Μέρος 1: Αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, ενυδατικές και αντιμελανογενετικές επιδράσεις της κερκετίνης 3-O- -D-Glucuronide σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και κύτταρα μελανώματος μέσω ενεργοποίησης των μονοπατιών NF-κB και AP-1

Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: Κερσετίνη3-O- -D-γλυκουρονίδιο(Q-3-G), το σύζευγμα γλυκουρονιδίου της κερκετίνης, έχει αναφερθεί ότι έχειαντιφλεγμονώδηιδιότητες στα μακροφάγα που διεγείρονται από λιποπολυσακχαρίτες, καθώς και αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Σε αντίθεση με την κερσετίνη, η οποία έχει περιγραφεί εκτενώς ότι διαθέτει ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένων των προστατευτικών επιδράσεων του δέρματος, τα φαρμακολογικά οφέλη και οι μηχανισμοί του Q-3-G στο δέρμα έμειναν να διευκρινιστούν. Αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε στον χαρακτηρισμό των προστατευτικών ιδιοτήτων του δέρματος, συμπεριλαμβανομένων των αντιφλεγμονωδών και αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων του Q-3-Κατά του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από την UVB ή του H2O2-, των επιδράσεων ενυδάτωσης καιαντιμελανογένεσηδραστηριότητες που χρησιμοποιούν ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HaCaT) και κύτταρα μελανώματος (B16F10). Το Q-3-G μείωσε την έκφραση του προφλεγμονώδους γονιδίου και της κυτοκίνης όπως η κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) και ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF)- σε HO ή UVB- ακτινοβολημένα κύτταρα HaCaT. Επίσης, δείξαμε ότι τα Ο-3-Gexhibits έχουν αντιοξειδωτική δράση χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς δέσμευσης ελεύθερων ριζών, κυτταρομετρία ροής και αυξημένη έκφραση του ερυθροειδούς 2- παράγοντα 2 (Nrf2) που σχετίζεται με τον πυρηνικό παράγοντα. Το Q{13}}G μείωσε την παραγωγή μελανίνης σε κύτταρα B16F10 που επάγονται από την ορμόνη διέγερσης των μελανοκυττάρων (-MSH). Τα αποτελέσματα ενυδάτωσης και οι μηχανισμοί του Q-3-G εξετάστηκαν αξιολογώντας τα γονίδια που σχετίζονται με τον παράγοντα ενυδάτωσης, όπως η τρανσγλουταμινάση-1(TGM-1), η φιλαγκρίνη (FLG) και η συνθάση του υαλουρονικού οξέος (ΕΧΕΙ)-1. Επιπλέον, το Q{25}}G αύξησε τη φωσφορυλίωση της c-Jun, της Ν-τερματικής κινάσης Jun (JNK), της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης (MAPK) κινάσης 4 (MKK4) και της TAK1, που εμπλέκονται στα MAPKs/AP -1, και η φωσφορυλίωση των IkB, IkB κινάσης(IKK)-, Akt και Src, που εμπλέκονται στην οδό NF-kB. Συνολικά, έχουμε αποδείξει ότι το Q{35}}G ασκεί αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, ενυδατικές και αντιμελανογενετικές ιδιότητες σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και κύτταρα μελανώματος μέσω των οδών NF-kB και AP-1.

Λέξεις-κλειδιά: κερσετίνη 3-O- -D-γλυκουρονίδιο, προστασία UV; ενυδατική? αντιμελανογένεση; AP-1; NF-kB

1. Εισαγωγή

Το δέρμα, το μεγαλύτερο όργανο του σώματος, προσφέρει ένα φράγμα που παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία του σώματος από το εξωτερικό περιβάλλον και επιβλαβείς παράγοντες όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, τα μολυσματικά μικρόβια και οι επιβλαβείς χημικές ουσίες. Αυτό το φράγμα ρυθμίζει επίσης την ισορροπία των ηλεκτρολυτών και τη θερμοκρασία του σώματος και αποτρέπει την απώλεια υγρασίας [1,2]. Το ανθρώπινο δέρμα αποτελείται από τρία στρώματα: την επιδερμίδα, το χόριο με τα εξαρτήματα και τον υποδόριο ιστό [3]. Το επιδερμικό στρώμα παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της θερμοκρασίας του σώματος.

