για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Μέρος: II Νεφρικές και εξωνεφρικές εκδηλώσεις σε ενήλικα ψάρια ζέβρας Μοντέλο κυστίνωσης

2.3.5. Ctns−/− Zebrash Παρόν αυξημένο πάχος του κερατοειδούς

Κυστίνωσηεπηρεάζει τα μάτια με αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυστίνης σε αρκετούς ιστούς, όπως η ίριδα, ο επιπεφυκότας και το επιθήλιο του αμφιβληστροειδούς, ωστόσο, ο κερατοειδής είναι το πιο επηρεασμένο τμήμα λόγω της συσσώρευσης κυστίνης [19] και παρουσιάζει αυξημένο πάχος [20]. Χρησιμοποιώντας τη χρώση H&E, παρατηρήσαμε ότι το ctns-/-zebrafish παρουσίασε αυξημένο πάχος του στρωματικού στρώματος του κερατοειδούς σε σύγκριση με το άγριου τύπου (Εικόνα 10A, B, E) zebrafish. Ωστόσο, δεν αποκαλύψαμε εμφανείς ανωμαλίες στο επιθήλιο του αμφιβληστροειδούς του ctns−/−zebrafish (Εικόνα 10C, D).

Εικόνα 9. Μέση ταχύτητα κολύμβησης σε άγριου τύπου και ctns−/−zebrash. Η μέση ταχύτητα είναι μειωμένη σε ctns−/−zebrash σε σύγκριση με άγριου τύπου και στα δύο φύλα. Η μέση ταχύτητα κολύμβησης μετριέται σε pixel/δευτερόλεπτο. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα ζέβραψαρο, για ένα σύνολο n=6 άγριου τύπου και n=6 ctns−/−18-ζέβρα ενός μηνός. Αμφίδρομη ANOVA με δοκιμή ελάχιστης σημαντικής διαφοράς Fisher (PLSD): ** p <>

Εικόνα 10. Οφθαλμική ιστολογία σε άγριου τύπου και ctns−/− zebrafish. (Α, Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του κερατοειδούς άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) 18-ζέβρα μηνών. Το στρωματικό στρώμα του κερατοειδούς (μαύρες αιχμές βελών και μαύρες γραμμές). Χρώση H&E. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (C,D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του αμφιβληστροειδή χιτώνα άγριου τύπου (A) και ctns−/− (B) zebrafish. Χρώση H&E. Οι ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. (Ε) Σχετική ποσοτικοποίηση του πάχους της στρωματικής στιβάδας του κερατοειδούς. Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει ένα μύθο του πάχους της στρωματικής στιβάδας του κερατοειδούς. Ασύζευκτο t-test με διόρθωση Welch, δύο ουρών: * p <>

2.3.6. Πρόσθετοι Φαινότυποι Ctns−/− Zebrafish

Εκτός από τους φαινοτύπους που αναφέρθηκαν παραπάνω, πραγματοποιήσαμε ιστολογική ανάλυση του εγκεφάλου και της ωοθήκης χωρίς να βρούμε διαφορές μεταξύ ψαριών-/- και άγριου τύπου. Επιπλέον, αξιολογήσαμε το μήκος και το βάρος του ctns-/- και του ζέβρα-ζέβρα άγριου τύπου σε 18 μήνες και βρεθήκαμε σε αυξημένο σωματικό βάρος-/-ζεβρόψαρο, ενώ εντοπίσαμε αυξημένο μήκος σώματος σε ctns-/-ζέβρα και των δύο φύλων σε σύγκριση με το άγριου τύπου (Σχήμα 1).

3. Συζήτηση

Τις τελευταίες δεκαετίες,κυστίνωσηέχει μετατραπεί από μια θανατηφόρα ασθένεια της παιδικής ηλικίας σε μια θεραπεύσιμη μεταβολική διαταραχή με την οποία οι ασθενείς μπορούν να επιβιώσουν μέχρι την ενηλικίωση και να φτάσουν σε προχωρημένη ηλικία [21,22]. Η μεγαλύτερη επιβίωση των ασθενών αποκάλυψε νέους φαινοτύπους της νόσου και έθεσε νέα ερωτήματα σχετικά με την παθογένεση και τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις των θεραπειών. Από αυτή την άποψη, η μελέτη μοντέλων κυστίνωσης σε ενήλικα ζώα γίνεται όλο και πιο σχετική.

Στην τρέχουσα μελέτη, διερευνήσαμε το νεφρικό και το εξωνεφρικό εκδηλώσεις κυστίνωσης σε μοντέλο ενηλίκων ζεβραϊκών 18 μηνών, που αντιστοιχεί στην ανθρώπινη ηλικία 40-50 ετών [23,24]. Αρχικά, επικυρώσαμε ότι το μοντέλο ctns-/- zebrash για ενήλικα παρουσιάζει τη συσσώρευση κυστίνης σε ολόκληρο το σώμα και διάφορα όργανα. Στονεφρό, σε ιστολογικό επίπεδο, παρατηρήσαμε σημάδια βλάβης PTEC που αντανακλώνται από την παρουσία πολυάριθμων ηωσινοφιλικών σταγονιδίων που μοιάζουν με υαλίνη, κυτταροπλασματικών κενοτοπίων και μερικής απώλειας των ορίων της βούρτσας. Επιπλέον, το ctns−/−αρσενικό ζέβρα ανέπτυξε σπειραματική υπερτροφία. Τέλος, δείξαμε ότι η έκφραση της διασπασμένης κασπάσης 3 αυξήθηκε στο νεφρικό PTEC του ctns-/-zebrafish, υποδεικνύοντας ότι η απόπτωση εμπλέκεται στην παθογένεση της νεφροπαθητικής κυστίνωσης στο zebrafish. Απόκυστίνωσηοι ασθενείς παρουσιάζουν και εξωνεφρικά εκδηλώσεις, διερευνήσαμε την επίδραση της μετάλλαξης ctns-/- σε άλλα όργανα στο μοντέλο μας zebrash. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι η μετάλλαξη ctns-/- προκάλεσε βλάβη στην ανατομία του δέρματος και επηρεάζει τη γονιμότητα, την κινητική δραστηριότητα και τα μάτια.

