Προστατευτικές επιδράσεις της Wogonin στη φλεγμονή και την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτες και στους πιθανούς μηχανισμούς της

Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ιστορικό: Το Wogonin (5,{1}}διυδροξυ-8-μεθοξυφλαβόνη) είναι ένα φυσικό δι-υδροξυλ φλαβονοειδές που εξάγεται από τη ρίζα του Scutellaria baicalensis Georgi. Η παρούσα εργασία είχε σκοπό να διερευνήσει τον μηχανισμό δράσης της βογονίνης στην ανακούφισηφλεγμονήκαιαπόπτωσησε οξεία πνευμονική βλάβη (ALI).

Υλικά και μέθοδοι: Λιποπολυσακχαρίτης (LPS) χρησιμοποιήθηκε για την καθιέρωση του in vitro μοντέλου του ALl. Μετά τη θεραπεία με βογονίνη, η κυτταρική βιωσιμότητα και η απόπτωση των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549 μετρήθηκαν αντίστοιχα με CCK-8, TUNELssays και διπλή χρώση ακριδίνης πορτοκαλιού/βρωμιούχου αιθιδίου, ενώ τα περιεχόμενα των φλεγμονωδών κυτοκινών καιοξειδωτικό στρεςΟι δείκτες εκτιμήθηκαν με RT-qPCR, δοκιμασία ELISA, ανάλυση στυπώματος western και εμπορικά κιτ. Διεξήχθη επίσης στύπωμα Western για την αξιολόγηση της έκφρασης των εμπλεκόμενων πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της βογκονίνης στην αποακετυλίωση της πρωτεΐνης υψηλής κινητικότητας της ομάδας κουτιού 1 (HMGB1) που προκαλείται από τη sirtuin 1 (SIRT1). Ο αναστολέας SIRT1 EX527 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των ρυθμιστικών επιδράσεων της βογονίνης στην αποακετυλίωση HMGB1 με τη μεσολάβηση SIRT σε κύτταρα A549 υπό διέγερση LPS.

Αποτελέσματα: Το LPS προκάλεσε φλεγμονή, οξειδωτικό στρες και απόπτωση των κυττάρων Α549, η οποία καταργήθηκε από τη βογκονίνη. Βρέθηκε επίσης ότι η βογκονίνη προήγαγε την αποακετυλίωση HMGB1, συνοδευόμενη από ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση SIRT1. Ωστόσο, ο αναστολέας SIRT1 EX527 ανέστρεψε εν μέρει τις προστατευτικές επιδράσεις της βογονίνης στη φλεγμονή και την απόπτωση των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549.

συμπέρασμα: Το Wogonin ανακούφισε τη φλεγμονή και την απόπτωση στα επαγόμενα από LPS κύτταρα A549 με αποακετυλίωση HMGB1 με τη μεσολάβηση SIRT, η οποία μπορεί να αντιπροσωπεύει την αναγνώριση ενός νέου μηχανισμού με τον οποίο η wogonin ασκεί προστατευτικά αποτελέσματα στο ALI και παρέχει ιδέες για την εφαρμογή του wogonin σε Όλη η θεραπεία.

Λέξεις-κλειδιά: Οξεία πνευμονική βλάβη, Wogonin, Φλεγμονή, SIRT1, αποακετυλίωση HMGB1

