Η επίδραση του παράγοντα ανάπτυξης των νεύρων στην υποστήριξη της χωρικής μνήμης εξαρτάται από τη χολινεργική νεύρωση του ιππόκαμπου

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Αφηρημένη

Η γονιδιακή θεραπεία με αυξητικό παράγοντα νεύρων (NGF) έχει χρησιμοποιηθεί σε κλινικές δοκιμές της νόσου του Αλτσχάιμερ. Κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού για το πώς επηρεάζει το NGFμνήμημπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη θεραπεία. Τόσο ο NGF όσο και το χολινεργικό σύστημα παίζουν σημαντικό ρόλο στη μάθηση καιμνήμη. Το NGF είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της χολινεργικής νεύρωσης του ιππόκαμπου, αλλά εξαρτάται από το εάν η υποστηρικτική επίδραση του NGF στη μάθηση καιμνήμηεξαρτάται ειδικά από την ανέπαφη χολινεργική νεύρωση του ιππόκαμπου. Εδώ χαρακτηρίζουμε τη συμπεριφορά και τις μετρήσεις του ιππόκαμπου του όγκου, της νευρογένεσης, της μακροπρόθεσμης ενίσχυσης και της χολινεργικής νεύρωσης, σε ποντίκια με έλλειψη Ngf ειδικά για τον εγκέφαλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα νοκ-άουτ ποντίκια παρουσιάζουν αυξημένο άγχος, μειωμένη χωρική μάθηση και μνήμη, μειωμένο όγκο ιππόκαμπου ενηλίκου, νευρογένεση, βραχυπρόθεσμη ενίσχυση και χολινεργική νεύρωση. Υπερέκφραση του Ngf στον ιππόκαμπο ποντικών νοκ-άουτ γονιδίου Ngf που διασώθηκαν στο χώρομνήμηκαι αποκατέστησε εν μέρει τις χολινεργικές νευρώσεις, αλλά όχι το άγχος. Η εκλεκτική εξάντληση της χολινεργικής νεύρωσης του ιππόκαμπου οδήγησε σε εξασθενημένη χωρικήμνήμη. Ωστόσο, η υπερέκφραση Ngf στον ιππόκαμπο απέτυχε να διασώσει το χώρομνήμησε ποντίκια με ιππόκαμπο εκλεκτική εξάντληση χολινεργικών ινών, Συμπερασματικά, καταδεικνύουμε τον αντίκτυπο της ανεπάρκειας Ngf στον εγκέφαλο και παρέχουμε στοιχεία ότι η επίδραση του NGF στο χώρομνήμηβασίζεται σε ανέπαφες χολινεργικές νευρώσεις στον ιππόκαμπο. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η επαρκής χολινεργική στόχευση μπορεί να είναι μια κρίσιμη απαίτηση για την επιτυχή χρήση της γονιδιακής θεραπείας NGF της νόσου του Alzheimer.

Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,

Roderick N. Carter3 και Guo-Jen Huang 1,4,5

Εισαγωγή

Ο αυξητικός παράγοντας νεύρων (NGF), ένας νευροτροφικός αυξητικός παράγοντας που αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά στη δεκαετία του 1950, προάγει την ανάπτυξη νευριτών και διεγείρει τη διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων σε πειράματα καλλιέργειας1–3. Στον εγκέφαλο, η υψηλότερη έκφραση του Ngf mRNA βρίσκεται στον ιππόκαμπο4. Ο NGF ενεργοποιεί δύο υποδοχείς: τον υποδοχέα NGF χαμηλής συγγένειας (κοινός νευροτροφικός υποδοχέας, p75) και ο υποδοχέας NGF υψηλής συγγένειας (TrkA), οι οποίοι εκφράζονται και οι δύο σε βασικούς χολινεργικούς νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου5,6 και είναι γνωστό ότι νευρώνουν τη δομή του ιππόκαμπου7. Τα στοιχεία δείχνουν ότι ο NGF απελευθερώνεται από τα κύτταρα-στόχους και ενεργοποιεί οδούς σηματοδότησης ανάδρομα κατά μήκος του άξονα8. Υπάρχει μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ του NGF και του χολινεργικού συστήματος στον ιππόκαμπο. Η έγχυση NGF στις πλάγιες κοιλίες αυξάνει τη δραστηριότητα της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης (ChAT) στον ιππόκαμπο9. Επιπλέον, ο NGF έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει τους βασικούς χολινεργικούς νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου μετά από αξονική βλάβη των προεξεχόντων ινών του ιππόκαμπου10.

Κάντε κλικ στο Cistanche tubulosa οφέλη και παρενέργειες για τη μνήμη

Έχουν προταθεί αρκετές υποθέσεις για την αιτία της νόσου του Αλτσχάιμερ. Ένα από αυτά είναι η υπόθεση NGF11. Από τις αρχές της δεκαετίας του 1980, αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι σημαντική χολινεργική δυσλειτουργία εμφανίζεται σε ηλικιωμένους με άνοια και ότι ο χολινεργικός νευρωνικός εκφυλισμός σχετίζεται με γνωστικά ελλείμματα στη νόσο του Alzheimer1.

Η νέα τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET) ραδιοϊχνηλάτη 18F-φθορο αιθοξυ βενζολίου ερωτηματικό παρείχε πιο πρόσφατες ενδείξεις ότι υπάρχει μια πιο φλοιώδης χολινεργική τερματική απώλεια σε ασθενείς με νόσο Alzheimer13. Μελέτες σε ζώα παρέχουν επίσης στοιχεία ότι η πυκνότητα των χολινεργικών νεύρων μειώνεται σε ηλικιωμένους αρουραίους και σε διαγονιδιακά ποντίκια παρόμοια με τη νόσο του Αλτσχάιμερ14,15. Επιπλέον, ηλικιωμένα ποντίκια κατά του NGF εμφανίζουν φαινότυπους που μοιάζουν με τη νόσο του Αλτσχάιμερ, όπως απώλεια νευρώνων, χολινεργικά ελλείμματα και βλάβες στη χωρική μνήμη16. Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι η μεταβολική οδός του NGF είναι εξασθενημένη σε ασθενείς με νόσο Alzheimer, διαπιστώνοντας ότι ο μοριακός μηχανισμός για την ωρίμανση του proNGF μειώνεται ενώ αυτός για την ώριμη αποικοδόμηση του NGF ενισχύεται17.

Το κεντρικό χολινεργικό σύστημα εμπλέκεται στη μάθηση18,19 και ο NGF φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην υποστήριξη αυτού. Η έγχυση NGF ενδοκοιλιακά μπορεί να διασώσει τόσο την ήπια χολινεργική εξάντληση στον ιππόκαμπο όσο και τα ελλείμματα μνήμης σε ετερόζυγα Ngf συν /− μεταλλαγμένα ποντίκια20. Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι το NGF ρυθμίζει την ισχύ των χολινεργικών προβολών στον ιππόκαμπο και επηρεάζει την πλαστικότητα των νευρώνων και τη διατήρηση της συμπεριφοράς χωρικής μάθησης21. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο εάν οι επιδράσεις του NGF στη μάθηση εξαρτώνται από αυτές τις χολινεργικές προβολές στον ιππόκαμπο. Η διευκρίνιση αυτού μπορεί να προσφέρει καλύτερη κατανόηση για την ανάπτυξη μιας θεραπείας για τη νόσο του Αλτσχάιμερ. Σε αυτή τη μελέτη, αντιμετωπίσαμε αυτό το ερώτημα χρησιμοποιώντας ποντίκια Ngf υπό όρους νοκ-άουτ (cKO) ειδικά για τον εγκέφαλο για να αποκαλύψουμε τη σημασία του NGF στο άγχος και τη χωρική μνήμη. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η επίδραση του NGF στη χωρική μνήμη, αλλά όχι στο άγχος, απαιτεί τη χολινεργική προβολή στον ιππόκαμπο.

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων

Πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε κοόρτες με ισορροπία φύλου ποντικών 12-εβδομάδων Ngf cKO και άγριου τύπου (WT). Ποντίκια Ngf από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων, Ταϊβάν, (RMRC 13175) και ποντίκια Sox1::Cre (Αρ. Acc. CDB0525K)22 χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία Ngf flox/flox. Sox1:: Ποντίκια Cre σε αυτή τη μελέτη. Ngf flox/flox; Τα ποντίκια Sox1::Cre (cKO) και Ngf flox/flox (WT) που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν γέννα που δημιουργήθηκαν με διασταύρωση Ngf flox/flox. Sox1:: Ποντίκια Cre με ομόζυγα ποντίκια Ngf flox/flox. Αρσενικά ποντίκια C57BL/6Narl ηλικίας δώδεκα εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για χολινεργική απονεύρωση του ιππόκαμπου. Τα ποντίκια έχουν εκτραφεί σε ειδικές συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα με πιστοποίηση AAALAC. Στεγάστηκαν σε κύκλο φωτός-σκότους 12:12 ωρών σε θερμοκρασία 22 βαθμών και επίπεδο υγρασίας 60-70 τοις εκατό. Τα ζώα είχαν ad libitum πρόσβαση σε τροφή και νερό. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων στο Πανεπιστήμιο Chang Gung (Αριθμός άδειας: CGU105-033).