Τα κερατινοκύτταρα, το άφθονο συστατικό στην επιδερμίδα του δέρματος, αλληλεπιδρούν στενά με ένα άλλο μέσω δεσμοσωμάτων και στενών ενώσεων που επιτρέπουν έναν αποτελεσματικό φυσικοχημικό φραγμό[4]. Αν και το δέρμα λειτουργεί ως προστατευτικός φραγμός, η υπεριώδης ακτινοβολία (UV) έχει σημαντική επίδραση στα περισσότερα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κερατινοκυττάρων, του εξωτερικού στρώματος του δέρματος. Η υπεριώδης ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει γήρανση του δέρματος, βλάβη του δέρματος, ρυτίδες και υπερμελάγχρωση, που θεωρείται ένας από τους πιο λογοκριτικούς παράγοντες κινδύνου [5]. Το υπεριώδες φως αποτελείται από τρία εύρη μήκους κύματος: UVA(320-400 nm), UVB (280-320 nm) και UVC (200-280 nm). Εκτός από το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), το οποίο είναι γνωστό ότι συμβάλλει στο οξειδωτικό στρες, η UVB μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) μέσω της ενεργοποίησης των ενζύμων που δημιουργούν ROS [6]. Η ανεξέλεγκτη συσσώρευση ROS σε κύτταρα συμπεριλαμβανομένων των κερατινοκυττάρων έχει περιγραφεί ότι προκαλεί οξειδωτικές τροποποιήσεις σε λιπίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα και άλλα ενδοκυτταρικά μόρια που στη συνέχεια οδηγούν σε διάφορους τύπους δερματικής βλάβης και διεργασίες που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως ο κυτταρικός θάνατος, το οξειδωτικό στρες. και φλεγμονή [7,8]. Επιπλέον, η απόκριση του οξειδωτικού στρες είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη βλάβη διαφόρων κυτταρικών συστατικών [9]. Τα κατεστραμμένα κύτταρα του δέρματος μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις, με αποτέλεσμα το δέρμα να έχει χρόνιες βλάβες [10]. Ένας τύπος βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVB ή το H2O2- μέσω βιολογικών διεργασιών είναι η έκφραση φλεγμονωδών γονιδίων όπως η κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) και οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες [11]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ασφαλέστερων, πιο ισχυρών και αποτελεσματικών προστατευτικών επιδράσεων του δέρματος είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τον αποκλεισμό ασθενειών που σχετίζονται με δερματικές βλάβες που προκαλούνται από την UVB ή το H2O2.

