Δομικός σχεδιασμός, σύνθεση και αντιοξειδωτικές, αντιλεϊσμανιακές, αντιφλεγμονώδεις και αντικαρκινικές δραστηριότητες ενός νέου παραγώγου ακετυλιωμένης κερκετίνης

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνία:tina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: Η κερκετίνη (Q) είναι ένα βιοφλαβονοειδές με βιολογικό δυναμικό. Ωστόσο, η κακή διαλυτότητα στο νερό, ο εκτεταμένος ενζυμικός μεταβολισμός και η μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα περιορίζουν τη βιοφαρμακολογική χρήση του. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να πραγματοποιηθεί δομική τροποποίηση στην ακετυλίωση Qby, λαμβάνοντας έτσι το ανάλογο πενταοξικής κερκετίνης (Q5), προκειμένου να διερευνηθούν οι βιολογικές δυνατότητες (αντιοξειδωτικές, αντιλεϊσμανιακές, αντιφλεγμονώδεις και κυτταροτοξικές δραστηριότητες) σε κυτταροκαλλιέργειες. Το Q5 χαρακτηρίστηκε από φάσματα FTIR, 'Η και 13C NMR. οαντιοξειδωτικόδυναμικό αξιολογήθηκε έναντι της ρίζας ABTS· plus . Το αντιφλεγμονώδες δυναμικό αξιολογήθηκε με μέτρηση του προφλεγμονώδους παράγοντα νέκρωσης όγκου κυτοκίνης (TNF) και της παραγωγής μονοξειδίου του αζώτου (NO) σε περιτοναϊκούς μακροφάγους από ποντικούς BALB/c. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κυτταροτοξικότητας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο AlamarBlue σε καρκινικά κύτταρα HepG2 (ανθρώπινο ηπατοκαρκίνωμα), HL-60 (προμυελοκυτταρική λευχαιμία) και MCR-5 (υγιείς ανθρώπινοι ινοβλάστες πνεύμονα) καθώς και τη μέθοδο MTT για κύτταρα C6 καλλιέργειες (γλοιώματος αρουραίου). Τα Q και Q5 έδειξαν αντιοξειδωτική δράση 29 τοις εκατό και 18 τοις εκατό, αντίστοιχα, η οποία δικαιολογείται από την αντικατάσταση των υδροξυλών από ομάδες ακετυλίου. Τα Q και Q5 έδειξαν μειώσεις εξαρτώμενες από τη συγκέντρωση στην παραγωγή NO και TNF (σελ<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μΜ). Τέλος, επαληθεύτηκε η κυτταροτοξική υπεροχή του Q5 (IC50=11 μM), η οποία, στα 50 μM για 24 ώρες, προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων του γλοιώματος C6 που χαρακτηρίζονται από στρογγυλό σχήμα σώματος (δεν έχει ακόμη αναφερθεί στη βιβλιογραφία ). Το ανάλογο Q5 είχε πιθανές βιολογικές επιδράσεις και μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενο για περαιτέρω έρευνες έναντι άλλων κυτταρικών καλλιεργειών, ιδιαίτερα των νευρικών.

Λέξεις-κλειδιά: κερκετίνη;σύνθεση; πενταοξική κερσετίνη; αντιοξειδωτικό; αντιλεϊσμανία; αντιφλεγμονώδης δράση κυτταροτοξικότητας

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερα για τα προϊόντα

1. Εισαγωγή

Κερσετίνηείναι ένα βιοφλαβονοειδές με αποδεδειγμένη επίδραση στην υγεία και καλά τεκμηριωμένες βιοχημικές δραστηριότητες. Αυτή η ένωση θεωρείται ένα από τα πιο ισχυρά αντιοξειδωτικά μεταξύ των πολυφαινολών [1-3]. Λόγω των ιδιοτήτων της, η κερσετίνη έχει δοκιμαστεί για διάφορες θεραπευτικές εφαρμογές, όπως π.χαντιοξειδωτικό, αντιπαρασιτικό,αντιφλεγμονώδη, και αντικαρκινικές δραστηριότητες [4,5]. Στις παρασιτικές ασθένειες, τα φλαβονοειδή είναι μια ομάδα υψηλού ενδιαφέροντος. Αυτό οφείλεται στη χαμηλή τοξικότητά τους στους ξενιστές και σε αρκετούς μηχανισμούς με τους οποίους μπορούν να ρυθμίσουν παθολογικά αλλοιωμένες διεργασίες κατά τη διάρκεια λοιμώξεων [6].Φλαβονοειδήέχουν πολλαπλούς στόχους για τη θεραπεία της λεϊσμανίασης και περιλαμβάνουν στόχους, όπως η αργινάση, η ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση και η τοποϊσομεράση II [7,8].

Κερσετίνηέχει πολλαπλές αντικαρκινικές δράσεις σε διάφορους τύπους συμπαγών όγκων. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι έχει δραστηριότητα σε κύτταρα HL-60 (που προέρχονται από οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML)) ότι μειώνει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου μειώνοντας το ενδοογκικό οξειδωτικό στρες, την ενεργοποίηση του σήματος της Εξωκυτταρικής Ρυθμιζόμενης Κινάσης (ERK) και επακόλουθη απόπτωση [9]. Η κερσετίνη βελτίωσε την προφλεγμονώδη απόκριση μειώνοντας την έκφραση της IL-6 και του TNF με θετική αντιφλεγμονώδη δράση σε πληθυσμούς μακροφάγων ανθρώπινου THP1 [10].

Μεταξύ των διαφορετικών τύπων καρκίνου, το γλοίωμα είναι ένα από τα πιο επιθετικά και με κακή πρόγνωση. Δυστυχώς, οι κύριες θεραπείες (χειρουργική αφαίρεση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία) δεν είναι αποτελεσματικές. Η μέση συνολική επιβίωση για τους ασθενείς παραμένει περίπου στους 14 μήνες [11]. Ωστόσο, νέες ενώσεις, όπως το τεμοζολομίδιο [12], τα ρετινοειδή [13] και τα φλαβονοειδή [14] έχουν δείξει δράση κατά του γλοιώματος. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις της κερκετίνης έχουν περιγραφεί σε κύτταρα από γλοιοβλάστωμα, το οποίο είναι το πιο επιθετικό από τα γλοιώματα [15].