Τα λυσοσώματα είναι οι θέσεις της ενδοκυτταρικής πέψης και θεωρούνται οι ζωτικοί συντονιστές του κυτταρικού μεταβολισμού [25]. Όντας μια ασθένεια λυσοσωμικής αποθήκευσης, το βασικό χαρακτηριστικό τηςκυστίνωσηείναι η λυσοσωμική συσσώρευση κυστίνης [26,27]. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε 54-πλάσια αύξηση της κυστίνης σε ολόκληρο το σώμα του18-μήνας κυστίνωσης ζέβρα σε σύγκριση με άγριου τύπου, ενώ, στην προηγούμενη μελέτη μας [10], οι προνύμφες ζέβρα κυστίνωσης στις 6 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση παρουσίασαν 13-πλάσια αύξηση. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η κυστίνη συσσωρεύεται κατά τη διάρκεια της ζωής στο ζέβρα της κυστίνωσης. Η υγρή χρωματογραφία και η ανάλυση φασματομετρίας μάζας επιβεβαίωσαν ότι, μεταξύ όλων των οργάνων,νεφρόείναι η προτιμώμενη θέση για τη συσσώρευση κυστίνης. Λυσοσωμική διόγκωση και ηωσινόφιλα σταγονίδια που μοιάζουν με υαλίνη μέσα στα λυσοσώματα έχουν αναφερθεί σε PTEC φορτωμένο με κυστίνη [28,29] και, σε ανθρώπινες βιοψίες, οι κρύσταλλοι κυστίνης εμφανίζονται ως χώροι πολυμορφικού σχήματος εντός των διάμεσων μακροφάγων και του [PTEC] κυτταροπλάσματος. Στον ανθρώπινο ιστό, η συσσώρευση και η κρυστάλλωση κυστίνης είναι μια αθροιστική διαδικασία που συμβαίνει κατά τη διάρκεια της ζωής. Ενσωματωμένα, κρύσταλλοι κυστίνης δεν ανιχνεύθηκαν στο ctns−/−zebrafish στο στάδιο της προνύμφης [10] ενώ, στα πιλοτικά μας πειράματα, βρήκαμε ότι το πολύμορφο σχήμα των κρυστάλλων κυστίνης εμφανίζεται στην ηλικία των 3 και 6 μηνών και είναι καθαρά ορατό σε ηλικία 18-μηνών, υποδηλώνοντας προοδευτική επιδείνωση των επιπτώσεων της κυστίνωσης στηννεφρό.

Κάντε κλικ στοΕπιδράσεις Cistanche για νεφρική νόσο

Για να αξιολογήσουμε τις ιστολογικές αλλαγές των σπειραμάτων, μετρήσαμε τις επιφανειακές περιοχές της κάψουλας του Bowman, του σπειραματικού θυσάνου και του χώρου του ctns−/−zebrash του Bowman σε τομές βαμμένες με PAS. Βρήκαμε ότι το ctns-/-zebrafish ανέπτυξε σπειραματική υπερτροφία, υποδηλώνοντας υπερδιήθηση. Οι ήπιες σπειραματικές βλάβες που παρατηρούνται στα ένθετα-/-ζέβρα μπορεί να αποδοθούν στην αναγεννητική ικανότητα του ζέβρανεφρό, έχοντας τη δυνατότητα προσθήκης νέων νεφρώνων, καθώς και επισκευής υπαρχόντων νεφρώνων [30].

Εκτός από την ιστολογική βλάβη, η συσσώρευση κυστίνης έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί την πρωτεϊνκινάση που προκαλεί απόπτωση στο PTEC[12]. Έτσι, αξιολογήσαμε την έκφραση διασπασμένης κασπάσης-3 στο PTEC και βρήκαμε ότι το ctns−/−zebrash παρουσίασε αυξημένη κασπάση-3 και πυρηνικό κατακερματισμό. Η παρουσία διασπασμένης κασπάσης-3 βρέθηκε κυρίως σε κύτταρα που συσσώρευσαν τα κυτταροπλασματικά κενοτόπια, υποδηλώνοντας ότι η απόπτωση λαμβάνει χώρα στο τραυματισμένο PTEC. Ένας επιπλέον μηχανισμός που μπορεί να εξηγήσει την αυξημένη απόπτωση μπορεί να είναι η παρουσία ενεργών ειδών οξυγόνου λόγω της μειωμένης γλουταθειόνης που σχετίζεται με τη συσσώρευση κυστίνης [31]. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να αξιολογηθεί εάν αυτός ο μηχανισμός εμφανίζεται επίσης σε ctns−/−zebrash.

