Η τρέχουσα κατάσταση της νευροπροστασίας στη συγγενή καρδιακή νόσο Μέρος 2

Οι μικροσκοπικές εικόνες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε υπολογισμό εικόνας χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ΗΠΑ). Το σήμα του Hsp60 πολλαπλασιάστηκε με "x".

Το Hsp60 είναι ένα σημαντικό μόριο πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό βιολογικό ρόλο στο ανθρώπινο σώμα. Έρευνες των τελευταίων ετών έχουν δείξει ότι η παρουσία του Hsp60 σχετίζεται στενά με την ανθρώπινη μνήμη.

Η Hsp60 είναι μια μοριακή πρωτεΐνη συνοδού που εμπλέκεται κυρίως στην αναδίπλωση, το ξεδίπλωμα, τη σταθεροποίηση και την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών. Αυτές οι διεργασίες είναι πολύ σημαντικές για τον φυσιολογικό μεταβολισμό και την κυτταρική λειτουργία του ανθρώπινου σώματος. Ταυτόχρονα, το Hsp60 έχει επίσης αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα και παίζει μεγάλο ρόλο στη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας και της ισορροπίας του ανοσοποιητικού συστήματος.

Η έρευνα έχει βρει ότι το Hsp60 παίζει καθοριστικό ρόλο στο σχηματισμό και τη συντήρηση της μνήμης. Κατά τη διαδικασία της μάθησης και της μνήμης, τα εγκεφαλικά κύτταρα παράγουν μεγάλο αριθμό μορίων Hsp60. Αυτά τα μόρια μπορούν να προστατεύσουν τα κύτταρα από παρεμβολές και βλάβες από το εξωτερικό περιβάλλον για να εξασφαλίσουν την ομαλή πρόοδο της μάθησης και της μνήμης. Επιπλέον, το Hsp60 μπορεί επίσης να επηρεάσει την ανθρώπινη σκέψη και συμπεριφορά αλλάζοντας τη μετάδοση σήματος των εγκεφαλικών κυττάρων και την ανάπτυξη των νευρώνων και έχει θετικό αντίκτυπο στη γνωστική λειτουργία και την αντίσταση στο στρες.

Αν και ο ρόλος του Hsp60 έχει δείξει θετικά αποτελέσματα στο ανθρώπινο σώμα, οι άνθρωποι πρέπει επίσης να συνειδητοποιήσουν ότι τόσο η περίσσεια όσο και η ανεπάρκεια Hsp60 μπορεί να έχουν αρνητικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να διερευνήσουμε και να μελετήσουμε ενεργά τον μηχανισμό του Hsp60 σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις του ανθρώπινου σώματος για να κατανοήσουμε καλύτερα τη θέση και το ρόλο του Hsp60 στην ανθρώπινη υγεία. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη και το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola έχει αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντικά αποτελέσματα, τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη μείωση της οξείδωσης και των φλεγμονωδών αντιδράσεων στον εγκέφαλο, προστατεύοντας έτσι τον υγεία του νευρικού συστήματος. Επιπλέον, το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη και την επισκευή των νευρικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη συνδεσιμότητα και τη λειτουργία των νευρωνικών δικτύων. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στη βελτίωση της μνήμης, της ικανότητας μάθησης και της ταχύτητας σκέψης και μπορεί επίσης να αποτρέψουν την ανάπτυξη γνωστικής δυσλειτουργίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Κάντε κλικ στο Γνωρίζω για να βελτιώσετε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη

Η τιμή "x" προσδιορίστηκε ως εξής: αφαιρώντας το "χ"-διπλωμένο σήμα Hsp60 από το σήμα μιτοχονδριακού DNA στην ομάδα ελέγχου έκανε την τιμή του μιτοχονδριακού DNA μικρότερη ή ίση με μηδέν. Το σήμα της ιστόνης H2B πολλαπλασιάστηκε με το "y".

Η τιμή "y" προσδιορίστηκε ως εξής: η αφαίρεση του σήματος "y" διπλωμένης ιστόνης-H2B από το σήμα πυρηνικού DNA στην ομάδα ελέγχου έκανε την τιμή πυρηνικού DNA μικρότερη από ή ίση με μηδέν. Εάν το σήμα φόντου γίνει υψηλό από τον πολλαπλασιασμό, η αντίθεση της πολλαπλασιασμένης εικόνας μπορεί να ρυθμιστεί για τις ίδιες συνθήκες σε όλα τα δείγματα.

