Ανάλυση πρωτεώματος και in vitro Αντιιικές, αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές ικανότητες των υδατικών εκχυλισμάτων των βρώσιμων μανιταριών Lentinula Edodes και Pleurotus Ostreatus

Για περισσότερες λεπτομέρειες, επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε υδατικά εκχυλίσματα των βρώσιμων μανιταριών Pleurotus ostreatus (μανιτάρι στρείδια) και Lentinula edodes (μανιτάρι shiitake). Η ανάλυση πρωτεώματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας LC-Triple TOF-MS και έδειξε την έκφραση 753 πρωτεϊνών από Pleurotus ostreatus και 432 πρωτεϊνών από Lentinula edodes. Βιοενεργά πεπτίδια: Αναστολέας διάστασης GDP Rab, δισμουτάση υπεροξειδίου, αναγωγάση θειορεδοξίνης, πρωτεϊνάση σερίνης και λεκτίνη, ταυτοποιήθηκαν και στα δύο μανιτάρια. Τα εκχυλίσματα περιελάμβαναν επίσης υποσχόμενες βιοδραστικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινολικών,φλαβονοειδή, βιταμίνες και αμινοξέα. Τα αποσπάσματα έδειξαν πολλά υποσχόμενααντιιικές δραστηριότητες, με δείκτη επιλεκτικότητας (SI) 4,5 για το Pleurotus ostreatus έναντι του αδενοϊού (Ad7) και μια ελαφρά δραστηριότητα για το Lentinula edodes έναντι του απλού έρπητα-II(HSV-2). Τα εκχυλίσματα δεν ήταν κυτταροτοξικά σε φυσιολογικά ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs). Αντίθετα, έδειξαν μέτρια κυτταροτοξικότητα έναντι διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Επιπλέον, η αντιοξειδωτική δράση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας DPPHριζική σάρωση, ABTS ριζική σάρωση κατιόντων και δοκιμασίες ORAC. Τα δύο εκχυλίσματα έδειξαν δυνατότητεςαντιοξειδωτικές δραστηριότητες, με τη μέγιστη δραστηριότητα που παρατηρείται για Pleurotus ostreatus (IC50 ug/mL)=39.46 ± 1.27 για DPPH; 11.22±1.81 για ABTS; και 21,40±2,20 για δοκιμές ORAC. Αυτή η μελέτη ενθαρρύνει τη χρήση αυτών των μανιταριών στην ιατρική υπό το πρίσμα της χαμηλής κυτταροτοξικότητάς τους στα φυσιολογικά PBMC σε σχέση με τις αντιικές, αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές τους ικανότητες.

Λέξεις-κλειδιά: μύκητας λευκής σήψης; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; Shiitake? αντιοξειδωτικό; κατά του όγκου? αντιικό

1. Εισαγωγή

Τα μανιτάρια έχουν μεγάλες προοπτικές στην ιατρική και τη διατροφική παραγωγή. Εκτός από τις καλές οργανοληπτικές ιδιότητες και τις υψηλές θρεπτικές αξίες, πολλά μανιτάρια αναφέρθηκε ότι έχουν μυριάδες φαρμακολογικές δραστηριότητες [1-3]. Μεταξύ των πιο ευρέως καλλιεργούμενων μανιταριών είναι το Lentinula edodes (μανιτάρι shiitake) και το Pleurotus ostreatus (μανιτάρι στρειδιού). Το Shiitake έρχεται δεύτερο μετά το Agaricus bisporus ως το πιο καταναλωτικό βρώσιμο μανιτάρι παγκοσμίως [4]. Αυτό το μανιτάρι έχει πολλά υποσχόμενα αντιβακτηριακά, αντιμυκητιακά, αντιικά, ηπατοπροστατευτικά, αντιυπεργλυκαιμικά και ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα [5-7]. Είναι πλούσιο σε βιοενεργά μόρια, το πιο μελετημένο από τα οποία είναι η "lentinan", ένας πολυσακχαρίτης με δράση κατά των βακτηρίων, των ιών και των όγκων, εκτός από τη "lentinan", η οποία έδειξε βοήθεια στον έλεγχο της δυσλιπιδαιμίας και της υπεργλυκαιμίας [8]. Το Pleurotus ostreatus, το πιο κοινό είδος του γένους Pleurotus [9], γνωστό και ως μανιτάρι στρειδιών, είναι αποσυνθέτης ξύλου και έχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων [10]. Σε σύγκριση με άλλα θεραπευτικά μανιτάρια, τα μανιτάρια στρειδιών γίνονται πιο δημοφιλή ως προαγωγοί υγείας [11]. Η παρουσία μεγάλου αριθμού θρεπτικών συστατικών όπως λεκτίνες, πολυσακχαρίτες, βιταμίνες και μέταλλα στα μανιτάρια στρειδιών τα καθιστά ικανά να διαθέτουν πιθανά αντικαρκινικά,αντιοξειδωτικό, αντιδιαβητικές, αντιμικροβιακές και αντι-υπερχοληστερολαιμικές ιδιότητες [12,13]. Σε σύγκριση με άλλα βρώσιμα μανιτάρια, τα στρείδια και τα μανιτάρια shiitake έχουν σύντομη περίοδο ανάπτυξης και μπορούν να συλλεχθούν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους 14. Ως αποτέλεσμα της ευκολίας καλλιέργειας και δοκιμής, των υψηλών θρεπτικών αξιών και των υποσχόμενων φαρμακευτικών οφελών, αυτά τα μανιτάρια έχουν τεράστιες δυνατότητες στις βιομηχανίες τροφίμων και φαρμακευτικών προϊόντων [4,15]. Πράγματι, οι υψηλότεροι βασιδιομύκητες μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενες πολυλειτουργικές πηγές τροφίμων.

Πολλές βιοδραστικές ενώσεις, όπως σάκχαρα, φυσιολογικά ενεργές πρωτεΐνες, ακόρεστα λιπαρά οξέα, φαινολικά (φαινολικά οξέα και πολυφαινόλες), φλαβονοειδή, τερπενοειδή, γλυκοπρωτεΐνες, πολυκετίδια, στεροειδή και αλκαλοειδή, βρέθηκαν σε αυτά τα δύο μανιτάρια [16,17]. Αυτές οι ενώσεις δρουν αποκλειστικά ή συνεργικά για να επιφέρουν τις ευρείες φαρμακολογικές δράσεις αυτών των μυκήτων. Τα μανιτάρια Shiitake και στρειδιών αναφέρεται ότι έχουν αντιβακτηριακή, αντιική, αντιυπερτασική, ανοσοτροποποιητική και αντιοξειδωτική δράση [1,18,19]. Οι Seo et al. [20] συνόψισε τους μηχανισμούς της αντιϊκής δράσης των βιομορίων μανιταριών, υποδεικνύοντας ότι η μείωση της ιογενούς λοίμωξης οφείλεται κυρίως στην παρεμβολή στην πρόσληψη του ιού στα κύτταρα ξενιστές, στην αντιγραφή του και στη σύνθεση πρωτεϊνών και ενζύμων του, επιπλέον της διέγερσης του ανοσοαπόκριση του ξενιστή [21]. Τα αντιοξειδωτικά είναι σημαντικά μόρια για την αντιμετώπιση των ενεργών ειδών οξυγόνου που βρίσκονται πίσω από πολλά προβλήματα υγείας. Δεδομένου ότι πολλές κόκκινες σημαίες υψώθηκαν κατά της χρήσης συνθετικών αντιοξειδωτικών, η μελέτη των φυσικών έχει γίνει υποχρεωτική [22]. Η αντινεοπλασματική δράση αυτών των προϊόντων μανιταριού σχετιζόταν με βιομόρια συμπεριλαμβανομένων των γλυκανών, της εργοστερόλης, των πρωτεογλυκανών και των αμινοξέων (αργινίνη και γλουταμίνη)[23]. Ο υποτιθέμενος μηχανισμός που διέπει αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να περιλαμβάνει τη διέγερση των Τ-λεμφοκυττάρων, την καταστολή της νεοαγγείωσης και την πρόκληση θανάτου καρκινικών κυττάρων, επιπλέον της ενεργοποίησης της ανοσοαπόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων [24,25].

