για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef ³, Χάρολντ Τέιτερ⁴, Τόμας Νόρτον⁴, Πίτερ Μπάατσεν ⁵, Sara Cairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte ⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²και η Έλενα Λεβτσένκο^1,*

^{Μέρος Ι: Νεφρικές και εξωνεφρικές εκδηλώσεις σε ενήλικα ψάρια ζέβρας Μοντέλο κυστίνωσης}

¹Laboratory of Pediatric Nephrology, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Τμήμα Παθολογίας, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Λέιντεν, 2300 RC Leiden, Ολλανδία; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ Neural Circuit Development and Regeneration Research Group, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, Division of Animal and Human Health Engineering, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵Molecular Neurobiology, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Βέλγιο; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Department of Pediatric Medicine, Laboratory of Metabolic Biochemistry Unit, Bambino Gesù Children's Hospital, IRCCS, 00146 Rome, Italy; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Τμήμα Παιδιατρικής Νεφρολογίας, Πανεπιστημιακό Ιατρικό Κέντρο Radboud, 6525 GA Nijmegen, Ολλανδία

^*Αλληλογραφία: elena.levtchenko@uzleuven.be; Τηλ.: συν 32-16-34-38-22

^† Αυτοί οι συγγραφείς συνέβαλαν εξίσου στην εργασία αυτή.

Αφηρημένη:Κυστίνωσηείναι μια σπάνια, ανίατη, αυτοσωμική υπολειπόμενη νόσος που προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο του CTNS. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί την κυστίνωση μεταφορέα λυσοσωμικής κυστίνης, που οδηγεί σε συσσώρευση λυσοσωμικής κυστίνης σε όλα τα κύτταρα του σώματος, με τα νεφρά να είναι τα πρώτα επηρεαζόμενα όργανα. Η τρέχουσα θεραπεία με κυστεαμίνη μειώνει τη συσσώρευση κυστίνης αλλά δεν αναστρέφει την εγγύς σωληναριακή δυσλειτουργία, τον σπειραματικό τραυματισμό ή την απώλειανεφρώνλειτουργία. Στην προηγούμενη μελέτη μας, αναπτύξαμε ένα μοντέλο κυστίνωσης με ζέβρα μέσω μιας ανόητης μετάλλαξης στο γονίδιο CTNS και δείξαμε ότι οι προνύμφες ζέβρα ανακεφαλαιώνουν τονεφρόφαινότυπο που περιγράφεται στους ανθρώπους. Στην παρούσα μελέτη, χαρακτηρίσαμε τον ενήλικακυστίνωσημοντέλο zebrash και αξιολόγησε τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της νόσου σενεφρόκαι εξωνεφρική όργανα μέσω βιοχημικών, ιστολογικών μελετών, γονιμότητας και κινητικής δραστηριότητας. Διαπιστώσαμε ότι ο ενήλικαςκυστίνωσηΤο ζέβρα παρουσιάζει συσσώρευση κυστίνης σε διάφορα όργανα, αλλοιωμένη μορφολογία των νεφρών, μειωμένη μελάγχρωση του δέρματος, μειωμένη γονιμότητα, αλλοιωμένη κινητική δραστηριότητα και οφθαλμικές ανωμαλίες. Συνολικά, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο ενήλικαςκυστίνωσηΤο μοντέλο zebrash αναπαράγει αρκετούς ανθρώπινους φαινοτύπους κυστίνωσης και μπορεί να είναι χρήσιμος για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας και των μακροπρόθεσμων επιπτώσεων νέων θεραπειών.

Λέξεις-κλειδιά:νεφρόνόσος;κυστίνωση; μοντέλο zebrash;νεφρώνκαι εξωνεφρική εκδήλωση; φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ενηλίκων

1. Εισαγωγή

Κυστίνωσηείναι μια αυτοσωμική υπολειπόμενη διαταραχή αποθήκευσης που προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο CTNS που κωδικοποιεί την κυστίνωση συν-μεταφορέα πρωτονίων κυστίνης λυσοσωμικού, που μεταφέρει την κυστίνη από τον λυσοσωμικό αυλό στο κυτταρόπλασμα. Πολλά όργανα εμπλέκονται στη νόσο, όπως οι μύες, οι όρχεις, τα μάτια και ο εγκέφαλος, και μεταξύ όλων,νεφράείναι τα πρώτα και πιο σοβαρά προσβεβλημένα όργανα [1]. Η πιο συχνή και σοβαρή κλινική παραλλαγή είναι η βρεφική νεφροπαθητικήκυστίνωση, στην οποία η πρώτη κλινική εκδήλωση είναι ηνεφρώνΣύνδρομο Fanconi, που χαρακτηρίζεται από εξασθενημένο εγγύς σωληναριακό επιθηλιακό κύτταρο