Η εικόνα της χρώσης dsDNA, μείον την προσαρμοσμένη εικόνα του πολλαπλασιασμένου Hsp60 και της ιστόνης H2B, χρησιμοποιήθηκε για επακόλουθη ανάλυση. Χρησιμοποιώντας τη λειτουργία "Adjust-Threshold", αυτές οι εικόνες δυαδοποιήθηκαν. Επιλέξαμε σημεία dsDNA με μέγεθος από 2 έως 20 μm2 (κυκλικότητα 0,1–1,0) και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση "Ανάλυση-Ανάλυση σωματιδίων".

2.3. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Μία ημέρα πριν από τη διαμόλυνση, τα κύτταρα HeLa επιστρώθηκαν σε μια πυκνότητα 600 κυττάρων/μL. Η έκφραση των γονιδίων ενδιαφέροντος αποσιωπήθηκε σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) σε αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή (με τελική συγκέντρωση RNA 10 nM).

Τέσσερις ημέρες μετά την καταστροφή του siRNA, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μονιμοποίηση. Δείγματα κυτταροκαλλιέργειας σταθεροποιήθηκαν με 2% PFA και 2% γλουταραλδεΰδη σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 7,4, στους 37 ◦C και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 4 ◦C ψυγείο για 30 λεπτά. Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε γλουταραλδεΰδη 2% σε ρυθμιστικό φωσφορικού διαλύματος 0.1 Μ όλη τη νύχτα στους 4 ◦C. Τα δείγματα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ για 30 λεπτά και μετά σταθεροποιήθηκαν με τετροξείδιο οσμίου 2% σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ στους 4 ◦C για 1 ώρα.

Τα δείγματα αφυδατώθηκαν διαλύματα ενσωματωμένης αιθανόλης, μεταφέρθηκαν σε ρητίνη (Quetol-812, Nisshin EM Co., Τόκιο, Ιαπωνία) και πολυμερίστηκαν στους 60 ◦C για 48 ώρες. Οι πολυμερισμένες ρητίνες κόπηκαν σε εξαιρετικά λεπτά 70-nm τμήματα με ένα μαχαίρι διαμαντιού χρησιμοποιώντας έναν υπερμικρότομο (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε χάλκινα πλέγματα.

Οι τομές χρωματίστηκαν με 2% οξικό ουρανύλιο σε ΘΔ για 15 λεπτά και πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό, ακολουθούμενο από δευτερογενή χρώση με διάλυμα χρώσης μολύβδου (Sigma-Aldrich, Τόκιο, Ιαπωνία) σε ΘΔ για 3 λεπτά.

Τα πλέγματα παρατηρήθηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία) σε τάση επιτάχυνσης 80 kV (εγκέφαλος ψαριού ζέβρα) ή 100 kV (κύτταρο) και οι εικόνες καταγράφηκαν με χρήση κάμερας συσκευής φόρτισης (CCD) (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα δείγματα στους χρυσούς δίσκους καταψύχθηκαν σε υγρό προπάνιο στους -175 ◦C. Αφού τα δείγματα καταψύχθηκαν, υποκαταστάθηκαν με κατάψυξη με 1% ταννικό οξύ σε αιθανόλη και 2% απεσταγμένο νερό στους -80 ◦C για 24 ώρες.

Τα δείγματα διατηρήθηκαν στη συνέχεια στους -20 ◦C για 4 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση στους 4 ◦C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε άνυδρη αιθανόλη 3 φορές για 30 λεπτά. κάθε φορά, ακολουθούμενη από διήθηση με ένα μίγμα 50:50 ρητίνης αιθανολάνδης (LR λευκό: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) στους 4 ◦C για 1 ώρα. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε φρέσκια 100% ρητίνη και επωάστηκαν στους 4 ◦C για 30 λεπτά, και αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε φρέσκια 100% ρητίνη και πολυμερίστηκαν στα 50◦CO/N. Οι πολυμερισμένες ρητίνες κόπηκαν σε εξαιρετικά λεπτή τομή στα 90 nm με ένα μαχαίρι διαμαντιού χρησιμοποιώντας έναν υπερμικρότομο (Ultracut UCT, Leica) και οι τομές τοποθετήθηκαν σε πλέγματα νικελίου. Τα πλέγματα επωάστηκαν με αντίσωμα anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) σε 1% BSA/PBS σε 4 ◦CO/N, ακολουθούμενα από τρεις εκπλύσεις με 1% BSA/PBS για 1 λεπτό το καθένα.