Η Proteomics έχει αποδειχθεί ως ένα από τα πολύτιμα εργαλεία στη βιοέρευνα, ιδιαίτερα στη γεωργική έρευνα [26]. Οι Lindequist et al. [27]ήταν η πρώτη ομάδα που έριξε φως στη σημασία της χρήσης πρωτεομικών στην έρευνα για βρώσιμα μανιτάρια. Τόνισαν την ανάγκη χρήσης «ωμικών» για τη μελέτη βιοδραστικών μορίων μυκήτων. Η Proteomics έχει χρησιμοποιηθεί σπάνια στην έρευνα για βρώσιμα μανιτάρια έναντι των παθογόνων μυκήτων [28]. Αντίστοιχα, οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν η ανάλυση του πρωτεώματος των δύο βρώσιμων μανιταριών, Pleurotus ostreatus και Lentinula edodes, και η διερεύνηση των δυνατοτήτων τους.αντιικό, αντικαρκινικές και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες.

2. Αποτελέσματα

2.1.Ανάλυση Proteom1e

Η ανάλυση πρωτεώματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανάλυση LC-Triple TOF-MS με ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR)<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Σύνολο βιοδραστικών ενώσεων Σύνολο περιεχομένων

Κατά την αξιολόγηση του συνολικού περιεχομένου, αυτό περιελάμβανε την αξιολόγηση των συνολικών υδατανθράκων, πρωτεϊνών, φαινολικών και φλαβονοειδών. Το εκχύλισμα P. ostreatus περιείχε σχεδόν τριπλάσιο αριθμό υδατανθράκων και διπλάσιο αριθμό πρωτεϊνών που υπάρχουν στο εκχύλισμα L.edodes. Ωστόσο, περισσότερα φλαβονοειδή ανιχνεύθηκαν στο εκχύλισμα L.edodes από το εκχύλισμα P. ostreatus (Πίνακας 1).

2.3. Φαινολικά και Φλαβονοειδή Μόρια

Και τα δύο εκχυλίσματα μανιταριών περιείχαν κατεχίνη (ανιχνεύτηκε σε χρόνο κατακράτησης 26,48 λεπτών). Το P.ostreatus περιελάμβανε επιπλέον καμπφερόλη και απιγενίνη (που ανιχνεύτηκαν σε χρόνους κατακράτησης 59,13 λεπτών και 59,56 λεπτών, αντίστοιχα), ενώ το L.edodes περιείχε επίσης κερκετίνη (χρόνος κατακράτησης=56.86 min· Πίνακας 2· Εικόνα, Εικόνα). S1).

2.4.Βιταμίνες

Οι υδατοδιαλυτές καθώς και οι λιποδιαλυτές βιταμίνες προσδιορίστηκαν μέσω HPLC (Πίνακας 3 και Εικόνες S2 και S3). Και τα δύο μανιτάρια είναι πλούσια σε βιταμίνη C, με ανιχνεύσιμες ποσότητες βιταμινών Β3, Β6 και D. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο μανιταριών στις ποσότητες βιταμινών που διαθέτουν. Από την άλλη πλευρά, οι βιταμίνες Β1, Β2, Β9, Α και Ε δεν ανιχνεύθηκαν και στα δύο μανιτάρια.

2.5. Ανάλυση Αμινοξέων

Για την ανάλυση αμινοξέων χρησιμοποιήθηκε ένας αναλυτής αμινοξέων Sykam. Η συνολική περιεκτικότητα σε αμινοξέα ήταν 5,14 και 4,35 στο P.ostreatus και στο L.edodes, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, και τα δύο μανιτάρια είναι πλούσια σε γλουταμινικό οξύ. Ενώ ανιχνεύτηκε προλίνη σε σημαντική συγκέντρωση (0.57 g/100 g πρωτεΐνης) στο εκχύλισμα P. ostreatus, δεν ανιχνεύθηκε στο εκχύλισμα L.edodes. Ιστιδίνη και ασπαρτικό οξύ δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα από τα δύο μανιτάρια.

2.6. Βιολογικές Δραστηριότητες

2.6.1.Αντιιική δράση

Η αντιική δράση αξιολογήθηκε έναντι δύο ιών: του αδενοϊού και του απλού έρπητα-II. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5, το εκχύλισμα P.ostreatus έδειξε αποτελεσματική αντιική δράση έναντι του αδενοϊού, με δείκτη επιλεκτικότητας τόσο υψηλό όσο 4,5. Υποσχόμενες αντιικές επιδράσεις καταγράφηκαν επίσης για το εκχύλισμα P. ostreatus κατά του απλού έρπητα-II και για το εκχύλισμα L.edodes έναντι και των δύο ιών. Τα σχήματα S4 και S5 αντιπροσωπεύουν τις καμπύλες δόσης-απόκρισης.

2.6.2. Κυτταροτοξική δράση κατά των φυσιολογικών ανθρώπινων PBMC

Ελάχιστη κυτταροτοξικότητα (IC50 ug/mL, 66,41±3,7 και 82,81± 2,72, για P.ostreatus και L. edodes, αντίστοιχα) καταγράφηκε έναντι φυσιολογικών ανθρώπινων PBMCs.

Κατά των κυτταρικών σειρών του καρκίνου

Σε αυτό το τεστ χρησιμοποιήθηκαν διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (DU{0}} και PC3). ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2); ορθοκολικό καρκίνωμα (Colo-205); καρκίνωμα τυφλού εντέρου (LS-513); καρκίνος του τραχήλου της μήτρας (HeLa); και αδενοκαρκίνωμα μαστού (MDA-MB-231 και MCF-7). Η δοξορουβικίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας (προκάλεσε μείωση της βιωσιμότητας σε 53 τοις εκατό στο HepG2, 44 τοις εκατό σε MDA-MB-231, 39 τοις εκατό στο PC3, 35 τοις εκατό σε DU-145, 29 τοις εκατό στο MCF -7:25 τοις εκατό σε LS-513, 23 τοις εκατό σε HeLa και 19 τοις εκατό σε κελιά Colo{-205). Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2 δείχνουν ότι το εκχύλισμα Ledodes και P. ostreatus μείωσε τη βιωσιμότητα των δοκιμασμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών των LS-513, HepG2, DU{-145 και PC-3 κατά περίπου 20 τοις εκατό .

Κατά της Λευχαιμίας και των Κυτταρικών Σειρών Λεμφώματος

Τα εκχυλίσματα μανιταριών του P.ostreatus και του L.edodes δοκιμάστηκαν για κυτταροτοξικότητα έναντι κυττάρων λευχαιμίας (CCR-CEM, NB-4, THP-1) και λεμφώματος (U937). Η δοξορουβικίνη ήταν το θετικό πρότυπο, προκαλώντας μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων σε 29 τοις εκατό , 25,5 τοις εκατό , 20,3 τοις εκατό και 19,1 τοις εκατό στα κύτταρα U937, NB4, CCRF-CEM και THIP1, αντίστοιχα. Το εκχύλισμα L.edodes μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων ΤΗΡ1 στο 66,02 τοις εκατό, ενώ το εκχύλισμα P.ostreatus μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων CCRF-CEM στο 70,64 τοις εκατό (Εικόνα 3).