Τεστ συμπεριφοράς

Για δοκιμές συμπεριφοράς, η κίνηση των ζώων καταγράφηκε και παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα εγγραφής βίντεο. Τα ποντίκια για τη διεξαγωγή της ανάλυσης συμπεριφοράς τυχαιοποιήθηκαν σε ξεχωριστό κλουβί για δοκιμή, με κλινοσκεπάσματα, τροφή και νερό, πριν μεταφερθούν πίσω στο κλουβί του σπιτιού. Όλοι οι λαβύρινθοι είναι κατασκευασμένοι από ακρυλικό. δεν υπάρχει κρεβάτι στο λαβύρινθο κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Όλα τα δεδομένα συμπεριφοράς καταγράφηκαν και αποκτήθηκαν αυτόματα από το λογισμικό Ethovision.

Ανοιχτό πεδίο

Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ένα στρογγυλό ανοιχτό πεδίο με ακτίνα=45 cm και εσωτερικό κύκλο με ακτίνα =30cm. Τους άφησαν να κινούνται ελεύθερα για 5 λεπτά και παρακολουθήθηκαν από το λογισμικό Ethovision.

Υπερυψωμένο συν-λαβύρινθο

Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή ανυψωμένου συν λαβύρινθου (EPM) αποτελούνταν από δύο ανοιχτούς βραχίονες (30 × 5 cm) και δύο κλειστούς βραχίονες ίδιου μεγέθους, με τοιχώματα ύψους 15 cm. Ο λαβύρινθος ήταν υψωμένος 38 cm πάνω από το πάτωμα. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στο EPM για 5 λεπτά με αμυδρό φως και μετρήθηκε ο χρόνος που δαπανήθηκε στον ανοιχτό βραχίονα.

Λαβύρινθος νερού Morris

Αυτό διεξήχθη σε μια στρογγυλή δεξαμενή λαβύρινθου νερού (διάμετρος 110 cm, βάθος 50 cm) που βρίσκεται σε ένα φωτεινό δωμάτιο. Η πισίνα γεμίστηκε σε βάθος 15 cm με νερό που έγινε αδιαφανές προσθέτοντας λευκό, μη τοξικό χρώμα. Μια τετράγωνη πλατφόρμα διαφυγής (9 × 9 cm) βυθίστηκε 0,5 π.μ. κάτω από την επιφάνεια του νερού, σε σταθερή θέση σε ένα από τα τεταρτημόρια. Τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν για 4 ημέρες. Σε κάθε ημέρα εκπαίδευσης, τα ποντίκια έλαβαν τέσσερις δοκιμές εκπαίδευσης. Το διάστημα μεταξύ των δοκιμών ήταν 15 λεπτά. Σε κάθε δοκιμή, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στην πισίνα σε μία από τις τέσσερις θέσεις εκκίνησης. Τα ποντίκια είχαν τη δυνατότητα να κολυμπήσουν/ψάξουν το πολύ για 90 δευτερόλεπτα ή μέχρι να βρουν την πλατφόρμα και τους επετράπη να παραμείνουν στην πλατφόρμα για 30 δευτερόλεπτα. Εάν το ποντίκι απέτυχε να βρει την πλατφόρμα σε μια δεδομένη δοκιμή, το ποντίκι οδηγήθηκε στην πλατφόρμα. Οκτώ ημέρες μετά την τελευταία δοκιμή, για τη δοκιμή μνήμης, η πλατφόρμα αφαιρέθηκε από την πισίνα και το ποντίκι αφέθηκε στη δεκαετία του '90 να την αναζητήσει. Η απόκτηση και η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκαν αυτόματα, συμπεριλαμβανομένου του μήκους της διαδρομής κολύμβησης των δοκιμών προπόνησης και του ποσοστού χρόνου που δαπανήθηκε στο τεταρτημόριο στόχο για το τεστ μνήμης.

Αναγνώριση νέου αντικειμένου

Τα ποντίκια αφέθηκαν να εξοικειωθούν με δύο ίδιους λευκούς ακρυλικούς κυλίνδρους (ύψος=9cm, διάμετρος= 5 cm) για 15 λεπτά την ημέρα, για 2 ημέρες. Τα αντικείμενα βρίσκονταν σε μια σταθερή θέση σε έναν λευκό θάλαμο. Κατά τη φάση της δοκιμής την τρίτη ημέρα, ένα από τα εκτεθειμένα αντικείμενα αντικαταστάθηκε με ένα γκρι γυαλί (ύψος=8,7 cm, διάμετρος=5cm) στερεωμένο ανάποδα στον θάλαμο και το άλλο αντικείμενο αντικαταστάθηκε με νέο αλλά πανομοιότυπο λευκό ακρυλικό κύλινδρο. Ο χρόνος που αφιερώθηκε στην εξερεύνηση καθενός από τα αντικείμενα συλλέχτηκε και αναλύθηκε από το λογισμικό Ethovision.

Ογκομετρική ανάλυση ιππόκαμπου

Όλες οι σαρώσεις μαγνητικής τομογραφίας (MRI) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ClinScan 70/30 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Γερμανία) με πηνίο συστοιχίας φάσεων προσαρμοσμένο για το κεφάλι του ποντικιού. Επιλέχθηκε μια τρισδιάστατη (3D) διαβαθμισμένη ακολουθία ηχούς για τη λήψη εικόνων πολλαπλών τμημάτων του εγκεφάλου με τις ακόλουθες παραμέτρους: χρόνος επανάληψης=30 ms;χρόνος ηχούς=15 ms; γωνία αναστροφής=20";αριθμός μέσων τιμών=5; πάχος τομής =0.2 mm; ανάλυση εντός επιπέδου=256×256; μέγεθος voxel=59×59 ×200μm². Ο συνολικός χρόνος απόκτησης ήταν περίπου 15 λεπτά με 1-2 τοις εκατό ισοφλουράνιο ως αναισθητικό. Ο όγκος του ιππόκαμπου μετρήθηκε με PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Ελβετία). Οι ιππόκαμποι σκιαγραφήθηκαν χειροκίνητα σε 13 ή 14 στεφανιαία ζώα. Ο όγκος κάθε φέτας λήφθηκε πολλαπλασιάζοντας την περιγραμμένη περιοχή με το πάχος της τομής (0,2 mm). Ο συνολικός όγκος του εγκεφάλου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας χειροκίνητα περιγραμμένες περιοχές σε 19 οβελιώδεις φέτες ανά ζώο, πολλαπλασιάζοντας την περιγεγραμμένη περιοχή στο πάχος της τομής (0,2 mm) Οι εικόνες αναλύθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες με τυφλό τρόπο.

Ποσοτικοποίηση mRNA

Ο ιστός του ιππόκαμπου συλλέχθηκε από ποντίκια WT και cKO, στη συνέχεια ομογενοποιήθηκε σε Trizol, ακολουθούμενη από εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου του ολικού RNA. Στη συνέχεια κατασκευάστηκε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript Ill (Invitrogen). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης στη συνέχεια υπολογίστηκαν με τη μέθοδο △ACt και κανονικοποιήθηκαν έναντι ενός ελέγχου Gapdh. Ng-Forward: 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3; Ngf-Reverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'

Δοκιμασία κορτικοστερόνης

Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν μεταξύ 7:30 και 8:00 μ.μ. με παρακέντηση φλέβας προσώπου και συλλέχθηκαν σε σωλήνες Microvette" CB300 LH. Το πλάσμα διαχωρίστηκε από το πλήρες αίμα με φυγοκέντρηση και αποθηκεύτηκε σε φυγοκεντρικούς σωλήνες στο {{5} }"C μέχρι να αναλυθεί. Για την ανάλυση, τα δείγματα αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (1/40), στη συνέχεια αναλύθηκαν με κιτ Corticosterone EIA (Enzo Life Sciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Προετοιμασία ιικού φορέα και ενδοιπποκαμπικές ενέσεις

Για το πείραμα υπερέκφρασης Ngf, θραύσματα DNA που κωδικοποιούσαν το Ngf (RefSeq NM 013609) ή βελτιώθηκαν. Οι πράσινες φθορίζουσες πρωτεΐνες (eGFP) δημιουργήθηκαν με PCR και υποκλωνοποιήθηκαν στη θέση Note ενός κατασκευάσματος ιού AAV9. Ανασυνδυασμένοι φορείς AAV9 παρήχθησαν με μια τυπική μέθοδο επιμόλυνσης τριπλού πλασμιδίου και καθαρίστηκαν με δύο γύρους φυγοκέντρησης Csd. Οι τίτλοι φυσικών φορέων των AAV ποσοτικοποιήθηκαν με μέτρηση του αριθμού των συσκευασμένων γονιδιωμάτων φορέων χρησιμοποιώντας μια μέθοδο PCR σε πραγματικό χρόνο.

