Επίδραση της ενδοφλέβιας γλουταμίνης στην έκφραση της κασπάσης-12 στην απόπτωση των σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων αρσενικών αρουραίων που εκτέθηκαν σε σισπλατίνη

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tamara Aulia Fakhrinnisal, Imam Susilo, Arifa Mustika, Miyayu Soneta Sofyan

Εισαγωγή

Ο επιπολασμός των μεταβολικών ασθενειών στην Ινδονησία, ιδιαίτερα της νεφρικής νόσου, παρουσιάζει υψηλή τάση. Με βάση τα στοιχεία του 2017 από τον Οργανισμό Διαχείρισης Ασφάλισης Υγείας (BPJS), το κράτος κάλυψε τις 3.657.691 καταγεγραμμένες περιπτώσεις αιμοκάθαρσης χρόνιας νεφρικής νόσου με συνολικό κόστος κάλυψης 3,1 τρισεκατομμυρίων IDR. Μία από τις αιτιολογίες της νεφρικής ανεπάρκειας είναι η μόνιμη βλάβη των νεφρώνων από τις τοξίνες.

Η σισπλατίνη είναι ένα ισχυρό φάρμακο χημειοθεραπείας που χρησιμοποιείται ευρέως για θεραπεία ευρέος φάσματος για κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων της κεφαλής και του τραχήλου, του οισοφάγου, της ουροδόχου κύστης, των όρχεων, των ωοθηκών, του μαστού και των μη μικροκυτταρικών καρκίνων του πνεύμονα (Fillipski et al., 2008; Reck , et al., 2010). Ωστόσο, η κλινική εφαρμογή της σισπλατίνης είναι περιορισμένη λόγω των επιδράσεων υψηλής τοξικότητας στα όργανα, όπως νεφροτοξικές, νευροτοξικές, ωτοτοξικές και ηπατοτοξικές επιδράσεις (Karasawa, and Steyger, 2015; Guo et al., 2018). Η σισπλατίνη προκαλεί απόπτωση σε χαμηλότερες δόσεις (10-100uM) και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε υψηλότερες δόσεις (200-800 μM) Skinner et al.1998). Επιπλέον, οξεία νεφρική βλάβη εμφανίζεται στο 20-30 τοις εκατό όλων των ασθενών που χορηγούνται (Miller et al., 2010). Η νεφρική δυσλειτουργία αρχίζει συνήθως λίγες ημέρες μετά την τυπική δόση σισπλατίνης (50-120 mg/m²) χορήγηση και εκφράζεται από τα αυξανόμενα επίπεδα κρεατινίνης ορού και αζώτου ουρίας αίματος (Akcay et al.2010), η θεραπεία με σισπλατίνη προκαλεί μια μαζική σωληναριακή διαστολή και σχηματισμός χύτευσης σε αρκετούς αυλούς σωληναρίων. Περιστασιακά παρατηρούνται επίσης εστιακή σωληναριακή νέκρωση, πάχυνση της βασικής μεμβράνης των νεφρικών σωληναρίων και της κάψας Bowman και εστιακή διήθηση μονοπύρηνων κυττάρων. Παρουσιάζεται επίσης νεφρική σωληναριακή βλάβη, μαζί με κενοτοπίωση και απολέπιση των επιθηλιακών κυττάρων. Μερικά σπειράματα εμφανίζουν νέκρωση και τα φυσιολογικά υπολειμματικά σπειράματα συχνά εμφανίζουν διευρυμένους περισπειραματικούς χώρους.

Η ακτεοσίδη στο cistanche έχει καλές επιδράσεις στα νεφρά

Ένας από τους νεφροτοξικούς μηχανισμούς της σισπλατίνης είναι η απόπτωση, η οποία είναι μια προγραμματισμένη οδός κυτταρικού θανάτου που ενεργοποιείται από τη σισπλατίνη μέσω ορισμένων μηχανισμών. Η σισπλατίνη μειώνει την έκφραση του Bcl-2 στη μιτοχονδριακή οδό, η οποία υποτίθεται ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των προ-αποπτωτικών μορίων (Oltvai και Korsmeyer, 1994). Στα μονοπάτια των υποδοχέων θανάτου, η σισπλατίνη ενεργοποιεί τις εξαρτώμενες από το Fas μονοπάτια και την απόπτωση, είτε in vivo (Noga et al., 1998) είτε in vitro (Feldenberg et al., 1999). Η σισπλατίνη ενεργοποιεί επίσης τις οδούς κασπάσης. Ο ρόλος της κασπάσης-3 συναντάται για πρώτη φορά στα καλλιεργημένα σωληναριακά εγγύς κύτταρα, τα οποία ανταποκρίνονται στη σισπλατίνη αυξάνοντας τη δραστηριότητα της κασπάσης-3 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Fukuoka et al, 1998; Lau, 1999) . Οι ακόλουθες μελέτες αποκάλυψαν ενεργοποίηση κασπάσης-9 και, σε μικρότερο βαθμό, ενεργοποίηση κασπάσης-8 (Kaushal et al.2001:Park et al., 2001).

ΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνη(Gln ή Q) είναι ένα -αμινοξύ που χρησιμοποιείται στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών. Είναι ένα από τα συστατικά για την παραγωγή γλουταθειόνης, η οποία είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό. Μία μόνο δόση τουενδοφλέβια γλουταμίνη(0.15-0.75 g/kg) μπορεί να αυξήσει την έκφραση της HSP, να μειώσει τον τραυματισμό των τελικών οργάνων και να βελτιώσει το ποσοστό επιβίωσης από σηπτικό σοκ σε ποντίκια (Wischmeyer, 2002).ΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνηαύξησε επίσης την αγγειακή αντιδραστικότητα επάγοντας έκφραση HSP και αναστέλλοντας την απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτοκινών και βιοσύνθεσης υπεροξειδίου σε ποντικούς σοκ LPS (Jiang et al..2017).ΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνημπορεί επίσης να μειώσει την απόπτωση αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες, όπως παρατηρείται από τα αποτελέσματα των δοκιμών σε ποντίκια με κολίτιδα που προκαλείται από ένα α2,4,{2}}τρινιτροβενζολοσουλφονικό οξύ (Crespoet al.2012)

Τα επίπεδα της κασπάσης-12 στο σπειραματικό επιθήλιο δεν έχουν μελετηθεί, παρόλο που ο χρόνος έκθεσης στην τοξίνη που λαμβάνεται στο σπείραμα είναι υψηλός και τα επιθηλιακά κύτταρα εκτίθενται πρώτα και μετά τα σωληνάρια. Μια μελέτη έδειξε ότι οι κάψουλες του Bowman έχουν ρόλο στη φυσιολογική λειτουργία του φυσιολογικού σπειράματος. Ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων διεγείρει την ενεργοποίηση των βρεγματικών κυττάρων της κάψουλας του Bowman, τα οποία εκτείνονται στη σπειραματική δέσμη, με αποτέλεσμα την τμηματική και ολική σκλήρυνση παράγοντας περισσότερες μήτρες και καταστρέφοντας τον αυλό του τριχοειδούς σπειράματος (Al Hussain et al., 2017).

Αυτή η μελέτη στοχεύει να αναλύσει τη νεφροπροστατευτική δράση τουενδοφλέβια γλουταμίνηστα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα απόπτωση εξετάζοντας την έκφραση της κασπάσης-12, η οποία είναι ο εκκινητής της απόπτωσης στην οδό στρες του ενδοπλασματικού δικτύου. Η προκασπάση-12 βρίσκεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ιδιαίτερα στα εγγύς σωληνάρια του νεφρού. οενδοφλέβια γλουταμίνηαναμένεται να είναι μια εναλλακτική λύση για τη νεφρική ανεπάρκεια που προκαλείται από τους τρόπους χημειοθεραπείας με σισπλατίνη.

Υλικά και Μέθοδοι Ζώα και Θεραπεία

Αυτή η έρευνα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Έρευνας Υγείας της Ιατρικής Σχολής Universitas Airlangga (No.25/C/KEPKFKUA/2020). Σε αυτήν την έρευνα, 30 αρσενικοί λευκοί αρουραίοι (Rattus norvegicus), ηλικίας 2-3 μηνών με σωματικό βάρος 150-200 γραμμαρίων ελήφθησαν από τη μονάδα πειραματόζωων της Κτηνιατρικής Σχολής, Universitas Airlangga. Κάθε ένα από αυτά κρατήθηκε χωριστά σε ένα αναπλαστικό κουτί, επενδεδυμένο με φλοιούς στο κάτω μέρος και στη συνέχεια καλυμμένο με υφαντά σύρματα από πάνω. Οι φλοιοί αντικαταστάθηκαν κάθε μέρα.

Χημικά

οΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνηελήφθη από τη Serva (Γερμανία). οΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνηΤο διάλυμα παρασκευάστηκε σε {{0}},9 τοις εκατό NaCl, με μια δόση lg γλουταμίνης σε 10 mL 0,9 τοις εκατό NaCl. Η δόση γλουταμίνης εγχέεται 100 mg/kg σωματικού βάρους (BW) και μια εφάπαξ ένεση γίνεται το πολύ 0,2 mL IV. οΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνηεγχύθηκε ενδοφλεβίως στην ουρά του αρουραίου χρησιμοποιώντας μια σύριγγα μετρητή 1 mL 27-.