2.6.3. Αντιοξειδωτική Δραστηριότητα

Τα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής δράσης μελετήθηκαν με τις τρεις μεθόδους αξιολόγησης, δηλαδή την DPPHριζική σάρωση, η σάρωση κατιόντων ριζών ABTS και οι προσδιορισμοί ORAC, σε σύγκριση με το αντιοξειδωτικό πρότυπο, Trolox, παρουσιάζονται στον Πίνακα 6 και στο Σχήμα S6a,b. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το εκχύλισμα P. ostreatus είχε πιο ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα από το εκχύλισμα L.edodes, όπως υποδεικνύεται από τις τρεις αντιοξειδωτικές δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν. Το Σχήμα 4 δείχνει τη διάσπαση του σήματος της φλουορεσκεΐνης που προκαλείται από τα εκχυλίσματα στον προσδιορισμό ORAC.

3. Συζήτηση

Οι μύκητες της λευκής σήψης έχουν προκαλέσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας λόγω των φαρμακευτικών τους ιδιοτήτων, οι οποίες περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος, την υπογλυκαιμική και αντιθρομβωτική δράση και τις αντιυπερτασικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές και αντικαρκινικές ιδιότητες, καθώς και την ικανότητα να μειώνουν τα επίπεδα χοληστερόλης στο αίμα. 24,36-38]. Οι δύο μύκητες λευκής σήψης P. ostreatus και L.edodes είναι δύο από τα βρώσιμα μανιτάρια με τη μεγαλύτερη κατανάλωση σε πολλές χώρες [39]. Ένα πλήθος βιοδραστικών πρωτεϊνών παράγεται από αυτά τα δύο μανιτάρια, και η ανάλυση πρωτεϊνών είναι επί του παρόντος το πιο αποτελεσματικό εργαλείο για τη δημιουργία προφίλ πρωτεΐνης [40]. Στην τρέχουσα μελέτη, η ανάλυση πρωτεϊνών έδειξε την έκφραση βιοδραστικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένου του αναστολέα διάστασης Rab GDP, της αναγωγάσης θειορεδοξίνης, της πρωτεϊνάσης της σερίνης, της δισμουτάσης του υπεροξειδίου και της λεκτίνης στα δύο μανιτάρια δοκιμής. Ο αναστολέας διάστασης Rab GDP (Rab GDI) ρυθμίζει τη λειτουργία των Rab GTPases που παίζουν κεντρικό ρόλο στη διακίνηση μεμβράνης σε κύτταρα όγκου. Συνεπώς, η χρήση του Rab GDI είναι μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική στρατηγική [29].

Η πρωτεϊνάση της σερίνης συμβάλλει στηναντιικόδραστηριότητα βρώσιμων μανιταριών [30,31]. Επιπλέον, οι Yap et al. (2018) ανέφερε ισχυρή εκλεκτική κυτταροτοξικότητα της πρωτεϊνάσης σερίνης στο πρόσωπο μιας κυτταρικής σειράς ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος μαστού (MCF7) και πρότεινε ότι ο μηχανισμός περιλαμβάνει τη συνεργατική επίδραση τόσο του εξωγενούς όσο και του ενδογενούς κυτταρικού θανάτου, επιπλέον της διέγερσης της κασπάσης{{ 4}} και-9 και αναστολή του Bcl-2 [41].

Η πρόσληψη τουαντιοξειδωτικάείναι μια ευοίωνη προφυλακτική στρατηγική κατά της παθοφυσιολογίας που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) [22]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν την έκφραση των ενζύμων του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος από το Pleurotus ostreatus και το Lentinula edodes. Αυτά τα ένζυμα περιλαμβάνουν την υπεροξειδική δισμουτάση, την καταλάση και την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, τα οποία αντισταθμίζουν την παραγωγή ROS [32]. Η υπεροξειδική δισμουτάση ξεκινά με τη μετατροπή του υπεροξειδίου σε υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο, με τη σειρά του, μετατρέπεται από την καταλάση και την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης σε νερό [33].

Η έκφραση της λεκτίνης ανιχνεύθηκε επίσης στα δύο μανιτάρια. Πολλοί ερευνητές ανέφεραν τα εξαιρετικά διαφορετικά βιολογικά προφίλ της λεκτίνης με ένα ευρύ φάσμα δραστηριοτήτων που περιλαμβάνουν αντιφλεγμονώδεις, αντικαταθλιπτικές, αντισυλληπτικές και αγγειοδιασταλτικές δραστηριότητες[34,35,42]. Οι λεκτίνες είναι πρωτεΐνες που δεσμεύουν υδατάνθρακες με μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της in vitro και in vivo καταστολής της ανάπτυξης του όγκου μέσω της επιλεκτικής δέσμευσης με τις μεμβράνες των καρκινικών κυττάρων ή τους υποδοχείς τους, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών ή τη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων μέσω της παραγωγής ιντερλευκίνης [43]. Επιπλέον, οι λεκτίνες των μανιταριών έχουν επίσης ρόλο στην ενεργοποίηση διαφορετικών οδών κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, της νέκρωσης και/ή της αυτοφαγίας [42].

Τα δεδομένα μας δείχνουν την έκφραση τόσο της οστεόλυσης όσο και της πλευροτολυσίνης στο Pleurotus ostreatus. Αυτές είναι πρωτεΐνες που σχηματίζουν πόρους με εξαιρετικά εκλεκτική αντικαρκινική δράση [44,45]. Η οστρεολυσίνη είναι μια κυτταρολυτική πρωτεΐνη 15 kDa με την ικανότητα να διαπερνά τα ερυθροκύτταρα και άλλα κύτταρα σε υπομικρομοριακές συγκεντρώσεις. Δρα μέσω ενός κολλοειδούς οσμωτικού μηχανισμού και προκαλεί το σχηματισμό ευρειών πόρων μεμβράνης |46,47I. Οι Nimri et al. παρήγαγε ανασυνδυασμένη πλευροτολυσίνη με ισχυρή αντινεοπλασματική δράση έναντι κυττάρων όγκου του παχέος εντέρου ανθρώπου και ποντικού [48].

Στο L.edodes, εκφράστηκαν πρωτεΐνη που περιέχει βαλοσίνη και καρφίτσα μανδάλωσης. Πρωτεΐνη που περιέχει βαλοσίνη αναφέρθηκε προηγουμένως ότι είχεαντιοξειδωτικόιδιότητες που θα μπορούσαν να βοηθήσουν σε νευρωνικά σύνδρομα όπως η νόσος Alzheimer, η πλευρική σκλήρυνση και η άνοια [49-51]. Η λακριπίνη είναι ένας πιθανός αντικαρκινικός παράγοντας [50]. Οι Riaz Ud Din et al. (2020) διερεύνησαν τον αντικαρκινικό μηχανισμό της καρφίτσας μανδάλωσης έναντι κυτταρικών γραμμών καρκίνου του μαστού. Ανέφεραν την ικανότητά του να προκαλεί κυτταρικό θάνατο καθώς και αυτοφαγία, εκτός από την ανασταλτική του επίδραση στη μετανάστευση και την εισβολή [52].