Για τις ενέσεις ιικού φορέα, η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία (ένα μείγμα Zoletil-Rompun). Τα ποντίκια έλαβαν αμφίπλευρες ενέσεις ιικών φορέων στον ιππόκαμπο σε όγκο 1,5 ul υπό στερεοταξική καθοδήγηση. Υπήρχαν συνολικά τέσσερα σημεία ένεσης (για τον ραχιαίο ιππόκαμπο, Πρόσθιο-Πίσω (AP)-22 mm. Μέση-Πλάγια (ML)±2.0 mm από το βρεγμό και Ραχιαία-Κοιλιακή ( DV)-1.8 mm από τη μήνιγγα· για κοιλιακή ιπποκαμπούρα, AP-3.0mm, ML ±3.0 και DV-3 .3mm). Η τελική συγκέντρωση του ενέσιμου φορέα AAV ήταν 3,1×10 12vg/ml.

Ανοσοϊστοχημεία/υβριδισμός και ποσοτικοποίηση in situ

Όλα τα τμήματα για την επισήμανση των Ki67, Doublecortin (DCX,5-Bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)/NeuN και ChAT κόπηκαν σε φέτες σε πάχος 40μm σε συρόμενο μικροτόμο Οι τομές τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες SuperFrost και ξηράνθηκαν όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν σε ρυθμιστικό κιτρικού διαλύματος 0,01 mol/L για 20 λεπτά στους 90*C, 3 τοις εκατό HaO, για 10 λεπτά, ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και επωάστηκε όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου με αντίσωμα κουνελιού anti-Ki67 (1:3000, Abcam), αντίσωμα κουνελιού anti-DCX (1:4000, Abcam) και αντίσωμα αντι-ChAT (1:200, Abcam). Την επόμενη μέρα, ένα Χρησιμοποιήθηκε η τυπική διαδικασία κιτ ABC IgG κουνελιού (Vector Lab) και οι αντικειμενοφόρες πλάκες αντέδρασαν για 5-10λεπτά με ένα δισκίο Sigma DAB. Τα τμήματα στη συνέχεια καλύφθηκαν με DPX.

Για τη διπλή επισήμανση BrdU/NeuN, τα τμήματα επωάστηκαν σε 2Ν HCl για 15 λεπτά στους 37"C, εξουδετερώθηκαν σε βορικό νάτριο (Sigma) για 10 λεπτό (pH 8,5) και πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS πριν από την επώαση με αρουραίο anti-BrdU (1:1500, Abcam) και αντι-NeuN ποντικού (1:1000, Millipore) Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS (5 λεπτά το καθένα), οι τομές επωάστηκαν με το φθορίζον δευτερεύον αντίσωμα (1:250, Alex Fluor 488 και Texas Red, Invitrogen) για 2 ώρες σε 0,3 τοις εκατό Triton/PBS με 2 τοις εκατό ορού κατσίκας.

Για τον in situ υβριδισμό Ngf, χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής Ngf (Αριθμός καταλόγου 565131) και RNAscope 2.5 HD Brown Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, ΗΠΑ) και η χρώση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το εγχειρίδιο του προϊόντος. Εν συντομία, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν σε 1× ρυθμιστικό διάλυμα ανάκτησης για 5 λεπτά στους 100 βαθμούς C, 3 τοις εκατό H, O, για 10 λεπτά και ξεπλύθηκαν σε 1× ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν σε πρωτεάση για 20 λεπτά και, στη συνέχεια, ανιχνευτής στόχος για 2 ώρες στους 40" C. Μετά από μια σειρά ενισχύσεων, το DAB χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση του RNA.

Τα διπλά επισημασμένα κύτταρα DCX, Ki67-και BrdU/NeuN μετρήθηκαν σε κάθε όγδοο τμήμα σε ολόκληρη την ροστροουραία έκταση του στρώματος κοκκωδών κυττάρων (έξι τομές ανά ζώο). Ο αριθμός των κυττάρων που μετρήθηκαν στη συνέχεια πολλαπλασιάστηκε επί 16, για να ληφθεί μια εκτίμηση του συνολικού αριθμού των θετικών σε DCX, Ki67 και BrdU κυττάρων στην οδοντωτή έλικα. Όλες οι διαφάνειες τυχαιοποιήθηκαν και κωδικοποιήθηκαν πριν από την ποσοτική ανάλυση. Τα επισημασμένα με ChAT σωματικά κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε δεύτερη τομή μέσω της ροστροκουδικής έκτασης του πυρήνα του κατακόρυφου άκρου της διαγώνιας ζώνης (VDB) και του έσω διαφράγματος (MS) (τέσσερις τομές ανά ζώο). Για μια αντιπροσωπευτική εικόνα διπλής επισήμανσης BrdU/NeuN, μια εικόνα στοίβας z (επτά φέτες στη στοίβα) λήφθηκε αρχικά κάτω από αντικειμενικό x40, ακολουθούμενη από τρισδιάστατη αποσυνέλιξη με γρήγορη επαναληπτική λειτουργία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).

Οι χολινεργικές ίνες οπτικοποιήθηκαν σε χρώση ChAT και εξετάστηκαν στο σκοτεινό πεδίο, υπό ×10 αντικειμενικό (Axio Imager 2, που καταγράφηκε από τη Nikon D5100). Η πυκνότητα των ινών ποσοτικοποιήθηκε ως η μέση ένταση (Μέση τιμή του γκρίζου) του κατωφλίου σήματος κάτω από την περιοχή του ιππόκαμπου με Εικόνα 142 g (NIH), η πυκνότητα χολινεργικής ίνας του ιππόκαμπου ποσοτικοποιήθηκε μονομερώς σε κάθε όγδοο τμήμα σε ολόκληρη την έκταση του ουροφόρου ιστού ολόκληρου του ιππόκαμπου.

Ηλεκτροφυσιολογία σε φέτες ιππόκαμπου

Οι φέτες ιππόκαμπου (πάχους 450 um) κόπηκαν εγκάρσια με δονούμενο τεμαχιστή ιστού (DSK Microslicer DTK-1000; Dosaka EM, Kyoto, Japan). Οι φέτες αφέθηκαν να ανακτήσουν για τουλάχιστον 120 λεπτά και μεταφέρθηκαν σε θάλαμο εγγραφής τύπου εμβάπτισης τοποθετημένο σε όρθιο μικροσκόπιο (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Ιαπωνία) εξοπλισμένο με ένα μικροσκοπικό βίντεο υπέρυθρης διαφορικής παρεμβολής-αντίθεσης. Οξυγονωμένο τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (5 τοις εκατό CO,/95 τοις εκατό Ο) που περιέχει 0,1 mM πικροτοξίνη εγχύθηκε στον θάλαμο καταγραφής με ρυθμό 1-2 ml/min. Ένα διπολικό ηλεκτρόδιο διέγερσης από ανοξείδωτο χάλυβα (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (σύνθετη αντίσταση 10 Meg-ohm) και μια γυάλινη πιπέτα γεμάτη με 3 M NaCl τοποθετήθηκαν στην ακτίνα στρώματος του CA1 για την πρόκληση και την καταγραφή των διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών πεδίου (fEPSPs )δραστηριότητα, αντίστοιχα. Η διευκόλυνση ζευγαρωμένων παλμών (PPF) διερευνήθηκε σε διάφορα διαστήματα μεταξύ διέγερσης και κάθε διάστημα μεταξύ ερεθισμάτων εφάρμοζε δύο παλμούς ρεύματος μικρής διάρκειας (40 μs) κάθε 20 δευτερόλεπτα για τουλάχιστον τέσσερις φορές. Οι αναλογίες των αρχικών κλίσεων από τη δεύτερη απόκριση fEPSP/πρώτη απόκριση fPSP μετρήθηκαν για ανάλυση δεδομένων. Για πειράματα μακροπρόθεσμης ενίσχυσης (LTP), η σταθερή βασική δραστηριότητα fPSP προκλήθηκε κάθε 20 δευτερόλεπτα για τουλάχιστον 20 λεπτά, η διέγερση υψηλής συχνότητας (HFS)-LTP στη συνέχεια προκλήθηκε χρησιμοποιώντας 5 αμαξοστοιχίες των 100 παλμών στα 100 Hz με ένα διάστημα μεταξύ των στελέχων της δεκαετίας του 20. Τα ηλεκτροφυσιολογικά ίχνη ενισχύθηκαν με έναν ενισχυτή (Multiclamp 700 B, Axon Instruments, Union City, CA). Όλα τα σήματα φιλτραρίστηκαν χαμηλής διέλευσης στο 1 kHz και ψηφιοποιήθηκαν στα 10 kHz χρησιμοποιώντας μια διεπαφή CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Οι συναπτικές αποκρίσεις κανονικοποιήθηκαν στο μέσο όρο της βασικής γραμμής. Οι τιμές βραχυπρόθεσμης ενίσχυσης (STP) και LTP προσδιορίστηκαν με τον μέσο όρο 5 λεπτών κανονικοποιημένων τιμών κλίσης σε 10-15 λεπτά και 55-60 λεπτά μετά το HFS, αντίστοιχα. Οι πειραματιστές που διεξήγαγαν την ηλεκτροφυσιολογία τυφλώθηκαν στην ομάδα ποντικών.

Ιπποκαμπική χολινεργική απονεύρωση

Το αντίσωμα p{0}} ποντικού με συζευγμένη σαπορίνη (mu p75-SAP) (ATS Bio, San Diego) χρησιμοποιήθηκε στη χολινεργική απονεύρωση. Στη συνέχεια, χορηγήθηκαν 0,2 μg του mup75-SAP ανά θέση και τα σημεία ένεσης ήταν παρόμοια με τα σημεία ένεσης ιικού φορέα (τέσσερις θέσεις ένεσης ανά ζώο).