Η ενυδάτωση του δέρματος παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας του. Συγκεκριμένα, η κεράτινη στιβάδα (SC) έχει προστατευτική δράση έναντι της απώλειας νερού [12]. Η περιεκτικότητα σε νερό της κεράτινης στιβάδας συμμετέχει στην απολέπιση του δέρματος και τη σωστή ωρίμανση, ενώ η ανεπαρκής ποσότητα νερού στο SC προάγει τη συσσώρευση και δυσλειτουργία των κερατοκυττάρων [12,13]. Στα τελικά στάδια της διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων, η πλασματική τους μεμβράνη και τα κυτταρικά οργανίδια εξαφανίζονται και στη συνέχεια η εισροή ασβεστίου προκαλεί τρανσγλουταμινάση (TGM) για διασύνδεση με άλλες πρωτεΐνες. Μια ανεπάρκεια ή απώλεια TGM-1 οδηγεί σε ελαττωματική διασύνδεση του περιβλήματος των κυττάρων. Η ιχθύωση με ελάσματα είναι ένα παράδειγμα ασθένειας που προκαλείται από απώλεια TGM-1. Επιπλέον, η φιλαγκρίνη (FLG), η σχηματιζόμενη μήτρα κερατίνης, παίζει ρόλο στον σχηματισμό SC καθώς δρα ως ικρίωμα για τη δέσμευση πρωτεϊνών και λιπιδίων με κερατινοποιημένο περίβλημα[14] καταλύοντας αντιδράσεις διασύνδεσης g-γλουταμυλικής λυσίνης, ATGM και μεμβράνης -σχετιζόμενα ένζυμα, που προσδίδουν ακεραιότητα στα SC [15]. Επιπλέον, το υαλουρονικό οξύ (HA) είναι ένας τύπος φυσικού παράγοντα υγρασίας (NMF) που εμπλέκεται στην κατακράτηση υγρασίας στο δέρμα και εμφανίζει ένα ξεχωριστό προφίλ στην εγγενή γήρανση του δέρματος, είναι ένας παράγοντας χορήγησης φαρμάκων και είναι σημαντικό συστατικό της εξωκυτταρικής μήτρας [16,17]. Το ΗΑ παίζει ρόλο στην αύξηση της υγρασίας του δέρματος ρυθμίζοντας τα γονίδια συνθάσης του υαλουρονικού οξέος (HAS). Επιπλέον, το ρετινοϊκό οξύ (βιταμίνη Α) μπορεί να ρυθμίσει αποτελεσματικά το ΗΑ στην επιδερμίδα [17]. Τα TGM-1, FLG και HAS-12,3 είναι γονίδια που σχετίζονται με την παραγωγή NMF [18]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση παραγόντων μεταγραφής όπως η πρωτεΐνη ενεργοποιητή-1(AP-1) και ο πυρηνικός παράγοντας (NF)-kB εμπλέκονται στην παραγωγή προφλεγμονωδών ουσιών που βελτιστοποιούν τον φραγμό του δέρματος και την ενυδάτωση του δέρματος μέσω των οδών AP-1 και NF-kB[19]. Τα ανοδικά σηματοδοτικά ένζυμα στην οδό AP-1 περιλαμβάνουν ενεργοποιημένες από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες (MAPKs) όπως η N-τερματική κινάση c-Jun (JNK), εξωκυτταρική κινάση ρυθμιζόμενη με σήμα (ERK) και p38, ενώ η Src, Οι Akt, IkB-κινάση (IKKo/) και KBO(IkBa) ανήκουν στο μονοπάτι NF-KB [20. Το δέρμα παράγει επίσης μελανίνη στην επιδερμική στιβάδα, ειδικά στα μελανοκύτταρα - την κύρια πηγή μελανίνης - τα οποία συμβάλλουν στον προσδιορισμό του χρώματος του δέρματος και της μελανογένεσης [21]. Η ακτινοβολία UVB και η ορμόνη διέγερσης των μελανοκυττάρων (o-MSH) μπορούν να διεγείρουν την έκκριση μελανίνης, πυροδοτώντας έτσι τη μελανογένεση [22. Κατά τη μελανογένεση, το -MSH ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA), τον παράγοντα μεταγραφής που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία πρωτεΐνης (MITF) και τη δέσμευση στοιχείων απόκρισης cAMP (CREB)[23]. Μία από τις λειτουργίες της μελανίνης θεωρείται ότι είναι η πρόληψη της βλάβης του δέρματος από την υπεριώδη ακτινοβολία, συμπεριλαμβανομένου του ηλιακού φωτός. Ωστόσο, η υπερβολική παραγωγή μελανίνης ή η απουσία περιεκτικότητας σε μελανίνη που προκαλείται από τη γήρανση, την ορμόνη διέγερσης των μελανοκυττάρων και την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία προάγει πανάδες, μέλασμα, γεροντικές φακίδες και άλλες διαταραχές υπερ/υπομελάγχρωσης που θα μπορούσαν να έχουν αρνητικό αντίκτυπο στην εμφάνιση και το δέρμα. υγεία [24]. Έτσι, ο έλεγχος της μελανογένεσης είναι επίσης επιθυμητός για τη διατήρηση τόσο της υγείας όσο και της καλλυντικής εμφάνισης του ανθρώπινου σώματος.