Μια σειρά βιοδραστικών ενώσεων ποσοτικοποιήθηκε σε εκχυλίσματα P.ostreatus και L.edodes. TPN's 19,37 ± 0,39 και 24,14 ± 1.01 mg/g εκχυλίσματος για P.ostreatus και L.edodes, αντίστοιχα, ανιχνεύθηκαν στην τρέχουσα μελέτη. Αυτές οι τιμές είναι υψηλότερες από αυτές που καταγράφηκαν από τους Rahimah et al., οι οποίοι χρησιμοποίησαν τις δοκιμές αμμωνίου και Shinoda για να ποσοτικοποιήσουν τη συνολική περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή του P. ostreatus ως 6,67 mg/g του εκχυλίσματος [53]. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας είναι υψηλότερα από αυτά που βρέθηκαν από τους Montibus et al., οι οποίοι ανέλυσαν την TPC σε εκχυλίσματα L edodes χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Folin-Ciocalteu και βρήκαν 0.8-1.5 τοις εκατό ξηρό βάρος (DW) στα κεφαλαία και 0.8-1.1 τοις εκατό dw στα γράμματα [54].

Η κατεχίνη ανιχνεύθηκε και στα εκχυλίσματα P. ostreatus και L.edodes. Η κατεχίνη είναι ένας φυτικός δευτερογενής φαινολικός μεταβολίτης, με ισχυρές ιδιότητες δέσμευσης ελεύθερων ριζών [55]. Το εκχύλισμα L.edodes βρέθηκε να περιέχει το φλαβονοειδές κερκετίνη. Η αντιοξειδωτική δράση της κερκετίνης μεσολαβείται μέσω της ρύθμισης των επιπέδων γλουταθειόνης και της αύξησης της παραγωγής αντιοξειδωτικών ενζύμων συμπεριλαμβανομένης της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης και της αλδο-κετο αναγωγάσης [56]. Επιπλέον, η κερσετίνη αναφέρεται ότι έχει αντικαρκινική δράση μέσω της διακοπής του κυτταρικού κύκλου και της προαγωγής της απόπτωσης [57,58]. Οι Lee et al. ανέφερε ότι η κερσετίνη προκαλεί διακοπή των κυττάρων στις καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3, Du145 και U937 [59]. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν επίσης ότι η καμπφερόλη και η απιγενίνη βρέθηκαν στο P.ostreatus. Η καεμπφερόλη και η απιγενίνη έχουν αποδειχθεί ότι έχουν αντιοξειδωτική και αντιπολλαπλασιαστική δράση [60-62]. Το γλουταμινικό οξύ βρέθηκε ότι είναι το πιο άφθονο αμινοξύ και στα δύο εκχυλίσματα μανιταριών. Στο ίδιο πνεύμα, οι Chirinang et al. ανέλυσαν την περιεκτικότητα σε αμινοξέα του P. ostreatus και του P. major-caju και διαπίστωσαν ότι η περιεκτικότητα σε γλουταμικό οξύ ήταν η υψηλότερη, ακολουθούμενη από ασπαρτικό οξύ και στη συνέχεια αργινίνη [63].

Οι P.ostreatus και L. edodes έδειξαν πολλά υποσχόμενες αντιικές δράσεις κατά του αδενοϊού και του ιού του απλού έρπητα-II, με το SI να φτάνει στο 4,5 για το εκχύλισμα P. ostreatus έναντι του αδενοϊού. Το SI χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας και της ασφάλειας των εκχυλισμάτων καθώς εκτιμά το παράθυρο μεταξύ της κυτταροτοξικής και της αντιϊκής δράσης. Όσο υψηλότερο είναι το SI, τόσο ασφαλέστερη και αποτελεσματικότερη είναι η ένωση [64,65]. Σχετικά δεδομένα παρουσιάστηκαν πρόσφατα από τους Urbancikova et al., όπου συμπληρώματα με βάση τον υπεζωκότα (αδιάλυτο -1,3/1,6-D-γλυκάνη απομονωμένη από P. ostreatus) μείωσαν σημαντικά τη διάρκεια του ιού του απλού έρπητα -Συμπτώματα, με χαμηλότερη βαρύτητα αναπνευστικών συμπτωμάτων, σε ασθενείς θετικούς στον ιό του απλού έρπητα Ι από την ομάδα εικονικού φαρμάκου, χωρίς σημαντικές παρενέργειες, προτείνοντας υπεζωκοτική για πιθανή μελλοντική χρήση στη θεραπεία του οξέος ιού απλού έρπητα Ι [66].

Η αντιική δράση των μανιταριών οφείλεται κυρίως στην παρεμβολή στην πρόσληψη του ιού, την αναπαραγωγή, τη δραστηριότητα των ενζύμων και τα πεπτίδια που λειτουργούν, καθώς και στην ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή [67]. Οι Seo και Choi (2021) πρότειναν ότι η -γλυκάνη στο κλάσμα πολυσακχαρίτη των P.ostreatus και L.edodes μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αντιερπητική της δράση μέσω των επιδράσεων πριν και μετά τη θεραπεία [20]. Η επίδραση κατά του HIV των υδατικών εκχυλισμάτων του P. ostreatus και του L.edodes μπορεί να προκληθεί από την αναστολή του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης από πρωτεΐνη που μοιάζει με ουβικιτίνη και λεπτίνη, αντίστοιχα [68,69].

Τα υδατικά εκχυλίσματα των μανιταριών μας αποδείχθηκε ότι αναστέλλουν τη βιωσιμότητα των δοκιμασμένων καρκινικών κυτταρικών γραμμών κατά περίπου 20 τοις εκατό. Είδαμε επίσης παρόμοια αποτελέσματα κατά της λευχαιμίας και των κυτταρικών γραμμών λεμφώματος, με μείωση της βιωσιμότητας σε 66 τοις εκατό με το εκχύλισμα L.edodes έναντι των κυττάρων THP1 λευχαιμίας και σε 70,6 τοις εκατό με το εκχύλισμα P.ostreatus έναντι των κυττάρων λευχαιμίας CCRF-CEM. Τα υδατικά εκχυλίσματα μυκηλίων και φρούτων του L.edodes είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι ασκούν αντιπολλαπλασιαστική και αποπτωτική δράση σε MCF-7 καρκινικά κύτταρα του μαστού[70]. Το κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα και η -γλυκάνη του L.edodes ήταν κυρίως υπεύθυνα για αυτές τις δράσεις[71,72]. Στο ίδιο πλαίσιο, το εκχύλισμα P. ostreatus μπόρεσε να δείξει αντιπολλαπλασιαστική δράση προς τα κύτταρα MCF-7 και MDA-MB-231 αδενοκαρκινώματος του μαστού [73] και τις 6-συνδεδεμένες γλυκάνες του εκχυλίσματος ενίσχυσε τη φυσική φονική κυτταροτοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων του μαστού και του πνεύμονα [74]. Πρόσφατα, οι Jakopovic et al. διαπίστωσε ότι τα φαρμακευτικά σκευάσματα μανιταριών που αποτελούνταν από 6 και 10 μανιτάρια, συμπεριλαμβανομένων των L.edodes και P. ostreatus, εμφάνισαν σημαντικές αντιπολλαπλασιαστικές και προ-αποπτωτικές επιδράσεις στις κυτταρικές σειρές όγκου του παχέος εντέρου (HCT-116, SW620) [75]. Αντίθετα, οι συγγραφείς παρατήρησαν ότι η επίδραση σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών (WI-38) ήταν πολλαπλασιαστική, δείχνοντας την ειδικότητα αυτών των παρασκευασμάτων μανιταριών προς τις κυτταρικές σειρές όγκου. Ομοίως, εντοπίσαμε ελάχιστη κυτταροτοξικότητα που εκκρίνεται από τα μανιτάρια μας έναντι των φυσιολογικών ανθρώπινων PBMC. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει επίσης την ασφαλή χρήση των μανιταριών μας.