Παρόλονεφράείναι τα πρώτα και πιο σοβαρά προσβεβλημένα όργανα,κυστίνωσηείναι μια πολυσυστηματική ασθένεια στην οποία εμπλέκονται διάφορα όργανα, όπως το δέρμα, οι γονάδες, τα μάτια και οι μύες. Από τη βιβλιογραφία, είναι γνωστό ότι οι ασθενείς με κυστίνωση συχνά εμφανίζουν πρόωρη γήρανση του δέρματος, ξανθά μαλλιά και ανοιχτόχρωμο δέρμα [13]. Ο τελευταίος φαινότυπος οφείλεται στη συμμετοχή της κυστινομεταφοράς στη ρύθμιση της σύνθεσης μελανίνης[32] και στη διατήρηση της πιο σκούρας μελάγχρωσης μέσω του πρόσφατα ανακαλυφθέντος μεταφορέα κυστεΐνης MFSD12 [33]. Συναρπαστικά, το ενήλικο μοντέλο μας ctns−/−zebrash παρουσίασε ένα υπόχρωμο και κηλιδωμένο μοτίβο δέρματος και έδειξε μια εξασθενημένη κατανομή μελανίνης που δεν παρατηρήθηκε στο στάδιο της προνύμφης [10].

Επιπλέον,κυστίνωσηπροκαλεί υπογονιμότητα στους άνδρες, ενώ τα θηλυκά είναι γνωστό ότι είναι γόνιμα [14]. Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υπογονιμότητα μπορεί να οφείλεται σε προοδευτική εκφύλιση των όρχεων, που οδηγεί σε μεταβολή της ποιότητας του σπέρματος ή σε απόφραξη σε ένα απροσδιόριστο τμήμα του ανδρικού απεκκριτικού συστήματος. Οι αποφραχθείσες δομές μπορεί να επηρεάσουν την ποιότητα του σπέρματος, ειδικά στις περιοχές όπου οι πόροι έχουν πολύ μικρή διάμετρο, για παράδειγμα, ο ρετετέστις[16]. Το Inzebrash, το σπέρμα με το genicprocessis είναι πολύ παρόμοιο με τα θηλαστικά. Ωστόσο, μία από τις κύριες διαφορές είναι ότι η σπερματογένεση συμβαίνει στις κύστεις [34]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε αυξημένα σπερματοζωάρια στη σπερματογενή κύστη του ctns−/−zebrafish, ωστόσο, δεν βρήκαμε σημάδια εκφύλισης των όρχεων. Ως εκ τούτου, ο περιγραφόμενος φαινότυπος θα μπορούσε να υποδηλώνει μια απόφραξη στα επίπεδα των όρχεων που οδηγεί σε μικρότερη απελευθέρωση σπερματοζωαρίων στο περιβάλλον, ωστόσο απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση. Σε λειτουργικό επίπεδο, ο μειωμένος αριθμός ωαρίων και τα μειωμένα γονιμοποιημένα ωάρια φαίνεται να αντανακλούν μια έκπτωση στη γονιμότητα του ctns-/-zebrafish.

Μια άλλη κλινική εκδήλωση τουκυστίνωση, που γενικά επηρεάζει ασθενείς ξεκινώντας από τη δεύτερη δεκαετία της ζωής τους, είναι η μυοπάθεια, που χαρακτηρίζεται από μυϊκή απώλεια και αδυναμία [1]. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι τα ctns-/-ενήλικα ζέβρα παρουσίασαν μειωμένη κινητική δραστηριότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο, υποδηλώνοντας μειωμένη μυϊκή λειτουργία. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτός ο φαινότυπος δεν ήταν παρών στις προνύμφες [10], υποδηλώνοντας ότι επηρεάζει τα ctns−/−zebrafish κατά το τελευταίο στάδιο της νόσου. Παρόλα αυτά, δεν ανιχνεύθηκαν ορατές ιστολογικές διαφορές στους μύες. Η μειωμένη κινητική δραστηριότητα μπορεί να οφείλεται σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία η οποία δεν μπορούσε να ανιχνευθεί με συνήθεις ιστολογικές μελέτες [35-37]. Ως εκ τούτου, ένας ολοκληρωμένος χαρακτηρισμός των μιτοχονδρίων σε ζέβρα κυστίνωσης χρειάζεται περαιτέρω αξιολόγηση.

Εκτός από τους προαναφερθέντες φαινότυπους, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με κυστίνωση εμφανίζουν επίσης οφθαλμικά συμπτώματα όπως φωτοφοβία και βλεφαρόσπασμο [1], με τον κερατοειδή να είναι ένα από τα πιο επηρεασμένα μέρη του ματιού με αποτέλεσμα τη συσσώρευση κρυστάλλων κυστίνης και το αυξημένο πάχος [20]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τα αίτια του αυξημένου πάχους του κερατοειδούς. Για παράδειγμα, προτάθηκε ότι ο περιγραφόμενος φαινότυπος οφείλεται σε υποκλινική δυσλειτουργία των επιθηλιακών και/ή των ενδοθηλιακών κυττάρων που οδηγεί σε στρωματοοίδημα[20]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι το ctns−/−adultzebrashdisplayencreased είναι το πάχος της στρωματικής στιβάδας του κερατοειδούς, υποδεικνύοντας ότι το μοντέλο μας δείχνει σημάδια δυσλειτουργίας του κερατοειδούςκυστίνωση.