Στατιστική ανάλυση

Ο μέσος όρος±SEM προσδιορίστηκε για κάθε ομάδα. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Graphpad Prism. Τα δεδομένα αναλύθηκαν μέσω ανάλυσης διακύμανσης ή t-test ανάλογα με την περίπτωση. Η μέθοδος Bonferroni εκτελέστηκε όταν ήταν εφαρμόσιμο. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν το p ήταν<>

Αποτελέσματα

Μειωμένη νευρογένεση του ιππόκαμπου, πυκνότητα χολινεργικών ινών και όγκο σε ποντικούς Ngf KO ειδικά για το νευρικό σύστημα

Μια σημαντική πρόκληση για τη μελέτη των λειτουργιών του NGF σε ενήλικα ποντίκια είναι ότι τα συμβατικά μοντέλα KO πεθαίνουν πρόωρα. Μέχρι στιγμής, οι περισσότερες αναφορές έχουν χρησιμοποιήσει αναστολείς NGF, όπως μικρά παρεμβαλλόμενα RNA ή αντισώματα, για την αξιολόγηση της επίδρασης του NGF52. Για να μελετήσουμε τον ρόλο του NGF στον εγκέφαλο, διασταυρώσαμε ποντίκια με ποντίκια Ngf με ποντίκια Sox: Cre, τα οποία εκφράζουν το Cre σε όλο τον νευρικό σωλήνα από το E1127. Αυτά τα ειδικά για τον ιστό ποντίκια cKO μας επιτρέπουν να διερευνήσουμε τις λειτουργίες του Ngf στον εγκέφαλο (Εικ. 1Α). Πρώτον, η έκφραση Mgf mRNA του ιππόκαμπου μετρήθηκε με ποσοτική PCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια ισχυρή μείωση της έκφρασης Ngf σε ποντικούς cKO (σελ<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">

Η έγχυση NGF στις πλάγιες κοιλίες αυξάνει τόσο την επιβίωση των νεογέννητων νευρώνων όσο και τη χολινεργική δραστηριότητα στον ιππόκαμπο8. Επομένως, ρωτήσαμε εάν τα ποντίκια με έλλειψη Ngf έχουν χαμηλότερα επίπεδα νευρογένεσης του ιππόκαμπου και χολινεργικής νεύρωσης. Για να ανιχνεύσουμε τη νευρογένεση ενηλίκων, εγχύαμε BrdU (200 mg/kg, μία ένεση, ενδοπεριτοναϊκά) σε ενήλικα ποντίκια WT και Ngf cKO (ηλικίας περίπου 13 εβδομάδων). Τα ποντίκια θανατώθηκαν 34 ημέρες μετά από αυτή την ένεση BrdU για να αξιολογηθεί η νευρωνική επιβίωση. Χρωματίσαμε τον εγκεφαλικό ιστό για Ki67 (δείκτης πολλαπλασιασμού κυττάρων), DCX (δείκτη για ανώριμους νευρώνες) και διπλή χρώση για BrdU και NeuN (νευρωνικός δείκτης). Για να αξιολογήσουμε την πυκνότητα των χολινεργικών ινών, χρωματίσαμε για το ChAT, το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση της ακετυλοχολίνης. Εντοπίσαμε σημαντικά λιγότερο Ki67 (p=0.0016, t(16)=3.8) και DCX (p <0,0001, t(16)="8.14)" θετικό="" αριθμό="" κυττάρων="" σε="" η="" οδοντωτή="" έλικα="" του="" ιππόκαμπου="" σε="" ποντικούς="" ngf="" cko="" σε="" σύγκριση="" με="" ποντίκια="" wt.="" για="" τη="" διπλή="" επισήμανση="" brdu="" και="" neun,="" τα="" ποντίκια="" ngf="" cko="" παρουσίασαν="" επίσης="" μια="" τάση="" για="" χαμηλότερο="" επίπεδο="" brdu="" συν="" eun="" συν="" αριθμό="" κυττάρου="" (p="0.054," t(14)="2.09)" (εικ.="" 1c).="" μαζί,="" αυτά="" τα="" δεδομένα="" καταδεικνύουν="" ότι="" ένα="" έλλειμμα="" ngf="" στον="" εγκέφαλο="" έχει="" ως="" αποτέλεσμα="" μειωμένη="" νευρογένεση="" του="" ιππόκαμπου="" των="" ενηλίκων.="" η="" κορτικοστερόνη="" του="" πλάσματος="" είναι="" ένας="" σημαντικός="" παράγοντας="" στον="" έλεγχο="" της="" νευρογένεσης="" ενηλίκων29,="" και="" έτσι="" για="" να="" προσδιορίσουμε="" εάν="" η="" μειωμένη="" νευρογένεση="" σε="" ποντικούς="" ngf="" cko="" οφείλεται="" σε="" αυξημένη="" κορτικοστερόνη="" πλάσματος,="" μετρήσαμε="" το="" βασικό="" επίπεδο="" κορτικοστερόνης="" πλάσματος="" από="" ποντίκια="" wt="" και="" cko.="" δεν="" υπήρχε="" σημαντική="" διαφορά="" στη="" βασική="" κορτικοστερόνη="" πλάσματος="" (p="0.24," t(9)="1.25)," γεγονός="" που="" υποδηλώνει="" ότι="" η="" επίδραση="" του="" ngf="" στη="" νευρογένεση="" δεν="" προκαλείται="" από="" τη="" διαφορά="" στη="" κορτικοστερόνη="" πλάσματος="" (="" συμπληρωματικό="" σχ.="">

Προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι οι χολινεργικές προβολές στον ιππόκαμπο προέρχονται από τον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο30. Έτσι, αξιολογήσαμε εάν υπάρχουν αλλαγές στις χολινεργικές σεπτοϊπποκαμπικές προβολές σε ποντικούς Ngf cKO. Τα αποτελέσματά μας από τη χρώση ChAT δείχνουν ότι η πυκνότητα των χολινεργικών ινών μειώνεται δραματικά στον ιππόκαμπο των ποντικών Ngf cKO (περίπου 76 τοις εκατό μειωμένη, p <0,0001, t(8)="9.56)" (εικ.="" 1d),="" αλλά="" όχι="" άλλες="" φλοιώδεις="" περιοχές,="" όπως="" ο="" έσω="" προμετωπιαίος="" φλοιός="" (p="0.12," t(8)="1.73)" και="" ο="" κροταφικός="" φλοιός="" συσχέτισης="" (p="0.2," t(16="" )="1.31)" (συμπληρωματικό="" σχ.="" s2a,="" b).="" μαζί,="" αυτά="" τα="" δεδομένα="" υποδεικνύουν="" ότι="" ο="" ngf="" απαιτείται="" για="" την="" υποστήριξη="" των="" χολινεργικών="" προβολών="" στον="" ιππόκαμπο,="" αλλά="" όχι="" στον="" φλοιό.="" στη="" συνέχεια,="" αναλύσαμε="" τον="" αριθμό="" των="" χολινεργικών="" νευρωνικών="" κυττάρων="" στο="" vdb="" του="" broca="" και="" της="" ms,="" από="" όπου="" προβάλλει="" χολινεργικές="" ίνες="" στον="" ιππόκαμπο31,32.="" τα="" ποντίκια="" ngf="" cko="" εμφανίζουν="" μια="" μικρή="" μείωση="" (περίπου="" 20="" τοις="" εκατό="" μειωμένη)="" στον="" αριθμό="" των="" κυττάρων="" chat="" σε="" ms="" και="" vdb="" (p="0.022," t(16)="2.52)" (συμπληρωματικό="" σχήμα="" s2c)="">

Κατά την τομή του εγκεφαλικού ιστού, διαπιστώσαμε ότι ο ιππόκαμπος των ποντικών cKO φαινόταν να είναι μικρός. Για να το επιβεβαιώσουμε, πραγματοποιήσαμε σάρωση μαγνητικής τομογραφίας και τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι το Ngf cKO έχει μικρότερο ιππόκαμπο από το WT (p < 0.0001,="" t(12)="12)." για="" να="" το="" επαληθεύσουμε="" περαιτέρω,="" ανατέμναμε="" τον="" ιππόκαμπο="" και="" μετρήσαμε="" το="" βάρος="" και="" βρήκαμε="" ότι="" ο="" ιππόκαμπος="" των="" ποντικών="" cko="" ήταν="" ελαφρύτερος="" σε="" βάρος="" σε="" σύγκριση="" με="" τα="" ποντίκια="" wt="" (p="0.01," t(23)="2." 79)="" (εικ.="">

Μειωμένη απόκριση άγχους και χωρική μάθηση σε ποντικούς Ngf cKO

Ο αποκλεισμός του ενδογενούς NGF βλάπτει τη διατήρηση της χωρικής μνήμης21 και διαταράσσει τη χολινεργική σηματοδότηση, ενώ η διαγραφή του χολινεργικού συστήματος του πρόσθιου εγκεφάλου επηρεάζει το άγχος και τη χωρική μάθηση18,33. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις επιπτώσεις του Ngf cKO στο άγχος και τη μάθηση, υποβάλαμε ποντίκια σε ανοιχτό πεδίο, EPM, δοκιμή υδάτινου λαβύρινθου και αναγνώριση νέων αντικειμένων.