Επαναπορρόφηση (PTE) με αποτέλεσμα την απώλεια αμινοξέων, γλυκόζης, χαμηλού μοριακού έως ενδιάμεσου μοριακού βάρους πρωτεϊνών και άλλων μεταβολιτών από τα ούρα. Η βλάβη του PTEC ακολουθείται από προοδευτική σπειραματική δυσλειτουργία και, όταν αφεθεί χωρίς θεραπεία, οδηγεί σε τελικό στάδιονεφρόασθένεια [1]. Η τρέχουσα θεραπευτική προσέγγιση αποτελείται από κυστεαμίνη, η οποία είναι μια αμινοθειόλη που καταστρέφει την κυστίνη και σπάει τη δισουλφιδική γέφυρα της κυστεΐνης, με αποτέλεσμα το σχηματισμό αμινοξέος κυστεΐνης και μικτού δισουλφιδίου κυστεαμίνης-κυστεΐνης. Αυτό το τελευταίο μόριο μπορεί να εξέλθει από λυσοσωμάτια μέσω του μεταφορέα αμινοξέων PQLC2[2]. Ωστόσο, η θεραπεία με κυστεαμίνη, αν και μειώνει τη συσσώρευση λυσοσωμικής κυστίνης, καθυστερεί μόνο την εξέλιξη της νόσου [3-5]. Επομένως, περαιτέρω κατανόηση της παθογένειας τουκυστίνωσηκαι η ανάπτυξη του νέου rapeuticoption εξακολουθούν να βρίσκονται στην ατζέντα της έρευνας. Έχουν αναπτυχθεί αρκετά ζωικά μοντέλα προκειμένου να ανακεφαλαιωθεί ο φαινότυπος της κυστίνωσης [6,7]. Ένα από τα πιο χρησιμοποιούμενα μοντέλα είναι το ποντίκι Ctns−/− C57BL/6, το οποίο αναπτύσσει συσσώρευση κυστίνης και ήπια εγγύς σωληνοπάθεια. Ωστόσο, δεν παρουσιάζει σπειραματική βλάβη και ο φαινότυπος έχει βρεθεί ότι εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο [8].

Μέχρι σήμερα, τα μοντέλα zebrafish έχουν γίνει ένα ελκυστικό εργαλείο για τη διερεύνηση ανθρώπινων ασθενειών λόγω πολλών πλεονεκτημάτων όπως η ταχεία ανάπτυξή τους, η υψηλή γονιμότητα, το χαμηλότερο κόστος συντήρησης και η διαθεσιμότητα εύκολα εφαρμόσιμων τεχνολογιών επεξεργασίας γονιδίων [9]. Σε μια προηγούμενη μελέτη, παρουσιάσαμε ένα μοντέλο συγγενών προνυμφών ζέβρα με μια ομόζυγη παράλογη μετάλλαξη στο εξόνιο 8 του γονιδίου ctns−/−, με αποτέλεσμα λειτουργική απώλεια κυστίνωσης [10], που οδηγεί σε συσσώρευση κυστίνης σε ολόκληρο το σώμα, αυξημένη παραμόρφωση προνυμφών, καθυστερημένη ανάπτυξη καινεφρόυλικές ζημιές. Ωστόσο, οι μακροπρόθεσμες συνέπειες της νόσου σε ενήλικα ζέβρα δεν έχουν μελετηθεί μέχρι στιγμής. Στην παρούσα μελέτη, στοχεύσαμε να χαρακτηρίσουμε τονεφρώνκαι εξωνεφρικές εκδηλώσεις στο ενήλικο μοντέλο ζέβρακυστίνωση.