Cistanche γιανεφρόλειτουργία

Ένα από τα κύρια κενά που πρέπει να καλυφθούν για μια ολοκληρωμένη κατανόησηκυστίνωσηείναι η έλλειψη ενός ζωικού μοντέλου που να ανακεφαλαιώνει πλήρως την ανθρώπινη ασθένεια. Έχουν αναπτυχθεί αρκετά μοντέλα ποντικιών, που δείχνουν συσσώρευση κυστίνης αλλά δεν μπορούν να αναπαραγάγουν το πλήρεςνεφρώνφαινότυπος [8,26]. Συγκεκριμένα, το ποντίκι C57BL/6 παρουσίασε συσσώρευση κυστίνης σε πολλά όργανα, η οποία αυξάνεται με την ηλικία [8]. Επιπλέον, το μοντέλο ποντικιού C57BL/6 εμφανίζει εγγύς σωληναριακές βλάβες ξεκινώντας από την ηλικία των 6 μηνών. Ομοίως, στο μοντέλο μας, οι εγγύς σωληναριακές βλάβες επιδεινώνονται με την πάροδο του χρόνου. Ωστόσο, σε σπειραματικό επίπεδο, το μοντέλο ποντικού C57BL/6 παρουσίασε έναν φυσιολογικό φαινότυπο, ενώ το ενήλικο μοντέλο ζέβρα μας δείχνει σπειραματική υπερτροφία. Επιπλέον, το μοντέλο ποντικού C57BL/6 αποτυγχάνει να μιμηθεί τη μειωμένη γονιμότητα που παρατηρείται στους ανθρώπους, ενώ το μοντέλο ctns−/−zebrash παρουσιάζει σπερματογόνες κύστεις εμπλουτισμένες σε σπερματοζωάρια και μειωμένη παραγωγή ωαρίων. Σε οφθαλμικό επίπεδο, και τα δύο ποντίκια[38] και το μοντέλο των τέκνων-/−ζέβρα παρουσιάζουν φυσιολογικές οφθαλμικές παθήσεις. Αντίθετα, σε επίπεδο δέρματος, αυτό το μοντέλο ποντικιού δεν παρουσιάζει μειωμένη παραγωγή μελατονίνης [8], η οποία εμφανίζεται στο ενήλικο μοντέλο ζέβρα ως υπόχρωμο μοτίβο δέρματος. Τέλος, σε επίπεδο συμπεριφοράς, το μοντέλο μας ctns−/− zebrash παρουσιάζει μειωμένη κινητική δραστηριότητα, η οποία μπορεί να οφείλεται σε εξασθενημένη μιτοχονδριακή λειτουργία ή μπορεί να προκαλείται από μια δευτερεύουσα επίδραση του αυξημένου βάρους στοκυστίνωσηζέβρα. Συνολικά, φαίνεται ότι το μοντέλο μας ctns−/− zebrash ανακεφαλαιώνει καλύτερα την ανθρώπινη ασθένεια. Πρόσφατα, οι Shimizu et al. καθιέρωσε μια νέα συγγενή μετάλλαξη Ctnsugl σε ένα στέλεχος αρουραίου που παρουσιάστηκενεφρώνβλάβες και κρύσταλλοι κυστίνης στα λυσοσώματα τουνεφρόφλοιός [7]. Ωστόσο, ένας πιο λεπτομερής χαρακτηρισμός του μοντέλου εξακολουθεί να λείπει. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν και να χαρακτηριστούν νέα λειτουργικά μοντέλα που ανακεφαλαιώνουν την ανθρώπινη ασθένεια.

Συμπερασματικά, δείξαμε ότι το ενήλικο μοντέλο μας ctns−/− zebrash αναπαράγει αρκετούς ανθρώπινους φαινοτύπους σκάμματος κυστίνης μπορεί να είναι χρήσιμος για τη μελέτη της παθογένεσης της νόσου σε ενήλικες και για τον έλεγχο των μακροπρόθεσμων επιδράσεων νέων φαρμάκων για τη διόρθωση των νεφρών και των εξω-νεφρώνεκδηλώσεις.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Συντήρηση και Εκτροφή Zebrafish

Ο χειρισμός και η συντήρηση του Zebrafish έγινε σε συμμόρφωση με τους κανονισμούς για την καλή διαβίωση των ζώων του KU Leuven (Ηθική έγκριση αρ. 142/2019). Για αυτήν τη μελέτη, συμπεριλάβαμε το ctns−/−zebrafish σε ηλικία 18 μηνών και το zebrafish άγριου τύπου ελέγχου και στα δύο φύλα. Οι λεπτομέρειες της δημιουργίας του ctns−/−zebrash περιγράφηκαν στην προηγούμενη μελέτη μας [10].