Η διαγραφή Ngf αύξησε τη συμπεριφορά που μοιάζει με άγχος και μείωσε τη χωρική μάθηση και τη μνήμη, χωρίς να επηρεάζει την αναγνώριση νέου αντικειμένου. Στη δοκιμή ανοιχτού πεδίου, τα ποντίκια cKO ξόδεψαν λιγότερα στην κεντρική ζώνη (p=0.04, t(40)=2.09), χωρίς διαφορά στη συνολική απόσταση που διανύθηκε (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (Εικ. 2Α). Στο EPM, τα ποντίκια cKO πέρασαν περισσότερο χρόνο στον ανοιχτό βραχίονα (p=0.001, t(40)=3.43) αλλά δεν εμφάνισαν σημαντική διαφορά στη συνολική απόσταση (p {{ 18}}.25, t(40)=1.15) (Εικ. 2Β). Στη δοκιμή λαβύρινθου νερού, τα ποντίκια Ngf cKO είχαν χειρότερη απόδοση στο τμήμα προπόνησης (ρ=0.001, F(1,16)=15.65). Μια εβδομάδα αργότερα, κάναμε ένα τεστ μνήμης. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στον υδάτινο λαβύρινθο αλλά με την πλατφόρμα αφαιρεθεί. Τα ποντίκια Ngf cKO πέρασαν λιγότερο χρόνο στο τεταρτημόριο στόχο (ρ=0.01, t(16)=2.79) (Εικ. 2C). Για την αναγνώριση νέου αντικειμένου, δεν υπάρχει διαφορά στο DI (p=0.41, t(20)=0.82). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το NGF παίζει ρόλο στη διαμεσολάβηση του άγχους και της χωρικής μάθησης/μνήμης.

Το LTP του ιππόκαμπου θεωρείται ευρέως ως συναπτικό μοντέλο μνήμης34 και οι άμεσες ενδοδιαφραγματικές εγχύσεις του NGF διευκολύνουν την επαγωγή του LTP21. Για να εξετάσουμε την επίδραση του NGF στη συναπτική πλαστικότητα, μετρήσαμε το LTP μέσω ex vivo ηλεκτροφυσιολογικής καταγραφής στην ιππόκαμπη CA1 Schaffer collaterals μονοπάτι εγκεφάλων σε ποντίκια WT και Ngf cKO. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι το HFS παρήγαγε μια επίμονη αύξηση στην κλίση των fEPSPs στους νευρώνες CA1 και των ποντικών WT και Ngf cKO, αλλά καμία διαφορά στο LTP (Εικ. 2D). Ωστόσο, μετά από πέντε αμαξοστοιχίες τετανοποιητικού ερεθίσματος HFS, το STP μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα Ngf cKO (10–15 λεπτά μετά το HFS, p=0.006, t(10)=3.39) ( Εικ. 2Ε). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω την επίδραση στην προσυναπτική μετάδοση, εξετάσαμε τη βραχυπρόθεσμη συναπτική πλαστικότητα από το PPF. Οι αναλογίες ζευγαρωμένων παλμών (PPRs) ήταν παρόμοιες μεταξύ των ποντικών Ngf cKO και WT. Ωστόσο, παρατηρούμε μια τάση ενισχυμένου PPR από δείγματα Ngf cKO χρησιμοποιώντας ένα διάστημα μεταξύ ερεθισμάτων 50 ms (p=0.094, t(18)=1.76) (Εικ. 2F), υποδηλώνοντας ότι το Η προσυναπτική μετάδοση μπορεί να έχει αλλάξει στα ποντίκια Ngf cKO.

Η υπερέκφραση του Ngf στον ιππόκαμπο ποντικών cKO διασώζει τη χωρική μνήμη, αλλά όχι το άγχος

Για να προσδιορίσουμε εάν οι συμπεριφορικοί φαινότυποι που παρατηρήσαμε σε ποντικούς Ngf cKO μπορούν να αντιστραφούν με την υπερβολική έκφραση του Ngf στον ιππόκαμπο, εγχύαμε AAV-CB (ακτίνη κοτόπουλου)-Ngf ιικό φορέα (υπερέκφραση) ή AAV-CB-eGFP ιικό φορέα ( έλεγχος) στον ιππόκαμπο ποντικών Ngf cKO. Δεκατέσσερις ημέρες μετά την επέμβαση, υποβάλαμε όλα τα ποντίκια σε τεστ συμπεριφοράς. Τα αποτελέσματα δεν δείχνουν σημαντική διαφορά στη δοκιμή ανοιχτού πεδίου (χρόνος στην κεντρική ζώνη, p=0.59, t(37)=0.54) και EPM (χρόνος στον ανοιχτό βραχίονα, p {{12} }.76, t(37)=0.29) (Εικ. 3Α, Β). Για τον υδάτινο λαβύρινθο, δεν βρέθηκε διαφορά στο τμήμα εκπαίδευσης (p=0.54, F(1,15)=0.39). Ωστόσο, τα ποντίκια cKO με υπερέκφραση Ngf πέρασαν περισσότερο χρόνο στη ζώνη στόχο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p=0.008, t(15)=3.01) (Εικ. 3C, D). Μετά τη συλλογή του εγκεφαλικού ιστού, επιβεβαιώσαμε την υπερέκφραση Ngf με in situ υβριδισμό και PCR σε πραγματικό χρόνο (Εικ. 3Ε, ΣΤ). Ανιχνεύσαμε επίσης ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο χολινεργικών ινών στον ιππόκαμπο ποντικών που υπερεκφράζουν το Ngf (p=0.001, t(10)=4.19) (Εικ. 3G, H). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ποντίκια Ngf cKO με υπερέκφραση του ιππόκαμπου Ngf μπορούν να αποκαταστήσουν τις χολινεργικές νευρώσεις και τη χωρική μνήμη, αλλά όχι το άγχος.

Διαταραχή της χωρικής μνήμης σε ποντίκια με χολινεργική απονεύρωση στον ιππόκαμπο

Τα ποντίκια Ngf cKO εμφάνισαν σοβαρά μειωμένη εννεύρωση χολινεργικών ινών του ιππόκαμπου, η οποία αποκαταστάθηκε με υπερέκφραση του ιπποκάμπου Ngf. Αυτό συσχετίστηκε με την αποκατάσταση της απόδοσης της χωρικής μνήμης (χωρίς βελτίωση του άγχους). Ως εκ τούτου, εξετάσαμε εάν η εξάντληση των χολινεργικών ινών επιλεκτικά στον ιππόκαμπο επηρεάζει το άγχος ή τη χωρική μνήμη στον λαβύρινθο του νερού.

Μια προηγούμενη αναφορά έδειξε ότι το anti-p75NTRSaporin είναι μια ειδική χολινεργική ανοσοτοξίνη σε ποντίκια35. Για το σκοπό αυτό, εγχύαμε αντι-p75NTRSaporin (ή όχημα PBS ως μάρτυρα) στον ιππόκαμπο ποντικών C57. Δεκατέσσερις ημέρες μετά την επέμβαση, υποβάλαμε αυτές τις δύο ομάδες ποντικών σε τεστ συμπεριφοράς. Δεν βρήκαμε σημαντική διαφορά τόσο στη δοκιμή ανοιχτού πεδίου (χρόνος στην κεντρική ζώνη, p=0.5, t(15) {{10}}.68) όσο και στο EPM (χρόνος σε ανοιχτές αγκάλες , p=0.51, t(14)=0.66) (Εικ. 4Α, Β). Για τον υδάτινο λαβύρινθο, δεν βρέθηκε διαφορά στο τμήμα εκπαίδευσης (p=0.49, F(1,14)=0.49); Ωστόσο, τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση αντι-p75NTRSaporin στον ιππόκαμπο πέρασαν λιγότερο χρόνο στη ζώνη στόχο σε σύγκριση με τον έλεγχο PBS (p=0.035, t(14)=2.33) (Εικ. 4C, ΡΕ). Μετά τη συλλογή του εγκεφαλικού ιστού, επιβεβαιώσαμε ότι είχε συμβεί χολινεργική απονεύρωση στον ιππόκαμπο με χρώση ChAT (p < 0,0001,="" t(10)="11},85)," δείχνοντας="" επίσης="" ότι="" οι="" χολινεργικές="" ίνες="" στον="" φλοιό="" είχαν="" διατηρηθεί="" (p="" {="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (εικ.="" 4ε).="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" καταδεικνύουν="" ότι="" το="" χολινεργικό="" σύστημα="" του="" ιππόκαμπου="" απαιτείται="" για="" τη="" διατήρηση="" της="" λειτουργίας="" της="" χωρικής="" μνήμης,="" χωρίς="" να="" έχει="" αντίκτυπο="" στο="">

Η επίδραση του NGF στη χωρική μνήμη εξαρτάται από το χολινεργικό σύστημα του ιππόκαμπου

Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν το όφελος της χωρικής μνήμης που αποκτάται από την υπερέκφραση του Ngf στον ιππόκαμπο των ποντικών Ngf cKO εξαρτάται από την άθικτη χολινεργική νεύρωση του ιππόκαμπου. Κάναμε ένεση τόσο αντι-p75NTRSaporin όσο και ιικούς φορείς AAV-Ngf στον ιππόκαμπο ποντικών Ngf cKO. Για την ομάδα ελέγχου, εγχύαμε και αντι-p75NTRSaporin και AAV-eGFP ιικούς φορείς. Δεκατέσσερις ημέρες μετά την επέμβαση, αξιολογήσαμε τόσο το άγχος όσο και τη χωρική μνήμη. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν διαφορά μεταξύ AAV-Ngf και AAV-eGFP στη δοκιμή ανοιχτού πεδίου (χρόνος στην κεντρική ζώνη, p=0.6, t(33)=0.51) και EPM (χρόνος σε ανοιχτές αγκάλες, p=0.92, t(33)=0.09) (Εικ. 5Α, Β). Για τη χωρική μάθηση και τη μνήμη, επίσης δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των ομάδων, τόσο στο τμήμα εκπαίδευσης (p=0.94, F(1,36)=0.004) όσο και στο τεστ μνήμης (p {{ 26}}.44, t(36)=0.77) (Εικ. 5C, D). Μετά τη συλλογή του εγκεφαλικού ιστού, αξιολογήσαμε την πυκνότητα των χολινεργικών ινών του ιππόκαμπου με χρώση ChAT και και οι δύο ομάδες έδειξαν σοβαρή εξάντληση των χολινεργικών ινών του ιππόκαμπου, αν και βρέθηκε ελαφρώς υψηλότερο επίπεδο πυκνότητας ινών σε ποντικούς AAV-Ngf σε σύγκριση με ποντίκια AAV-eGFP (p=0.01, t(12)=2.83) (Εικ. 5E, F). Η PCR σε πραγματικό χρόνο επιβεβαίωσε ότι η ομάδα AAV-Ngf είχε αυξήσει δραματικά την έκφραση Ngf σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (ρ=0.0004, t(12)=4.89) (Εικ. 5G). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ευεργετική επίδραση του NGF στη χωρική μνήμη απαιτεί άθικτη χολινεργική νεύρωση του ιππόκαμπου.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, ξεκινήσαμε να διερευνήσουμε τους ρόλους του NGF του ιππόκαμπου και του χολινεργικού συστήματος στο άγχος, τη μάθηση και τη μνήμη. Δείξαμε ότι τα ποντίκια με ειδική για τον εγκέφαλο διαγραφή Ngf (Mgf ckO) παρουσιάζουν αυξημένο άγχος και έλλειμμα στη χωρική μάθηση. Τα ποντίκια Ngf cKO παρουσίασαν επίσης χαμηλότερα επίπεδα νευρογένεσης ενηλίκων, μικρότερο όγκο ιππόκαμπου, μειωμένη STP και δραματική εξάντληση των χολινεργικών νευρώσεων στον ιππόκαμπο. Η υπερέκφραση του Ngf στον ιππόκαμπο των ποντικών KO γονιδίου Ngf διέσωσε τη χωρική μνήμη αλλά δεν αύξησε το άγχος. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε επίσης μια μερική αποκατάσταση της χολινεργικής νεύρωσης στον ιππόκαμπο μετά από υπερέκφραση Ngf σε αυτή τη δομή. Για να εξετάσουμε εάν η επίδραση του NGF στη χωρική μνήμη εξαρτάται από αυτές τις χολινεργικές νευρώσεις, πρώτα εξαντλήσαμε τις χολινεργικές ίνες του ιππόκαμπου σε ποντίκια WT C57 με έγχυση μιας χολινεργικής ανοσοτοξίνης στον ιππόκαμπο και επιβεβαιώσαμε ότι οι χολινεργικές ίνες του ιππόκαμπου υποστηρίζουν τη χωρική μνήμη. Στη συνέχεια, σε ποντίκια υποβάθρου Ngf cKO, εξαντλήσαμε τις χολινεργικές ίνες του ιππόκαμπου αλλά αυξήσαμε την έκφραση Ngf ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας AAV-Ngf, τα οποία συγκρίθηκαν με παρόμοια ποντίκια με εξάντληση χολινεργικών αλλά στους οποίους έγινε ένεση με τον έλεγχο AAV-eGFP. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η επανέκφραση υψηλών επιπέδων Ngf στον ιππόκαμπο δεν βελτίωσε τη χωρική μνήμη. Έτσι, δείχνουμε ότι η επανορθωτική δράση του NGF στο Ngf cKO εξαρτάται από ανέπαφες χολινεργικές νεύρωση του ιππόκαμπου και όχι από άλλο μηχανισμό.

Ο εξωγενώς παρεχόμενος NGF έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την επιβίωση των νεογέννητων νευρώνων28 και τη χωρική μάθηση36 σε τρωκτικά, ενώ ο αποκλεισμός του NGF από αντισώματα βλάπτει τη χωρική μνήμη21. Σε συμφωνία με τον υποστηρικτικό ρόλο του NGF σε αυτές τις παραμέτρους, δείξαμε ότι η ειδική διαγραφή του Ngf για το κεντρικό νευρικό σύστημα εμφανίζει μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της νευρογένεσης. Σε τεστ συμπεριφοράς, παρατηρήσαμε επίσης εξασθένηση του άγχους και της χωρικής μάθησης/μνήμης.

Μια προηγούμενη μελέτη Ngf KO παρείχε στοιχεία που δείχνουν ότι το NGF είναι απαραίτητο για τη μάθηση και τη μνήμη37. Ωστόσο, οι συγγραφείς δεν διεξήγαγαν δοκιμασία ανίχνευσης (τμήμα μνήμης) και αντ' αυτού πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μάθηση. Επιπλέον, το 60 τοις εκατό των χολινεργικών ινών του ιππόκαμπου παρέμενε ακόμα στα ποντίκια Ngff/f–Nes::Cre σε αυτή τη μελέτη. Στο μοντέλο ποντικών μας, ανιχνεύουμε μόνο το 20 τοις εκατό των χολινεργικών ινών που έχουν απομείνει στα ποντίκια Ngff/f–Sox1::Cre. Αυτή η ασυμφωνία μπορεί να εξηγήσει τη διαφορά στη συμπεριφορά που παρατηρήσαμε, καθώς το πείραμά μας παρέχει ενδείξεις ότι απαιτούνται χολινεργικές νευρώσεις του ιππόκαμπου για την επίδραση του NGF στη χωρική μνήμη. Ο φαινότυπος άγχους που παρατηρήσαμε σε ποντικούς Ngf cKO δεν μπορεί να αντιστραφεί με την υπερέκφραση του ιππόκαμπου Ngf. Μια πιθανότητα για αυτό είναι ότι ο φαινότυπος άγχους που παρατηρήσαμε σε ποντικούς Ngf cKO ήταν συνέπεια της αδρανοποίησης του Ngf σε πρώιμο στάδιο. Εναλλακτικά, ο NGF μπορεί να δρα εκτός του ιππόκαμπου για να ρυθμίσει το άγχος. Ωστόσο, παρατηρούμε την αναγέννηση των χολινεργικών ινών και τη βελτίωση της διατήρησης της χωρικής μνήμης σε ποντίκια που υπερεκφράζουν το Ngf του ιππόκαμπου και αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με μια προηγούμενη μελέτη σε ηλικιωμένους αρουραίους38.

Διαπιστώσαμε ότι η χολινεργική βλάβη του ιππόκαμπου δεν επηρέασε το άγχος αλλά εξασθενούσε τη χωρική μνήμη. Τα αποτελέσματά μας δεν συνάδουν με προηγούμενες αναφορές που έδειξαν μικροέγχυση ενός αναστολέα ακετυλοχολινεστεράσης ή μουσκαρινικών ανταγωνιστών των υποδοχέων Μ1 και Μ2 στον ιππόκαμπο που ρυθμίζει το άγχος39,40. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας συνάδουν με μια αναφορά που δεν βρήκε καμία επίδραση στο άγχος μετά από μείωση της χολινεργικής νεύρωσης του ιππόκαμπου που επιτεύχθηκε με έγχυση ανοσοτοξίνης στο ΣΚΠ και στο VDB του Broca41. Για τη χωρική μάθηση και τη μνήμη, αρκετές μελέτες υποδεικνύουν ότι η δραστηριότητα ChAT σχετίζεται με τη χωρική μάθηση18,35,42,43, αλλά άλλες εργασίες δεν έδειξαν καμία επίδραση στη χωρική μάθηση και μνήμη μετά από βλάβη ανοσοτοξίνης44,45. Στο πείραμά μας, διαπιστώσαμε ότι η εξάντληση της χολινεργικής νεύρωσης του ιππόκαμπου βλάπτει τη χωρική μνήμη, χωρίς να επηρεάζει την απόκτηση. Αυτές οι αποκλίσεις μεταξύ των μελετών θα μπορούσαν να οφείλονται στα διαφορετικά πρωτόκολλα συμπεριφοράς, την ηλικία, το στέλεχος και τις μεθόδους αναστολής του χολινεργικού συστήματος στον ιππόκαμπο.