Οι μη φυσιολογικές ανοσοαποκρίσεις εμπλέκονται στην έναρξη και ανάπτυξη ενός μεγάλου αριθμού ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των αυτοάνοσων νοσημάτων, των αλλεργιών, του καρκίνου και των νευροεκφυλιστικών ασθενειών.Φλαβονοειδήέχουν πιθανή ανοσοτροποποιητική δράση και μελετώνται ως εναλλακτικές για κλινική χρήση. Η κουερσετίνη μπορεί να ασκήσει σημαντικές ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις στην κυτταρική παραγωγή κυτοκινών που προέρχονται από το προφίλ Th-1 και Th-2 και τον λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό, ρυθμίζοντας την κυτταρική ανοσία[16]. Επιπλέον, η κερκετίνη μπορεί να ρυθμίσει διαφορικά την έκφραση των γονιδίων ιντερλευκίνης σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), ευνοώντας το προφίλ Th-1, το οποίο προάγει την κυτταρική ανοσία μέσω ιντερφερόνης-γ (IFN-y), τη μείωση του Th{ {6}} προφίλ που εμπλέκεται στη χυμική ανοσία και την ενεργοποίηση των μακροφάγων από την IL-4 [17].

Η χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, ο εκτεταμένος μεταβολισμός και η ενζυμική αποικοδόμηση περιορίζουν τη βιοδιαθεσιμότητα και μειώνουν τη βιοφαρμακολογική χρήση της κερκετίνης ως θεραπευτικού παράγοντα[13]. Μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση για να ξεπεραστεί η χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα των πολυφαινολών, προκειμένου να δοκιμαστεί και να διερευνηθεί η in vivo δραστηριότητά τους, είναι η χημική τροποποίηση της φυσικής ένωσης, η αύξηση της διαλυτότητας και η επιβράδυνση του μεταβολισμού. Έτσι, μελετώνται πολλές συνθετικές οδοί, όπως η ακετυλίωση, η προσθήκη αμινών και η βρωμίωση, η τροποποίηση σε οξίμες και η συμπλοκοποίηση με υδραζίνες [18-20].

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιούμε μια δομική τροποποίηση στην κερκετίνη, με στόχο τη λήψη του αναλόγου πενταοξικής κερκετίνης (Q5) για την αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού δυναμικού, της αντιφλεγμονώδους δράσης και της αναστολής της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων, ηπατοκαρκινώματος (HepG2), προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (HL-60) και κύτταρα γλοιώματος αρουραίου (C6).

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1.Σύνθεση και Χαρακτηρισμός

Για τη σύνθεση της αναλογικής κερκετίνης (3,3', Α',5,7-πενταοξική), χρησιμοποιήθηκε η προσέγγιση ολικής ακετυλίωσης, η οποία προσαρμόστηκε στις πειραματικές συνθήκες που βρέθηκαν στη βιβλιογραφία [21]. Με αυτόν τον τρόπο, ο οξικός ανυδρίτης διατηρείται ως ακυλωτικός παράγοντας και η πυριδίνη ως καταλύτης.

Το προϊόν που ελήφθη (Q5), ένα κίτρινο στερεό, χαρακτηρίστηκε από σημεία τήξης στην περιοχή 178-186 βαθμών , συμβατά με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας[18]. Επιπλέον, η συγκριτική ανάλυση του FTIR μεταξύ κερκετίνης και προϊόντος έδειξε την απουσία ζωνών απορρόφησης σε 3400 cm-1 χαρακτηριστικές των υδροξυλών κερκετίνης και από την εμφάνιση λωρίδων γύρω από 1600-1650 cm-ενδεικτικές του καρβονυλεστέρα , που δείχνει την αντικατάσταση των υδροξυλομάδων από ακετυλομάδες: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,13 και (Φιγούρα 1). Τα φάσματα συγκρίθηκαν με αυτά που περιγράφονται στη βιβλιογραφία [21].

Οι αναλύσεις πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) της κερκετίνης (Q) και του προϊόντος που ελήφθη (Q5) έδειξαν ολική ακετυλίωση, με την εξαφάνιση των απλών χαρακτηριστικών των υδροξυλών πάνω από 9 ppm στο φάσμα H NMR (Συμπληρωματικά σχήματα S1, S2, και S{ {4}}S6) και η εμφάνιση μεγάλων και χαρακτηριστικών σημάτων μεθυλίου στις αλειφατικές περιοχές του φάσματος, μεταξύ 2 και 3 ppm. Για το φάσμα 13C NMR (Συμπληρωματικά σχήματα S3 και S7-S9), το προϊόν που λήφθηκε έδειξε αύξηση στα αντιπροσωπευτικά σήματα των καρβονυλικών εστέρων κοντά στα 170 ppm και την εμφάνιση σημάτων μεταξύ 20 και 21 ppm που αντιστοιχούν στη χημική ουσία μετατοπίσεις των πέντε αλειφατικών ανθράκων των μεθυλίων, που επαληθεύονται μέσω της ενσωμάτωσης των σημάτων. Τα φάσματα συγκρίθηκαν με αυτά που περιγράφονται στη βιβλιογραφία [22].

Biasutto et al. [23] ήταν πρωτοπόροι στην έρευνα των προδρόμων ουσιών με βάση τους εστέρες, προκειμένου να αυξηθεί η βιοδιαθεσιμότητα της κερκετίνης. Με βάση τις μελέτες τους, οι Mattarei et al. [21] προώθησε τη συνολική ακετυλίωση της κερκετίνης και έλαβε το παράγωγο Q5 σε υψηλή απόδοση (79-97 τοις εκατό ). Πιο πρόσφατα, οι Mohajeri et al. [24] πέτυχε απόδοση 85 τοις εκατό στην απόκτηση αναλόγου Q5, υπό θέρμανση (180 βαθμούς για 6 ώρες). Στην παρούσα μελέτη, η σύνθεση του Q5 ήταν αποτελεσματική και λάβαμε μια ένωση δεόντως χαρακτηρισμένη σύμφωνα με τα δεδομένα που περιγράφονται στη βιβλιογραφία.

2.2. Αντιοξειδωτικό ABTS· συν Ριζική Δραστηριότητα

Η συγκριτική ανάλυση της αντιοξειδωτικής δράσης του Qand Q5 έδειξε ότι η κερσετίνη (Q) ήταν πιο ενεργή στη σάρωση της ρίζας ABTS* συν από το O5 (29 τοις εκατό και 18 τοις εκατό, αντίστοιχα), με τιμές IC50 (σε μΜ) 188,850±0,003 και 379,560± 0,004 για Q και Q5, αντίστοιχα.

Η αντιοξειδωτική δράση των φλαβονοειδών σχετίζεται άμεσα με τη μοριακή τους δομή. Υπάρχουν δύο μηχανισμοί μέσω των οποίων οι φαινολικές ενώσεις μπορούν να ασκήσουν τις αντιοξειδωτικές τους λειτουργίες: μεταφορά ατόμων υδρογόνου και δωρεά ηλεκτρονίων [25]. Η ανώτερη αντιοξειδωτική δράση της κερκετίνης μπορεί να αποδοθεί στη σημαντική συνεισφορά των υδροξυλίων και των υδρογόνων τους, τα οποία αντικαθίστανται από ακετύλια στο ανάλογο Q5, μειώνοντας έτσι την ικανότητα για δωρεά υδρογόνου ή σάρωση ελεύθερων ριζών από συνθετικά μόρια.