Κάντε κλικ στο ΒιολογικόCistanche για νεφρική νόσο

2. Αποτελέσματα

2.1. Η κυστίνη συσσωρεύεται σε Ctns−/− Zebrash

Κυστίνωσηθεωρείται πολυσυστημική διαταραχή με αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυστίνης σε όλα τα κύτταρα του σώματος. Στην προηγούμενη εργασία μας, διαπιστώσαμε ότι η κυστίνωση (ctns−/−) των ζέβρα εμφανίζει συσσώρευση κυστίνης ξεκινώντας από το στάδιο ανάπτυξης της προνύμφης και σε πολλά όργανα μέχρι την ηλικία των 8 μηνών [9]. Για να αξιολογήσουμε εάν το μοντέλο μας διατηρεί τη συσσώρευση κυστίνης στα τελευταία στάδια της νόσου, μετρήσαμε τα επίπεδα κυστίνης σε ολόκληρο το σώμα,νεφρό, όρχεις, μάτια, μύες και εγκέφαλος σε 18-μηνών ctns−/− ζεβράψαρο σε σύγκριση με αρσενικό ζέβρα άγριου τύπου που ταιριάζει στην ηλικία. Βρήκαμε μια 54-πλάσια αύξηση στην περιεκτικότητα σε κυστίνη σε ολόκληρο το σώμα (Εικόνα 1Α) και μια 146-πλάσια αύξηση στο νεφρό (Εικόνα 1Β) του ctns−/− ζέβραψαρου σε σύγκριση με το ζέβρα αγρίου τύπου. Επιπλέον, παρατηρήσαμε εκτεταμένη συσσώρευση κυστίνης στους όρχεις, τα μάτια, τους μύες και τον εγκέφαλο (Εικόνα 1C–F) σε ctns−/− zebrafish.

2.2. Νεφρική εκδήλωση

2.2.1. Ctns−/− Zebrash Present PTEC Damage

Δεδομένου ότι τονεφρόείναι το πιο σοβαρά προσβεβλημένο όργανο, εξετάσαμε τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του νεφρού χρησιμοποιώντας χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης(H&E) και Periodic Acid-Shiff(PAS). Παρατηρήσαμε την παρουσία θολού οιδήματος, ηωσινόφιλων σταγονιδίων που μοιάζουν με υαλίνη και κυτταροπλασματικών κενοτοπίων στο PTEC του ctns-/- ζέβρα (Εικόνα 2Β, Δ) αλλά όχι σε ζέβρα άγριου τύπου (Εικόνα 2Α, Γ). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν βρέθηκε καμία περιφερική σωληναριακή βλάβη. Οι κρύσταλλοι κυστίνης είχαν παρατηρηθεί προηγουμένως στο PTEC ως κυτταροπλασματικά κενοτόπια με ορθογώνια ή πολύμορφα σχήματα [11]. Επομένως, ερευνήσαμε εάν αυτές οι δομές υπήρχαν επίσης σε σωληνάρια ζέβρα. Βρήκαμε πολυάριθμα κυτταροπλασματικά κενοτόπια στο PTEC του ctns-/- zebrafish μέσω χρώσης μπλε τολουιδίνης (Εικόνα 3B, D, που υποδεικνύεται με αστερίσκους). Επιπλέον, βρήκαμε κενοτόπιο χώρο με ορθογώνια ή πολύμορφα σχήματα (Εικόνα 3Β, Δ, που υποδεικνύεται με αιχμές βελών). Επιβεβαιώσαμε αυτό το εύρημα με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) (Εικόνα 3F). Αυτές οι δομές δεν ήταν παρούσες στο PTEC των ζέβρα άγριου τύπου (Εικόνα 3Α, Γ, Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, εκτός από την παρουσία κενοτοπίων πολυμορφικού σχήματος, παρατηρήσαμε μια μερική απώλεια του περιγράμματος της βούρτσας στην υπερδομή PTEC (Εικόνα 3F).

Εικόνα 1. Περιεκτικότητα σε κυστίνη σε ομογενοποιήματα άγριου τύπου και ctns−/− zebrafish. (A–F) Περιεκτικότητα σε κυστίνη σε ολόκληρο το σώμα (A),νεφρό(B), όρχεις (C), μάτια (D), μυς (E) και εγκέφαλος (F) σε άγριου τύπου και ctns−/− 18-μηνών αρσενικό ζέβρα. Η συγκέντρωση κυστίνης εκφράζεται ως nmol/mg πρωτεΐνης. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα ζέβρα, για συνολικά n=3 άγριου τύπου και n=3 σεντς−/− 18-αρσενικό ζέβρα μηνών. μη ζευγαρωμένο t-test με διόρθωση του Welch, με δύο ουρές: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Σχήμα 2.Νεφρόιστολογία σε άγριου τύπου και ctns−/− zebrash. (Α, Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες τουνεφρώνσωληνάρια άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζεβράφις μηνών. Λεπτομέρειες εγγύς σωληναρίων με ηωσινόφιλα σταγονίδια που μοιάζουν με υαλίνη (μαύρες αιχμές βέλους) και κυτταροπλασματικά κενοτόπια (*). Χρώση H&E. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C,D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της χρώσης με PAS των νεφρικών σωληναρίων άγριου τύπου (C) και ctns−/− (D) 18-ζεβράφις μηνών. Λεπτομέρειες εγγύς σωληναρίων με σταγονίδια που μοιάζουν με υαλίνη (μαύρες αιχμές βέλους) και κυτταροπλασματικά κενοτόπια (*). Χρώση PAS. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. PT: εγγύς σωληνάριο. DT: άπω σωληνάριο.