Κερσετίνηείναι ένα κυρίαρχο φλαβονοειδές τύπου φλαβονόλης που υπάρχει σε λαχανικά, φρούτα, ποτά και φαρμακευτικά φυτά [25]. Συνεπώς, η κερσετίνη έχει μελετηθεί εκτενώς για να έχει φαρμακολογικά οφέλη, συμπεριλαμβανομένων των αντιφλεγμονωδών, αντιαθηροσκληρωτικών,αντιοξειδωτικό, αντικαρκινικές και προστατευτικές ιδιότητες του δέρματος και σχετίζεται με τη μελανογένεση [24,26-29]. Ωστόσο, αρκετές εργασίες που χρησιμοποιούν ευαίσθητες και αξιόπιστες μεθόδους έχουν δείξει ότι η κερσετίνη δεν έχει ανιχνευθεί στο πλάσμα [30-33] και σπάνια βρίσκεται στον εγκέφαλο [34,35]. Η κερκετίνη, η οποία γενικά εμφανίζεται ως γλυκοσιδική μορφή, απορροφάται καλά και ως επί το πλείστον υδρολύεται και μεταβολίζεται στο λεπτό έντερο, το κόλον, το ήπαρ και τα νεφρά σε συζευγμένους μεταβολίτες [30,36-38]. Στο κυκλοφορούν αίμα ανιχνεύονται μόνο οι συζευγμένοι μεταβολίτες όπως το γλυκουρονίδιο ή το θειικό (μεθυλιωμένο ή μη μεθυλιωμένο, αντίστοιχα), αντί της κουερσετινικής αγλυκόνης ή των γλυκοσίδων της. Η 3/-μεθυλ-κερκετίνη-3-γλυκουρονίδιο, η κερσετίνη-3-γλυκουρονίδιο και η κερκετίνη-3'-θειική έχουν αναγνωριστεί ως κύριοι μεταβολίτες του πλάσματος μετά από 1,5 ώρα από την κατανάλωση τηγανητών κρεμμυδιών[30, 32]. Αυτοί οι μεταβολίτες της κερκετίνης σχηματίζονται στο λεπτό έντερο και στο ήπαρ από ένζυμα βιομετασχηματισμού συμπεριλαμβανομένων των UDP-γλυκουρονυλοτρανσφερασών ως αποτέλεσμα του μεταβολισμού φάσης II [29,39,40]. Αναφέρθηκε επίσης ότι συζευγμένοι μεταβολίτες της κερκετίνης συσσωρεύονται στο ανθρώπινο πλάσμα στο εύρος συγκεντρώσεων από 10-' έως 10- βαθμού Μ μετά την περιοδική λήψη κρεμμυδιών με τα γεύματα για 1 εβδομάδα[41]. Ο χρόνος ημιζωής των μεταβολιτών της κερκετίνης είναι αρκετά υψηλός, περίπου στις 11 έως 28 ώρες [29]. Δεδομένου ότι αυτές οι ενώσεις έχουν παρατηρηθεί ως οι κύριες μορφές συζευγμένων μεταβολιτών κερκετίνης, μελέτες που επικεντρώνονται στη βιολογική δραστηριότητα των φλαβονολών χρησιμοποιώντας αυτούς τους συζευγμένους μεταβολίτες θα ήταν απαραίτητες, γεγονός που μας ώθησε να μελετήσουμε τη βιολογική δραστηριότητα ενός από τους συζευγμένους μεταβολίτες της κερκετίνης. Ένας από τους πιο άφθονους μεταβολίτες γλυκουρονιδίου που βρίσκεται κυρίως στο πλάσμα και στους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του ήπατος, των νεφρών και του εγκεφάλου, είναι η κερσετίνη 3-O- -D-γλυκουρονίδιο(Q-3-G) (Εικόνα 1) [31,35,40,42,43], που μπορεί να δημιουργήσουν παρόμοιες, ισχυρότερες ή ασθενέστερες δραστηριότητες σε σύγκριση με τις μητρικές ενώσεις σε διαφορετικά μοντέλα. Το Q{40}}G μεταφέρεται στους ιστούς στόχους μέσω του πλάσματος για να ασκήσει τη βιολογική του δραστηριότητα [39]. Το O{42}}G έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένας αποτελεσματικός μεταβολίτης στο πλάσμα αρουραίων μετά από χορήγηση κερκετίνης από το στόμα [43]. Σε άλλες μελέτες, ο μεταβολίτης που περιέχει Q{44} βρέθηκε ότι συσσωρεύεται στην αορτή μετά τη χορήγηση τροφής πλούσιας σε κερκετίνη και έχει αναγνωριστεί ως ενεργό συστατικό που ανιχνεύεται στο ανθρώπινο αίμα που κυμαίνεται από 0.{48} } μM【44】. Επιπλέον, το Q{50}}G μπορεί να βρεθεί στο κρασί [45] και σε φαρμακευτικά φυτά όπως το Hypericum hirsutum, το Nelumbo nucifera, το Oenothera biennis και τα πράσινα φασόλια [46-49].Q-3-G έχει περιγραφεί ως αντιφλεγμονώδες συστατικό υπό συνθήκες διεγερμένες από LPS και έδειξε αντιοξειδωτικές ιδιότητες στο πλάσμα του αίματος [50-52]. Ωστόσο, σε σύγκριση με τη μακρά ιστορία εφαρμογής και την ευρεία μελέτη της κερκετίνης, η μελέτη του Q-3-G μένει να διερευνηθεί. Επομένως, το Q-3-G επιλέχθηκε ως αντιπρόσωπος των μεταβολιτών της κερκετίνης ως ενεργός in vivo παίκτης της κερκετίνης. Επιπλέον, ο ρόλος του Q-3-G στις προστατευτικές επιδράσεις του δέρματος δεν έχει επίσης αποσαφηνιστεί πλήρως. Σε αυτήν τη μελέτη, χρησιμοποιώντας διάφορες in vitro αξιολογήσεις, διερευνήσαμε τις προστατευτικές επιδράσεις του δέρματος του Q-3-G έναντι του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής που προκαλείται από το UVBor H2O2-, την ενυδάτωση του δέρματος στο HaCaT (μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων) κύτταρα και αντιμελανογένεση σε κύτταρα B16F10 (μια κυτταρική σειρά μελανώματος ποντικού).