Δεν βρέθηκαν δεδομένα στην επιστημονική βιβλιογραφία που να αναφέρουν την αντιοξειδωτική δράση της ένωσης Q5. Oh, et al. [26] αξιολόγησε τα παρασκευάσματα εστέρων κερκετίνης και τις αντιοξειδωτικές τους δράσεις, δείχνοντας ότι η κερσετίνη είχε την υψηλότερη δράση δέσμευσης ριζών μεταξύ των δειγμάτων που δοκιμάστηκαν. Ως εκ τούτου, η υψηλή συμβολή των ομάδων υδροξυλίου στην αντιοξειδωτική δράση της κερκετίνης είναι απαραίτητη [27].

2.3.Δραστηριότητα Αντιλεϊσμανίας

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM σε σύγκριση με την αμφοτερικίνη Β (IC501,1 μM±0,1). Επιπλέον, αξιολογήθηκαν οι επιδράσεις του Q5 στις προμαστιγώτες μορφές της L.amazonenses και αυτή η ένωση εμφάνισε χαμηλότερη τιμή IC50 (75,1). ± 4,7 μM) για αυτό το είδος σε σύγκριση με το L. braziliensis.

Οι Tasdemir et al. [8] συνέκρινε τις αντιτριπανοσωμικές και αντιλεϊσμανιακές δραστηριότητες των φλαβονοειδών και των αναλόγων τους (που προέρχονται από την κερσετίνη) και τα βρήκε ότι είναι ισχυροί και αποτελεσματικοί αντιπρωτοζωικοί παράγοντες έναντι των μορφών του L donovani με μαστιγώτη (IC{1}}).{{2}ug mL. -μεγάλο). Για τις προμαστιγωτικές μορφές του L.amazonensis, Fonseca και Silva et al.[27] βρέθηκε IC50=31.4 uM σε καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κερκετίνη εντός 48 ωρών. Επιπλέον, ανέφεραν πλήρη διακοπή της κυτταρικής ανάπτυξης με 96 μM κερκετίνη σε 96 ώρες, επιδεικνύοντας ικανοποιητική αντιλεϊσμανιακή δράση. Cataneo et al. [28] αξιολόγησε την αντιπρομαστιγωτική δράση της κερκετίνης (έως 192 μM) έναντι του L.brasiliensis, σε περιτοναϊκά κύτταρα μακροφάγων. Σε καλλιέργειες προμαστιγωτών του L. major, η κερκετίνη και το ανάλογο της κερσετίνη-πενταοξική έδειξαν επίδραση εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση (IC 50 =2.5±0.92 και 2.85±0.99 μM, αντίστοιχα 【24】.

Μερικοί συγγραφείς έχουν δείξει ότι η κερκετίνη προκαλεί θάνατο σε προμαστιγώτες L amazonensis μέσω της δυσλειτουργίας της μιτοχονδριακής μεμβράνης που προκύπτει από την παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [27,28] και άλλων στόχων, όπως η αργινάση [7], η ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση [8,29] και το τοποϊσομερές. II[30]. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη υποδεικνύουν ότι άλλες δοκιμές θα πρέπει να εξεταστούν προοπτικά για τις δοκιμασμένες ενώσεις (Q και Q5), λαμβάνοντας υπόψη τις δοκιμές silico για τη διερεύνηση στόχων που ενδέχεται να εμπλέκονται στους παρατηρούμενους μηχανισμούς θανάτου.

2.4. Αντιφλεγμονώδεις και Κυτταροτοξικές Δραστηριότητες

Στη συνέχεια, επικεντρωθήκαμε στην αξιολόγηση της βιολογικής δραστηριότητας του νέου παραγώγου. Πρώτον, οι μη τοξικές συγκεντρώσεις των Q και Q5 προσδιορίστηκαν σε περιτοναϊκούς μακροφάγους που ελήφθησαν από ποντικούς BALB/c. Οι τιμές CCs0 δεν έδειξαν κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις ίσες ή μικρότερες από 80 μΜ (Εικόνα 2Α, Δ). Η δεξαμεθαζόνη δεν ήταν κυτταροτοξική στη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (20 μΜ). Με βάση αυτό, οι επόμενες δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις που δεν υπερβαίνουν τα 80 μΜ.

Η ανοσοτροποποιητική δράση των Q και Q5 διερευνήθηκε για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις των ενώσεων στην έκκριση προφλεγμονώδους μεσολαβητή. Τα ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα των ενώσεων (Qand Q5) αξιολογήθηκαν αρχικά σε καλλιέργειες περιτοναϊκών μακροφάγων μέσω της παραγωγής μονοξειδίου του αζώτου. Όπως αναμενόταν, η ενεργοποίηση μακροφάγων με LPS PLUS IFNy αύξησε την ποσότητα παραγωγής νιτρωδών (Εικόνα 2Β, Ε). Η θεραπεία με κερσετίνη ανέστειλε, με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση, την παραγωγή νιτρωδών (p<>

Η πενταδακτυλική ένωση (Q5) δεν έδειξε παρόμοια δραστηριότητα στα 20 μΜ. Είναι ενδιαφέρον ότι η δραστηριότητα ήταν σημαντική στις υψηλότερες συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (40 και 80 μΜ), και για τις δύο ενώσεις. Στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (80 μΜ), τα αποτελέσματα των ενώσεων ήταν παρόμοια με εκείνα που παρατηρήθηκαν σε καλλιέργειες ενεργοποιημένων μακροφάγων και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 20 μΜ δεξαμεθαζόνη. Οι ενώσεις δεν ήταν κυτταροτοξικές για τα περιτοναϊκά μακροφάγα στις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις (20, 40 και 80 μΜ).

Για τον καλύτερο χαρακτηρισμό τουαντιφλεγμονώδηεπίδραση των ενώσεων (Ο και Ο5), η φλεγμονώδης κυτοκίνη TNF προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη μέθοδο Ενζυμικής Ανοσοροφητικής Δοκιμασίας (ELISA). Η διέγερση των μακροφάγων χρησιμοποιώντας LPS συν INF-y προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στην παραγωγή TNF. Η θεραπεία με Q και Q5 μείωσε σημαντικά την παραγωγή TNF (σελ<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Η μείωση των φλεγμονωδών παραγόντων από την κερσετίνη περιγράφεται ποικιλοτρόπως, συμπεριλαμβανομένης της διαμόρφωσης για τα φλεγμονώδη προφίλ Th-2, που σχετίζονται με την προστασία σε νευρικές παθήσεις [31,32]. Η αντιφλεγμονώδης δράση της κερκετίνης περιγράφεται καλά στη βιβλιογραφία [33,34]. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες μελέτες που καταδεικνύουν το αντιφλεγμονώδες δυναμικό του αναλόγου Ο5. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει τα ευρήματα των Chen et al. [35], οι οποίοι απέδειξαν τον ρόλο των Q και O5 στην αναστολή της παραγωγής ΝΟ που προκαλείται από το LPS, με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση χωρίς επιβλαβή κυτταροτοξικά αποτελέσματα για τη σειρά μακροφάγων RAW 264.7. Επιπλέον, αυτή η μελέτη έδειξε την άνευ προηγουμένου επίδραση του Q5 στην αναστολή της προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNF.