Εικόνα 3.Νεφρόκρύσταλλοι κυστίνης σε PTEC άγριου τύπου και ctns−/− zebrafish. (Α, Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες με μπλε βαμμένες τολουϊδίνηςνεφρώνεγγύς σωληνάρια σε άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζεβρόψαρο μηνών. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C,D) Τα σχήματα 3C, D δείχνουν υψηλότερη μεγέθυνση του σχήματος 3A,B. Λεπτομέρειες εγγύς νεφρικών σωληναρίων με κυτταροπλασματικά κενοτόπια ((D)· *), ορθογώνια και πολύμορφα κενοτόπια ((D)· μαύρες αιχμές βελών). (E, F) Αντιπροσωπευτικές εικόνες TEM του εγγύς νεφρικού σωληναρίου άγριου τύπου (E) και ctns−/− 18-ζεβραΐας μηνών (F). (ΣΤ) Μερική απώλεια των εγγύς ορίων βούρτσας σωληναρίων (PB) και συσσώρευση ορθογωνικών και πολυμορφικών κενοτοπίων (*) παρατηρήθηκαν στο εγγύς νεφρικό σωληνάριο του ctns−/− zebrash. Η όψη υψηλής μεγέθυνσης του ορθογωνίου στην κάτω δεξιά γωνία δείχνει τα πολύμορφα κενοτόπια και ένα μεγάλο κενοτόπιο με ευθύγραμμα τμήματα συνόρων μεμβράνης (ευθεία γραμμή). Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 5 μm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrash Εμφάνιση σπειραματικής υπερτροφίας

Δεδομένου ότι η σπειραματική βλάβη συνήθως ακολουθεί τις βλάβες PTEC, αξιολογήσαμε τη σπειραματική ιστολογία των τεκτόνων-/- ζέβρα, και παρατηρήσαμε ότι ταctns-/− μαλζεβράφις έδειξε σημαντική μεγέθυνση της κάψουλας του Bowman (Εικόνα 4B, E) και το σφαιρικό διάστημα , Ζ) σε σύγκριση με αρσενικό ζέβρα άγριου τύπου (Εικόνα 4Α, E–G). Τα ίδια επιβεβαιώθηκαν για το σπειραματικό σωληνοειδές θηλυκό θηλυκό που φέρει τη μετάλλαξη ctns−/− (Εικόνα 4F), και μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε κατά τις μετρήσεις του χώρου του Μπάουμαν και της κάψας του Μπάουμαν (Εικόνα 4Ε, G). Παρατηρήθηκε μη πολλαπλασιασμός μεσαγγειακών κυττάρων ή σπειραματοσκλήρωση. Στις εικόνες TEM, δεν παρατηρήσαμε αλλοιώσεις στη βασική μεμβράνη του σπειράματος, εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού του ποδοκυττάρου ή μη φυσιολογικά εμβολιασμένα ενδοθηλιακά κύτταρα στα σπειράματα του ctns−/− ζέβρα (Εικόνα 4D) σε σύγκριση με ζέβρα άγριου τύπου (Εικόνα 4Γ).

Εικόνα 4. Σπειραματική μορφολογία σε άγριου τύπου και σε ctns−/− zebrafish. (A, B) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του σπειράματος άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζέβρα μηνών. Χρώση PAS. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C,D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες TEM του σπειράματος άγριου τύπου (ctns−/− (D) zebrafish. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 1 μm. (E–G) Η ποσοτικοποίηση των επιφανειών της κάψουλας του Bowman (E), σπειραματική τούφα (F) και ο χώρος του Bowman (G) άγριου τύπου και ζέβρα και στα δύο φύλα.