Στη συνέχεια επωάστηκαν με αυτό το δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με σωματίδια χρυσού {{0}}nm (πολυκλωνικό αντισώμα IgG κατσίκας αντι-ποντικού) για 2 ώρες σε RT. Μετά το ξέπλυμα με PBS, τα πλέγματα τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα γλουταραλδεΰδης 0,1 Μ 2% κακοδυλικής.

Στη συνέχεια, τα πλέγματα στέγνωσαν και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 2% οξικό ουρανύλιο για 15 λεπτά και με διάλυμα χρώσης μολύβδου (Sigma-Aldrich) σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά. Τα πλέγματα παρατηρήθηκαν μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης (JEM-1400 συν, JEOLLtd.) σε τάση επιτάχυνσης 100 kV. Λήφθηκαν ψηφιακές εικόνες με κάμερα CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Αποτελέσματα

3.1. Μειωμένη TFAM ή GBA προκαλεί αύξηση στο έκτοπο μιτοχονδριακό DNA

Πρώτον, δείξαμε ένα παράδειγμα ανίχνευσης κυτταροπλασμικού DNA που προέρχεται από μιτοχόνδρια σε κύτταρα HeLa στα οποία η πρωτεΐνη TFAM καταρρίφθηκε από το siRNA (Εικόνα 1Α). .

Οι πολυμορφισμοί αλληλουχίας σε αυτό το γονίδιο αναφέρεται ότι σχετίζονται με τη νόσο του Πάρκινσον [21,22]. Μετά από 3 ημέρες καταστροφής της πρωτεΐνης TFAM, ανιχνεύθηκαν πολλές κουκκίδες δίκλωνου DNA στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων HeLa.

Οι ιστόνες είναι θετικοί δείκτες για το DNA πυρηνικής προέλευσης στο κυτταρόπλασμα και αρνητικοί δείκτες για το μιτοχονδριακό DNA και το DNA μιτοχονδριακής προέλευσης στο κυτταρόπλασμα [23]. Αυτές οι κουκκίδες δεν συνεντοπίστηκαν με τις ιστόνες, υποδηλώνοντας ότι δεν προέρχονταν από πυρηνικό DNA. Επιπλέον, μερικές από αυτές τις κυτταροπλασματικές, έκτοπες κουκκίδες DNA δεν συνεντοπίστηκαν με το Hsp60, έναν δείκτη για τη μιτοχονδριακή μήτρα, υποδεικνύοντας ότι βρίσκονταν εκτός των μιτοχονδρίων (Εικόνα 1Β, Γ).

Η ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε επίσης ότι το έκτοπο DNA διέρρευσε από τα μιτοχόνδρια (Εικόνα 2Α, Β). Συνοπτικά, η αύξηση στις έκτοπες κουκκίδες DNA στο κυτταρόπλασμα από την καταστροφή του TFAM οφειλόταν στη διαρροή μιτοχονδριακού DNA από τα μιτοχόνδρια. (Εικόνα 1Α).

Το GBA είναι το αιτιολογικό γονίδιο για τη νόσο του Gaucher, αλλά μια ετερόζυγη μετάλλαξη του GBA είναι επίσης παράγοντας κινδύνου για τη νόσο του Πάρκινσον [24]. Πολλές κουκκίδες δίκλωνου DNA ανιχνεύθηκαν στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων HeLa μετά από 3 ημέρες καταστροφής της πρωτεΐνης GBA. Ορισμένες κουκκίδες DNA ταυτοποιήθηκαν μαζί με ιστόνες, υποδηλώνοντας ότι προέρχονταν από πυρηνικό DNA.

Άλλες κουκκίδες DNA δεν ταυτοποιήθηκαν μαζί με ιστόνες, υποδηλώνοντας ότι δεν ήταν DNA προερχόμενο από πυρήνα αλλά DNA προερχόμενο από μιτοχόνδρια (Εικόνα 1D). Συνοπτικά, η αύξηση των έκτοπων κουκκίδων DNA στο κυτταρόπλασμα από την πτώση του GBA οφειλόταν τουλάχιστον εν μέρει στη διαρροή μιτοχονδριακού DNA από τα μιτοχόνδρια.

For more information:1950477648nn@gmail.com