Τα δεδομένα που ελήφθησαν υποδεικνύουν τη διατήρηση των επιδράσεων στο ημι-συνθετικό μόριο (O5). Ωστόσο, η δοσολογία άλλων παραγόντων, όπως η κυτοκίνη IL-10, μπορεί να είναι μια προοπτική στην αξιολόγηση αυτών των προφίλ. Ως εκ τούτου, το Q5 μπορεί να θεωρηθεί ένα πιθανό μόριο για μελλοντικές in vitro και in vivo δοκιμές που στοχεύουν σε μια επιπλέον θεραπευτική εναλλακτική με αντιφλεγμονώδη δράση.

Η κυτταροτοξικότητα των ελεγχόμενων ενώσεων (Q και Q5) αξιολογήθηκε στα 20, 40 και 80 uM χρησιμοποιώντας τη χρωματομετρική μέθοδο AlamarBlue σε υγιή κυτταρική σειρά (MRC-5, ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα) και σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου , HepG2 (ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) και HL-60 (ανθρώπινη προμυελοκυτταρική λευχαιμία), όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Η δοξορουβικίνη ήταν το τυπικό φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, για τα κύτταρα HepG2, η κερκετίνη (Q) δεν έδειξε σημαντική κυτταροτοξική δράση στην υψηλότερη συγκέντρωση που ερευνήθηκε (80 μΜ) και το πενταοξικό της ανάλογο (Q5) έδειξε μειωμένη δραστηριότητα (IC{{4 }}.9μM）. Για την καρκινική κυτταρική σειρά HL-60, η κερσετίνη αποδείχθηκε ότι δεν είναι πολύ ενεργή (IC50=51,3 uM). Ωστόσο, είναι ενδιαφέρον ότι το Q5 ήταν σημαντικά πιο ενεργό από την κερσετίνη με IC50 33,6 uM. Το τυπικό φάρμακο δοξορουβικίνη είχε τιμές IC50 που κυμαίνονταν από 0,1 έως 0,2 μΜ για καρκινικές κυτταρικές σειρές που έδειχναν σημαντικές κυτταροτοξικές επιδράσεις έναντι της υγιούς κυτταρικής σειράς MRC-5(Πίνακας 1), κάτι που δεν παρατηρήθηκε για τις ενώσεις (Q και Q5) .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, που δείχνει επιλεκτικό προφίλ έναντι της καρκινικής κυτταρικής σειράς. Λίγες μελέτες έχουν δείξει τη δράση του αναλόγου κερκετίνης O5 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, η δραστηριότητα Q5 σε μια σειρά κυττάρων όγκου HeLa τεκμηριώθηκε από τον Danihelovået al. [22], που έδειξε ότι οι ακετυλιωμένοι εστέρες της κερκετίνης ήταν τα πιο αποτελεσματικά κυτταροτοξικά παράγωγα. Δεν βρέθηκαν δεδομένα σχετικά με τον κυτταροτοξικό ρόλο του Q5 σε κύτταρα γενεαλογίας HepG2. Μόνο μία μελέτη βρέθηκε στη βιβλιογραφία που αποκάλυψε ότι το τετρα-ακετυλιωμένο ανάλογο της κερκετίνης είχε σημαντική επίδραση στην αναστολή των κυττάρων της γενεαλογίας HL-60 μέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3, προάγοντας την απόπτωση [36].

Χρησιμοποιήθηκε μια χρωματομετρική μέθοδος ανάλυση ΜΤΤ για την πρόσβαση στην κυτταροτοξικότητα σε καλλιέργεια κυττάρων C6. Η κουερσετίνη και το Q5 προκάλεσαν μείωση στην απορρόφηση ΜΤΤ 57{{10}} nm που αντιπροσωπεύει τη δραστηριότητα της μιτοχονδριακής αφυδρογονάσης και υποδηλώνει μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας στα κύτταρα C6. Όπως αποκαλύπτεται στο Σχήμα 4, η επαγόμενη από την κερκετίνη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα C6 σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 25 uM για 72 ώρες (Εικόνα 4Α), ενώ 0.78 μM Q5 για 72 ώρες ήταν σε θέση να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 4Β ). Παρατηρήθηκε ότι 50 uM κερκετίνη (O) και O5 μείωσαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε 41,3 τοις εκατό ± 2,9 τοις εκατό και 47,5 τοις εκατό ± 1,2 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (100,0 τοις εκατό ± 6,4 τοις εκατό) (Εικόνα 4Α, Β) . Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε καλλιέργειες C6 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (0,05 τοις εκατό), σε σύγκριση με κύτταρα που δεν είχαν υποστεί αγωγή.

Με βάση τα αποτελέσματα που ελήφθησαν, στη συνέχεια διερευνήσαμε τις μορφολογικές επιδράσεις των ενώσεων Q και Q5 (50 μM) στα κύτταρα C6, στις 24, 48 και 72 ώρες της θεραπείας, χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο. Η πενταοξική κερκετίνη (Q5) στα 50 μΜ προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων γλοιώματος C6 εντός των πρώτων 24 ωρών, με ορατή μείωση στις κυτταροπλασματικές παρατάσεις σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 5). Μετά από 48 ώρες θεραπείας με Q5, τα κύτταρα απέκτησαν μια στρογγυλεμένη μορφολογία που χαρακτηρίζεται από συστολή του κυτταρικού σώματος και άμορφης μεμβράνης (που δεν αναφέρθηκε στην επιστημονική βιβλιογραφία), σε αντίθεση με την κερσετίνη, η οποία, κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου θεραπείας, παρουσίαζε μορφολογική πτυχή παρόμοια με τους ινοβλάστες [37]. Οποιεσδήποτε άλλες μορφολογικές αλλαγές εμφανίστηκαν σε κύτταρα υπό άλλες συνθήκες θεραπείας.