2.2.3. Ctns−/− Zebrash Εμφάνιση Αύξηση Απόπτωσης στο Επίπεδο PTEC

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε ανκυστίνωσηπροκάλεσε κυτταρικό θάνατο στο μοντέλο μας zebrafish [10,12]. Πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση με διάσπαση κασπάσης-3 στονεφρώνιστούς άγριου τύπου και ctns-/- ζέβρα και παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση των επιπέδων σχισμένης πρωτεΐνης κασπάσης3 στο PTEC του ctns-/- ζέβρα (Εικόνα 5B, D, G) σε σύγκριση με το ζέβρα άγριου τύπου (Εικόνα 5A, C, Ζ) και στα δύο φύλα. Η έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3 ήταν κυρίως παρούσα σε κύτταρα που έδειχναν τα πολύμορφα κυτταροπλασματικά κενοτόπια (Εικόνα 5Β, Δ). Καμία έκφραση διασπασμένης κασπάσης-3 δεν υπήρχε στα σπειράματα, τόσο σε άγριου τύπου όσο και σε ctns-/- ζέβρα (Εικόνα 5Ε, ΣΤ).

Εικόνα 5. Αυξημένη απόπτωση σε PTECs με κενοτόπια σε ctns−/− zebrafish. (Α, Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της διασπασμένης κασπάσης-3 ανοσοχρώσης σωληναρίων άγριου τύπου (Α) και ctns− παλιάς ζέβρα. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C,D) Τα κάτω πάνελ δείχνουν μεγαλύτερη μεγέθυνση των περιοχών σε κουτί στα επάνω πάνελ. Λεπτομέρειες PTEC με κυτταροπλασματικά κενοτόπια (*). Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (E, F) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της διασπασμένης κασπάσης-3 ανοσοχρώσης σπειραμάτων άγριου τύπου (E) και ctns−/− (F) 18-ζέβρα μηνών. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (Ζ) Η ποσοτικοποίηση της θετικής περιοχής χρώσης σωληνοειδούς κασπάσης{10}} σε άγριου τύπου και ζέβρα και στα δύο φύλα. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα ζέβρα, για ένα σύνολο n=3 άγριου τύπου και ctns−/− 18-ζέβρα μηνών. Αμφίδρομη ANOVA με δοκιμή ελάχιστης σημαντικής διαφοράς Fisher (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" p=""><>

2.3. Επιπλέον Νεφρικές Εκδηλώσεις

2.3.1. Ctns−/− Zebrash Εμφάνιση ενός χαρακτηριστικού υποχρωματισμένου στίγματος δέρματος

ΚυστίνωσηΟι ασθενείς συχνά εμφανίζουν πρόωρη γήρανση του δέρματος, υπομελάγχρωση και ξανθά μαλλιά [1,13]. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ένα υποχρωματισμένο μοτίβο κηλίδων του δέρματος ctns-/- ζέβρα, ενώ τα ψάρια άγριου τύπου παρουσίαζαν το τυπικό μαύρο ριγέ μοτίβο. Ο φαινότυπος είναι παρών και στα δύο φύλα καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής τους (Εικόνα 6Α, Β). Προκειμένου να διερευνήσουμε τη διαφορά στη μελάγχρωση, πραγματοποιήσαμε χρώση PAS στο δέρμα του ζέβρα και βρήκαμε ότι το ctns−/− το ζέβρα εμφανίζει αλλοιωμένη κατανομή του στρώματος μελανίνης στην επιδερμίδα, γεγονός που προκάλεσε το ελαφρύ μοτίβο κηλίδων (Εικόνα 6C, D).

Εικόνα 6. Υπόχρωμο μοτίβο κηλίδων δέρματος σε ctns−/− zebrafish. (A, B) Αντιπροσωπευτικές εικόνες άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζέβρα μηνών. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 0,5 cm. Οι μαύρες αιχμές βελών υποδεικνύουν τα διαφορετικά ριγέ μοτίβα δέρματος. (C,D) Εικόνες της επιδερμίδας που έχουν χρωματιστεί με PAS άγριου τύπου (C) και ctns−/− (D) 18-ζέβρα μηνών. Οι μαύρες αιχμές βελών τονίζουν το στρώμα μελανίνης. Η διακοπή στο στρώμα μελανίνης είναι παρούσα στο ctns−/− (D) ενώ απουσιάζει στα ψάρια ζέβρα άγριου τύπου (C). Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μ