4.2. Μέτρηση Κυστίνης

Τα επίπεδα κυστίνης μετρήθηκαν σε ζέβρα (άγριου τύπου αρσενικό ψάρι, n=3andctns−/−αρσενικό ψάρι, n=3) και η ποσότητα εκφράστηκε ως πρωτεΐνες nmol/mg. Αρχικά, τα ζέβρα θυσιάστηκαν με εμβάπτιση σε μεθανοσουλφονική τρικαΐνη MS-222 (300 mg/L), στη συνέχεια, δείγματα ιστών υποβλήθηκαν σε υπερήχους παρουσία 200 μL 5 mM Ν-αιθυλομαλεϊμιδίου (NEM, St. Louis, MO, ΗΠΑ, Sigma-Aldrich E3876) σε αλατούχο διάλυμα Dulbecco με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), για μέγιστο 200 mg ιστού για κάθε προϊόν λύσης. Στη συνέχεια, 100 μL σουλφοσαλικυλικού οξέος 12 τοις εκατό (SSA) προστέθηκαν σε κάθε ομογενοποίημα και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 12,000 g για 10 λεπτά, στους 4°C. Τα υπερκείμενα που περιείχαν κυστίνη αποθηκεύτηκαν στους -80◦C μέχρι τη στιγμή της ανάλυσης, ενώ τα σφαιρίδια διαλύθηκαν όλη τη νύχτα στους 4◦C σε 300 μL 0,1 M NaOH και διατηρήθηκαν στους -80◦C μέχρι να μετρηθεί η πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Στη συνέχεια, η ποσότητα (nmol) κυστίνης κανονικοποιήθηκε στην ποσότητα (mg) πρωτεΐνης από κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, 50 µl του υπερκείµενου που περιέχει κυστίνη στροβιλίστηκε µε 50 µL του διαλύµατος εσωτερικού προτύπου (Κυστίνη d6) και στροβιλίστηκε για 5 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια το μίγμα εκχυλίστηκε με 200 μL ακετονιτριλίου, στροβιλίστηκε για 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 16,000 g για 9 λεπτά. Η υγρή χρωματογραφία και η ανάλυση φασματομετρίας μάζας πραγματοποιήθηκαν με μια UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA) εξοπλισμένη με μια πηγή ESI-JET-STREAM που λειτουργεί σε λειτουργία θετικού ιόντος (ESI plus ). Το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο αυτού του εξοπλισμού και την ανάλυση δεδομένων ήταν το MassHunter (Work station Agilent Technologies, Βαρκελώνη, Ισπανία). Η στήλη διαχωρισμού που χρησιμοποιήθηκε ήταν το InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 μm 100×2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Αιματοξυλίνη και Ηωσίνη και Περιοδική Χρώση Οξέος-Shiff

Ζέβρα (θηλυκό ψάρι άγριου τύπου, n=3; αρσενικό ψάρι άγριου τύπου, n=3; ctns−/−θηλυκό ψάρι, n=3; ctns−/−αρσενικό ψάρι, n=3) θυσιάστηκαν με εμβάπτιση σε μεθανοσουλφονική τρικαΐνη MS-222 (300 mg/L), στη συνέχεια, ολόκληρο το ζέβρα σταθεροποιήθηκε σε 4 τοις εκατό ρυθμισμένη παραφορμαλδεΰδη (4 τοις εκατό PFA) στους 4 ◦C για 1 εβδομάδα . Αφού πλύθηκαν με PBS δύο φορές, το ζεμπρίκι μεταφέρθηκε σε διάλυμα EDTA (100 mM, pH=8) για την απασβέστωση για άλλη 1 εβδομάδα, ακολουθούμενη από ενσωμάτωση σε παραφίνη. Ο ενσωματωμένος σε παραφίνη ιστός ζέβρα είχε κοπεί (4-μm πάχους) σε λεικαμικρότομο (LeicaBiosystems, Wetzlar, Γερμανία). Οι τομές χρωματίστηκαν με H&E και PAS σύμφωνα με τα τυπικά πρωτόκολλα.

Ιστολογικές μελέτες των ματιών ζέβρα (άγριου τύπου θηλυκά, n=3andctns−/−θηλυκά ψάρια, n=3), τα μάτια εκπυρηνώθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό PFA σε θερμοκρασία δωματίου για 4 ώρες. Έγινε η ακόλουθη ενσωμάτωση σε μέσο βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (Tissue-Tek® VIP®· Sakura Finetek, Ιαπωνία), κρυοτομές 10-μm (Cryostar NX70, Thermosher Scientific, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι τομές χρωματίστηκαν με Η&Ε σύμφωνα με τα τυπικά πρωτόκολλα. Οι εικόνες έγιναν με μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου Leica (Leica DM6, Wetzlar, Γερμανία).

4.4. Ανοσοϊστοχημεία (Χρώση διασπασμένης κασπάσης-3)

Τα τμήματα με τον φρεσκοκομμένο ιστό ζέβρα αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν. Οι τομές υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου επαγόμενης από θερμότητα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό κιτρικού διαλύματος 10 mM (ρΗ=6). Μετά τον αποκλεισμό με 5 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) σε dPBS, οι τομές επωάστηκαν με κασπάση κατά της διάσπασης κουνελιού-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, ΗΠΑ, αραίωση 1:200) ακολουθούμενη από ένα αντι-κουνέλι -Envision, δευτερογενές αντίσωμα σημασμένο με HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Ως αρνητικός έλεγχος, χρησιμοποιήθηκε ένας κανονικός ορός κουνελιού. Ως χρωμογόνο χρησιμοποιήθηκε διαμινοβενζιδίνη (DAB, DAKO, Glostrup, Δανία). Στη συνέχεια, οι τομές αντιχρωματίστηκαν με H&E, αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν.

Θεραπεία νεφρικής νόσου: Cistanche

4.5. Toluidine Blue Staining και TEM

Ζέβρανεφρώνιστοί (αρσενικό ζέβρα άγριου τύπου, n=3 και ctns−/−αρσενικό ζέβρα, n=3) συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα στερέωσης ΗΜ (1,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη/1 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη) για 24 . Στη συνέχεια, οι νεφρικοί ιστοί μονιμοποιήθηκαν με 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη/1,2 τοις εκατό ακρολεΐνη σε ρυθμιστικό διάλυμα στερέωσης (0.1 mol/L κακοδυλικά, 0},1 mol/L σακχαρόζη, pH 7,4) και 1 επί τοις εκατό τετροξείδιο του οσμίου, και ενσωματώνεται σε ρητίνη. Ημίλεπτες τομές (0.5-μm πάχους) χρωματίστηκαν με μπλε τολουιδίνης. Οι εξαιρετικά λεπτές τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο. Οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEM-1200 EX (JEOL Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία) με διαφορετικές μεγεθύνσεις.