Το υλικό σισπλατίνης ελήφθη από την Kalbe Farma (Ινδονησία), με δόση 20 mg/kg ΣΒ, χορηγούμενη μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης χρησιμοποιώντας μια σύριγγα μετρητή I mL 27-. Χρησιμοποιήσαμε επίσης πρωτογενή αντισώματα κασπάση-12 (Πολυκλωνικό αντίσωμα PA5-27094 Thermo Scientific) και κιτ ανίχνευσης απόπτωσης in Situ CellPOD(11684817910ROCHE).

Πειραματικό σχέδιο

Σε αυτή την έρευνα, 30 αρσενικοί λευκοί αρουραίοι Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες στην αρχή της μελέτης. Η ομάδα ελέγχου (ΡΟ) θυσιάστηκε με εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας μετά από αναισθησία με αιθέρα και στη συνέχεια ελήφθησαν τα νεφρά για ανοσοϊστοχημεία.

Την ημέρα 7, η ομάδα Ρ1 χορηγήθηκε με σισπλατίνη σε μία εφάπαξ δόση 20 mg/kg ΣΒ μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης και στη συνέχεια παρατηρήθηκε για 72 ώρες. Οι αρουραίοι θυσιάστηκαν τη 10η ημέρα με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας μετά από αναισθησία με αιθέρα, και στη συνέχεια οι νεφροί ελήφθησαν για ανοσοϊστοχημεία. Ο χρόνος εκτέλεσης οφείλεται στα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα που έλαβε χώρα απόπτωση μετά την ένεση σισπλατίνης την ημέρα 10 (Tsuruya et al..2003). Η ομάδα Ρ2 χορηγήθηκε μεΕνδοφλεβίωςΓλουταμίνησε δόση 100 mg/kg ΣΒ μία φορά την ημέρα μέσω ενδοφλέβιας ένεσης από την ημέρα 1 έως την ημέρα 7 (Zhang et al.2009). Την 7η ημέρα, στους αρουραίους χορηγήθηκε σισπλατίνη σε μία δόση 20 mg/kg ΣΒ μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης. Στη συνέχεια, οι αρουραίοι παρατηρήθηκαν για 72 ώρες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν τη 10η ημέρα μέσω εξάρθρωσης του τραχήλου της μήτρας μετά από αναισθησία με αιθέρα. Αργότερα ελήφθησαν και τα νεφρά για την ανοσοϊστοχημεία.

Ιστοπαθολογική Παρασκευή

Ο ιστός του νεφρού σταθεροποιήθηκε σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό για 15-24 ώρα. Η αφυδάτωση πραγματοποιήθηκε για 60 λεπτά χρησιμοποιώντας τη σειρά αλκοόλης (30 τοις εκατό , 50 τοις εκατό , 70 τοις εκατό , 80 τοις εκατό , 96 τοις εκατό και απόλυτη συγκέντρωση) για να αποφευχθούν τυχόν αλλαγές στη μορφολογία των ιστών. Στη συνέχεια, ο καθαρισμός με χρήση ξυλόλης πραγματοποιήθηκε δύο φορές (60 λεπτά το καθένα). Στη συνέχεια, η διήθηση με τρυφερή παραφίνη πραγματοποιήθηκε για 60 λεπτά στους 48 βαθμούς. Αργότερα, η σκληρή παραφίνη μπλοκαρίστηκε στο καλούπι και αποθηκεύτηκε για 1 ημέρα. Την επόμενη μέρα, το σκληρυμένο τοποθετήθηκε στη βάση και κόπηκε σε τμήματα πάχους 4-5-με χρήση περιστροφικού μικροτόμου. Μετά από αυτό, η τοποθέτηση σε γυαλί αντικειμένου πραγματοποιήθηκε με την επίστρωση πολυ-L-λυσίνης. Ο τοποθετημένος ιστός βυθίστηκε σε ξυλόλη δύο φορές (5 λεπτά το καθένα). Μετά από αυτό, η επανυδάτωση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη σειρά αλκοόλης (απόλυτη, 96 τοις εκατό , 80 τοις εκατό , 70 τοις εκατό , 50 τοις εκατό , και 30 τοις εκατό συγκέντρωση ) για 5 λεπτά, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, ξεπλύθηκε σε dH, O για 5 λεπτά.