2.3.2. Ctns−/− Zebrafish Εμφανίζουν σπερματογόνες κύστεις εμπλουτισμένες σε σπερματοζωάρια

ΚυστίνωσηΕίναι γνωστό ότι επηρεάζει τις λειτουργίες των όρχεων, με αποτέλεσμα αζωοσπερμία και στειρότητα σε άνδρες ασθενείς [14-16]. Η προέλευση της αζωοσπερμίας είναι ακόμα ασαφής, αν και η σπερματογένεση έχει αποδειχθεί άθικτη στο επίπεδο των όρχεων. Σε αντίθεση με τους άνδρες ασθενείς, οι γυναίκες με κυστίνωση είναι γόνιμες [17]. Στο μοντέλο μας zebrafish, τόσο τα θηλυκά όσο και τα αρσενικά ctns−/− zebrafish είναι γόνιμα. Προκειμένου να διερευνήσουμε εάν η μετάλλαξη ctns−/− επηρεάζει την ανατομία του όρχεως, πραγματοποιήσαμε χρώση PAS και βρήκαμε αυξημένη συσσώρευση σπερματοζωαρίων στις σπερματογόνες κύστεις σε ctns−/− ζέβρα

Εικόνα 7. Σπερματογόνες κύστεις εμπλουτισμένες σε σπερματοζωάρια σε ctns−/− zebrafish. (A, B) Αντιπροσωπευτικές εικόνες με χρώση H&E από όρχεις άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζέβρα μηνών. Το σκούρο μπλε και η στρογγυλεμένη χρώση αντιπροσωπεύουν τα σπερματοζωάρια που έχουν συσσωρευτεί στις σπερματογόνες κύστεις (που υποδεικνύονται με τους αστερίσκους). Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 200 μm.

2.3.3. Ctns−/− Θηλυκό Zebrash Εμφάνιση Μειωμένης Παραγωγής Αυγών

Προκειμένου να διερευνήσουμε τη λειτουργικότητα του αναπαραγωγικού συστήματος, μετρήσαμε την παραγωγή ωαρίων και το ποσοστό των γονιμοποιημένων ωαρίων τόσο σε άγριου τύπου όσο και σε ctns−/− ζέβρα. Βρήκαμε ότι τα ctns−/− θηλυκά παρουσιάζουν μειωμένη παραγωγή αυγών (Εικόνα 8Α) και μειωμένο ποσοστό γονιμοποιημένων ωαρίων (Εικόνα 8Β) σε σύγκριση με τα θηλυκά άγριου τύπου.

Εικόνα 8. Παραγωγή ωαρίων και ποσοστό γονιμοποιημένων αυγών σε άγριου τύπου και ctns−/− zebrafish. (Α) Η παραγωγή αυγών μετρήθηκε ως συνολικός αριθμός αυγών σε άγριου τύπου και ctns−/− zebrafish 18-ζέβρα μηνών. Το ποσοστό παραγωγής αυγών είναι 1.941 υψηλό σε ζέβρα άγριου τύπου σε σύγκριση με ctns−/− ζέβρα 18 μηνών (αναλογία ποσοστού=1.941). 95 τοις εκατό CI (κάτω όριο=1.165, υψηλότερο όριο=3.234); Ανάλυση παλινδρόμησης Poisson; p=0.011. (Β) Το ποσοστό των γονιμοποιημένων ωαρίων μετρήθηκε επί του συνολικού αριθμού των ωαρίων. Οι πιθανότητες των γονιμοποιημένων αυγών είναι 3.504 υψηλές σε ζέβρα άγριου τύπου σε σύγκριση με ctns−/− 18-ζέβρα μηνών (αναλογία πιθανοτήτων=3.504). 95 τοις εκατό CI (κάτω όριο=2.005, υψηλότερο όριο=6.124); Ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης; p < 0,001;="" α/α:="" δεν="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish Εμφάνιση μειωμένης κινητικής δραστηριότητας

Δεδομένου ότι η μυϊκή απώλεια και αδυναμία έχουν διαγνωστεί σεκυστίνωσηασθενείς, γενικά από τη δεύτερη δεκαετία της ζωής [1,18], αξιολογήσαμε την κινητική δραστηριότητα στο μοντέλο μας zebrafish. Ανακαλύψαμε ότι το ctns−/− zebrafish και από τα δύο φύλα εμφάνισε μειωμένη κινητική δραστηριότητα σε σύγκριση με το zebrafish άγριου τύπου, υποδηλώνοντας μια εξασθενημένη μυϊκή λειτουργία (Εικόνα 9). Ωστόσο, η ιστολογική ανάλυση του σκελετικού μυϊκού ιστού δεν αποκάλυψε εμφανείς ανωμαλίες στο ctns−/− zebrafish.