4.6. Ψηφιακή Ανάλυση Εικόνας

Οι χρωματισμένες διαφάνειες ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν Ultra-Fast Scanner 1.6 RA της Philips (Philips, Eindhoven, Ολλανδία)

4.6.1. Ανάλυση σπειραματικής υπερτροφίας

Για να αναλυθεί η σπειραματική υπερτροφία σε ζέβρα, οι επιφανειακές περιοχές (μm2) της κάψουλας του Bowman, ο χώρος του Bowman και η σπειραματική τούφα μετρήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες βαμμένες με PAS. Όλα τα διαθέσιμα σπειράματα ανά τομή συμπεριλήφθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Ο μέσος όρος των μετρήσεων από κάθε ζέβρα χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

4.6.2. Ανάλυση έκφρασης διασπασμένης κασπάσης-3

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 τοις εκατό θετική χρώση). Ο μέσος όρος της βαθμολογίας από κάθε ζέβρα χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

4.6.3. Ανάλυση πάχους κερατοειδούς στρώματος

Το πάχος του στρώματος του κερατοειδούς του ζέβρα (10×μεγέθυνση) μετρήθηκε στις ίδιες αποστάσεις από το κέντρο του ματιού χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ στο ζέβρα. Για κάθε εικόνα, n=7 μετρήσεις σε διαφορετικές θέσεις στο τμήμα του ματιού (κεντρικό, μέσο, ​​περιφέρεια) λήφθηκαν κατά μήκος του κερατοειδούς σε διαστήματα 100 μΜ. Ο μέσος όρος των μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση.

4.7. Μελέτη Γονιμότητας

Η γονιμότητα αξιολογήθηκε με ζευγάρωμα θηλυκού και αρσενικού ζέβρα (αρσενικό ψάρι άγριου τύπου, n=4 και θηλυκό ψάρι άγριου τύπου, n=6 και ctns−/−αρσενικό ψάρι, n=4 και ctns−/−θηλυκό ψάρι, n=6) σε έναν δίσκο αναπαραγωγής. Το επόμενο πρωί, μία ώρα μετά το φως, συλλέχθηκαν τα έμβρυα και καταγράφηκε ο συνολικός αριθμός των ωαρίων που παράγονται. Τα γονιμοποιημένα ωάρια υποβλήθηκαν σε διαλογή και μετρήθηκαν από τα μη γόνιμα χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός. Η αναπαραγωγή πραγματοποιήθηκε n=7 φορές μία φορά την εβδομάδα στη σειρά. Αποκλείστηκαν δύο πειράματα που είχαν ως αποτέλεσμα καμία παραγωγή αυγών ταυτόχρονα τόσο σε άγριου τύπου όσο και σε ctns−/−zebrash.

4.8. Κινητική Δραστηριότητα

Ζέβρα (θηλυκό ψάρι άγριου τύπου, n=6; αρσενικό ψάρι άγριου τύπου, n=6; ctns−/−θηλυκό ψάρι, n=6; ctns−/−αρσενικό ψάρι, n=6) τοποθετήθηκαν στις κανονικές κατοικίες και, μετά από χρόνο προσαρμογής 5 λεπτών, γυρίστηκαν για 5 λεπτά. Η εγγραφή βίντεο εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα GoPro® HERO 7 που τοποθετήθηκε στην κορυφή της δεξαμενής, προσφέροντας έτσι μια κορυφαία προβολή του ψαριού που κολυμπούσε. Η ανάλυση και ο ρυθμός καρέ ορίστηκαν αντίστοιχα σε 1080 p (1920×1080) και 30 fps. Τα βίντεο αναλύθηκαν με το Tracker.aitrackingthetrajectories μεμονωμένων ζυγών σε όλο το πείραμα. Οι τροχιές στη συνέχεια αναλύθηκαν με προσαρμοσμένο κώδικα python για να εξαχθεί η μέση ταχύτητα κίνησης (pixel/sec) σε κάθε ομάδα [39].

Cistanche-renal

4.9. Μετρήσεις σωματικού βάρους και μήκους

Το Zebrafish υποβλήθηκε σε ευθανασία με βύθιση σε 300 mg/Loftricainemethanesulfonate MS-222. Μετά την επαλήθευση της απουσίας ανταπόκρισης στα εξωτερικά ερεθίσματα, το ζέβρα που είχε υποστεί ευθανασία τοποθετήθηκε σε χαρτομάντηλο και στέγνωσε. Το μήκος του ζέβρα που είχε υποστεί ευθανασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο, μετρώντας από την άκρη του στόματος μέχρι τον ουραίο μίσχο. Το βάρος του ζέβρα που είχε υποστεί ευθανασία αξιολογήθηκε με αναλυτική ζυγαριά.

4.10. Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS (IBM, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Τα δεδομένα δύο ομάδων αναλύθηκαν σε μη ζευγαρωμένο t-test με διόρθωση του Welch, με δύο ουρές. Τα δεδομένα δύο κατηγορικών ανεξάρτητων μεταβλητών αναλύθηκαν με αμφίδρομη ANOVA με δοκιμή ελάχιστης σημαντικής διαφοράς Fisher (PLSD). Οι διαφορές με p < 0.05="" θεωρήθηκαν="" στατιστικά="">

4.11. Μελέτη Γονιμότητας

Για τη σύγκριση των ρυθμών παραγωγής αυγών μεταξύ άγριου τύπου και ctns−/−zebrafish, πραγματοποιήθηκε ανάλυση παλινδρόμησης Poisson χρησιμοποιώντας εξισώσεις γενικευμένης εκτίμησης με ισχυρά τυπικά σφάλματα για να ληφθεί υπόψη η συσχέτιση των ρυθμών με τα πειράματα. Για τη σύγκριση της προσφοράς πιθανοτήτων χρησιμοποιήθηκαν αυγά μεταξύ άγριου τύπου και ctns−/−zebrafishΑλογιστική ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας Εξισώσεις Γενικευμένης Εκτίμησης με ισχυρά τυπικά σφάλματα για να ληφθεί υπόψη η συσχέτιση των πιθανοτήτων στα πειράματα.

