματικά, ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους πιο διαδεδομένους καρκίνους παγκοσμίως και μπορεί να προληφθεί στην πλειονότητα των περιπτώσεων. Η χρήση μη τοξικών φυτικών εκχυλισμάτων μπορεί να προσφέρει μια αποτελεσματική στρατηγική για την πρόληψη της ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου και μπορεί επίσης να εφαρμοστεί ως χημειοεπικουρικό, το οποίο μπορεί να ωφελήσει την ενίσχυση της χημειοθεραπευτικής αντικαρκινικής αποτελεσματικότητας ή/και τη μείωση της χημειοθεραπευτικής παρενέργειες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη καταδεικνύουν ξεκάθαρα ότι η θεραπεία με υδατικό εκχύλισμα C. deserticola μειώνει την υπερπλασία και τη μόλυνση από H. hepaticus στο έντερο ποντικών με τάση για καρκίνο του παχέος εντέρου. Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο ή έντεροφλεγμονήυπερπλασίααποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου. Η τρέχουσα μελέτη μας δείχνει ότι η χρήση αυτού του βοτάνου μπορεί να έχει τη δυνατότητα για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, ιδιαίτερα για εκείνα τα άτομα που έχουν IBD.

Αναγνώριση

Το YM υποστηρίχθηκε από υποτροφία μεταπτυχιακών φοιτητών από το Συμβούλιο Υποτροφιών της Κίνας.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων.

Cistancheεκχύλισμαμπορεί να μειώσειΦλεγμονώδηςυπερπλασία

Από: «Μείωση τουΦλεγμονώδηςΥπερπλασίαστο έντερο σε ποντίκια επιρρεπή σε καρκίνο του παχέος εντέρου με εκχύλισμα νερού απόCistanchedeserticola' από Yamin Jia,1,2 et al

---Πνευματικά δικαιώματα © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Ανοσοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Η δράση κατά της κόπωσης του εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινυλαιθανοειδή απόCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Κατανάλωση κρέατος και κίνδυνος καρκίνου του παχέος εντέρου. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Καρκίνος παχέος εντέρου. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Δομικός χαρακτηρισμός και ανοσολογική δραστηριότητα δύο πολυσακχαριτών που εκχυλίζονται με κρύο νερό απόCistanchedeserticola YC. Μαμά. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Το μονοξείδιο του αζώτου προκαλεί απόπτωση σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών σωληναριακών μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Χρωματομετρικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό των σακχάρων των σχετικών ουσιών. Anal Chem 28: 350-356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Ο κίνδυνος του καρκίνου του παχέος εντέρου στην ελκώδη κολίτιδα: μια μετα-ανάλυση. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori και γαστρικός καρκίνος. Curr Opin Gastroenterol 17(Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Ο μετασχηματιζόμενος αυξητικός παράγοντας βήτα 1 καταστέλλει τον μη μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου σε πρώιμο στάδιο ογκογένεσης. Cancer Res 59: 3379-3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Εξάλειψη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντίκια με έλλειψη μικροβίων μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-βήτα 1-. Cancer Res 62: 6362-6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. Τα CD4 συν CD25 συν ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα αναστέλλουν τον μικροβιακά επαγόμενο καρκίνο του παχέος εντέρου σε ποντίκια με ανεπάρκεια Rag2-. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Εκτιμήσεις του παγκόσμιου φορτίου του καρκίνου το 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Φλεγμονώδηςνόσος του εντέρου: αιτιολογία και παθογένεια. Gastroenterology 115: 182-205.
Hausmann Μ, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. Η in vivo θεραπεία με το φυτικό φαινυλαιθανοειδές ακτεοσίδιο βελτιώνει την εντερική φλεγμονή σε κολίτιδα που προκαλείται από θειική δεξτράνη. Clin Εχρ Immunol 148: 373-381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Ανοσορυθμιστικές δράσεις πολυσακχαριτών από την κινεζική βοτανοθεραπεία. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Ανάλυση χημικών συστατικών σεCistancheείδος. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Αντιπαθητικό και αντι-φλεγμονώδηςδραστηριότητα που προκαλείται απόCistanchedeserticola σε τρωκτικά. J Ethnopharmacol 83: 177-182.
Λουκάς Μ. 2010.Φλεγμονώδηςνόσος του εντέρου ως παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Φλεγμονή που σχετίζεται με τον καρκίνο. Nature 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Πόλωση μακροφάγων: μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους ως παράδειγμα για πολωμένα μονοπύρηνα M2 φαγοκύτταρα. Trends Immunol 23: 549-555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Προσδιορισμός κυτταροτοξικότητας καλσεΐνης-ακετοξυμεθυλίου: τυποποίηση μιας μεθόδου που επιτρέπει πρόσθετες αναλύσεις σε ανακτημένα τελεστικά κύτταρα και υπερκείμενα. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Βελτιωμένη παραγωγή φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών απόCistancheΚύτταρα deserticola που καλλιεργήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα αερομεταφοράς εσωτερικού βρόχου με πιο κοσκινισμένο ανυψωτικό. Enzyme Microb Technol 36: 982-988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Πρόσληψη διαιτητικών ινών και κίνδυνος καρκίνου του παχέος εντέρου: μια συγκεντρωτική ανάλυση προοπτικών μελετών κοόρτης. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού και κίνδυνος γαστρικού καρκινώματος. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside απόCistancheΤο salsa αναστέλλει την απόπτωση από το ιόν 1-μεθυλ-4-φαινυλοπυριδίνιο στους νευρώνες των κοκκίων της παρεγκεφαλίδας. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Ταυτοποίηση ευρέως διαδεδομένης μόλυνσης από Helicobacter hepaticus σε κόπρανα σε εμπορικές αποικίες ποντικών με καλλιέργεια και δοκιμασία PCR. J Clin Microbiol 33: 2968-2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Κληρονομικά σύνδρομα καρκίνου του παχέος εντέρου. Cancer Causes Control 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Ο κίνδυνος καρκίνου σε ασθενείς με νόσο του Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Η πρωτεομική ανάλυση των επιδράσεων της πυκνογενόλης σε μακροφάγους RAW 264.7 αποκαλύπτει επαγωγή έκφρασης της καθεψίνης D και ενίσχυση της φαγοκυττάρωσης. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Μια αραβινογαλακτάνη που απομονώθηκε από τους μίσχους τουCistanchedeserticola επάγει τον πολλαπλασιασμό καλλιεργημένων λεμφοκυττάρων. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-γλυκάνες απόCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Ηπατοπροστατευτική δραστηριότητα των φαινυλαιθανοειδών απόCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioxidative effect of phenylethanoids fromCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.