Ανοσοϊστοχημική δοκιμασία CSP12

Οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν μία φορά με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) (Millipore 524650) σε ρΗ 7,4 για 5 λεπτά τρεις φορές. Ο ενδογενής αποκλεισμός υπεροξειδίου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 3 τοις εκατό H2O2 για 20 λεπτά. Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν ξανά με την ίδια διαδικασία πριν από την επεξεργασία αποκλεισμού. Ο μη ειδικός αποκλεισμός πρωτεΐνης έγινε χρησιμοποιώντας 5 τοις εκατό PBS (Millipore 524650) που περιέχει 0,25 τοις εκατό TritonX-100 (Sigma-Aldrich T8787) και στη συνέχεια επαναλάβετε τη διαδικασία πλύσης. Η επώαση των πρωτογενών αντισωμάτων κασπάσης-12(Polyclonal Antibody PA5-27094 Thermo Scientific) έγινε κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 40 βαθμούς. Μετά από αυτό, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν χρησιμοποιώντας PBS (Millipore 524650), ρΗ 7,4, τρεις φορές για 5 λεπτά η καθεμία. Η επώαση χρησιμοποιώντας συζευγμένη με βιοτίνη αντι-ποντικού έγινε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια η διαδικασία πλύσης επαναλήφθηκε. Η επώαση χρησιμοποιώντας στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση ραπανάκι (Thermo Fisher Scientific NI00) έγινε για 40 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκε άλλη μια φορά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια προστέθηκαν με σταγόνες με διάμ σε βενζιδίνη (DAB) (Thermo Fisher Scientific 3400) και επωάστηκαν για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν με παρόμοια διαδικασία. Η αντιχρώση έγινε με χρήση διαλύματος αιματοξυλίνης Mayer (Sigma-Aldrich MHS32) για 10 λεπτά, στη συνέχεια πλύθηκε με νερό βρύσης, ξεπλύθηκε με dH2O και στέγνωσε στον αέρα. Οι παρασκευασμένες πλάκες παρατηρήθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου φωτός σε μεγέθυνση 400× αφού τοποθετήθηκαν και καλύφθηκαν με γυάλινο κάλυμμα. Η θετική μοριακή έκφραση με πρωτογενή αντισώματα θα εμφανιζόταν καφέ όταν παρατηρηθεί. Τα υπολογιζόμενα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα εντοπίστηκαν στην περιοχή του νεφρικού σωματιδίου που χαρακτηρίζεται από ένα επίπεδο στρώμα επιθηλιακών κυττάρων στο βρεγματικό τμήμα του χώρου του Bowman.

Εξέταση απόπτωσης

Η αποπαραφίνη ιστού πραγματοποιήθηκε με πλύσιμο του ιστού τρεις φορές με ξυλόλιο (Supelco 108297) για 5 λεπτά. Ο ιστός εμποτίστηκε δύο φορές σε απόλυτη αιθανόλη για 5 λεπτά το καθένα και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε 95 τοις εκατό αιθανόλη και 70 τοις εκατό αιθανόλη για 3 λεπτά το καθένα. Ο ιστός πλύθηκε με PBS (Millipore 524650) για 5 λεπτά.

Η πρόσληψη αντιγόνου έγινε δίνοντας πρωτεϊνάση Κ (Sigma-Aldrich 70663) για 15 λεπτά στο δείγμα. Στη συνέχεια, ο ιστός πλύθηκε δύο φορές με ΗΟ σε σωλήνα Coplin για 2 λεπτά. Η ενδογενής υπεροξειδάση απομακρύνθηκε με στάγδην 3 τοις εκατό Η, Ο, PBS και αφέθηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, ο ιστός πλύθηκε δύο φορές με PBS (Millipore 524650) για 2 λεπτά το καθένα σε ένα σωλήνα Coplin. Η περίσσεια υγρού ξηράνθηκε χρησιμοποιώντας χαρτί. Περίπου 75 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος εξισορρόπησης έπεσαν στον ιστό και στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υγρό γύρω από τον ιστό στη συνέχεια στέγνωσε χρησιμοποιώντας χαρτί. Η ενζυμική δραστηριότητα μειώθηκε κατά 55 μΐ/5 cm στον ιστό του TdT (Sigma-Aldrich SAB5600268). και στη συνέχεια ο ιστός επωάστηκε στους 37 βαθμούς σε ένα υγρό δοχείο για 1 ώρα. Τα παρασκευάσματα τοποθετήθηκαν σε βάζο Coplin που περιείχε ισχυρό ρυθμιστικό διάλυμα/καθαριστικό και στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα παρασκευάσματα πλύθηκαν τέσσερις φορές με PBS (Millipore 524650) για 2 λεπτά σε βάζο Coplin σε θερμοκρασία δωματίου. Η περίσσεια υγρού γύρω από τον ιστό στέγνωσε με χρήση χαρτιού. Το σύζευγμα αντιδιγοξιγενίνης (Roche 11333089001), το οποίο είχε προηγουμένως αφαιρεθεί από την αποθήκευση και θερμάνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου, έπεσε σε επιφάνεια ιστού 65 ul/5 cm2 και στη συνέχεια επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το παρασκεύασμα πλύθηκε τέσσερις φορές με PBS (Millipore 524650) σε βάζο Coplin για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, η περίσσεια υγρού γύρω από τον ιστό στέγνωσε με χαρτί. Το χρώμα εκτέθηκε μετά από υπόστρωμα υπεροξειδάσης (Sigma-Aldrich CPS160) σταγόνες 75 ul/5 cm2 στην επιφάνεια του ιστού και αφέθηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα παρασκευάσματα πλύθηκαν τρεις φορές με DH, O για 1 λεπτό σε βάζα Coplin και στη συνέχεια επωάστηκαν με βάζα DH, Oin Coplin για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου Η αντιχρώση πράσινου μεθυλίου (Sigma-Aldrich M8884) πραγματοποιήθηκε για τη δεκαετία του '30 σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το παρασκεύασμα πλύθηκε τρεις φορές με dH.O για 1 λεπτό σε Coplin ar Τα παρασκευάσματα καθαρίστηκαν με ξυλόλιο (Supelco 108297) και η περίσσεια υγρού γύρω από τον ιστό στέγνωσε με χαρτί. σε κάθε οπτικό πεδίο.