Η κυτταροτοξικότητα των μανιταριών έχει αποδοθεί σε ένα ευρύ φάσμα μορίων, συμπεριλαμβανομένων των χ- και -γλυκανών, πρωτεϊνών, γλυκοπρωτεϊνών, λιπαρών οξέων, ανταγωνιστών νουκλεοσιδίων, τερπενοειδών και φαινολικών ενώσεων [76]. Abdalla et al. (2012) πρότεινε ότι τα εκχυλίσματα μανιταριών καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της αρωματάσης [77]. Imam et al. (2021) απομόνωσε ένα ινδόλη-3-γαλακτικό οξύ από το Ledodes που ανέστειλε τη διαίρεση των κυττάρων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [78]. Οι Yukawa et al. (2012) πρότεινε ότι η άμεση αποπτωτική επίδραση των μυκηλίων L edodes στα κύτταρα HepG2 είναι μέσω της ενεργοποίησης των οδών του υποδοχέα της κασπάσης-3 και -8 του θανάτου [79]. Οι Wu et al. (2011) μελέτησαν την κυτταροτοξική επίδραση του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος του P. ostreatus σε κύτταρα ανθρώπινου ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος (SW480) και σε μια ανθρώπινη μονοκυτταρική λευχαιμία, THP-1(κύτταρα) και ανέφεραν δημιουργία ROS, εξάντληση της γλουταθειόνης, αλλοίωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και αποσύνθεση του ολιγονουκλεοσωμικού DNA, με αποτέλεσμα την απόπτωση των κυττάρων SW480 [80].

Καθώς τα αντιοξειδωτικά δεν δρουν μέσω ενός μόνο μηχανισμού, η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας συνήθως διεξάγεται με περισσότερες από μία μεθόδους [81]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν τρεις μέθοδοι αξιολόγησης, και συγκεκριμένα, οι προσδιορισμοί DPPH, ABTS και ORAC. Ο αντιοξειδωτικός μηχανισμός SET (μεταφορά ενός ηλεκτρονίου) αξιολογήθηκε μέσω της ανάλυσης DPPH, ενώ οι προσδιορισμοί ABTS και ORAC χρησιμοποιήθηκαν για αντιδράσεις HAT (μεταφορά ατόμου υδρογόνου) [81]. Η ανάλυση ORAC παρέχει ακριβέστερες ακριβείς εκτιμήσεις καθώς συνδυάζει τον χρόνο αναστολής και τον βαθμό αναστολής σε έναν μόνο όρο [82]. Ενώ η ανάλυση φωσφομολυβδαινικού χρησιμοποιείται συνήθως για την έκφραση της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (TAC), και οι τρεις μέθοδοι που χρησιμοποιούνται

σε αυτό το χειρόγραφο έχουν αναφερθεί για την αξιολόγηση του TAC. Οι Munteanu και Apetrei (2021), στην ανασκόπηση των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δράσης, περιέγραψαν τον προσδιορισμό καθαρισμού ριζών ABTS ως μια «απλή και βολική μέθοδο που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (TAC)»[83]. Στη συγκριτική τους μελέτη, οι Csepregi et al. (2016) συνέκρινε τέσσερις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του TAC, που ήταν η ισοδύναμη αντιοξειδωτική ικανότητα Trolox (TEAC), το αντιοξειδωτικό δυναμικό μείωσης του σιδήρου (FRAP), το 2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζύλιο (DPPH) προσδιορισμός δέσμευσης ριζών και αντιδραστικότητα αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (FCR)[84]. Το 2013, οι Ou et al. εισήγαγαν την ORAC ως νέα μέθοδο για την αξιολόγηση του TAC[85]. Στο ίδιο πνεύμα, οι Rubio et al. (2016 )ταξινόμησε τον προσδιορισμό ORAC ως μεταξύ των άμεσων μεθόδων για τον προσδιορισμό του TAC, μαζί με το TEAC [86]. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων ABTS και ORAC δείχνουν ότι τα εκχυλίσματα P. ostreatus και L.edode έχουν αντιοξειδωτικές ικανότητες που είναι υψηλότερες από αυτές του τυπικού αντιοξειδωτικού, Trolox.

Η αντιοξειδωτική δράση των δύο μανιταριών μπορεί να αποδοθεί στην παρουσία πολλών βιοδραστικών συστατικών όπωςφλαβονοειδή, φαινολικά, βιοενεργά πεπτίδια και βιταμίνη C[87]. Οι Gaber et al. συνέκρινε τις αναλύσεις ABTS, DPPH, αντιοξειδωτικής ισχύος μείωσης του σιδήρου (FRAP) και ORAC για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισμάτων γκουάβα και ανέφεραν θετική συσχέτιση μεταξύ των αντιοξειδωτικών δυνάμεων, όπως προσδιορίζονται από τις τέσσερις μεθόδους, και της περιεκτικότητας σε βιταμίνη C και TPN. Από την άλλη πλευρά, κατέγραψαν αρνητική συσχέτιση με την περιεκτικότητα σε καροτενοειδή [88]. Η DPPH(1,1-Διφαινυλ-2-πικρυλ-υδραζυλ) είναι μια σταθερή ελεύθερη ρίζα που έχει ένα μη ζευγαρωμένο ηλεκτρόνιο σθένους σε ένα άτομο της γέφυρας αζώτου. Έτσι, η σάρωση της ρίζας DPPH είναι η βάση της δημοφιλής αντιοξειδωτικής ανάλυσης DPPH[89]. Το 2,2'-αζινο-δις (3-αιθυλβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό κατιόν) (ABTS) χάνει το μπλε του χρώμα όταν ανάγεται από ένα αντιοξειδωτικό και η χρωματική αλλαγή μπορεί να ποσοτικοποιηθεί φασματοφωτομετρικά [90]. Η ανάλυση ORAC μετρά την οξειδωτική αποικοδόμηση του ανιχνευτή φθορισμού από τις ελεύθερες ρίζες που διακόπτονται από την αντιοξειδωτική ουσία. Κατά συνέπεια, όσο ισχυρότερη είναι η αντιοξειδωτική ικανότητα, τόσο μικρότερος είναι ο χρόνος που απαιτείται για να σβήσει ο φθορισμός [91]. Επιπλέον, δεδομένου ότι τα εκχυλίσματα που δοκιμάστηκαν έδειξαν πολλά υποσχόμενα αντιοξειδωτικά αποτελέσματα όταν δοκιμάστηκαν μέσω των προαναφερόμενων μεθόδων, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι δρουν μέσωσάρωση ελεύθερων ριζών. Ωστόσο, τα μανιτάρια που δοκιμάστηκαν περιείχαν σημαντική συνολική περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή και καθώς τα φλαβονοειδή έχουν συνδεθεί με την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2 (2017), αυτό μπορεί να προστεθεί ως υποτιθέμενος μηχανισμός [92].