Η υποκατάσταση υδροξυλίου από τις ομάδες ακετυλίου μπορεί να προάγει τη βελτιωμένη κυτταρική απορρόφηση των αναλόγων της κερκετίνης ευνοώντας διάφορες βιολογικές δοκιμές, ιδιαίτερα σε καρκινικά κύτταρα [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] κατέδειξε, με την επεξεργασία των κυττάρων C6 με τα φλαβονοειδή ρουτίνη και κερκετίνη, σημαντική μείωση στην αναλογία προσκολλημένων κυττάρων C6, με λεπτότερο και διπολικό μορφολογικό φαινότυπο, σε σύγκριση με τις καλλιέργειες ελέγχου. Η επεξεργασία των κυττάρων C6 με φλαβονοειδή ανέστειλε τις μεταναστευτικές ιδιότητες των βιώσιμων κυττάρων C6 μετά από 24 ώρες θεραπείας. Σε συνθήκες ελέγχου, η μικρογλοία παρουσίασε πιο στρογγυλό φαινότυπο. Μετά από θεραπεία με ρουτίνη, περισσότερο από το 50 τοις εκατό των κυττάρων απέκτησαν διακλαδισμένο, πολυπολικό φαινότυπο, και τα άλλα απέκτησαν τον αμοιβοειδή φαινότυπο, υποδεικνύοντας και τα δύο ενεργοποίηση.

Μελέτες δείχνουν ότι η κερσετίνη παρεμβαίνει στη ρύθμιση των οδών μεταγωγής σηματοδότησης των κυττάρων που σχετίζονται με τον κυτταρικό θάνατο λόγω απόπτωσης και στα στάδια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου [41,42]. Οι Santos et al. [14] έδειξε πιθανή μείωση στην ανάπτυξη των GL-15 κυττάρων ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος. Bi et al. [43] οραματίστηκε μια επαγωγή αυτοφαγίας των κυττάρων του ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U87 και U251 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν επιβεβαιώνουν με τους Danihelova et al. [22], στην οποία οι ομάδες ακετυλίου που εισήχθησαν στο μόριο κερκετίνης προώθησαν μια βελτίωση στην αντικαρκινική δραστηριότητα. Επιπλέον, έδειξαν μεγαλύτερο τροπισμό για τα καρκινικά κύτταρα, ιδιαίτερα για τα κύτταρα νευρικών γραμμών. Αυτή η μελέτη είναι άνευ προηγουμένου σε σχέση με το ανάλογο Ο5 στη θεραπεία των κυττάρων γλοιώματος C6. Οι Dell'Albani et al. [44]έδειξε καλύτερη δράση των ακυλικών παραγώγων της κερσετίνης σε καλλιέργειες στελεχών ανθρώπινου γλοώματος U373-MG και γλοιώματος ποντικού 9L, υποδεικνύοντας μονοπάτια θανάτου από απόπτωση. Η τροποποίηση της μορφολογίας των κυττάρων σε ένα στρογγυλεμένο προφίλ μπορεί να αναφέρεται σε μηχανισμούς θανάτου, όπως η απόπτωση, που αποδίδεται ευρέως στην κερσετίνη [45-47]. Σε μελλοντικές προοπτικές, δοκιμές με υγιή νευρικά κύτταρα μπορεί να βοηθήσουν στη διαλεύκανση αυτής της υπόθεσης.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Αντιδραστήρια και Υλικά

Όλα τα αντιδραστήρια (κερκετίνη, πυριδίνη, οξικός ανυδρίτης, τριχλωροϊσοκυανουρικό οξύ, διχλωρομεθάνιο, 2,4-δινιτρο-φαινυλυδραζίνη, υδροχλωρική υδροξυλαμίνη, οξικό νάτριο, πετρελαϊκός αιθέρας, θειικό οξύ, νιτρικό και υπερθειικό κάλιο ήταν διαθέσιμα στο εμπόριο, (Ouimex, Merck, Βραζιλία και Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ). Για την παρασκευή όλων των τυπικών διαλυμάτων και δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκε υπερκαθαρό νερό (με ειδική αντίσταση 18 MOcm-I) που ελήφθη από το σύστημα καθαρισμού νερού Milli-Q Plus (Milipore, Molsheim, Γαλλία). Όλα τα εργαστηριακά γυάλινα σκεύη πλύθηκαν σε 10 τοις εκατό (10%) o/ø） διάλυμα HNO3 για 24 ώρες, ξεπλύθηκε με νερό υψηλής καθαρότητας και στέγνωσε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.

3.2. Σύνθεση και Χαρακτηρισμός

Το δομικό ανάλογο ελήφθη μετάκερσετίνημοριακή τροποποίηση από την πιο προσιτή και αναπαραγώγιμη συνθετική οδό (ακετυλίωση Penta). Εφαρμόσαμε τις αρχές της πράσινης χημείας με την ελαχιστοποίηση της χρήσης ουσιών. Το ανάλογο πενταδακτυλίου (Q5) ελήφθη μετά τη μοριακή τροποποίηση της κερκετίνης, από μια συνθετική οδό, η οποία χρησιμοποιεί οξικό ανυδρίτη ως παράγοντα ακυλίωσης και πυριδίνη ως καταλύτη.

Το μίγμα που περιείχε κερκετίνη (300 mg, 1 π.χ.), οξικό ανυδρίτη (0,80 mL, 20 π.χ.) και πυριδίνη (7,5 mL) διατηρήθηκε υπό μαγνητική ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 24 ώρες ανάδευσης, προστέθηκαν 250 mL διχλωρομεθανίου στο μέσο αντίδρασης. Στη συνέχεια, η αντίδραση πλύθηκε με 10 τοις εκατό HCl (3x100 mL), αραιωμένο NaOH (3x50 mL) και νερό (3x100 mL). ξηράνθηκε πάνω από άνυδρο θειικό νάτριο. φιλτραρισμένο? και εξατμίζεται, στον περιστροφικό εξατμιστή (Fisatom, Minas Gerais, Βραζιλία)[21]. Η ποσότητα του Ο5 και η απόδοση που ελήφθη ήταν 280 mg και 54 τοις εκατό, αντίστοιχα.

Η αντίδραση δομικής τροποποίησης του μορίου κερσετίνης παρακολουθήθηκε με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) χρησιμοποιώντας ένα μίγμα εξανίου και οξικού αιθυλεστέρα (1:1) ως διαλύτες. Για τον φυσικοχημικό χαρακτηρισμό χρησιμοποιήθηκε το σημείο τήξης. Οι δοκιμές υπέρυθρων μετασχηματισμού Fourier (FTIR) με τη μέθοδο Attenuated Total Reflection (ATR) πραγματοποιήθηκαν με ένα μοντέλο FTIR Spectrum 100S (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), με την απόκτηση των φασμάτων σάρωσης στο μέσο υπέρυθρο (4000 έως 600 cm-1).