2. Αποτέλεσμα

2.1.Αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές επιδράσεις του Q{3}}G έναντι των κυττάρων UVB ή H2O2-Διεγερμένων κυττάρων HaCaT

Ο ιστός του δέρματος μπορεί να καταστραφεί από την υπεριώδη ακτινοβολία. Η υπεριώδης ακτινοβολία ενεργοποιεί διάφορους επιβλαβείς παράγοντες, όπως το οξειδωτικό στρες, τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, τη φλεγμονή και τη γήρανση του δέρματος. Προκειμένου να προσδιοριστούν οι δραστηριότητες προστασίας από την υπεριώδη ακτινοβολία του Q-3-G, αρχικά, αξιολογήσαμε εάν το Q-3-G έχει κάποια επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων. Χρησιμοποιώντας μια ανάλυση 3-(4-5-Διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-διφαινυλ-243 βρωμιούχου τετραζολίου (MTT), διερευνήσαμε τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του O-3-G σε κελιά HaCa. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, δεν υπήρξε σημαντική παρέμβαση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκέντρωση 2.{11}} uM από το Q-3-G, το οποίο έδειξε ότι το O-3-G δεν έδειξε κυτταροτοξικότητα μέχρι 20 μM και δεν έβλαψε τα κερατινοκύτταρα, το επιφανειακό στρώμα των κυττάρων του δέρματος. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις προστασίας του δέρματος του Q-3-G σε κύτταρα HaCaT που εκτίθενται σε UVB. Μετά από ακτινοβολία UVB στα 30 mJ/cm², το Q{18}}G προστάτευσε σημαντικά τα κύτταρα HaCaT από τον επαγόμενο από την UVB κυτταρικό θάνατο με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Εικόνα 2β). Σε συμφωνία με τον προσδιορισμό MTT, χρησιμοποιώντας μια κάμερα συνδεδεμένη σε μικροσκόπιο για να καταγράψει τη μορφολογία των κυττάρων HaCaT, το Q{22}}G προστάτευσε από τον κυτταρικό θάνατο λόγω των κυττάρων HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVB μέχρι συγκέντρωση 10 μM (Εικόνα 2γ) . Ο αριθμός των κυττάρων HaCaT υπό κάθε συνθήκη ήταν 482 για την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία, 91 για την ομάδα UVB 30 mJ/cm, 276 για την ομάδα UVB 30 mJ/cm² συν 5μM O-3-}G και 320 για την ομάδα UVB 30 mJ/cm² συν 10μM Q-3-G Group (Εικόνα 2δ). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το Q{39}}G αναστέλλει τη βλάβη HaCaT που προκαλείται από την UVB και διασώζει το προστατευτικό αποτέλεσμα του δέρματος από την ακτινοβολία UVB.