Συμπληρωματικό Υλικό: Τα ακόλουθα είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο στη διεύθυνση https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Συνεισφορές συγγραφέα: Conceptualization, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; μεθοδολογία, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; λογισμικό SPB, JH, LDG, HT, TN; επικύρωση, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB και EL. επίσημη ανάλυση, SPB, JH, LDG, HT, TN; έρευνα, LvdH, HJB, EL; πόρους, HJB και EL? επιμέλεια δεδομένων, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; γραφή—προετοιμασία πρωτότυπου σχεδίου SPB, JH; συγγραφή—κριτική και επεξεργασία, LvdH, HJB, EL; οπτικοποίηση, LvdH, HJB, EL; εποπτεία, PdW, LvdH, HJB, EL; διαχείριση έργου, LvdH, HJB, EL; εξαγορά χρηματοδότησης, HJB, EL Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση: Οι συντάκτες θα ήθελαν να αναγνωρίσουν το εσωτερικό κεφάλαιο από το KULeuvenC1GranttoE.L. (C14/17/113), Η επιχορήγηση του Συμβουλίου Υποτροφιών της Κίνας στον JH (CSC n◦ 201508500109) και η μεταδιδακτορική υποτροφία FWO στην LDG (12I3820N).

Δήλωση Επιτροπής Θεσμικής Αναθεώρησης: Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες της Διακήρυξης του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του KU Leuven με αρ.142/2019. Ευχαριστίες: Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τους: Didier Cagnini για την αξιολόγηση της ιστολογίας του εγκεφάλου τόσο σε ctns−/−και wild-typezebrafish, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickxandKimvanKelst για τη συνεχή υποστήριξή τους και τη βοήθειά τους στην τεχνική υποστήριξη του KU fake Leuven a Neuven a. του TEM, και ο Ron Wolterbeek για στατιστική ανάλυση.

Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν μη σύγκρουση συμφερόντων. Ο χρηματοδότης του σχεδίου της μελέτης. στη συλλογή, αναλύσεις ή ερμηνεία δεδομένων· στη συγγραφή του χειρογράφου ή στην απόφαση δημοσίευσης των αποτελεσμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, Μ.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: A review. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, Ε.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, Α.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, Β.; et al. Η επταελική πρωτεΐνη PQLC2 είναι ένας λυσοσωμικός εξαγωγέας κατιονικών αμινοξέων που βασίζεται στη δράση της κυστεαμίνης σεκυστίνωσηθεραπεία. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Βελτίωση της πρόγνωσης της νεφροπαθητικής κυστίνωσης. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, Ρ.; Antignac, C.; Επισκέπτης, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, Μ.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, Ρ.; et al. Η θεραπεία με κυστεαμίνη καθυστερεί την εξέλιξη της νεφροπαθητικής κυστίνωσης σε όψιμους εφήβους και ενήλικες. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Θεραπεία με κυστεαμίνη: Μια θεραπεία για την κυστίνωση, όχι μια θεραπεία. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, Ν.; van den Heuvel, Β.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E.MolecularBasisofCystinosis: GeographicDistribution,Functional Consequencesof Mutationsinthe CTNSGene, and Potential for Repair. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Υ.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, Κ.; Hamase, Κ.; Shimizu, Τ.; Okamura, T. Μια διαγραφή στο γονίδιο Ctns προκαλεί νεφρική σωληναριακή δυσλειτουργία και συσσώρευση κυστίνης σε αρουραίους LEA/Tohm. Μαμ. Genome 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, Ν.; Chol, Μ.; Bailleux, Α.; Καλατζής, Β.; Morisset, L.; Devuyst, Ο.; Gubler, MC; Antignac, C. Renal phenotype of theκυστίνωσηΤο μοντέλο του ποντικιού εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο. Nephrol. Καντράν. Transplant 2010, 25, 1059-1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, ΜΑ; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, Μ.; Levtchenko, EN ΓενετικήΝεφρώνΑσθένειες: Ο αναδυόμενος ρόλος των μοντέλων Zebrafish. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, Α.; Tylzanowski, Ρ.; Ny, Α.; Lowe, Μ.; etal. Κυστίνωση(ctns)μεταλλαγμένα ζέβρα εμφανίζουν προνεφρική σπειραματική και σωληναριακή δυσλειτουργία. Sci. Απ. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco,MA;Najaan,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAtlasofNenalPathology:Κυστίνωση. Είμαι. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Αυξημένη απόπτωση σε κυστινοτικούς ινοβλάστες καινεφρώνΤα εγγύς επιθηλιακά κύτταρα του σωληναρίου είναι αποτέλεσμα κυστεϊνυλίωσης της πρωτεϊνικής κινάσης C δέλτα. Μαρμελάδα. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, Μ.; Janssen, Μ.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, Κ.; Reda, Α.; Quatresooz, Ρ.; van den Heuvel, Β.; et al. Ενισχυμένη ενδογενής γήρανση του δέρματος στη νεφροπαθητική κυστίνωση που αξιολογήθηκε με τομογραφία οπτικής συνοχής υψηλής ευκρίνειας. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Κατάσταση γονιμότητας σε άρρενες ασθενείς με κυστίνωση που έλαβαν θεραπεία με κυστεαμίνη. Γόνιμη. Αποστειρωμένο. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, Α.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, Ε.; van den Heuvel, LP; Wetzels, Α.; Levtchenko, EN Πρώτη επιτυχής σύλληψη που προκλήθηκε από έναν άνδρα ασθενή κυστίνωσης. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Ορχική λειτουργία σε άνδρες με βρεφική νεφροπαθητική κυστίνωση. Βουητό. Αναπαραγωγή. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, Η.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, Ε.; Lipkin, G. Εγκυμοσύνη σε γυναίκες με κυστίνωση. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Τσίλου, Ε.; Rubin, Β.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Ιδιοπαθής ενδοκρανιακή υπέρταση στην κυστίνωση. J. Pediatr. 2004, 145, 673-678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, Ρ.; Christopher, Κ.; Chauhan, Α. Πιθανός ρόλος του στρωματικού κολλαγόνου στην κρυστάλλωση κυστίνης σε ασθενείς με κυστίνωση. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, Β.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Πάχος κερατοειδούς στη νεφροπαθητική κυστίνωση. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665-668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Κυστίνωση: Η εξέλιξη μιας θεραπεύσιμης νόσου. Παιδιατρ. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Επιδράσεις της μακροχρόνιας θεραπείας με κυστεαμίνη σε ασθενείς μεκυστίνωση. Παιδιατρ. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrash (Danio rerio) ως μοντέλο για τη μελέτη της γήρανσης και της άσκησης: Η σωματική ικανότητα και η ικανότητα εκπαίδευσης μειώνονται με την ηλικία. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, Ε.; Cheng, KC Η διάρκεια ζωής και οι γηραστικοί φαινότυποι σε δύο στελέχη Zebrafish (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, Ρ.; Klumperman, J. Βιογένεση λυσοσωμάτων και πρωτεΐνες λυσοσωμικής μεμβράνης: Η εμπορία συναντά τη λειτουργία. Nat. Rev. ΜοΙ. Cell Biol. 2009, 10, 623-635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Καλατζής, Β.; Sich, Μ.; Pequignot, MO; Gogat, Κ.; Abitbol, ​​Μ.; Broyer, Μ.; Gubler, MC; et al. Ενδολυσοσωμική συσσώρευση κυστίνης σε ποντίκια που δεν έχουν κυστίνωση, την πρωτεΐνη ελαττωματική στην κυστίνωση. ΜοΙ. Κύτταρο. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, Α.; Nevo, Ν.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Η αποδιαφοροποίηση και οι εκτροπές του ενδολυσοσωμικού διαμερίσματος χαρακτηρίζουν το πρώιμο στάδιο της νεφροπαθητικής κυστίνωσης. Βουητό. ΜοΙ. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Μερικά βοηθήματα στην ιστολογική αναγνώριση της νεφροπάθειας υαλινοσταγονιδίων σε μελέτες τοξικότητας ενενήντα ημερών. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, Α.; Timmons, C.; Baum, M. Ενδοκυτταρική κατανομή κυστίνης σε εγγύς σωληνάρια φορτωμένα με κυστίνη. Παιδιατρ. Res. 1994, 35, 447-450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Χρήση zebrafish για τη μελέτη της γένεσης των ποδοκυττάρων κατά την ανάπτυξη και την αναγέννηση των νεφρών. Γένεση. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, Β.; Newsholme, Ρ.; McMorrow, Τ. Η συσσώρευση λυσοσωμικής κυστίνης προάγει τη μιτοχονδριακή εκπόλωση και την επαγωγή γονιδίων ευαίσθητων στην οξειδοαναγωγή σε εγγύς σωληναριακά κύτταρα ανθρώπινου νεφρού. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, Ε.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, Κ.; Φώντας, Ε.; Berard, Ε.; Cailliez, Μ.; Chat, P.; et al. Η κυστινοσίνη είναι μια μελανοσωμική πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη σύνθεση μελανίνης. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12 μεσολαβεί στην εισαγωγή κυστεΐνης σε μελανοσώματα και λυσοσώματα. Nature 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Ιστολογική και στερεολογική αξιολόγηση της σπερματογένεσης ζέβρα (Danio rerio) με έμφαση στις σπερματογονικές γενιές. Biol. Αναπαραγωγή. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, Ρ.; Sarwal, MM Μη φυσιολογική μιτοχονδριακή αυτοφαγία σε νεφροπαθήκυστίνωση. Autophagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, Α.; Tamma, G.; Ranieri, Μ.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Impact of atypical mitochondrial cyclic-AMP level in nephropathic cystinosis. Κύτταρο. ΜοΙ. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, Α.; De Leo, Ε.; Polishchuk, EV; Ferretti, Α.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitochondrialDynamics ofProximal Tubulular Epithelial CellssinNephropathicCystinosis. Int. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Καλατζής, Β.; Serratrice, Ν.; Hippert, C.; Payet, Ο.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, Τ.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. Οι οφθαλμικές ανωμαλίες σε ένα ζωικό μοντέλο κυστίνωσης μιμούνται την παθογένεση της νόσου. Παιδιατρ. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Παρακολούθηση όλων των ατόμων σε μικρές ή μεγάλες ομάδες ζώων χωρίς σήμα. Nat. Methods 2019, 16, 179–182. [CrossRef]