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες

Ιστορικό

Η οξεία πνευμονική βλάβη (AL) τεκμηριώνεται κλινικά ως αποτέλεσμα παθολογικών καταστάσεων, όπως η σήψη, η πνευμονία, το τραύμα και η οξεία παγκρεατίτιδα [1]. Συχνά παρατηρείται σε ασθενείς που εισάγονται στις μονάδες εντατικής θεραπείας και εμφανίζει υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [2]. Όσοι επιζούν από ALI συνήθως έρχονται αντιμέτωποι με κατώτερη ποιότητα ζωής [3]. Αν και έχουν επιτευχθεί επιτεύγματα στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της AL, η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των τρεχουσών θεραπειών παραμένει περιορισμένη, γεγονός που δεν μπορεί να εκπληρώσει τις προσδοκίες των ασθενών και των οικογενειών τους [4]. Επομένως, είναι εξαιρετικά επείγον να εντοπιστούν νέες θεραπείες ή στόχοι για τη θεραπεία της ΟΛΛ. Το Wogonin(5,7-διυδροξυ-8-μεθοξυφλαβόνη), η δομή του οποίου φαίνεται στο Σχήμα 1Α, είναι ένα φυσικό δι-υδροξυλ φλαβονοειδές που εξάγεται από τη ρίζα του Scutellaria baicalensis Georgi [5]. Οι σημαντικές αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές του και η εφαρμογή του στη θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών έχουν αναφερθεί ευρέως από μεγάλο αριθμό μελετών. Για παράδειγμα, η βογκονίνη δυνητικά βελτίωσε το οίδημα του πνεύμονα στα ποντίκια και τα προστάτεψε από την επαγόμενη από λιποπολυσακχαρίδια (LPS) ALI αναστέλλοντας την ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (MAPK) και την τελική κινάση c-Jun NH(2) (φωσφορυλίωση INK [6 ]. Το Wogonin μείωσε επίσης τη διείσδυση ουδετερόφιλων που προκαλείται από LPS, την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών, την έκφραση μορίων προσκόλλησης και κατέστειλε την επαγόμενη από LPS AL σε ποντίκια [7]. αποτέλεσμα της θεραπείας με βογκονίνη με οδό NF-KB με τη μεσολάβηση του υποδοχέα γάμμα (PPARy) που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισωμάτων [8]. Η αναδυόμενη μελέτη έδειξε ότι η γουγονίνη μείωσε την απολίνωση του τυφλού και την επαγόμενη από παρακέντηση (CLP) υψηλής κινητικότητας πρωτεΐνη της ομάδας 1 (HMGB1) παραγωγή και HMGB1-εξαρτώμενη φλεγμονή και μείωσε τη νοσηρότητα που σχετίζεται με τη σήψη και τον κίνδυνο τραυματισμού των πνευμόνων [9]. Στο μοντέλο ALI in vitro και in vivo που προκαλείται από LPS, μια άλλη αναφορά έδειξε ότι η αναστολή του HMGB1 και άλλοι φλεγμονώδεις μεσολαβητές μέσω της ουλιναστατίνης προφανώς ανακούφισαν τις εκδηλώσεις της ALI [10]. Και προηγούμενες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι τα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα που προκαλούνται από LPS (A549) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως μοντέλο in vitro για το ALI [11-13]. Η Sirtuin 1 (SIRT1), ο κατάντη τελεστής της ενεργοποιημένης από μονοφωσφορική αδενοσίνη πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK), έχει προταθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απελευθέρωσης αδιπονεκτίνης [14]. Η συμπλήρωση βογκονίνης αύξησε αξιοσημείωτα τη φωσφορυλίωση της AMPK και την έκφραση SIRT1, ενώ η αναστολή της AMPK ή της SIRT1 μείωσε τις επιδράσεις της βογονίνης στην παραγωγή ή την απελευθέρωση της αδιπονεκτίνης [14]. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η αποακετυλίωση HMGB1 που ρυθμίζει το SIRT{45}}ανέστειλε την οξεία νεφρική βλάβη που προκλήθηκε από σήψη [15].

Στην παρούσα μελέτη, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε τον μηχανισμό δράσης του wogonin στην ανακούφιση τουφλεγμονήκαιαπόπτωσητων ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα που προκαλούνται από LPS, τα οποία θα μπορούσαν να παρέχουν μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα για τη θεραπεία της ALI από τη βογονίνη.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της βογονίνης στη βιωσιμότητα και την απόπτωση των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549