Το δείγμα (μάζα~5.0 mg) τοποθετήθηκε στον κρύσταλλο ATR και υποβλήθηκε σε πίεση περίπου 20 Ν με τη βοήθεια χειροκίνητης μηχανικής πρέσας. Τα φάσματα FTIR εντοπίστηκαν από το λογισμικό OriginPro8, OriginLAB4 (www.originlab.com, πρόσβαση στις 10 Σεπτεμβρίου 2021). Τα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Switzerland)-500 MHz για 1Η NMR και 125 MHz για 13C NMR, χρησιμοποιώντας DMSO ως διαλύτη. Οι χημικές μετατοπίσεις εκφράστηκαν στην κλίμακα ppm (ug/mL) και το χλωροφόρμιο (CHCla) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά.

Τα φάσματα NMR υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λογισμικό TopSpin⑤4.0 (Bruker Biospin, Coventry, UK) και συγκρίθηκαν με δεδομένα της βιβλιογραφίας [38]. Τα δεδομένα NMR ήταν: 'H NMR(500 MHz, CDCl3)2.34(6H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s,-OCOCH3);2.35(3H,s, -OCOCH3);2.44(3H, s,-OCOCH3);6.88(1H,d, J=2.5 Hz);7.34(1H,d,J=2.0 Hz);7.36(1H,d,J=8.5);7.70 (1Hd, J=2.0Hz);7.73(1H,dd,J1=8.5 Hz,J 2=2.0Hz）;13CNMR（125 MHz, CDCl3）δ 170.04;169.24;167.86;167.79;156.87;154.28;150.43;2.217;150.43;1144. ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; και 20,49.

3.3. Αντιοξειδωτικό ABTS* plus Radical Activity

Η δραστηριότητα δέσμευσης ABTS* plus προσαρμόστηκε από τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Dorman και Hiltunen[48]. Το υπερθειικό κάλιο και το ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό για να σχηματίσουν μια τελική συγκέντρωση 2,45 mM και 7 mM, αντίστοιχα. Το διάλυμα ABTS παρήχθη προσθέτοντας και τα δύο διαλύματα με ρυθμό 1:1, και στη συνέχεια το διάλυμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 16 ώρες στο σκοτάδι.

Το προκύπτον διάλυμα, έντονα χρωματισμένο, ρυθμίστηκε με αιθανόλη, στο φασματοφωτόμετρο, σε απορρόφηση {{0}},7±0,05 nm στα 734 nm πριν από τη χρήση. Χρησιμοποιήσαμε 30 μL των δειγμάτων ή Trolox (Sigma Aldrich⑧, St.Louis, MO), ως πρότυπο αναφοράς σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (5,10,25,50,75 και 100 μM), προστέθηκαν σε 3 mL του διάλυμα ABTS* plus και αναμενόταν να αντιδράσει για 6 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 734 nm έναντι ενός τυφλού (αιθανόλη). Η ικανότητα καθαρισμού ABTS· plus υπολογίστηκε ως:

ABTS* συν εφέ καθαρισμού (%){{0}} (1- A0/A1)×100;

όπου A0 είναι η απορρόφηση του μάρτυρα και A1 είναι η απορρόφηση του δείγματος ή του προτύπου. Όλοι οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Οι τιμές IC5so υπολογίστηκαν και εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD σε μΜ.

3.4.Δραστηριότητα Αντιλεϊσμανίας

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125στέλεχος Leila) και Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456)προμαστιγώτες (1 × 10 μοίρες ανά φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε 96-πλάκα φρεατίου σε Μέσο Schneider (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; GIBCO) και 50 ug mL-'γενταμυκίνη (Life, Carlsbad, CA, USA) και υποβλήθηκε σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ( 100 μΜ; έξι αραιώσεις 1∶2） του Q5. Τα παράσιτα επωάστηκαν για 72 ώρες στους 26 βαθμούς. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 20 μL/πηγάδι AlamarBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σε διάστημα 2 ωρών. Η ανάγνωση πραγματοποιήθηκε σε φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιώντας μήκη κύματος 570 και 600 nm. Ο υπολογισμός της αναστολής της καλλιέργειας αξενικής προσδιορίστηκε με βάση τον μάρτυρα που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή [49].

3.5. Αντιφλεγμονώδεις και Κυτταροτοξικές Δραστηριότητες

3.5.1.Ναρκωτικά

Η δεξαμεθαζόνη (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), ένα συνθετικό γλυκοκορτικοειδές, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας σε ανοσοτροποποιητικούς προσδιορισμούς. Η δοξορουβικίνη (υδροχλωρική δοξορουβικίνη, Εργαστήριο IMA SAIC, Μπουένος Άιρες, Αργεντινή) χρησιμοποιήθηκε ως αντικαρκινικό φάρμακο αναφοράς. Όλες οι ενώσεις διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, PanReac, Βαρκελώνη, Ισπανία) και αραιώθηκαν σε μέσο κυτταροκαλλιέργειας για χρήση στους προσδιορισμούς. Η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν μικρότερη από 1 τοις εκατό σε όλα τα πειράματα.

3.5.2.Ζώα

Τα ποντίκια BALB/c, ηλικίας 4-10 εβδομάδων, παρασχέθηκαν από το vivarium του Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Βραζιλία) όπου κρατήθηκαν σε κλουβιά που περιείχαν έως πέντε ποντίκια. Όλα τα κλουβιά διατηρήθηκαν σε ένα εγκλιματισμένο δωμάτιο στους 21 βαθμούς ±1 μοίρες, σε κύκλο φωτός/σκότους 12-h, ​​με νερό και τροφή κατά βούληση καθ' όλη την πειραματική περίοδο. Τα πειράματα με ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας και Χρήσης Ζώων του Ινστιτούτου Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA (IGM-018/15).

3.5.3. Κύτταρα

Χρησιμοποιήθηκαν HL-60 (ανθρώπινη οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία) και HepG2 (ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) από την American Type Culture Collection—ATCC (Rockville, ML.USA). Για την αξιολόγηση της επιλεκτικότητας της κερκετίνης (Ο) και του παραγώγου Ο5 στον πολλαπλασιασμό μη καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε η γενεαλογία MRC-5 (ινοβλάστης ανθρώπινου πνεύμονα), που ελήφθη επίσης από την ATCC. Κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε κύτταρα μπουκάλια καλλιέργειας (όγκος 75 cm3,250 mL) χρησιμοποιώντας μέσο καλλιέργειας RPMI 1640 (GibcoTM) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (GibcoM) και 50 ug/mL γενταμυκίνη (GibcoTM). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε επωαστήρες με ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO, στους 37 βαθμούς και παρακολουθείται καθημερινά. Όλες οι κυτταρικές σειρές εξετάστηκαν για μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης μυκοπλάσματος χρώσης Hoechst (Sigma-Aldrich, St.Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Η κυτταρική σειρά C6 προήλθε από νευρογλοιακούς όγκους αρουραίου που προκλήθηκαν από n-νιτρομεθυλουρία [50]. Αυτά τα κύτταρα γλοιώματος καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται από τους de Oliveira et al. [51]. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 βαθμούς σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα σε 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα C6 αναπτύχθηκαν σε δίσκους κυτταροκαλλιέργειας (100-mm Ø, TPP) σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 100 UI/mL πενικιλλίνη G, 100 μg/mL στρεπτομυκίνη, 7 mM γλυκόζη, 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό, και 10 τοις εκατό ορό εμβρύου μόσχου. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες. Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από τις κατεργασίες, τα κύτταρα C6 σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri διαμέτρου 35 mm ή πλάκες 96- φρεατίων σε πυκνότητα 3,5 × 10* κύτταρα/φρεάτιο.