Η εμφάνιση και η έξαρση της φλεγμονής στο σώμα ενεργοποιούν περιστασιακά τα μακροφάγα και απελευθερώνουν ορισμένες κυτοκίνες. Η φλεγμονή είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα του οξειδωτικού στρες. Διερευνήσαμε την αντιφλεγμονώδη δράση του Q-3-G έναντι της φλεγμονής που προκαλείται από την UVB ή HO2-. Είναι ευρέως γνωστό ότι η UVB μπορεί να προάγει τη βλάβη του DNA και τη φλεγμονή στα κύτταρα του δέρματος 【10】. Ακτινοβολήσαμε τα κύτταρα HaCaT με UVB 30 mJ/cm² και επωάσαμε τα κύτταρα HaCaT με H2O2 (500 uM). Χρησιμοποιήσαμε μια ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο για να ελέγξουμε την έκφραση mRNA του φλεγμονώδους ενζύμου COX-2 και της προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNF- . Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2e,f, μια συγκέντρωση 10 μM O-3-G ανέστειλε σημαντικά την έκφραση mRNA του COX-2 και του TNF- . Κατά συνέπεια, το Q{17}}G κατέστειλε τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκλήθηκαν στα κύτταρα HaCaT μετά από έκθεση σε ακτινοβολία UVB ή H2O2.

Χρησιμοποιήσαμε 2,2'-αζινοδις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ) (ABTS) και 2,2-διφαινυλ-πικρυλυδραζυλ(DPPH) προσδιορισμούς καθαρισμού ριζών—-ευρέως χρησιμοποιούμενα συστήματα μοντέλων να διερευνήσει τις δραστηριότητες σάρωσης in vitro φυσικών ενώσεων — να αξιολογήσει την αντιοξειδωτική ιδιότητα του Q{10}}G σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Q-3-G με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση από 2,{14}} μΜ παρουσία DPPH και το αποτέλεσμα έδειξε σημαντική δραστηριότητα σάρωσης σε περισσότερο από 2,5 uM (Εικόνα 2g) . Η ανάλυση ABTS έδειξε επίσης σημαντικά τις επιδράσεις του Q-3-G στη σάρωση των ελεύθερων ριζών με τρόπους που εξαρτώνται από τη συγκέντρωση με τιμή IC50 1,75 μM (Σχήμα 2h). Το ασκορβικό οξύ (ΑΑ), ως θετικός μάρτυρας, έδειξε τα μεγαλύτερα αντιοξειδωτικά αποτελέσματα και στις δύο δοκιμές DPPH και ABTS. Ο σχετιζόμενος με τον πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδές παράγοντα 2 (Nrf2), ένα από τα εξαρτώμενα από το στοιχείο αντιοξειδωτικής απόκρισης (ARE) γονίδια, έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζει τις προστατευτικές οξειδορεδουκτάσες και τα πυρηνόφιλα υποστρώματά τους, προάγοντας έτσι τα αντιοξειδωτικά ένζυμα για την αφαίρεση της βλάβης και την επιδιόρθωση συστήματα [53]. Στη συνέχεια, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης του Nrf2 σε κύτταρα HaCaT που ακτινοβολήθηκαν με UVB. Ενισχύοντας τα παραπάνω ευρήματα, το O-3-G ενίσχυσε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του Nrf2 κατά την ακτινοβολία UVB σε σύγκριση με τον έλεγχο με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση, έως και 10 uM(Εικόνα 2i), πράγμα που υπονοούσε ότι το Q-3- Το G παρουσιάζει αντιοξειδωτική δράση τόσο χημικά όσο και βιολογικά με ιδιότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών και αυξάνει την προστατευτική επίδραση της σηματοδότησης εξαρτώμενης από Nrf2-ARE, αντίστοιχα. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε επίσης κυτταρομετρία ροής ROS χρησιμοποιώντας διχλωροδιϋδροφθοροσκεΐνη (DCFDA) σε κατάσταση UV. Το αντιοξειδωτικό είναι ευρέως γνωστό ότι καταστέλλει τους κυτταρικούς στρεσογόνους παράγοντες αναστέλλοντας την παραγωγή ROS [54]. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η θεραπεία με Q-3-G σε συγκεντρώσεις 5 και 10 μM μείωσε το επίπεδο του ROS που προκαλείται από την UVB (Εικόνα 2j). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδήλωναν ότι το Q{44}}Έχει ιδιότητες προστασίας του δέρματος, όπως αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτικά αποτελέσματα έναντι του H2O ή το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή που προκαλείται από την UVB στα κύτταρα HaCaT.