Στατιστική ανάλυση

Η αναλογία ήταν η κλίμακα δεδομένων που χρησιμοποιήθηκε για κύτταρα που εκφράζουν κασπάση-12 και αποπτωτικά κύτταρα, επομένως ήταν απαραίτητο να διεξαχθεί μια δοκιμή κανονικότητας χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Shapiro-Wilk (=0.05) και τη δοκιμή ομοιογένειας χρησιμοποιώντας το προζύμι δοκιμή ( =0.05). Εάν τα αποτελέσματα ήταν στην κανονική κατανομή και ήταν ομοιογενή, τότε διεξήχθη μια διαφορετική δοκιμή χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA (= 0.05). Εάν τα αποτελέσματα ήταν φυσιολογικά αλλά ετερογενή, τότε η δοκιμή που διεξήχθη ήταν Kruskal-Wallis( =0.05). Εάν υπήρχε διαφορά στα δεδομένα που ελήφθησαν. στη συνέχεια την ανάλυση ακολούθησε η δοκιμή Mann-Whitney U (=0.05). Τελικά, διεξήχθη η δοκιμή συσχέτισης του Pearson για να διαπιστωθεί η συσχέτιση μεταξύ κυττάρων που εκφράζουν κασπάση-12 και αποπτωτικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

Μορφολογία Σπειραματικών Επιθηλιακών Κυττάρων

Πριν από την παρατήρηση των κυττάρων που εκφράζουν την κασπάση-12 και των αποπτωτικών κυττάρων, η μορφολογία του νεφρικού επιθηλίου της κάψουλας Bowman παρατηρήθηκε για πρώτη φορά με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (ΗΕ) σε μεγέθυνση 400×. Το αντικείμενο που παρατηρήθηκε επιλέχθηκε τυχαία για να αναπαραστήσει την ιστολογική εικόνα κάθε ομάδας. Η σισπλατίνη βρέθηκε περιστασιακά σε εστιακή σωληναριακή νέκρωση, στην πάχυνση της βασικής μεμβράνης στα νεφρικά σωληνάρια και στις κάψουλες του Bowman και στη διείσδυση εστιακών μονοπύρηνων κυττάρων στο σπείραμα. Μερικά σπειράματα εμφανίζουν νέκρωση και τα φυσιολογικά υπολειμματικά σπειράματα συχνά παρουσιάζουν διευρυμένους περισπειραματικούς χώρους.

Έκφραση πρωτεΐνης κασπάσης-12 και αποπτωτικά κύτταρα στα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα

Τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής χρώσης νεφρού ιστού εμφάνισαν αλλαγές στην έκφραση της κασπάσης-12 σε κάθε ομάδα. Η χορήγηση ένεσης σισπλατίνης στην ομάδα P1 έδειξε υψηλότερη μέση έκφραση της κασπάσης-12 μετά από 72 ώρες (4,1±0.86) ​​σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Ρ{{9} }). Η χορήγηση ένεσης γλουταμίνης και ένεσης σισπλατίνης (Ρ2) εμφάνισε χαμηλότερη μέση έκφραση της κασπάσης-12 μετά από 72 ώρες (2,54± 0}.72) σε σύγκριση με την Ρ1 (Πίνακας 1).