Για να παρατηρήσουμε την επίδραση της βογονίνης στο ALI, υποθέσαμε αρχικά εάν η βιωσιμότητα των φυσιολογικών κυττάρων Α549 θα μπορούσε να καταστραφεί από τη βογκονίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, η βογονίνη δεν προκάλεσε βλάβη στα κύτταρα Α549 χωρίς να λάβει καμία θεραπεία, υποδηλώνοντας την ασφάλεια της θεραπείας με βογονίνη σε κύτταρα Α549 σε συγκεντρώσεις Ο,5,10 και 20 μΜ. Μετά από διέγερση LPS για 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 υπέστη αξιοσημείωτη βλάβη, η οποία εξουδετερώθηκε από τη βογκονίνη με τρόπο που εξαρτάται από τη συγκέντρωση (Εικ. 1C). Επιπλέον, τα αποτελέσματα από τον προσδιορισμό LDH έδειξαν ότι μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της LDH σε κύτταρα Α549 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με LPS μειώθηκε μετά τη χορήγηση αυξανόμενων δόσεων βογονίνης (Εικ. 1D). Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε την επίδραση της βογονίνης στην απόπτωση των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Α, η χρώση TUNEL έδειξε ότι η έκθεση σε LPS ενίσχυσε δραματικά την απόπτωση των κυττάρων Α549 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η οποία μειώθηκε από τη βογονίνη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, εμφανής μείωση στην έκφραση Bcl-2 και ανοδική ρύθμιση στις εκφράσεις Bax, Cyto-C και σχισμένης κασπάσης 3 παρατηρήθηκαν στην ομάδα που εκτέθηκε σε LPS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η οποία αποκαταστάθηκε με θεραπεία με βογονίνη (Εικ. 2Β). Συνεπώς, τα αποτελέσματα των αναλύσεων διπλού φθορισμού AO/EB που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3 υποδηλώνουν ότι το LPS οδήγησε σε αυξημένο ποσοστό απόπτωσης κυττάρων ως σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ τα θετικά σε ΕΒ κύτταρα μειώθηκαν σημαντικά μετά την προσθήκη wogonin σε σύγκριση με το LPS ομάδα. Έτσι, η βογκονίνη αποκαθιστά τη βιωσιμότητα και μειώνει την απόπτωση των κυττάρων Α549 που προκαλείται από το LPS.

Επιδράσεις της βογκονίνης στη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549

Για να εξερευνήσετε τις αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ικανότητες του wogonin στο ALI, τοφλεγμονήκαιοξειδωτικό στρεςανιχνεύθηκαν, αντίστοιχα, των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με βογονίνη. Όπως φαίνεται στην Εικ. 4A-C, τα επίπεδα mRNA των φλεγμονωδών κυτοκινών (TNF-, IL-6 και IL-1) που μετρήθηκαν με RT-qPCR αυξήθηκαν σε σημαντικά υψηλά επίπεδα κατά τη διέγερση του LPS, ενώ η βογονίνη θεραπεία οδήγησε στη μείωση της έκφρασής τους. Με συνέπεια, τα αποτελέσματα της ELISA έδειξαν ότι η επαγωγή LPS οδήγησε σε σημαντική αύξηση στα περιεχόμενα TNF-, IL-6 και IL{10}} σε σύγκριση με την ομάδα που δεν έλαβε θεραπεία, τα οποία μειώθηκαν δοσοεξαρτώμενα μετά τη θεραπεία με wogonin (Εικ. 4D-F). Είναι σημαντικό ότι η κυκλοοξυγενάση-2(Cox-2) και ο φωσφο-πυρηνικός παράγοντας (NF)-KB p65 (p-NF-KB p65), που είναι δείκτες που σχετίζονται με τη φλεγμονή, ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από το LPS ενώ ρυθμίζεται προς τα πάνω από τη βογονίνη (Εικ. 4G). Επιπλέον, το LPS είχε ως αποτέλεσμα μειωμένες δραστηριότητες των SOD και GSH-Px και αυξημένα περιεχόμενα MDA και ROS, τα οποία αντιστράφηκαν από τη βογονίνη (Εικ. 4Η-Κ). Συνολικά, το wogonin ανακουφίζει τη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες των κυττάρων A549 που προκαλούνται από LPS.

Η ρύθμιση της βογκονίνης στην αποακετυλίωση του HMGB1 με τη μεσολάβηση SIRT1-

Για να επιβεβαιώσουμε την εικασία μας ότι το wogonin άσκησε προστατευτικά αποτελέσματα στον τραυματισμό των κυττάρων A549 που προκαλείται από LPS από αποακετυλίωση HMGB1 με τη μεσολάβηση SIRT, πραγματοποιήσαμε western blot για να ανιχνεύσουμε τα επίπεδα πρωτεΐνης των εμπλεκόμενων παραγόντων. Προφανώς, το LPS κατέστειλε την έκφραση του SIRT1 και προώθησε τη μετατόπιση του HMGB1 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, μαζί με την ακετυλίωση του HMGB1. Ωστόσο, αυτή η τάση αντιστράφηκε με έκθεση βογκονίνης σε κύτταρα A549 που προκαλούνται από LPS (Εικ. 5). Έτσι, η θεραπεία με βογκονίνη ρυθμίζει την αποακετυλίωση HMGB1 που προκαλείται από SIRT σε κύτταρα A549 που προκαλούνται από LPS.