2.2. Επίδραση αντιμελανογένεσης στο B16F10 και ενυδατικό αποτέλεσμα σε κύτταρα HaCaT του Q{4}}G

Για να εξεταστούν τα αποτελέσματα του O-3-G στη μελανογένεση, τα κύτταρα μελανώματος υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH για 48 ώρες για να εκκρίνουν μελανίνη στα κύτταρα B16F10. Χρησιμοποιώντας αναλύσεις MTT, επιβεβαιώσαμε αρχικά ότι το Q-3-G δεν είχε κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα B16F10 σε συγκεντρώσεις έως και 20 μΜ για 48 ώρες (Εικόνα 3α). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε, για τις επόμενες αξιολογήσεις, ότι τα αποτελέσματα του O-3-G στο B16F10 δεν οφείλονταν σε κυτταρικό θάνατο. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε το B16F10 με Q-3-Gand -MSH για 48 ώρες για να προσδιορίσουμε τις επιδράσεις του Q-3-G στη μελανογένεση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3β, το Q-3-G ανέστειλε σημαντικά την έκκριση μελανίνης. Η αρβουτίνη θετικού μάρτυρα μείωσε επίσης σημαντικά την έκκριση μελανίνης.

Το μόριο που σχετίζεται με την υγρασία του δέρματος είναι το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το HA, κατανεμημένο σε όλη την επιδερμίδα και το χόριο, είναι ένα NMF που ενισχύει την ενυδάτωση του δέρματος [55]. Χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR) για να εξετάσουμε το επίπεδο μεταγραφής του HAS-1 μετά από 12 ώρες με συγκέντρωση Q-3-G έως 30 uM. Το HAS προάγει τη συσσώρευση μεσαίου μεγέθους ΗΑ στα κερατινοκύτταρα [12]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3γ, η έκφραση του HAS-1 αυξήθηκε με θεραπεία με Q-3-G έως και 10 μM. Εκτός από τον παράγοντα ενυδάτωσης, εξετάσαμε επίσης την έκφραση των FLG και TGM{{ 13}}. Χρησιμοποιήσαμε ρετινόλη ως ομάδα θετικού ελέγχου. Τα επίπεδα μεταγραφής των FLG και TGM-1 αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία με Q-3-G σε συγκεντρώσεις έως και 10 μΜ (Εικόνα 3δ). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το Q{18}}G έχει ενυδατική δράση του δέρματος στα κύτταρα HaCaT. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας SB203580 (αναστολέας p38), SP600125 (αναστολέας JNK), UO126 (αναστολέας ERK) και Bay11-7082 (αναστολέας NF-kB), εξετάσαμε τη συμμετοχή των οδών σηματοδότησης MAPK και NF-kB στην ενυδάτωση παράγοντας των κυττάρων HaCaT που έχουν υποστεί επεξεργασία με Q{26}}G. Με βάση την έκφραση του γονιδίου που προκαλείται από O-3-G, τόσο τα επίπεδα του TGM-1 και του FLG μειώθηκαν με θεραπεία με SP600125, έναν αναστολέα JNK (Εικόνα 3e), υποδηλώνοντας ότι απαιτείται η JNK για την αύξηση της έκφρασης του TGM-1 και του FLG όσον αφορά την ενυδατική δράση του δέρματος του O-3-G. Επιπλέον, η έκφραση FLG μειώθηκε επίσης από τον Bay11-7082, έναν αναστολέα των IKK και IkB, υποδηλώνοντας ότι ο φαρμακευτικός μηχανισμός του Q-3-G θα μπορούσε επίσης να ανήκει στο μονοπάτι σηματοδότησης NF-kB.