Μια αλληλεπίδραση μεταξύ του NGF και του χολινεργικού συστήματος έχει μελετηθεί από καιρό. Η απώλεια του TrkA, καθώς και η διαγραφή του Ngf, μειώνει τους χολινεργικούς νευρώνες στη ΣΚΠ και τις χολινεργικές νευρώσεις στις φλοιώδεις περιοχές και στον ισχιακό πόκαμπο37,46. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο μοντέλο μας με έλλειψη Ngf με περίπου το 76 τοις εκατό των χολινεργικών ινών του ιππόκαμπου να είναι απονευρωμένες. Για να μάθουμε εάν αυτές οι χολινεργικές ίνες συνέβαλαν στην επίδραση του NGF στη χωρική μάθηση, αυξήσαμε την έκφραση του Ngf, εξαντλώντας παράλληλα τις χολινεργικές νευρώσεις σε ποντικούς Ngf cKO μέσω ενδο-ιπποκαμπικής ένεσης με μικτό AAV-Ngf (ή AAV-eGFP για την ομάδα ελέγχου και) anti-p75NTRSaporin. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυξήσαμε δραματικά την έκφραση του Ngf και επίσης εξαντλήσαμε με επιτυχία αυτές τις χολινεργικές νευρώσεις. Αν και η πυκνότητα των χολινεργικών ινών στην ομάδα AAV-Ngf plus anti-p75NTRSaporin ήταν λίγο υψηλότερη από την ομάδα AAV-eGFP plus anti-p75NTRSaporin, και οι δύο ομάδες έφτασαν το 90 τοις εκατό της εξάντλησης των χολινεργικών ινών στον ιππόκαμπο σε σύγκριση με τα ποντίκια WT χωρίς θεραπεία. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη χωρική μνήμη μεταξύ αυτών των ομάδων, υποδηλώνοντας ότι η απλή αύξηση της έκφρασης Ngf χωρίς χολινεργική νεύρωση του ιππόκαμπου δεν αρκεί για την αποκατάσταση της χωρικής μνήμης.

Εδώ χρησιμοποιούμε ποντίκια Ngf υπό όρους KO ειδικά για τον εγκέφαλο για να αποκαλύψουμε τη σημασία του NGF στη ρύθμιση του όγκου του ιππόκαμπου, της συμπεριφοράς, της συναπτικής πλαστικότητας, της νευρογένεσης και της χολινεργικής νεύρωσης. Επιπλέον, αποδεικνύουμε ότι η επίδραση του ιππόκαμπου NGF στη χωρική μνήμη εξαρτάται από ένα άθικτο χολινεργικό σύστημα. Η γονιδιακή θεραπεία Ngf έχει δοκιμαστεί σε ασθενείς με νόσο Αλτσχάιμερ, αλλά δεν βρέθηκαν αποτελέσματα στην τελευταία κλινική δοκιμή φάσης 247. Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα από την προηγούμενη κλινική δοκιμή φάσης 1 με πανομοιότυπη χειρουργική διαδικασία, αναλύοντας μεταθανάτιο ιστό, διαπίστωσαν ότι ο εγχυόμενος AAV-Ngf δεν εμπλέκεται άμεσα με τους χολινεργικούς νευρώνες-στόχους48. Τα δεδομένα μας παρέχουν ενδείξεις ότι το AAV-Ngf μπορεί να είναι αναποτελεσματικό χωρίς χολινεργική εκ νέου νεύρωση. Η μελέτη μας, σε συνδυασμό με αυτήν την πρόσφατη μεταθανάτια παρατήρηση, υποδηλώνει ότι είναι ακόμη πολύ νωρίς για να συμπεράνουμε ότι η θεραπεία με NGF είναι αναποτελεσματική για τη νόσο του Αλτσχάιμερ.

βιβλιογραφικές αναφορές

1 Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Επιλεκτικές επιδράσεις διεγέρσεως της ανάπτυξης του σαρκώματος ποντικού στο αισθητήριο και συμπαθητικό νευρικό σύστημα του εμβρύου του κοτόπουλου. J. Εχρ. Zool. 116, 321–361 (1951).

2. Levi-Montalcini, R. Επιδράσεις της μεταμόσχευσης όγκου ποντικού στο νευρικό σύστημα. Αννα. NY Acad. Sci. 55, 330–344 (1952).

3. Cohen, S., Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Ένας παράγοντας διεγέρσεως νεύρου που απομονώθηκε από τα σαρκώματα 37 και 180. Proc. Natl Acad. Sci. USA 40, 1014–1018 (1954).

4. Shelton, DL & Reichardt, LF Μελέτες σχετικά με την έκφραση του γονιδίου του βήτα νευρικού αυξητικού παράγοντα (NGF) στο κεντρικό νευρικό σύστημα: το επίπεδο και η περιφερειακή κατανομή του NGF mRNA υποδηλώνουν ότι ο NGF λειτουργεί ως τροφικός παράγοντας για αρκετούς διαφορετικούς πληθυσμούς νευρώνων . Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 2714–2718 (1986).

5. Lee, TH et al. Εντοπισμός νευρικού αυξητικού παράγοντα, ανοσοαντιδραστικότητας trkA και P75 στον σχηματισμό του ιππόκαμπου και στον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο ενήλικων αρουραίων. Neuroscience 83, 335-349 (1998).

6. Sobreviela, Τ. et al. TrkA-ανοσοαντιδραστικά προφίλ στο κεντρικό νευρικό σύστημα: εντοπισμός με νευρώνες που περιέχουν υποδοχέα νευρικού αυξητικού παράγοντα p75, ακετυλοτρανσφεράση χολίνης και σεροτονίνη. J. Comp. Neurol. 350, 587-611 (1994).

7. Mesulam, MM, Mufson, EJ, Wainer, BH & Levey, AI Κεντρικά χολινεργικά μονοπάτια στον αρουραίο: μια επισκόπηση που βασίζεται σε μια εναλλακτική ονοματολογία (Ch1- Ch6). Neuroscience 10, 1185–1201 (1983).

8. Ehlers, MD, Kaplan, DR, Price, DL & Koliatsos, VE NGF-διεγερμένη ανάδρομη μεταφορά του trkA στο νευρικό σύστημα των θηλαστικών. J. Cell. Biol. 130, 149-156 (1995).

9. Vantini, G. et al. Ο αυξητικός νευρικός παράγοντας προκαλεί μια δοσοεξαρτώμενη και μακροχρόνια αύξηση της δραστηριότητας της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης στην περιοχή του διαφράγματος και στον ιππόκαμπο μη τραυματισμένων αρουραίων. Acta Neurobiol. Exp. (Wars.) 50, 323–331 (1990). 10. Hefti, F. Ο αυξητικός παράγοντας νεύρου προάγει την επιβίωση των διαφραγματικών χολινεργικών νευρώνων μετά από διατομές κροσσού. J. Neurosci. 6, 2155-2162 (1986).

11. Iulia, MF & Cuello, AC Νευρικός αυξητικός παράγοντας μεταβολική δυσλειτουργία στη νόσο του Alzheimer και στο σύνδρομο Down. Trends Pharmacol. Sci. 35, 338–348 (2014).

12. Bartus, RT, Dean, RL3rd., Beer, B. & Lippa, AS Η χολινεργική υπόθεση της γηριατρικής δυσλειτουργίας μνήμης. Science 217, 408-414 (1982).

13. Aghourian, M. et al. Ποσοτικοποίηση της χολινεργικής απονεύρωσης του εγκεφάλου στη νόσο του Alzheimer χρησιμοποιώντας απεικόνιση PET με [(18)F]-FEOBV. ΜοΙ. Psychiatry 22, 1531–1538 (2017).

14. Hu, L., Wong, TP, Cote, SL, Bell, KF & Cuello, AC Η επίδραση των πλακών Abeta στους φλοιώδεις χολινεργικούς και μη χολινεργικούς προσυναπτικούς μπουτόν σε διαγονιδιακά ποντίκια που μοιάζουν με τη νόσο του Αλτσχάιμερ. Neuroscience 121, 421-432 (2003).

15. Case, MA, Wong, TP, De Koninck, Y., Ribeiro-da-Silva, A. & Cuello, AC Η γήρανση προκαλεί κατά προτίμηση απώλεια της χολινεργικής νεύρωσης των χαρακτηρισμένων νεοφλοιωτικών πυραμιδικών νευρώνων. Cereb. Cortex 12, 329–337 (2002).

16. Capponi, S. et al. Νευροεκφυλισμός τύπου Alzheimer σε ηλικιωμένα διαγονιδιακά ποντίκια κατά του αυξητικού παράγοντα νεύρων. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 6826–6831 (2000).

17. Pentz, R., Iulia, MF, Ducatenzeiler, A., Bennett, DA & Cuello, AC Η μεταβολική οδός του ανθρώπινου εγκεφάλου NGF είναι εξασθενημένη στην προκλινική και κλινική συνέχεια της νόσου του Alzheimer. ΜοΙ. Psychiatry, 0797-2 (2020).

18. Nilsson, OG et al. Χωρικές διαταραχές μάθησης σε αρουραίους με εκλεκτική ανοσολογική βλάβη του χολινεργικού συστήματος του πρόσθιου εγκεφάλου. Neuroreport 3, 1005–1008 (1992).

19. Gage, FH & Bjorklund, A. Τα χολινεργικά μοσχεύματα διαφράγματος στον σχηματισμό του ιππόκαμπου βελτιώνουν τη χωρική μάθηση και τη μνήμη σε ηλικιωμένους αρουραίους μέσω ενός μηχανισμού ευαίσθητου στην ατροπίνη. J. Neurosci. 6, 2837-2847 (1986).