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1.Προετοιμασία Ειδών Μανιταριών και Υποκαλλιέργεια

Τα μανιτάρια P. ostreatus και L.edodes που είχαν ταυτοποιηθεί προηγουμένως ελήφθησαν, ως ωάρια και/ή καρποφόρα σώματα, από τη συλλογή καλλιέργειας του Κέντρου Ερευνών Γεωργίας, Κάιρο, Αίγυπτος [93,94]. Χρησιμοποιήθηκαν χειρουργικές λεπίδες για την άσηπτη κοπή του καρπού για υποκαλλιέργεια από καρποφόρα σώματα μανιταριών. Τα εσωτερικά μυκήλια συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας αποστειρωμένες βελόνες και υποκαλλιεργήθηκαν σε στείρες πλάκες άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA) (Merck, Darmstadt, Γερμανία)95]. Για την υποκαλλιέργεια μυκητιακών ωοτοκιών, χρησιμοποιήθηκαν στείρες λαβίδες για τη συλλογή των σπόρων και τη μεταφορά τους ασηπτικά σε αποστειρωμένες πλάκες PDA, οι οποίες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 28 βαθμούς για 7 ημέρες και τα καρποφόρα σώματα κάθε στελέχους πλύθηκαν ξεχωριστά. Κάθε προϊόν απομόνωσης (500 g) αφέθηκε για 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου για να στεγνώσει στον αέρα, αλέστηκε με το χέρι σε μύλο κουζίνας και αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε καλά αεριζόμενο χώρο για μελλοντική χρήση.

4.2. Υδατική Εκχύλιση Pleurotus Ostreatus και Lentinus Edodes

Οι αποξηραμένοι καρποί κάθε προϊόντος απομόνωσης αλέστηκαν σε σκόνη 500 g χρησιμοποιώντας ένα οικιακό μπλέντερ, στη συνέχεια εμβαπτίστηκαν τρεις φορές σε απεσταγμένο νερό 7Lof σε θερμοκρασία δωματίου για τρεις ημέρες, υποβλήθηκαν σε υπερήχους (υπερηχητικό καθαριστικό, Αγγλία, Ηνωμένο Βασίλειο) και στη συνέχεια διηθήθηκαν. Η διαδικασία διαβροχής και διήθησης επαναλήφθηκε μέχρις ότου εξαντληθεί το υγρό. Για την αποθήκευση της απόδοσης χρησιμοποιήθηκε αιθανόλη. Μετά την εξάτμιση της αιθανόλης στους 45 βαθμούς, ένα σύνολο 500 mL από κάθε απομόνωση ξηράνθηκε με ψύξη για να δώσει περίπου 20 g ξηρού υπολείμματος από κάθε εκχύλισμα [96].

4.3. Πρωτεομική Ανάλυση

Η πρωτεομική ανάλυση διεξήχθη στη μονάδα πρωτεομικής και μεταβολομικής στο Children's Cancer Hospital Egypt 57,357(CCHE), Κάιρο, Αίγυπτος. Περίπου 600 uL 8 M ουρίας σε 500 mM Tris (pH8,5) και 60 uL πλήρεις υπερπρωτεάσες (Roche , Mannheim, Germany) προστέθηκαν σε κάθε δείγμα και στη συνέχεια τα δείγματα ανακινήθηκαν έντονα και φυγοκεντρήθηκαν σε 10,000 RPM για 30 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και τα κλάσματα (1 ug/10 μL) εγχύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα NanoLC. Το σύστημα τριπλού TOF φασματομετρίας μάζας (Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord) συζεύχθηκε με υγρή χρωματογραφία (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), αποτελούμενο από έναν αυτόματο eksigent nanoampler συνδεδεμένο με το nanoLC40 μια αντλία Ekspert nanoLC425, με ρυθμό ροής 10 μL/min για 55 λεπτά, για κάθε δείγμα [97]. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε από το ProteinPilot (έκδοση 5.0.1.0,4895) και τον Αλγόριθμο Paragon (έκδοση 5.0.1.0,4874). Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με αλληλουχίες στο Swiss-Prot και στη βάση δεδομένων TrEMBL (Pleurotus sp. που περιέχει 14.792 καταχωρήσεις για P. ostreatus και Lentinula sp. που περιέχει 12603 καταχωρήσεις για L.edodes)[98]. Οι συνήθως ταυτοποιούμενες πρωτεΐνες μεταξύ των ειδών μανιταριών απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, Αγγλία, UK).

4.4. Χαρακτηρισμός Βιοδραστικών Ενώσεων

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η συνολική περιεκτικότητα σε διαλυτούς υδατάνθρακες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την τεχνική του θειικού οξέος της φαινόλης [100]. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά (TPC) και η συνολική περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή (TFC) προσδιορίστηκαν όπως αναφέρθηκε από τους Ryan et al. [101]. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν σε συγκέντρωση 20 mg/mL σε νερό. Παρασκευάστηκε γαλλικό οξύ (1 mg/mL μητρικό διάλυμα) σε μεθανόλη. Ρουτίνη (1 mg/mL μητρικό διάλυμα) παρασκευάστηκε σε μεθανόλη. Τα πρότυπα και τα δείγματα γαλλικού οξέος μεταφέρθηκαν με πιπέτα στα φρεάτια της πλάκας σε έξι αντίγραφα και μετρήθηκαν στα 630 nm. Καθένα από τα 10 πρότυπα και δείγματα ρουτίνης σε έξι αντίγραφα μετρήθηκε στα 420 nm.

Η ανάλυση HPLC των ολικών φαινολικών και φλαβονοειδών διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο των Singh et al. [102]. Καθένα από τα δείγματα και 10 διαφορετικά πρότυπα διαλύματα διαλύθηκαν σε μεθανόλη και διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρα σύριγγας 0,22 um και στη συνέχεια εγχύθηκαν 100 μL από κάθε δείγμα και 10 uL από κάθε πρότυπο χρησιμοποιώντας στήλη HPLC, Waters 2690 Alliance HPLC σύστημα εξοπλισμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου Waters 996. Στήλη C18 Inertsil ODS3:4,6×250 mm, 5 um; κινητή φάση: ρυθμιστικό διάλυμα (0,1 τοις εκατό φωσφορικό οξύ σε νερό). Ο τρόπος έκλουσης μεθανόλης ήταν βαθμιδωτός με ρυθμό ροής 1 mL/min σε μήκος κύματος 280 nm.

Για ανάλυση υδατοδιαλυτών βιταμινών, τα ελεγμένα εκχυλίσματα μανιταριών (50 mg/mL), πρότυπα αναφοράς (10 mg σε 10 mL0,05 M υδροξείδιο του νατρίου) καθενός από τις επτά υδατοδιαλυτές βιταμίνες (θειαμίνη HCl, ασκορβικό οξύ, ριβοφλαβίνη, νικοτινικό οξύ, νικοτιναμίδη, πυριδοξίνη HCl και φολικό οξύ)[103] και από τις λιποδιαλυτές βιταμίνες, διαλύματα (50 mg/mL) των τριών εκχυλισμάτων μανιταριών και παρασκευάστηκε ένα πρότυπο διάλυμα σε μεθανόλη τριών λιπαρών βιταμινών: Ε, D3 και Α, σε 806,2, 114 και 400 IU/mL, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα διαλύματα αραιώθηκαν σε 100 ug/mL, διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρο σύριγγας 0,22 um και 100 μL εγχύθηκαν σε στήλη HPLC, σύστημα HPLC Waters 2690 Alliance (Milford, CT, ΗΠΑ) εξοπλισμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου Waters 996. Στήλη Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm, 5 μm; κινητή φάση: ρυθμιστικό (0,85 g άλατος νατρίου εξανοσουλφονικού οξέος σε 1000 mL νερού και το ρΗ ρυθμίστηκε στο 3 με ορθοφωσφορικό οξύ). Η έκλουση μεθανόλης ήταν βαθμιδωτή με ρυθμό ροής 1 mL/min σε μήκος κύματος 210 nm [104].