Η ρύθμιση του αναστολέα SIRT1 EX527 στις κυτταρικές συμπεριφορές των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με βογονίνη

Για να επαληθεύσουμε το ρόλο του SIRT1 στον υποκείμενο μηχανισμό με τον οποίο η βογονίνη επηρέασε τη φλεγμονή και την απόπτωση των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549, χρησιμοποιήσαμε το EX527, έναν αναστολέα SIRT1, για τη θεραπεία των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549 για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, η προσθήκη του EX527 μείωσε την έκφραση SIRT1, εμπόδισε την πυρηνική-κυτταροπλασματική μεταφορά του HMGB1 και διέγειρε την αποακετυλίωση HMGB1, σε σύγκριση με την ομάδα LPS συν Wogonin. Περαιτέρω αναλύσεις CCK-8 και LDH έδειξαν ότι το EX527 κατέστρεψε το αποκαταστατικό αποτέλεσμα της βογονίνης στη βιωσιμότητα των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549 (Εικ. 6Β). Επιπλέον, οι επιδράσεις της βογκονίνης στην έκφραση της έκφρασης Bcl-2, Bax, Cyto-C και διασπασμένης κασπάσης 3 μετριάστηκαν εν μέρει από το EX527 σε κύτταρα A549 που επάγονται από LPS (Εικ. 6C). Τέλος, οι τάσεις διακύμανσης των φλεγμονωδών παραγόντων (TNF-, IL{-6 και IL{-1), των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη φλεγμονή (Cox-2 και p-NF-kB p65) και Οι δείκτες οξειδωτικού στρες (SOD, GSH-Px και MDA) σε επαγόμενα από LPS κύτταρα A549 που υποβλήθηκαν σε συν-επεξεργασία με βογονίνη και EX527 έδειξαν ότι η EX527 κατέστρεψε τις ανασταλτικές επιδράσεις της βογονίνης στη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες στα επαγόμενα από LPS κύτταρα A549 (Εικ. 7Α-Κ). Ως εκ τούτου, ο αναστολέας SIRT1 EX527 αναστρέφει τις προστατευτικές επιδράσεις της βογονίνης στους κακοήθεις φαινότυπους των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549.