Επιπλέον, η ένεση σισπλατίνης στην ομάδα PI εμφάνισε υψηλότερο ρυθμό απόπτωσης κυττάρων μετά από 72 ώρες (52,7±17.06) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Ρ0). Η χορήγηση ένεσης γλουταμίνης και ένεσης σισπλατίνης στο Ρ2 εμφάνισε χαμηλότερη μέση έκφραση της κασπάσης-12 μετά από 72 ώρες (31,5±6,73) σε σύγκριση με το PI (Πίνακας 1). Η δοκιμή Kruskal-Wallis έδειξε τις διαφορές στον αριθμό των σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν κασπάση-12 και στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων στις τρεις ομάδες θεραπείας. Στη συνέχεια, η δοκιμή Mann-Whitney U κατέληξε στο συμπέρασμα ότι υπήρχαν διαφορές στον αριθμό των βρεγματικών επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη κασπάσης-12 και στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων μεταξύ των ομάδων P1 και P2 με την ομάδα ελέγχου και μεταξύ των Pl και Ομάδες Ρ2. Υπήρχαν επίσης διαφορές στον αριθμό των βρεγματικών επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη κασπάσης-12 και στον αριθμό της κυτταρικής απόπτωσης (Πίνακας 2).

Η συσχέτιση μεταξύ των κυττάρων έκφρασης Capase-12 και των αποπτωτικών κυττάρων

Τα αποτελέσματα της δοκιμής συσχέτισης Pearson έδειξαν ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ των σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων που εκφράζουν κασπάση{{0}} και του αριθμού των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση με τον συντελεστή συσχέτισης 0,707, ο οποίος είναι ισχυρός και θετικός. Έτσι, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι εάν ο αριθμός των κυττάρων έκφρασης πρωτεΐνης μειωθεί, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων μειώνεται επίσης και αντίστροφα.

Πίνακας 1. Η περιγραφική στατιστική της έκφρασης κασπάσης-12 και των αποπτωτικών κυττάρων. P0: ομάδα ελέγχου. P1:σισπλατίνηένεση την 7η ημέρα. P2 αντιμετωπίστηκε μεενδοφλεβίωςγλουταμίνηένεση 7 συνεχόμενες ημέρες πριν από την ένεσησισπλατίνητην 7η μέρα.	Πίνακας 2. Αποτελέσματα δοκιμών Mann–Whitney U

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, η θεραπεία πραγματοποιήθηκε στα πειραματόζωα που χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: την ομάδα ελέγχου (PO). την ομάδα PI, η οποία έλαβε ενδοπεριτοναϊκή ένεση σισπλατίνης. και η ομάδα P2, η οποία έλαβε ενδοπεριτοναϊκή ένεση σισπλατίνης καιενδοφλέβια γλουταμίνηένεση. Η ανταπόκριση στη θεραπεία παρατηρήθηκε για 72 ώρες μετά τη θεραπεία επειδή η απόπτωση ήταν εμφανής μετά από 72 ώρες ένεσης σισπλατίνης (Tsuruya et al..2003). Η θέση που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν το σπειραματικό επιθήλιο. Μέχρι στιγμής, δεν έχει γίνει ακόμη έρευνα για τη νεφροτοξικότητα της σισπλατίνης στο σπειραματικό επιθήλιο. Το σπείραμα είναι πιο εγγύς από τα σωληνάρια και επομένως θεωρείται ότι επηρεάζεται από τη νεφροτοξικότητα της σισπλατίνης νωρίτερα από τα σωληνάρια.

Οι διαφορές στο επίπεδο έκφρασης της κασπάσης-12 ήταν ευθέως ανάλογες με το επίπεδο χορήγησης γλουταμίνης σε κάθε θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζονται από μια μελέτη που δήλωσε ότι η γλουταμίνη μπορεί να προκαλέσει υψηλά επίπεδα έκφρασης HSP σε όλα τα όργανα, συμπεριλαμβανομένων των νεφρών (Zhang et al., 2009). Μία μόνο δόση τουενδοφλέβια γλουταμίνημπορεί να αυξήσει την έκφραση της HSP, να μειώσει τον τραυματισμό των τελικών οργάνων και να βελτιώσει την επιβίωση από σηπτικό σοκ σε ολόκληρα ποντίκια (Wischmeyer, 2002). Οι κυτταροπροστατευτικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες της γλουταμίνης μπορεί να είναι κρίσιμες σε καταστάσεις υψηλού καταβολισμού, όπου η δραστηριότητα και η έκφραση των φλεγμονωδών μονοπατιών που διαμεσολαβούνται από το NF-kB ρυθμίζονται (Cruzat et al., 2014). Η μειωμένη διαθεσιμότητα γλουταμίνης πλάσματος έχει αναφερθεί ότι προκαλεί τη μείωση του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων, βλάπτει την έκφραση των πρωτεϊνών ενεργοποίησης της επιφάνειας και την παραγωγή κυτοκίνης και προκαλεί απόπτωση στα κύτταρα (Roth. 2008). Αυτός είναι ο λόγος που η γλουταμίνη μπορεί να αποτρέψει τα κύτταρα προς την απόπτωση σε αυτή τη μελέτη.

