Η αναλογία του συμπυκνώματος στη διατροφή των γαλακτοπαραγωγών αγελάδων πρώιμης γαλουχίας έχει αντίθετες επιδράσεις στα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα παγκόσμια μεταγραφικά προφίλ, την υγεία και τη γονιμότητα σύμφωνα με την ισοτιμία

Αφηρημένη:Η λειτουργικότητα των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων στις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής καταστέλλεται μετά τον τοκετό, με το αρνητικό ενεργειακό ισοζύγιο ως παράγοντα κινδύνου. Τα μεταγραφικά προφίλ λευκοκυττάρων συγκρίθηκαν χωριστά σε 44 πολύτοκες (MP) και 18 πρωτότοκες (PP) αγελάδες Holstein-Friesian που λάμβαναν δίαιτες διαφορετικές σε αναλογία συμπυκνώματος για να ελεγχθεί εάν η δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού θα μπορούσε να μετριαστεί με κατάλληλη διατροφή. Μετά τον τοκετό, οι αγελάδες προσφέρθηκαν είτε (1) χαμηλής συγκέντρωσης (LC). (2) δίαιτες μεσαίου συμπυκνώματος (MC), ή (3) υψηλής πυκνότητας (HC) δίαιτες με αναλογίες συμπυκνώματος προς ενσίρωση χόρτου 30%:70%, 50%:50% και 70%:30%, αντίστοιχα. Τα δεδομένα φαινοτύπου αγελάδας που συλλέχθηκαν περιελάμβαναν κυκλοφορούντες μεταβολίτες, απόδοση γάλακτος και αρχεία υγείας και γονιμότητας. Πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός αλληλουχίας RNA των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων στις 14 ημέρες στο γάλα. Η δίαιτα HC βελτίωσε το ενεργειακό ισοζύγιο και στις δύο ηλικιακές ομάδες. Υπήρχαν περισσότερα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια στις αγελάδες PP από ό,τι στις αγελάδες MP (460 έναντι 173, σύγκριση HC έναντι LC) με λίγες επικαλύψεις. Οι αγελάδες MP στη δίαιτα LC εμφάνισαν αυξημένη ρύθμιση του καταρράκτη συμπληρώματος και πήξης και έμφυτους μηχανισμούς άμυνας του ανοσοποιητικού έναντι των παθογόνων και είχαν μια τάση περισσότερων περιπτώσεων μαστίτιδας και φτωχότερης γονιμότητας. Αντίθετα, οι αγελάδες PP στη δίαιτα HC εμφάνισαν μεγαλύτερες ανοσολογικές αποκρίσεις με βάση τόσο τη γονιδιακή έκφραση όσο και τα φαινοτυπικά δεδομένα και μεγαλύτερο διάστημα από τον τοκετό έως τη σύλληψη. Επομένως, τα λευκοκύτταρα των αγελάδων MP και PP ανταποκρίθηκαν διαφορετικά στις δίαιτες μεταξύ ηλικίας, παροχής θρεπτικών συστατικών και ανοσίας, επηρεάζοντας την υγεία και την επακόλουθη γονιμότητά τους.

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Λέξεις-κλειδιά:ανοσοκαταστολή μετά τον τοκετό. έμφυτη ανοσία? μεταβολισμός; λευκοκύτταρα; δίαιτες γαλουχίας? μεταγραφή; αναπαραγωγή; αγελάδες