20. Chen, KS et αϊ. Η διαταραχή ενός μόνο αλληλόμορφου γονιδίου του νευρικού αυξητικού παράγοντα έχει ως αποτέλεσμα ατροφία των βασικών χολινεργικών νευρώνων του πρόσθιου εγκεφάλου και ελλείμματα μνήμης. J. Neurosci. 17, 7288–7296 (1997).

21. Conner, JM et al. Το NGF είναι απαραίτητο για την πλαστικότητα και τη μάθηση του ιππόκαμπου. J. Neurosci. 29, 10883–10889 (2009).

22. Takashima, Υ. et αϊ. Τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα παρέχουν ένα αρχικό παροδικό κύμα διαφοροποίησης των MSC. Cell 129, 1377–1388 (2007).

23. Tsai, CY, Tsai, CY, Arnold, SJ & Huang, GJ Η κατάλυση της νευρογένεσης του ιππόκαμπου σε ποντίκια βλάπτει την απόκριση στο στρες κατά τη διάρκεια του σκοτεινού κύκλου. Nat. Commun. 6, 8373 (2015).

24. Crowley, C. et αϊ. Τα ποντίκια που δεν έχουν αυξητικό παράγοντα νεύρων εμφανίζουν περιγεννητική απώλεια αισθητηριακών και συμπαθητικών νευρώνων, αλλά αναπτύσσουν βασικούς χολινεργικούς νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου. Cell 76, 1001-1011 (1994).

25. Kwon, EJ, Skalak, M., Lo Bu, R. & Bhatia, SN Neuron-targeted nanoparicle for siRNA delivery σε τραυματικές εγκεφαλικές βλάβες. ACS Nano. 10, 7926–7933 (2016).

26. da Silva, JT, Evangelista, BG, Veneto, RAG, Seminowicz, DA & Chacur, M. Η θεραπεία κατά του NGF μπορεί να μειώσει τον χρόνιο νευροπαθητικό πόνο αλλάζοντας τους περιφερικούς μεσολαβητές και την εγκεφαλική δραστηριότητα σε αρουραίους. Συμπεριφορά. Pharmacol. 30, 79–88 (2019).

27. Huang, GJ et al. Η έκτοπη μετανάστευση παρεγκεφαλιδικών κυττάρων προκαλεί κακή ανάπτυξη των κυττάρων Purkinje και μη φυσιολογική κινητική συμπεριφορά σε μηδενικά ποντίκια Cxcr4. PLoS ONE 9, e86471 (2014).

28. Frielingsdorf, H., Simpson, DR, Thal, LJ & Pizzo, DP Ο αυξητικός παράγοντας νεύρων προάγει την επιβίωση νέων νευρώνων στον ενήλικο ιππόκαμπο. Neurobiol. Dis. 26, 47–55 (2007).

29. Cameron, HA & Gould, E. Η νευρογένεση ενηλίκων ρυθμίζεται από στεροειδή των επινεφριδίων στην οδοντωτή έλικα. Neuroscience 61, 203-209 (1994).

30. Bloem, Β. et αϊ. Τοπογραφική χαρτογράφηση μεταξύ των βασικών χολινεργικών νευρώνων του πρόσθιου εγκεφάλου και του έσω προμετωπιαίου φλοιού σε ποντίκια. J. Neurosci. 34, 16234–16246 (2014).

31. Nyakas, C., Luiten, PG, Spencer, DG & Traber, J. Λεπτομερή σχέδια προβολής προσαγωγών διαφραγματικών και διαγώνιων ζωνών στον ιππόκαμπο στον αρουραίο με έμφαση στη νεύρωση του CA1 και της οδοντωτής έλικας. Brain Res. Ταύρος. 18, 533-545 (1987).

32. Palacios, G., Garcia-Ladona, J. & Codina, M. Υπερδομική μελέτη χολινεργικών νευρώνων στον έσω διαφραγματικό πυρήνα και κάθετο άκρο της διαγώνιας ζώνης του Broca στον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο του αρουραίου. J. Chem. Neuroanat. 4, 205-221 (1991).

33. Martinovich, K. et al. Οι ρόλοι του p75 (NTR), της μακροχρόνιας κατάθλιψης και της χολινεργικής μετάδοσης στην αντιμετώπιση του άγχους και του οξέος στρες. Biol. Psychiatry 71, 75–83 (2012).

34. Bliss, TV & Collingridge, GL Ένα συναπτικό μοντέλο μνήμης: μακροχρόνια ενίσχυση στον ιππόκαμπο. Nature 361, 31–39 (1993).

35. Berger-Sweeney, J. et al. Επιλεκτικές ανοσοαλλαγές χολινεργικών νευρώνων σε ποντίκια: επιδράσεις στη νευροανατομία, τη νευροχημεία και τη συμπεριφορά. J. Neurosci. 21, 8164–8173 (2001).

36. Pelleymounter, MA, Cullen, MJ, Baker, MB, Gollub, M. & Wellman, C. Οι επιδράσεις του ενδοιπποκαμπικού BDNF και NGF στη χωρική μάθηση σε ηλικιωμένους αρουραίους Long Evans. ΜοΙ. Chem. Νευροπαθόλη. 29, 211-226 (1996).

37. Muller, Μ. et αϊ. Η απώλεια της σηματοδότησης NGF-TrkA από το ΚΝΣ δεν επαρκεί για να προκαλέσει γνωστικές βλάβες σε νεαρά ενήλικα ή μέσης ηλικίας ποντίκια. J. Neurosci. 32, 14885–14898 (2012).

38. Fischer, W. et al. Βελτίωση της ατροφίας των χολινεργικών νευρώνων και της εξασθένησης της χωρικής μνήμης σε ηλικιωμένους αρουραίους από τον αυξητικό παράγοντα νεύρων. Nature 329, 65–68 (1987).

39. Τα χολινεργικά συστήματα Degroot, A. & Treit, D. Dorsal και κοιλιακού ιππόκαμπου ρυθμίζουν το άγχος στις δοκιμασίες συν-λαβύρινθο και ανιχνευτή σοκ. Brain Res. 949, 60–70 (2002).

40. File, SE, Gonzalez, LE & Andrews, N. Η ενδογενής ακετυλοχολίνη στον ραχιαίο ιππόκαμπο μειώνει το άγχος μέσω δράσεων στους νικοτινικούς και μουσκαρινικούς υποδοχείς1. Συμπεριφορά. Neurosci. 112, 352-359 (1998).

41. McHugh, SB et al. Η εξάντληση της ακετυλοχολίνης του ιππόκαμπου δεν έχει καμία επίδραση στο άγχος, στην προτίμηση της χωρικής καινοτομίας ή στη διαφορική ανταμοιβή για χαμηλά ποσοστά απόδοσης απόκρισης (DRL) σε αρουραίους. Συμπεριφορά. Neurosci. 129, 491–501 (2015).

42. Η δραστηριότητα Dunbar, GL, Rylett, RJ, Schmidt, BM, Sinclair, RC & Williams, LR της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης του ιπποκάμπου συσχετίζεται με τη χωρική μάθηση σε ηλικιωμένους αρουραίους. Brain Res. 604, 266-272 (1993).

43. Gil-Bea, FJ et al. Η χολινεργική υπολειτουργία βλάπτει την απόκτηση μνήμης πιθανώς μέσω της μείωσης του τόξου του ιππόκαμπου και του BDNF. Hippocampus 21, 999–1009 (2011).

44. Fletcher, BR, Baxter, MG, Guzowski, JF, Shapiro, ML & Rapp, PR Η εκλεκτική χολινεργική εξάντληση του ιππόκαμπου προστατεύει τόσο τη μεταγραφή τόξου που προκαλείται από τη συμπεριφορά όσο και τη χωρική μάθηση και μνήμη. Hippocampus 17, 227–234 (2007).

45. Baxter, MG & Gallagher, M. Άθικτη χωρική μάθηση τόσο σε νεαρούς όσο και σε ηλικιωμένους αρουραίους μετά από επιλεκτική αφαίρεση της χολινεργικής εισόδου του ιππόκαμπου. Συμπεριφορά. Neurosci. 110, 460-467 (1996).

46. ​​Phillips, HS et al. Διάσωση ποντικών με έλλειψη NGF II: οι βασικές χολινεργικές προεξοχές του πρόσθιου εγκεφάλου απαιτούν NGF για νεύρωση στόχου αλλά όχι καθοδήγηση. Brain Res. ΜοΙ. Brain Res. 124, 1–11 (2004).

47. Rafifii, MS et αϊ. Αδενοσυσχετιζόμενος ιικός φορέας (Ορότυπος 2) - αυξητικός παράγοντας νεύρου για ασθενείς με νόσο Alzheimer: μια τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή. JAMA Neurol. 75, 834–841 (2018).

48. Castle, MJ et al. Η μεταθανάτια ανάλυση σε μια κλινική δοκιμή της γονιδιακής θεραπείας AAV2-NGF για τη νόσο του Αλτσχάιμερ προσδιορίζει την ανάγκη για βελτιωμένη παροχή φορέα. Βουητό. Gene Ther. 31, 415–422 (2020).