Όπως αναφέρθηκε στα αποτελέσματα, η χορήγηση γλουταμίνης μείωσε την απόπτωση των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη. Αυτό έχει αποδειχθεί για το αντίθετο σε μια μελέτη των Kadri et al. (2017) όπου η καταστολή του μεταβολισμού της γλουταμίνης μπορεί να αυξήσει το κυτταροτοξικό δυναμικό ορισμένων θεραπευτικών φαρμάκων, όπως η σισπλατίνη, επιτρέποντας έτσι τη μείωση της δόσης των ενώσεων χημειοθεραπείας για την ελαχιστοποίηση της τοξικότητας και των ανεπιθύμητων ενεργειών.

Οι μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου εξαρτώνται από τη δόση χορήγησης σισπλατίνης, είτε με νέκρωση είτε με απόπτωση (Lieberthal et al, 1996). Σε πειράματα in vitro, χαμηλές συγκεντρώσεις σισπλατίνης προκαλούν απόπτωση στα κύτταρα, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις νέκρωση (Megyesi et al. 1998: Ramesh and Reeves.2003). Σε αυτή την έρευνα, η δόση ήταν αρκετή για να προκαλέσει απόπτωση τα επιθηλιακά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, η ένεση σισπλατίνης στο P1 εμφάνισε υψηλότερο ρυθμό απόπτωσης κυττάρων μετά από 72 ώρες σε σύγκριση με τον έλεγχο (PO). Βρήκαμε επίσης ότι η ένεση γλουταμίνης και σισπλατίνης στο P2 εξέφρασε χαμηλότερη έκφραση κασπάσης-12 μετά από 72 ώρες σε σύγκριση με το P1.

Η απόπτωση μετά από θεραπεία με σισπλατίνη μπορεί επίσης να περιλαμβάνει την οδό του στρες ER. Ο εκκινητής κασπάσης στην οδό ER είναι η κασπάση-12, η οποία εντοπίζεται στην κυτταροπλασματική επιφάνεια του ER και ενεργοποιείται από την πίεση ER (Boyce and Yuan, 2006). Η κασπάση-12 ενεργοποιείται κατά τη θεραπεία της σισπλατίνης σε κύτταρα LLC-PK1 (Liu and Baliga, 2005). Οι in vitro παρατηρήσεις έχουν πρόσφατα επεκταθεί σε μοντέλα ποντικών νεφροτοξικότητας της σισπλατίνης, όπου το ER καταπονείται και η σχετική σηματοδότηση, όπως η διάσπαση της κασπάσης-12, παρατηρήθηκαν (Peyrou et al., 2007).

Μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η απόπτωση λόγω χορήγησης σισπλατίνης συμβαίνει λόγω της αυξημένης έκφρασης της κασπάσης-12, η οποία προκαλεί απόπτωση στα νεφρικά σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα. Στις 72 ώρες παρατήρησης μετάενδοφλέβια γλουταμίνηχορήγηση, η επίπτωση της απόπτωσης στα νεφρικά σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα ανεστάλη σημαντικά (p<0.0001)between the="" groups="" and="" was="" directly="" proportional="" to="" the="" effect="" of="" glutamine,="" which="" inhibited="" the="" expression="" of="">

Συμπερασματικά, με βάση τα αποτελέσματα, υπάρχει μείωση στην έκφραση της κασπάσης-12 και των αποπτωτικών κυττάρων στα σπειραματικά επιθηλιακά κύτταρα αρσενικών λευκών αρουραίων που εκτέθηκαν σε σισπλατίνη μετάενδοφλέβια γλουταμίνηδιαχείριση. Η μειωμένη έκφραση της κασπάσης-/2 inενδοφλέβια γλουταμίνηη χορήγηση ακολουθείται από μείωση της απόπτωσης στο σπειραματικό επιθήλιο. Έτσι, θεωρείται ότι η ανοσοϊστοχημική εξέταση στο νεφρικό σπειραματικό επιθήλιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για τη νεφροτοξική δράση της σισπλατίνης.