1. Εισαγωγή

Πρώιμες μετά τον τοκετό, οι αγελάδες γαλακτοπαραγωγής χαρακτηρίζονται από ανοσοκαταστολή που επηρεάζει την έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία, συμπεριλαμβανομένης τόσο της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας. Τα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα στρατολογούνται σε ιστούς όπως ο μαστικός αδένας και το ενδομήτριο κατά τη διάρκεια της φλεγμονής. Προηγούμενες μελέτες, ωστόσο, έδειξαν μείωση τόσο στον αριθμό των λευκοκυττάρων όσο και στη λειτουργική τους ικανότητα κατά την περίοδο του τοκετού [1,2]. Οι αναφερόμενες επιδράσεις περιλαμβάνουν μειωμένη φαγοκυττάρωση και δραστηριότητα οξειδωτικής έκρηξης [3-5], μειωμένη ανταπόκριση των κυκλοφορούντων Τ-κυττάρων σε μιτογόνους παράγοντες και μειωμένη παραγωγή ανοσοσφαιρίνης από Β-κύτταρα [6,7]. Τα αίτια είναι πολυπαραγοντικά, αλλά φαίνεται να συνδέονται με τον καταμερισμό των θρεπτικών ουσιών προς όφελος της παραγωγής γάλακτος στην αρχή της γαλουχίας, υπονομεύοντας τη λειτουργία του ανοσοποιητικού [8-10]. Τα λευκοκύτταρα απαιτούν επαρκή παροχή γλυκόζης, διαφόρων λιπαρών οξέων και χοληστερόλης ή οξυστερολών για τη συντήρηση και τη λειτουργικότητά τους [8,11,12]. Ωστόσο, η διαθέσιμη παροχή θρεπτικών συστατικών έχει προτεραιότητα στον μαστικό αδένα μετά τον τοκετό, απαιτώντας περίπου 25% περισσότερη μεταβολίσιμη ενέργεια και πρωτεΐνη από ό,τι παρέχεται από την πρόσληψη τροφής [8,13,14]. Επιπλέον, ο τοκετός χαρακτηρίζεται από φλεγμονώδεις διεργασίες που σχετίζονται με αλλαγές στην έκκριση διαφόρων προσταγλανδινών, στεροειδών και κυτοκινών και πιθανούς τραυματισμούς κατά τη διάρκεια της ίδιας της διαδικασίας τοκετού [15-17]. Οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις στον τοκετό και οι μεταβολίτες που απελευθερώνονται κατά την κινητοποίηση των ιστών έχουν ισχυρά ανορεξικά αποτελέσματα, μειώνοντας περαιτέρω τις προσλήψεις και επιδεινώνοντας το αρνητικό ενεργειακό ισοζύγιο (NEB) [18]. Όταν η πρόσληψη τροφής δεν μπορεί να καλύψει την αυξανόμενη ζήτηση ενέργειας, οι αγελάδες εισέρχονται σε μια περίοδο NEB, με ορισμένα άτομα να παρουσιάζουν μεταβολική ανισορροπία [19-21]. Το NEB σχετίζεται με αντίσταση στην ινσουλίνη, μειωμένη έκφραση υποδοχέα ηπατικής αυξητικής ορμόνης (GH) και χαμηλότερη σύνθεση ηπατικού IGF-1 [22,23]. Η αποσύνδεση της GH με την ινσουλίνη στις αγελάδες μετά τον τοκετό είναι μια προσαρμογή που δίνει προτεραιότητα στην παροχή γλυκόζης σε ιστούς όπως τα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού, στα οποία η πρόσληψη είναι ανεξάρτητη από την ινσουλίνη [8]. Σε αυτήν την κατάσταση, ο ανταγωνισμός για την παροχή ενέργειας μεταξύ του μαστικού αδένα και του ανοσοποιητικού συστήματος είναι αναπόφευκτος, καθώς και οι δύο βασίζονται στα ίδια βασικά υποστρώματα και είναι και οι δύο κύριοι καταναλωτές ενέργειας. Οι Kvidera et al. [24] απέδειξε ότι η ενεργοποίηση μιας πλήρους ανοσολογικής απόκρισης στις αγελάδες απαιτούσε 2,5 έως 3,1 kg γλυκόζης την ημέρα. Αυτό είναι παρόμοιο με την εκτιμώμενη απαίτηση 2,7 kg/ημέρα γλυκόζης που προσλαμβάνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του μαστού για παραγωγή γάλακτος 40 kg/ημέρα [8].