2.3. Διαδρομές σηματοδότησης που σχετίζονται με την ενυδάτωση του Q-3-G μέσω ενεργοποίησης του AP-1 και του NF-kB

Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα mRNA, υποθέσαμε ότι η εμπλοκή της σηματοδότησης AP-1 και NF-kB στην επίδραση ενυδάτωσης του Q-3-G μπορεί επίσης να συμβεί στα επίπεδα πρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Western blot, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση των ανοδικών μορίων του AP-1 και του NF-kB. Πρώτον, στην οδό AP-1, η φωσφορυλίωση του c-Jun αυξήθηκε μετά την επώαση των κυττάρων HaCaT με Q-3-G για 24 ώρες (Εικόνα 4α). Το επίπεδο του p-INK αυξήθηκε επίσης μετά από θεραπεία με Q-3-G σε συγκεντρώσεις 2,5,5 και 10 μΜ. Η συνολική μορφή του JNK παρέμεινε αμετάβλητη (Εικόνα 4β). Εξετάσαμε περαιτέρω τη φωσφορυλίωση του MKK4 και του TAK-1, που είναι ρυθμιστές ανάντη του JNK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3γ, μετά την επεξεργασία των κυττάρων HaCaT με Ο-3-G, τα επίπεδα πρωτεΐνης του p-MKK4 και του p-TAK1 ρυθμίστηκαν επίσης προς τα πάνω.

Εκτός από τη σηματοδότηση NF-kB, το Q{1}}G αύξησε τη φωσφορυλίωση του p50 και του p65, μιας υπομονάδας του NF-kB (Εικόνα 4γ). Επιπλέον, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση των IKK και IkBa, οι οποίες επίσης αυξήθηκαν κατά Q-3-G έως και 10 uM σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 4δ). Τελικά, προσδιορίσαμε την ενεργοποίηση ανοδικών μορίων που εμπλέκονται στο μονοπάτι σηματοδότησης NF-kB. Η φωσφορυλίωση των Src και Akt (Ser473) ενισχύθηκε με επεξεργασία με Ο-3-G (Εικόνα 4e). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα προστασίας του δέρματος του Q-3-G στοχεύουν στην ενεργοποίηση TAK1 και Src αυξάνοντας το επίπεδο πρωτεΐνης, ρυθμίζοντας έτσι τη δραστηριότητα του AP-1 και του NF-kB, αντίστοιχα.

2.4. Επιδράσεις του Q-3-G στη μεταγραφική ενεργοποίηση του AP-1 και του NF-kB

Διερευνήσαμε την κυτταροτοξικότητα του Q-3-G σε κύτταρα ανθρώπινης εμβρυϊκής νεφρικής κυτταρικής σειράς HEK293T με ανάλυση MTT (Εικόνα 4στ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων HEK293T δεν επηρεάστηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με Q-3-G(2.5-20 μM) σε σύγκριση με κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία.

Χρησιμοποιήσαμε έναν προσδιορισμό λουσιφεράσης για να προσδιορίσουμε εάν το Q{0}}G θα μπορούσε να διαμορφώσει τους προσδιορισμούς υποκινητή NF-kB και AP-1. Επιβεβαιώσαμε ότι το O-3-G αύξησε τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης που προκαλείται από το AP-1- (Εικόνα 4g) και τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης που προκαλείται από τη μεσολάβηση NF-kB (Εικόνα 4h) με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Αυτά τα αποτελέσματα επικυρώνουν ότι η ενεργοποίηση AP-1 και η ενεργοποίηση NF-KB είναι σημαντικοί φαρμακολογικοί στόχοι του Q-3-G.

Κάντε κλικ στον σύνδεσμο για περισσότερες πληροφορίες:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html