Ο περιορισμός αυτής της μελέτης είναι ότι δεν έχουν παρατηρηθεί διάφορες μεταβλητές. Ο ερευνητής δεν έκανε παρατηρήσεις στην εκτελεστή κασπάση(κασπάση-3) επειδή ο ερευνητής ήθελε να δει τη σημασία της θεραπείας που πραγματοποιήθηκε στην κασπάση εκκινητή. Αυτή η μελέτη επίσης δεν είδε τη συχνότητα της απόπτωσης μέσω δύο ή περισσότερων οδών. Σε αυτή την περίπτωση, ο ερευνητής θέλει να προσπαθήσει να περάσει πρώτα από μία διαδρομή και δεν χρειάζεται να μελετήσει περισσότερες από μία διαδρομές εάν τα αποτελέσματα είναι σημαντικά. Προτείνεται επίσης να γίνει περαιτέρω έρευνα σχετικά με την εφαρμογή τουενδοφλέβια γλουταμίνηενδοφλέβια σε ανθρώπους που λαμβάνουν χημειοθεραπεία με σισπλατίνη και επίσης στη θεραπεία στο ζώο με καρκίνο, έτσι ώστε να μπορεί να παρατηρηθεί η επίδραση της γλουταμίνης σε ομάδες καρκίνου και μη.

Εικόνα 1. Μορφολογία σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων μετά από αντίσωμα CSP-12. P0:ομάδα ελέγχου. Ρ1: ένεση σισπλατίνης την 7" ημέρα. Ρ2 αγωγή μεενδοφλέβια γλουταμίνηένεση για 7 συνεχόμενες ημέρες πριν από τη μόλυνση με σισπλατίνη την ημέρα 7" ωρών. Το θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται με καφέ κυτταρόπλασμα.	Εικόνα 2. Μορφολογία των σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων μετά από κιτ ανίχνευσης απόπτωσης. PO: ομάδα ελέγχου. Ρ1: ένεση σισπλατίνης την 7" ημέρα. Ρ2 υποβλήθηκε σε αγωγή μεενδοφλέβια γλουταμίνηένεση για 7 συνεχόμενες ημέρες πριν από την ένεση με σισπλατίνη τις 7 ημέρες. Το θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται με καφέ κυτταρόπλασμα.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. AkcayA, Turkmen K, Lee D, Edelstein CL (2010). Ενημέρωση για τη διάγνωση και τη διαχείριση της οξείας νεφρικής βλάβης. Int J Nephrol Renovasc Dis, 3,129-40

2. Al Hussain T, Al Mana H, Hussein M, Akhtar M (2017). Αλληλεπιδράσεις ποδοκυττάρων και βρεγματικών επιθηλιακών κυττάρων στην υγεία και τη νόσο. Ady Anat Pathol, 24,24-34.

3. Bovce M. Yuan J(2006). Κυτταρική απόκριση στο στρες του ενδοπλασματικού δικτύου. θέμα ζωής ή θανάτου. CellDeathDiffer, 13,363-73

4. Crespo I, San-Miguel B, Prause C.et al (2012). Η θεραπεία με γλουταμίνη εξασθενεί το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου και την απόπτωση σε κολίτιδα που προκαλείται από TNBS.PLoS One,7,50407 Cruzat VF,BittencourtA,Scomazzon SP, et al2 (2) .Οι από του στόματος ελεύθερες και διπεπτιδικές μορφές συμπληρωμάτων γλουταμίνης εξασθενούν το οξειδωτικό στρες και τα ιόντα φλεγμονής που προκαλούνται από την ενδοτοξαιμία. Διατροφή, 30,602-11

5. Feldenberg LR, Thevananther S, Del Rio M, De Leon M, Devarajan P (1999). Η μερική μείωση του ATP προκαλεί απόπτωση που προκαλείται από Fas και κασπάση σε κύτταρα MDCK. Am.J/ Physiol (Renal Physiol),276.837-46.

6. Fillipski KK,Loos WJ, Verweij J, Sparreboom A(2008). Αλληλεπίδραση της σισπλατίνης με τον μεταφορέα ανθρώπινου οργανικού κατιόντος 2. Clin Cancer Res,15,3875-80

7. Fukuoka K, Takeda M, Kobayashi M et al (1998). Διακεκριμένες πρωτεάσες της οικογένειας μετατρεπτικών ενζύμων ιντερλευκίνης-1 - μεσολαβούν στην επαγόμενη από σισπλατίνη και σταυροσπορίνη απόπτωση κυττάρων εγγύς σωληναρίου ποντικού. Life Sei, 62.1125-38.

8. Guo Y, Wang M,MouJ,etal(2018). Η προεπεξεργασία του εκχυλίσματοςhuaiqihuang προστατεύει από τη νεφροτοξικότητα που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Sci Rep, 8, 7333

9. Hanigan MH. Devarajan P(2003). Νεφροτοξικότητα σισπλατίνης: Μοριακοί μηχανισμοί. Καρκίνος Ther,1,47-61

10. Jing L, Wu O, Wang F (2017). Η γλουταμίνη προκαλεί πρωτεΐνη θερμικού σοκ και προστατεύει από το Escherichia coli

Σημείωση:τα παραπάνω δεν είναι πλήρης λίστα αναφοράς