Η κινητοποίηση των ιστών σχετίζεται επίσης με αυξημένες συγκεντρώσεις μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων (NEFAs), βήτα-υδροξυβουτυρικού (BHB) και μειωμένης IGF-1, τα οποία συμβάλλουν όλα στη δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού [5,9,10,20 ]. Για παράδειγμα, η πρόσφατη μελέτη μας απέδειξε ότι η προσκόλληση λευκοκυττάρων από κύτταρο σε κύτταρο αναστέλλεται όταν η συγκέντρωση NEFA υπερβαίνει τα 750 μΜ [25]. Αν και η κινητοποίηση των ιστών είναι μια φυσιολογική προσαρμογή των θηλαστικών για την υποστήριξη της γαλουχίας, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η σοβαρή NEB έχει σημαντική επίδραση στην επακόλουθη ικανότητα της αγελάδας να συλλάβει έγκαιρα [26]. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των καθυστερήσεων στην αποκατάσταση του κατάλληλου περιβάλλοντος της μήτρας [2]. εκτεταμένη περίοδο ανωορρηξίας [27], φτωχό ενδοθυλακικό περιβάλλον [28] και μειωμένη ποιότητα ωαρίων [29]. Οι γαλακτοπαραγωγικές δαμαλίδες γεννούν γενικά περίπου το 90% του ώριμου σωματικού τους βάρους [30]. Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι οι πρωτότοκες (PP) αγελάδες είχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις ινσουλίνης, IGF-1 και λεπτίνης στην κυκλοφορία τους, χαμηλότερες συγκεντρώσεις μεταβολιτών στο αίμα (BHB, NEFAs και ουρία) και υψηλότερες συγκεντρώσεις γλυκόζης από τις πολύτοκες (MP ) αγελάδες για τουλάχιστον 7 εβδομάδες μετά τον τοκετό [31,32]. Αυτό δείχνει ότι υπάρχει μικρότερη αποσύνδεση του σωματοτροφικού άξονα στην πρώιμη γαλουχία στις αγελάδες ΡΡ σε σύγκριση με τις αγελάδες MP, που σχετίζεται με ασθενέστερη ιεράρχηση των θρεπτικών ουσιών στον μαστικό αδένα, επιτρέποντας έτσι τη συνεχή ανάπτυξη. Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης στα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα διαφέρουν επίσης μεταξύ των αγελάδων PP και MP κατά την πρώιμη γαλουχία [33].

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Η βελτιστοποίηση της διατροφικής διαχείρισης κατά τη διάρκεια της ξηρής περιόδου μπορεί να αυξήσει την πρόσληψη ξηρής ουσίας (DMI), να μειώσει τη συχνότητα εμφάνισης περιγεννητικής νόσου και να βελτιώσει τη γονιμότητα [34]. Υπάρχουν γενικές οδηγίες για τον τρόπο μείωσης του κινδύνου ασθένειας που σχετίζεται με τη σίτιση και τη διαχείριση [35]. Υπάρχουν, ωστόσο, λίγες διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με τα διαιτητικά σκευάσματα για κάθε αγελάδα σε μεταβολική ανισορροπία κατά την περίοδο μετά τον τοκετό που μπορούν να βελτιώσουν τη λειτουργία του ανοσοποιητικού, να μειώσουν τη συχνότητα της νόσου και να βελτιώσουν την επακόλουθη αναπαραγωγική απόδοση. Η διαμόρφωση δίαιτας με υψηλή δυνατότητα πρόσληψης θρεπτικών συστατικών είναι μια πρακτική προσέγγιση [36]. Στην παρούσα μελέτη, στις αγελάδες κατά την πρώιμη γαλουχία προσφέρθηκαν δίαιτες χαμηλής (LC), μέτριας (MC) ή υψηλής συγκέντρωσης (HC) με βάση τις αναλογίες του συμπυκνώματος προς το ενσίρωμα χόρτου και τις επιπτώσεις στη μεταβολική υγεία και νόσο και τη συστημική ανοσία. με αξιολόγηση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των σφαιρικών κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων) προσδιορίστηκαν. Τα δεδομένα από αγελάδες PP και MP αναλύθηκαν χωριστά για να αποφευχθεί οποιαδήποτε συγχυτική επίδραση που προέκυψε από την ισοτιμία. Η υπόθεσή μας ήταν ότι οι δίαιτες υψηλής συγκέντρωσης θα βελτίωναν τη λειτουργία του ανοσοποιητικού και θα ωφελούσαν τη γονιμότητα.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