Συζήτηση

Επί του παρόντος, πολλοί ειδικοί έχουν αναγνωρίσει το wogonin ως ισχυρό παράγοντα για τη θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών. Η αποτελεσματικότητά του στην ανακούφιση των φλεγμονωδών αποκρίσεων φέρεται να αποδόθηκε στην καταστολή του NF-kB και στην ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης του ερυθροειδούς 2-που σχετίζονται με τον παράγοντα 2(Nrf2)[16]. Είναι ενδιαφέρον ότι προηγούμενες αναφορές συσχέτισαν το αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα με τη μεσολάβηση της έκφρασης iNOS και Cox-2 ή την ενεργοποίηση δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)/ERK/Nrf2 σηματοδοτικών μονοπατιών [5,17]. Σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα που δεν έδειχναν καμία επίδραση της βογκονίνης στη βιωσιμότητα των χονδροκυττάρων, δεν βρήκαμε ουσιαστικά καμία σημαντική κυτταροτοξική επίδραση της βογονίνης σε φυσιολογικά κύτταρα Α549, υποστηρίζοντας την περαιτέρω εξερεύνηση στον υποκείμενο μηχανισμό με τον οποίο η βογκονίνη επηρέασε το in vitro κυτταρικό μοντέλο ALI [17]. Το οξειδωτικό στρες και η φλεγμονή είναι δύο κύρια χαρακτηριστικά στην παθογένεση της AL, και έτσι εντοπίσαμε τις αλλαγές στους δείκτες οξειδωτικού στρες και στις φλεγμονώδεις κυτοκίνες κατά τη θεραπεία με βογκονίνη [18]. Παραδόξως, η φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες αμφότερα μετριάστηκαν από την έκθεση στη βογονίνη στο μοντέλο κυττάρων A549 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS, όπως αποδεικνύεται από τον αποκλεισμό της απελευθέρωσης προφλεγμονώδους παράγοντα και την ενισχυμένη παραγωγή SOD και GSH-Px, καθώς και από τη μειωμένη παραγωγή MDA μετά Η θεραπεία με βογονίνη Η HMGB1 αναδύεται ως μια εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη που αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ότι ρυθμίζει τη σήψη σε ένα μοντέλο ποντικού[19]. Η στόχευση του HMGB1 θεωρήθηκε ως πιθανή θεραπευτική επιλογή για τη θεραπεία της σήψης λόγω του γεγονότος ότι οι ασθενείς που εκδηλώνονταν ως παρατεταμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις εμφάνιζαν συχνά συνεχιζόμενα υψηλά επίπεδα HMGB1 [10]. Πρόσφατες αναφορές και ανασκοπήσεις έχουν δώσει μεγάλη προσοχή στα θεραπευτικά αποτελέσματα του HMGB1 στις φλεγμονώδεις ασθένειες, χωρίς να περιορίζονται στη σήψη. Για παράδειγμα, είχε αποδειχθεί προηγουμένως ότι η αναστολή του HMGB1 από την ουλιναστατίνη βελτίωσε τον τραυματισμό ALI που προκαλείται από LPS σε ποντίκια [10,20]. Μετά την απελευθέρωση από ενεργοποιημένα μονοκύτταρα/μακροφάγα, το HMGB1 χρησίμευσε ως προφλεγμονώδης παράγοντας μέσω διαφόρων διεγερτικών [20]. Φλεγμονώδη σήματα όπως το LPS θα μπορούσαν να προκαλέσουν τη σχετιζόμενη με την ακετυλίωση μετατόπιση του HMGB1 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα [21]. Εδώ, το εύρημα ότι η μετατόπιση του HMGB1 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα κατά τη διέγερση του LPS εξουδετερώθηκε από τη θεραπεία με βογονίνη έμμεσα διευκρίνισε ότι η φλεγμονή των κυττάρων Α549 που πυροδοτήθηκε από το LPS παρεμποδίστηκε ισχυρά από τη βογονίνη.

Το SIRT1 έχει προταθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες [22]. Ανάλογα με τους στόχους της αποακετυλίωσης, οι αλλαγές στη δραστηριότητα του SIRT1 αναμενόμενα αφορούσαν το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή [23]. Το HMGB1 αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως στόχος αποακετυλίωσης του SIRT1 [20]. Ουσιαστικά στοιχεία έδειξαν ότι η αποακετυλίωση του HMGB1 ρυθμίζει το SIRT{7}}ανακούφισε τη φλεγμονή, αποκατέστησε τη νεφρική λειτουργία και παρέτεινε τον χρόνο επιβίωσης των ποντικών με οξεία νεφρική βλάβη που σχετίζεται με σήψη [15]. Σε μια πειραματική μελέτη τραυματικής εγκεφαλικής βλάβης, το Ωμέγα-3 πολυακόρεστο λιπαρό οξύ ανακούφισε τη φλεγμονή ρυθμίζοντας την πόλωση των μικρογλοίων μέσω της ρυθμισμένης αποακετυλίωσης SIRT1- της οδού HMGB1/NF-KB [24]. Περαιτέρω, το ολεανολικό οξύ απέτρεψε το μοντέλο του αρουραίου από υπαραχνοειδή αιμορραγία με ρυθμιζόμενη από SIRT1-αποακετυλίωση HMGB1 [25]. Η αναστολή του NLRP3/NF-kB από την αλοΐνη μέσω της ενεργοποίησης του SIRT1 εξασθένησε το ALI που προκαλείται από LPS σε ποντίκια [26]. Ρυθμίζοντας τη σηματοδότηση SIRT1/HMGB1/NF-KB, η καμπφερόλη βελτίωσε τον τραυματισμό των πνευμόνων που προκαλείται από ισχαιμία-επαναιμάτωση μέσω αντιφλεγμονώδους και αντιοξειδωτικού στρες 27I. Ως σημαντικό μόριο κατάντη του HMGB1, το NF-kB είναι μια κύρια οδός σηματοδότησης που εμπλέκεται στη ρύθμιση των φλεγμονωδών μεσολαβητών ενεργοποιώντας γονίδια προφλεγμονωδών παραγόντων και απελευθερώνοντας μεγάλο αριθμό φλεγμονωδών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των TNF-, IL-6 και TNF -a[28,29].Επιπλέον, το NF-KBcan συμμετέχει επίσης στη διαδικασία του οξειδωτικού στρες μέσω της ρύθμισης της παραγωγής ROS και επηρεάζοντας τα επίπεδα SOD, MDA και GSH-Px [30]. Στην παρούσα μελέτη, η Μειωμένη έκφραση p-NF-kB p65 παρατηρήθηκε μετά την προσθήκη βογονίνης, η οποία αποκαταστάθηκε με τον αναστολέα SIRT1, EX527. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η αποακετυλιωμένη HMGB1 από τη βογονίνη συνοδεύτηκε από ενεργοποιημένη έκφραση SIRT1, η οποία οδήγησε στην εικασία μας ότι η βογονίνη μπορεί να ασκήσει προστατευτικά αποτελέσματα στη φλεγμονή των κυττάρων A549 που προκαλείται από LPS από την αποακετυλίωση HMGB1 με τη μεσολάβηση SIRT. Η χρήση του EX527 στα ακόλουθα πειράματα έδειξε περαιτέρω ότι η αναστολή του SIRTl ανέστρεψε τα προστατευτικά αποτελέσματα της βογκονίνης στη φλεγμονή των επαγόμενων από LPS κυττάρων Α549.