Όλες οι κυτταρικές σειρές δοκιμάστηκαν για μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας το Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) για να επικυρωθεί η χρήση κυττάρων απαλλαγμένων από μόλυνση. Οι πληροφορίες κυτταρικών γραμμών περιέχονται στη βάση δεδομένων "Cell Bank of Rio de Janeiro (BCRJ)": κελί HepG2 (Κωδικός: 0291), κελί HL-60 (Κωδικός: 0104) και κελί C6 (Κωδικός: 0057) .

3.5.4. Δοκιμασία Κυτταροτοξικής Δραστηριότητας

Για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας των ελεγχόμενων ενώσεων (Q και Q5) στα κύτταρα HL-60 (ανθρώπινη οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία) και HepG2, χρησιμοποιήθηκε η χρωματομετρική μέθοδος του Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το Alamar Blue (ρεσαζουρίνη) είναι ένας δείκτης που παράγει μια χρωματομετρική αλλαγή και ένα φθορίζον σήμα ως απόκριση στη μεταβολική δραστηριότητα. Η ρεσαζουρίνη ανάγεται σε ρεσορουφίνη από μεταβολικά ενεργά κύτταρα. Η οξειδωμένη μορφή είναι μπλε (μη φθορίζον/μη βιώσιμο κύτταρο) και η ανηγμένη μορφή είναι ροζ (φθορισμό/βιώσιμο κύτταρο). Η αναγωγή της ρεσαζουρίνης σε ρεσορουφίνη αντανακλά τη βιωσιμότητα των κυττάρων [52].

Στον προσδιορισμό, τα κύτταρα κατανεμήθηκαν σε {{0}}πλάκες φρεατίων σε προκαθορισμένη πυκνότητα 0.3×1{{1{{0}} βαθμού κύτταρα/mL για κύτταρα τη γενεαλογία HL-60 και 0.7× 10 κύτταρα/mL για κύτταρα της σειράς HepG2. Οι ενώσεις προστέθηκαν σε μια σειρά οκτώ συγκεντρώσεων (80 έως 0,62 μΜ), με εξαίρεση τη δοξορουβικίνη, η οποία χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 0,003 έως 5 μΜ. Ο αρνητικός έλεγχος έλαβε την ίδια ποσότητα DMSO (0,025 τοις εκατό). Οι πλάκες επωάστηκαν για 72 ώρες σε φούρνο στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2. Μετά από αυτό το διάστημα, προστέθηκαν 20 μL/φρεάτιο Alamar Blue και οι πλάκες επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες. Οι πλάκες διαβάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), σε μήκη κύματος 570 και 600 nm.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων C6 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη χρωματομετρική μέθοδο που περιγράφεται από τους Hansen et al. [53]. Το βρωμιούχο ΜΤΤ(3-4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ,25-διφαινυλτετραζόλιο) διαλύθηκε σε συγκέντρωση 5 mg/mL σε στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) στο δωμάτιο θερμοκρασία και το διάλυμα αποστειρώθηκε περαιτέρω περνώντας από φίλτρο 0.2-mm και αποθηκεύτηκε στους 4 βαθμούς στο σκοτάδι. Στον προσδιορισμό, τα κύτταρα κατανεμήθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων με προκαθορισμένη πυκνότητα 3,5× 10* κύτταρα/mL για τη σειρά των κυττάρων C6. Οι ενώσεις προστέθηκαν σε μια σειρά οκτώ συγκεντρώσεων (80 έως 0,39 μΜ).

ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε τελική συγκέντρωση 2 mg/ml και τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα λύθηκαν με 20 τοις εκατό (w/ø) δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS) και 50 τοις εκατό (o/ø) διάλυμα διμεθυλοφορμαμιδίου (DMF) (pH 4,7), σε ολονύκτια επώαση [54,55 σε θερμοκρασία δωματίου] . Η απορρόφηση μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών φασματοφωτόμετρου (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (έκδοση 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Φινλανδία). Οκτώ αντίγραφα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε συγκέντρωση. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό απορρόφησης στα 570 nm και ο έλεγχος υιοθετήθηκε ως 100 τοις εκατό. Μετά από θεραπείες, η μορφολογία των κυττάρων αξιολογήθηκε με μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο (αντεστραμμένο μικροσκόπιο Eclipse TS100, Nikon Instruments, Τόκιο, Ιαπωνία) και φωτογραφήθηκε με χρήση ψηφιακής κάμερας (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Τόκιο, Ιαπωνία).

3.5.5. Πολιτισμός Μακροφάγων

Μακροφάγα περιτοναϊκού εξιδρώματος (2×105 κύτταρα/φρεάτιο) επωάστηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό PBS και 50 ug/ml γενταμυκίνη, εις τριπλούν, διεγερμένα ή όχι με LPS (500ng/mL) και IFN-y (5 ng/mL) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή όχι με διαφορετικές συγκεντρώσεις ενώσεων (20,40 και 80 μΜ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε επωαστήρα στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2 για 4 24 ώρες. Μετά από αυτό το διάστημα, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν για κυτοκίνες και δοσολογία μονοξειδίου του αζώτου. Σε ορισμένες δοκιμασίες, για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας, το υπερκείμενο αντικαταστάθηκε με μέσο και 10 τοις εκατό Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες. Η ανάγνωση του φασματοφωτόμετρου πραγματοποιήθηκε στα 570 και 600 nm.

3.5.6. Δοσολογία TNF

Η μέτρηση του TNF πραγματοποιήθηκε από υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας την τεχνική ELISA σάντουιτς, χρησιμοποιώντας κιτ Συστήματος ΑνάπτυξηςDuoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, ΗΠΑ), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι πλάκες ELISA (NUNC—IMMUNO PLATE Maxisorp Surface) ευαισθητοποιήθηκαν με 50 μL/φρεάτιο του αντισώματος σύλληψης, σε συγκέντρωση 2 ug/mL, αραιωμένο σε PBS 1x και επωάστηκαν για 16 ώρες στους 4 βαθμούς. Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με 1 × PBS/0.05 τοις εκατό tween 20 και μπλοκαρίστηκαν με 100 μL/φρεάτιο 1× PBS και 0,05 τοις εκατό tween 20 και 0,1 τοις εκατό βόεια λευκωματίνη για 2 ώρες .