4.5. Ανάλυση πρωτεϊνών και αμινοξέων

Η σύνθεση των αμινοξέων των εκχυλισμάτων μανιταριού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή αμινοξέων Sykam (Sykam GmbH, Γερμανία) εξοπλισμένο με σύστημα παροχής διαλύτη, S 2100 (τεταρτοταγής αντλία με εύρος ροής {{ 24}}.01 έως 10.00 mL/min και μέγιστη πίεση έως 400 bar), αυτόματη δειγματοληψία, S5200, μονάδα αντίδρασης αμινοξέων, S4300 (με ενσωματωμένο διπλό φίλτρο φωτόμετρο στα 570 nm) και έναν οργανωτή αντιδραστηρίου ψύξης, S4130. Ένα γραμμάριο από κάθε εκχύλισμα μανιταριού αναμίχθηκε με 5 mL εξανίου και αφέθηκε να εμποτιστεί για 24 ώρες, και στη συνέχεια το μίγμα διηθήθηκε χρησιμοποιώντας Whatman αρ. 1 διηθητικό χαρτί. Το υπόλειμμα τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε 10 mL6N HCl και επωάστηκε σε φούρνο στους 110 βαθμούς για 24 ώρες. Μετά την επώαση, διεξήχθη διήθηση χρησιμοποιώντας Whatman αρ. 1 διηθητικό χαρτί, ακολουθούμενο από εξάτμιση σε περιστροφικό εξατμιστή. Το υπόλειμμα διαλύθηκε πλήρως σε 2 mL ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης (αφυδατωμένο κιτρικό νάτριο 0,06 Μ, κιτρικό οξύ 0,03 Μ, φαινόλη 0,02 Μ, θειοδιγλυκόλη 1,4 τοις εκατό, HCL 32 τοις εκατό), αραιώθηκε {{31} φορές στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και στη συνέχεια φορτώνεται σε στήλη φίλτρου αμμωνίας (LCA, K04/Na, 4,6×100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Γερμανία) εξοπλισμένη με αυτόματο αναλυτή αμινοξέων (Sykam) [105].

4.6. Κυτταρικές Καλλιέργειες

Κύτταρα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (HeLa), οξείας μονοκυτταρικής λευχαιμίας (Thpl), καρκινώματος παχέος εντέρου (Colo-205) και καρκινώματος τυφλού (LS{1}}) διατηρήθηκαν στο μέσο Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Lonza, Κολωνία, Γερμανία) συμπληρωμένο με 100 mg/mL στρεπτομυκίνης, 100 μονάδες/mL πενικιλίνης και 10 τοις εκατό εμβρυϊκού βόειου ορού αδρανοποιημένου με θερμότητα. Άλλες κυτταρικές σειρές: ανθρώπινη λευχαιμία (CCRF-CEM); οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (NB-4); ανθρώπινο λέμφωμα (U937); καρκίνος του προστάτη (DU-145 και PC3). ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2); αδενοκαρκίνωμα μαστού (MCF-7 και MDA-MB-231); Vero; και Hep{15}}, υποκαλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Invitrogen, Καλιφόρνια, ΗΠΑ) και η επώαση διεξήχθη στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα με 5 τοις εκατό CO2. Οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Κάιρο, Αίγυπτος), ενώ τα πρωτογενή μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) και τα κύτταρα φυσιολογικών ανθρώπων (ATCC PCS-800-011TM) αγοράστηκαν από το Viscera, Κάιρο, Αίγυπτος. Αυτή η εργασία εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής Έρευνας της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Ain Shams (Έγκριση Αρ. 294).

4.7.Αντιαερική Δραστηριότητα

Αντιική δράσηδοκιμάστηκε έναντι αδενοϊού τύπου 7 (Ad7) και ιού απλού έρπητα τύπου II (HSV-2) (Nawah Scientific, Mokattam, Αίγυπτος). Η αντιική δράση αξιολογήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [106]. Τα κύτταρα Vero και Hep-2 σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 96-πηγαδιού σε πυκνότητα 2× 10* κύτταρα/φρεάτιο μία ημέρα πριν από τη μόλυνση. Το μέσο κυτταροκαλλιέργειας (Τμήμα 4.6) αφαιρέθηκε την επόμενη μέρα και χρησιμοποιήθηκε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) για την έκπλυση των κυττάρων. Η μολυσματικότητα του ανθρώπινου αδενοϊού και του ιού του απλού έρπη τύπου ΙΙ προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σουλφοροδαμίνης B(SRB), η οποία παρακολουθούσε τις κυτταροπαθητικές επιδράσεις (CPE) και υπολόγισε το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων [107]. Η αντιική δράση υπολογίστηκε με βάση την ικανότητα των εκχυλισμάτων μανιταριών να αναστέλλουν τα ιικά CPEs, όπου η 50 τοις εκατό κυτταροτοξική συγκέντρωση (CC5o) και η 50 τοις εκατό ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego , CA, ΗΠΑ). Ο δείκτης επιλεκτικότητας (SD) υπολογίστηκε όπως δηλώθηκε από τους Dogan et al. [108] σύμφωνα με την εξίσωση (1)Δείκτης επιλεκτικότητας (SI)=CC50/IC50

4.8.Κυτταροτοξικότητα έναντι των PBMC με χρήση της ανάλυσης MTT

Η κυτταροτοξικότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση MTT【109】. Δείγματα (100 μL) κυτταρικών εναιωρημάτων (πυκνότητα κυττάρων 1.2-1.8×10* κύτταρα/φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων, προστέθηκε πλήρες μέσο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σειριακές αραιώσεις εκχυλισμάτων μανιταριών για 48 ώρες. Διάλυμα ΜΤΤ (5 mg/mL) σε PBS προστέθηκε σε φρεάτια και επωάστηκε για 4 ώρες και η απορρόφηση στα 570 nm διαβάστηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες και κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Γερμανία) χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος.

4.9.Επανεκτίμηση Κυτταροτοξικής Δραστηριότητας UIsing SRB έναντι καρκινικών κυτταρικών σειρών

Κυτταροτοξικότητα κατά του καρκίνου του προστάτη (DU{{{{0}} και PC3). ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2); ορθοκολικό καρκίνωμα (Colo-205); καρκίνωμα τυφλού εντέρου (LS-513); καρκίνος του τραχήλου της μήτρας (HeLa); και κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος μαστού (MDA-MB-231 και MCF-7) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρωματομετρικό προσδιορισμό σουλφοροδαμίνης Β (SRB) [110]. Τα κυτταρικά εναιωρήματα σε πλήρη μέσα (4.6) επωάστηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων για 24 ώρες. Στη συνέχεια, προστέθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις (0 έως 100 ug/mL σε πλήρες μέσο) εκχυλισμάτων μανιταριού και επωάστηκαν για 72 ώρες. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες και τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος.

4.10. Η βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών λευχαιμίας και λεμφώματος με χρήση της ανάλυσης WST-1

Η κυτταροτοξικότητα έναντι της ανθρώπινης λευχαιμίας (CCRF-CEM), της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (NB4), της οξείας μονοκυτταρικής λευχαιμίας (THP1) και του ανθρώπινου λεμφώματος (U937) προσδιορίστηκε με ανάλυση υδατοδιαλυτού άλατος τετραζολίου (WST-1) χρησιμοποιώντας Abcamkit ( ab155902 WST-1 Αντιδραστήριο πολλαπλασιασμού κυττάρων, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα κυτταρικά εναιωρήματα επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0 έως 100 ug/mL σε πλήρες μέσο) εκχυλισμάτων μανιταριού για 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μL αντιδραστηρίου WST-1 για 1 ώρα και το A450 διαβάστηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών [111]. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες και κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (Sigma-Aldrich, Γερμανία) χρησίμευσαν ως θετικός έλεγχος.