συμπέρασμα

Συμπερασματικά, δείξαμε ότι η βογονίνη ανακούφισε τη φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση του προκαλούμενου από LPS κυτταρικού μοντέλου ALI. Αυτός ο μηχανισμός δράσης φάνηκε να οφείλεται στη ρύθμιση της αποακετυλίωσης HMGB1 που προκαλείται από το SIRT1-που προκαλείται από τη βογονίνη. Αυτά τα ευρήματα ενδέχεται να προσδιορίσουν έναν νέο μηχανισμό με τον οποίο το wogonin ασκεί προστατευτικά αποτελέσματα στο ALI και να παρέχουν μια πειραματική βάση για την εφαρμογή του wogonin στην κλινική θεραπεία του ALI.

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και φάρμακα

Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>99 τοις εκατό), που απομονώθηκε από το Scutellaria baicalensis Georgi, αγοράστηκε από την Biotic Chemical (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αποθηκεύτηκε σε -20 βαθμό C και αραιώθηκε με DMEM. Αναστολέας SIRT1 EX527 (10 μΜ; Το MedChemExpress, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κυττάρων για 24 ώρες πριν από τη χορήγηση σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη [31].

Δοκιμασία κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8).

Μετά τη διέγερση του LPS για 24 ώρες και τις διάφορες συγκεντρώσεις έκθεσης στη βογκονίνη για άλλες 4 ώρες, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96-πλάκα φρεατίου και πραγματοποιήθηκε ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων με προσθήκη 10 μL αντιδραστηρίου CCK-8 (Dojindo). , Κουμαμότο, Ιαπωνία) σε κάθε φρεάτιο στους 37 βαθμούς για 4 ώρες. Η απορρόφηση στα 450 nm παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Δοκιμασία απελευθέρωσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH).

Το κυτταρικό υπερκείμενο που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με βογκονίνη σπάρθηκε σε 96-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων και επωάστηκε για 24 ώρες στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO, πριν προστεθούν 100 μL του διαλύματος κιτ ανίχνευσης κυτταροτοξικότητας LDH (Roche Diagnostics, Γαλλία) σε κάθε 15 λεπτά αργότερα, το υπερκείμενο υγρό των κυττάρων αραιώθηκε, με την τιμή οπτικής πυκνότητας να παρακολουθείται στα 450 nm.

Η δοκιμασία TUNEL χρώσης με τη μεσολάβηση της τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης (TUNEL) διεξήχθη για την αξιολόγηση της απόπτωσης των επαγόμενων από LPS κυττάρων A549 με ή χωρίς θεραπεία με βογονίνη με Colorimetric TUNEL Απόπτωσης Κιτ (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα) με βάση την επέμβαση Κατευθυντήριες γραμμές. Μετά από φυσιολογικό ορό φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) πλύση δύο φορές και σταθεροποίηση με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 0.5 ώρες, 0.3 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου σε PBS χρησιμοποιήθηκε για την επώαση των κυττάρων για άλλα 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαμινοβενζόλιο (DAB) για 10 λεπτά και αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη (Solarbio, Πεκίνο, Κίνα) για 30 δευτερόλεπτα. Τα αποπτωτικά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus Corporation) και ο ρυθμός αποπτώσεως πιστοποιήθηκε από το λογισμικό Image-J (NIH, Bethesda, MD, USA).