Στη συνέχεια, 50 μL/φρεάτιο δειγμάτων, μια κενή και τυπική καμπύλη ανασυνδυασμένων αραιωμένων σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-αλατούχου διαλύματος (20 mM Trix στη βάση και 150 mM NaCl) που περιέχει Προστέθηκαν 0,1 τοις εκατό βόεια λευκωματίνη και 0,05 τοις εκατό tween 20 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το πρότυπο αραιώθηκε σειριακά (1:2), από την αρχική συγκέντρωση των 2000 pg/mL, με 11 διπλές αραιώσεις. Η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές με PBS/0,05 τοις εκατό tween και επωάστηκε με 50 μL του αντισώματος ανίχνευσης (βιοτινυλιωμένο) σε συγκέντρωση 400 ng/mL για περίοδο 2 ωρών.

Η πλάκα πλύθηκε τρεις φορές με PBS/{{{0}}.05 τοις εκατό tween και επωάστηκε για 20 λεπτά με υπεροξειδάση αβιδίνης αραιωμένη 1:200. Η ανάπτυξη πραγματοποιήθηκε με προσθήκη υποστρώματος ΤΜΒ (Thermo Fisher) και διακόπηκε με 0,05 Μ φωσφορικό οξύ. Η ανάγνωση της αντίδρασης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), με ένα φίλτρο 450 nm. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Softmax 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

3.5.7.Δοσολογία μονοξειδίου του αζώτου

Η παραγωγή νιτρωδών αλάτων στα υπερκείμενα μακροφάγα υπολογίστηκε μέσω της ποσοτικοποίησης του οξειδωτικού προϊόντος τους, των νιτρωδών, με τη μέθοδο Griess [50]. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), με ένα φίλτρο 570 nm. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε μΜ νιτρώδους άλατος, με βάση μια τυπική καμπύλη νιτρώδους νατρίου με αρχική συγκέντρωση 400 uM.

3.6. Στατιστική ανάλυση

Η δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης που ακολουθήθηκε από τη μετα-δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημασίας των συγκρίσεων μεταξύ των ομάδων στις μελέτες. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά όταν το p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Συμπεράσματα

Οι συνθήκες και τα μέσα σύνθεσης αντιδράσεων των αναλόγων κερκετίνης έδειξαν αποτελεσματικότητα στη λήψη μιας ένωσης δεόντως χαρακτηρισμένης, σύμφωνα με τα δεδομένα που περιγράφονται στη βιβλιογραφία. Η συγκριτική ανάλυση της αντιοξειδωτικής δράσης του Q και του Q5 έδειξε ότι η κερσετίνη (Ο) ήταν πιο δραστική στη σάρωση του ABTS* συν ρίζας από το O5 (29 τοις εκατό και 18 τοις εκατό, αντίστοιχα). Το μειωμένο αντιοξειδωτικό δυναμικό δεν έδειξε παρεμβολή στις ανοσοτροποποιητικές και αντικαρκινικές δραστηριότητες. Οι χημικές τροποποιήσεις που προτείνονται σε αυτή τη μελέτη ενίσχυσαν την αντιπολλαπλασιαστική δράση και διατήρησαν την αντιφλεγμονώδη δράση αλλά όχι την κυτταροτοξικότητα σε υγιή ελεγμένα κύτταρα.

Το ακετυλιωμένο παράγωγο (Q5) που υπάρχει βελτίωσε την κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά ηπατοκυτταρικά κύτταρα (HepG2), κύτταρα προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (LH-60) και, ιδιαίτερα, σε κύτταρα γλοιώματος (C6). Τα κύτταρα C6 γλοιώματος αρουραίου που διακινήθηκαν εμφάνισαν ένα μορφολογικό άνευ προηγουμένου πρότυπο κυτταρικού θανάτου. Το Q5 στα 50 μΜ για 24 ώρες προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων C6glioma που χαρακτηρίζονται από στρογγυλό σχήμα σώματος (το οποίο δεν αναφέρθηκε στην επιστημονική βιβλιογραφία), σε αντίθεση με την κερσετίνη, η οποία παρουσίαζε μορφολογία παρόμοια με τους ινοβλάστες.

Πρέπει να γίνουν περαιτέρω έρευνες για την καλύτερη κατανόηση των επιδράσεων των ακετυλιωμένων παραγώγων της κερκετίνης, ιδιαίτερα στα νευρωνικά κύτταρα. Αυτή η μελέτη επέτρεψε, για πρώτη φορά, την εφαρμογή δομικά τροποποιημένης κερκετίνης σε νευρικά κύτταρα για πιθανά νευροπροστατευτικά αποτελέσματα.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Formica, JV; Regelson, W. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Quercetin and its παράγωγα: Chemical structure and bioactivity—A review. Πολ. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Βιοενεργά φλαβονοειδή σε φαρμακευτικά φυτά: Δομή, δραστηριότητα και βιολογική μοίρα. Asian J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: Μια φφλλαβονόλη με πολύπλευρες θεραπευτικές εφαρμογές; Fitoterapia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Τα φλαβονοειδή προκαλούν κυτταρικό θάνατο στο Leishmania amazonensis: In vitro χαρακτηρισμός με κυτταρομετρία ροής και φασματοσκοπία Raman. Αναλυτής 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Αντιπαρασιτικές επιδράσεις επιλεγμένων ισοφφλαβονών σε πλατύσκωληκες. Helminthology 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Τα διαιτητικά φλαβονοειδή φισετίνη, λουτεολίνη και οι παράγωγές τους ενώσεις αναστέλλουν την αργινάση, ένα κεντρικό ένζυμο στη λοίμωξη από Leishmania (Leishmania) amazonensis. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, Μ.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Αντιτριπανοσωματικές και αντιλεϊσμανιακές δραστηριότητες των φφλλαβονοειδών και των αναλόγων τους: In vitro, in vivo, σχέση δομής-δραστικότητας και ποσοτικές μελέτες σχέσης δομής-δραστικότητας. Αντιμικροβιακό. Agents Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, Μ.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Η κερκετίνη επάγει απόπτωση που προέρχεται από μιτοχόνδρια μέσω ενεργοποίησης ERK που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου σε κύτταρα λευχαιμίας HL{11}} και ξενομόσχευμα. Αψίδα. Toxicol. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, Ν.; Marete, Ε.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER Αναστολή προφλεγμονωδών βιοδεικτών σε μακροφάγους THP1 από πολυφαινόλες που προέρχονται από χαμομήλι, λιβάδι και φλοιό ιτιάς. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]