4.11.Αντιοξειδωτική Δραστηριότητα

4.11.1. Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών DPPH

Η δοκιμασία σάρωσης ριζών DPPH διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο των Lu et al. [112]. Η προκύπτουσα μείωση στο χρώμα DPPH μετρήθηκε στα 540 nm.Αντιοξειδωτική δράσηεκφράστηκε ως το ποσοστό αναστολής με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης (R2=0.9903). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος± SD σύμφωνα με την Εξίσωση (2):(Ποσοστό αντιοξειδωτικής δραστηριότητας=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank]×100)

(2) όπου το abs-blank και το abs-samp αναφέρονται στην απορρόφηση του τυφλού και του δείγματος, αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του δείγματος που απαιτείται για την αναστολή των μισών ελεύθερων ριζών (IC50) υπολογίστηκε.

4.11.2.ABTS (2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid)) Δραστηριότητα καθαρισμού κατιόντων ριζών

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως 【113】. Εκχυλίσματα μανιταριών (10 μL διαλυμάτων 0 έως 100 ug/mL) αναμίχθηκαν με 190 μL φρεσκοπαρασκευασμένου ABTS (Sigma-Aldrich Germany) σε 96-πλάκες και επωάστηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 2 h. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε σε τέσσερις επαναλήψεις και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 734 nm. Η αντιοξειδωτική δράση εκφράστηκε ως ποσοστό αναστολής (Εξίσωση (1)) με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης (R2=0.9948).

4.11.3. Δοκιμασία ικανότητας απορρόφησης ριζών οξυγόνου (ORAC).

Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως καθορίστηκε προηγουμένως [62], με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, 12,5 μL εκχυλισμάτων μανιταριών, εις τριπλούν, επωάστηκαν με 75 μL φλουορεσκεΐνης (10 nm) για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Η μέτρηση φθορισμού (485 EX, 520 EM, nm) πραγματοποιήθηκε για τρεις κύκλους (χρόνος κύκλου=90 s). Στη συνέχεια, 12,5 μL πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 240 mm 2,2'-Azobis {{16} Διυδροχλωρικό αμιδινοπροπάνιο (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, UK) προστέθηκε αμέσως σε κάθε φρεάτιο και η μέτρηση φθορισμού συνεχίστηκε για 2,5 ώρες (85 κύκλοι, κάθε 90 s). Η ανάλυση μετρά την απώλεια φθορισμού φλουορεσκεΐνης με την πάροδο του χρόνου ως αποτέλεσμα του σχηματισμού υπεροξυλικής ρίζας με τη διάσπαση του AAPH. Trolox(6-υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλοχρωμαν-2-καρβοξυλικό οξύ), μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη Ε ανάλογο, χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας που αναστέλλει τη διάσπαση της φλουορεσκεΐνης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο Η αντιοξειδωτική δράση εκφράστηκε ως ποσοστό αναστολής (Εξίσωση (1) με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης (R2= 0.9957).

4.12.Στατιστική Ανάλυση

Διεξήχθησαν τριπλοί χημικοί προσδιορισμοί και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες ± τυπικές αποκλίσεις. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μονόδρομη ANOVA.

Η σημασία των διαφορών μεταξύ των μέσων τιμών αξιολογήθηκε με τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων Tukey-Kramer. Μια τιμή p μικρότερη ή ίση με 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η στατιστική αξιολόγηση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad PRISM (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA).

5. Συμπεράσματα

Τα μανιτάρια P. ostreatus και L.edodes περιέχουν ένα ευρύ φάσμα βιοδραστικών ενώσεων. Η ανάλυση πρωτεώματος έδειξε την έκφραση πολλαπλών βιοδραστικών μορίων με πολυάριθμες βιολογικές δραστηριότητες. Τα υδατικά εκχυλίσματα των μανιταριών έχουν πολλά υποσχόμενααντιικόΟι δραστηριότητες κατά του αδενοϊού τύπου 7 και του ιού του απλού έρπη τύπου II.CPEs ανιχνεύθηκαν έναντι καρκινικών κυτταρικών γραμμών αλλά όχι έναντι φυσιολογικών ανθρώπινων PBMC. Η παρούσα μελέτη ενθαρρύνει τη χρήση αυτών των μανιταριών για φαρμακολογικούς σκοπούς υπό το πρίσμα της χαμηλής κυτταροτοξικότητάς τους σε φυσιολογικά PBMC, επιπλέον των αντιιικών, αντικαρκινικών και αντιοξειδωτικών ικανοτήτων τους.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, WC; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, FAR; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; et al. Μίσχος και σωρός βασιδιοκάρπιου Lentinus crinitus: Χημική σύνθεση, κυτταροτοξικότητα και αντιοξειδωτική δράση. Ευρώ. Food Res. Τεχνολ. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; Stephen, Α.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Αντιβακτηριακή δράση, in vitro αντιοξειδωτικό δυναμικό και χαρακτηρισμός GC-MS του μεθανολικού εκχυλίσματος του Gymnopilus Junius, ενός άγριου μανιταριού από το Southern Western Ghats, Ινδία. Ευρώ. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA Τα διατροφικά και ιατρικά οφέλη του Agaricus bisporus: Μια ανασκόπηση. J. Microbiol. Biotechnol. Food Sci. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN Βελτίωση της απόδοσης του βρώσιμου και φαρμακευτικού μανιταριού Lentinula edodes σε άχυρο σίτου με τη χρήση συμπληρωμένου γόνου. Μπραζ. J. Microbiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, Α.; Delle Monache, F.; Smânia, Ε.; Gil, Μ.; Benchetrit, L.; Cruz, F. Αντιβακτηριδιακή δράση ουσίας που παράγεται από τον μύκητα Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177-181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Αντιβακτηριακή δράση του Lentinula edodes που αναπτύσσεται σε υγρό μέσο. Μπραζ. J. Microbiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, Η.-Ο.; Kim, Η.-Μ.; Yun, J.-W. Υπογλυκαιμική επίδραση ακατέργαστων εξωπολυσακχαριτών που παράγονται από ένα φαρμακευτικό μανιτάρι Phellinus baumii σε διαβητικούς αρουραίους που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, π.Χ. Maeda, Υ.; Goldsmith, CE; Rooney, PJ; Loughrey, Α.; Rao, J.; Moore, JE Μια εξέταση των αντιβακτηριακών και αντιμυκητιασικών ιδιοτήτων των συστατικών των μανιταριών Shiitake (Lentinula edodes) και Oyster (Pleurotus ostreatus). Συμπλήρωμα. Εκεί. Clin. Πρακτική. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Ζερβάκης, Γ.; Φιλιππούσης, Α.; Ιωαννίδου, Σ.; Διαμαντοπούλου, Π. Κινητική ανάπτυξης μυκηλίου και βέλτιστες συνθήκες θερμοκρασίας για την καλλιέργεια βρώσιμων ειδών μανιταριών σε λιγνοκυτταρινικά υποστρώματα. Folia Microbiol. 2001, 46, 231-234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Καλλιέργεια Pleurotus ostreatus και άλλων βρώσιμων μανιταριών. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]