Διπλή χρώση πορτοκαλιού ακριδίνης/βρωμιούχου αιθιδίου

Δοκιμασίες διπλού φθορισμού ακριδίνης πορτοκαλιού/βρωμιούχου αιθιδίου (ΑΟ/ΕΒ) πραγματοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η μεταβολή της απόπτωσης των κυττάρων. Εν συντομία, κύτταρα Α549 αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σε 24-πλάκες φρεατίων. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν για 24 ώρες με μέσο χωρίς ορό και στη συνέχεια επωάστηκαν με LPS και διάφορες συγκεντρώσεις βογονίνης στους 37 C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και τροφοδοτήθηκαν με 5 μL μικτού διαλύματος AO/EB (100 ug/ml AO και 100 ug/ml EB αναμεμειγμένα σε PBS, Aladdin, China) μέσα σε 3 λεπτά. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν και τραβήχτηκαν φωτογραφία σε μήκος κύματος διέγερσης 510 nm κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus Corporation).

Ανάλυση Western blot

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (Beyotime, Shanghai, Κίνα) και οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών μετρήθηκαν με κιτ δοκιμασίας δικινχονικού οξέος (BCA) Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, USA). Κατόπιν αυτού, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση 10 τοις εκατό ηλεκτροφόρησης γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE) για διαχωρισμό πρωτεϊνών 40 ug και οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Αυτές οι μεμβράνες στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν από μη λιπαρό γάλα και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 βαθμούς C όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα. Στη συνέχεια, συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για την επώαση των μεμβρανών για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), ενώ η ένταση της ζώνης παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image-J (NIH, Bethesda, MD, ΗΠΑ). Η GAPDH θεωρήθηκε ως εσωτερική αναφορά.

Αντίστροφη μεταγραφή-ποσοτική PCR (RT-gPCR)

Κύτταρα Α549 λύθηκαν σε 1 ml αντιδραστηρίου ΤΡΙζόλης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για την εκχύλιση ολικού RNA. Μετά τη συλλογή του ολικού RNA, διεξήχθη αντίστροφη μεταγραφή για τη σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cDNA) με κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.). Οι συνθήκες ήταν ως εξής: 50 βαθμοί C για 15 λεπτά, 85 βαθμοί C για 5 δευτερόλεπτα, και συντήρηση στους 4 βαθμούς. Το SYBR Premix Ex Taq TM(TaKaRa, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό των συνθηκών αντίδρασης PCR και του συστήματος αντίδρασης με βάση τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ένα όργανο ABI 7500 (AB-4351107; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) χρησιμοποιήθηκε για qPCR. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες θερμοκυκλοποίησης: αρχική μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 10 λεπτά. ακολουθούμενοι από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 βαθμούς C για 15 δευτερόλεπτα και ανόπτηση στους 60 βαθμούς για 1 λεπτό. και μια τελική επέκταση 10 λεπτών στους 72 βαθμούς C. Η GAPDH έγινε αποδεκτή ως ο έλεγχος κανονικοποίησης της σχετικής γονιδιακής έκφρασης. Ο υπολογισμός της σχετικής γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο 2-AAct.

Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA)

Τα κυτταρικά επίπεδα ιντερλευκίνης-6(IL-6), IL-1 και παράγοντα νέκρωσης όγκου- (TNF-) στο υπερκείμενο κυτταρικό υγρό μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA IL-6 , IL-1 ELISA Kit και TNF- ELISA Kit με βάση τις προτάσεις του κατασκευαστή (Shanghai Xi Tang Biotechnology, Shanghai, Κίνα).

Ανίχνευση οξειδωτικού στρες

Για την ανίχνευση του οξειδωτικού στρες, οι δραστηριότητες των δεικτών οξειδωτικού στρες συμπεριλαμβανομένης της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), των δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-Px) και της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) ανιχνεύθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Nanjing Jiancheng Biotechnology Ινστιτούτο, Κίνα).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD) τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Για συγκρίσεις μεταξύ πολλαπλών ομάδων, διεξήχθη μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με το post hoc τεστ Tukey, ενώ αυτές μεταξύ δύο ομάδων διεξήχθησαν με Student's t-test. Π<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">

Συντομογραφίες

AL: Οξεία πνευμονική βλάβη. LPS: Λιποπολυσακχαρίτης; HMGB1:Πρωτεΐνη ομαδικού κουτιού 1 υψηλής κινητικότητας. PPARy. Υποδοχέας-γάμα ενεργοποιημένος από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος. MAPK: ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση. JNK: C-Jun NH(2)-τελική κινάση. CLP: Απολίνωση και παρακέντηση του τυφλού. DMEM: Τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco. DMSO: Διμεθυλοσουλφοξείδιο. CCK-8:Κιτ μέτρησης κυττάρων-8; LDH: Γαλακτική αφυδρογονάση. TUNEL: Τερματική-δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση μεσολαβούμενη επισήμανση άκρου άκρου. PBS: Φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα. DAB: Διαμινοβενζόλιο; AO/EB: Ακριδίνη πορτοκαλί/βρωμιούχο αιθίδιο. BCA: Δικινχονικό οξύ; SDS-PAGE: Ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου. PVDF: Διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο. ECL: Ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. cDNA: Συμπληρωματικό DNA; ELSA: Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. IL: Ιντερλευκίνη; TNF-a: Παράγοντας νέκρωσης όγκου-a. MDA: Μαλονδιαλδεΰδη; GSH-Px υπεροξειδάση γλουταθειόνης; SOD: Δισμουτάση υπεροξειδίου. SD: Τυπική απόκλιση. ANOVA: Ανάλυση διακύμανσης. Cox-2: Κυκλοοξυγενάση-2; Nrf2: Ερυθροειδής πυρηνικός παράγοντας 2-σχετιζόμενος παράγοντας 2. ROS: Αντιδραστικά είδη οξυγόνου.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Mokra D, Kosutova P. Βιοδείκτες σε οξεία πνευμονική βλάβη. Respir Physiol Neurobiol. 2015; 209:52–8.

2. Hayes M, Curley G, Ansari B, Laffey JG. Κλινική ανασκόπηση: Θεραπείες με βλαστοκύτταρα για οξεία πνευμονική βλάβη/σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας—ελπίδα ή διαφημιστική εκστρατεία; Crit Care. 2012; 16 (2): 205.

3. Angus DC, Clermont G, Linde-Zwirble WT, Musthafa AA, Dremsizov ΤΤ, Lidicker J, et αϊ. Κόστος υγειονομικής περίθαλψης και μακροπρόθεσμα αποτελέσματα μετά από σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας: Δοκιμή φάσης ΙΙΙ του εισπνεόμενου μονοξειδίου του αζώτου. Crit Care Med. 2006;34(12):2883–90.

4. Hu JT, Lai J, Zhou W, Chen XF, Zhang C, Pan YP, et αϊ. Η υποθερμία ανακούφισε την επαγόμενη από LPS οξεία πνευμονική βλάβη σε μοντέλα αρουραίων μέσω της οδού TLR2/MyD88. Exp Lung Res. 2018; 44 (8–9): 397–404.

5. Chi YS, Lim H, Park H, Kim HP. Επιδράσεις του wogonin, μιας φυτικής φλαβόνης από το Scutellaria radix, στη φλεγμονή του δέρματος: in vivo ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης που σχετίζεται με τη φλεγμονή. Biochem Pharmacol. 2003; 66 (7): 1271–8.

6. Wei CY, Sun HL, Yang ML, Yang CP, Chen LY, Li YC, et αϊ. Προστατευτική επίδραση της βογκονίνης σε οξεία πνευμονική βλάβη που προκαλείται από ενδοτοξίνες μέσω μείωσης της p38 MAPK και φωσφορυλίωσης JNK. Environ Toxicol. 2017; 32 (2): 397–403.

7. Yeh YC, Yang CP, Lee SS, Horng CT, Chen HY, Cho TH, et al. Η οξεία πνευμονική βλάβη που προκαλείται από λιποπολυσακχαρίτη αναστέλλεται από τη βογονίνη σε ποντίκια μέσω μείωσης της φωσφορυλίωσης Akt και της ενεργοποίησης του RhoA. J Pharm Pharmacol.2016;68(2):257–63.