2. Αποτελέσματα

2.1. Επίδραση της δίαιτας στην πρόσληψη ξηρής ύλης, την απόδοση γάλακτος, το ενεργειακό ισοζύγιο και τους μεταβολίτες του αίματος

Οι παράμετροι γάλακτος, το σωματικό βάρος (BW), το DMI, η βαθμολογία της κατάστασης του σώματος (BCS), το ενεργειακό ισοζύγιο (EBAL) και οι μεταβολίτες του αίματος για τις αγελάδες MP και PP σε περίπου 14 ημέρες στο γάλα (DIM) συνοψίζονται στον Πίνακα 1. DMI για οι αγελάδες MP ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των τριών διατροφικών ομάδων με τη σειρά HC > MC > LC (p < 0.01–{0.0{{11 }}1). Η απόδοση γάλακτος στις αγελάδες MP που έλαβαν τις δίαιτες HC ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτές που έλαβαν δίαιτα LC (p < 0.05). Η διαφορά στην ενεργειακά διορθωμένη απόδοση γάλακτος (ECM) μεταξύ των ομάδων LC και HC ήταν σημαντική (p < 0.05), με ενδιάμεσες τιμές στην ομάδα MC. Οι τιμές EBAL και στις τρεις ομάδες MP ήταν αρνητικές, αλλά αυτές στις αγελάδες MC και HC ήταν σημαντικά καλύτερες (λιγότερο αρνητικές) από ό,τι στις αγελάδες LC (p < 0,01). Οι κυκλοφορούσες συγκεντρώσεις τόσο της γλυκόζης (ρ < 0,01) όσο και του IGF-1 (ρ < 0,001) στις αγελάδες HC ήταν σημαντικά υψηλότερες από ό,τι στις αγελάδες LC. Οι αγελάδες MP που προσέφεραν δίαιτες HC παρήγαγαν επίσης λιγότερη κυκλοφορούσα ουρία (p < 0,001), BHB (p < 0,05) και NEFA από εκείνες που προσέφεραν δίαιτες LC με συγκεντρώσεις LC > MC > HC, αν και οι διαφορές στις συγκεντρώσεις NEFA μεταξύ των διατροφικών ομάδων δεν ήταν στατιστικά σημαντικές.

Πίνακας 1. Συνολικές προσλήψεις ξηρής ουσίας, παράμετροι γάλακτος, σωματικά βάρη, ενεργειακό ισοζύγιο, βαθμολογία σωματικής κατάστασης και μεταβολίτες αίματος περίπου 14 ημέρες μετά τον τοκετό, αναλύθηκαν σύμφωνα με την ισοτιμία και τη δίαιτα 1,2

Στις αγελάδες PP, εκείνες που έλαβαν δίαιτα MC ή HC είχαν υψηλότερο DMI από εκείνες που έλαβαν δίαιτα LC (p < {0}}.01). Οι αποδόσεις γάλακτος δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές. Το EBAL ήταν θετικό σε αγελάδες στις οποίες προσφέρθηκαν δίαιτες MC ή HC ενώ για εκείνες στις οποίες προσφέρθηκε δίαιτα LC, ήταν αρνητικό. Οι διαφορές στο EBAL μεταξύ των αγελάδων HC και LC PP ήταν σημαντικές (p < 0,05). Από τους μεταβολίτες που μετρήθηκαν, μόνο οι συγκεντρώσεις ουρίας διέφεραν μεταξύ των ομάδων, καθώς ήταν χαμηλότερες στις αγελάδες HC (LC > MC > HC, p < 0,001 για LC έναντι HC ή MC).

2.2. Επίδραση της δίαιτας στις φλεγμονώδεις παραμέτρους

Οι επιδράσεις της δίαιτας στις φλεγμονώδεις παραμέτρους που μετρήθηκαν στη μήτρα και τον μαστικό αδένα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Στις αγελάδες ΡΡ, η αναλογία πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων προς επιθηλιακά κύτταρα της μήτρας (PMNs: UECs) που συλλέχθηκαν από τη μήτρα με χρήση κυτταροβούρτσας ήταν σημαντικά υψηλότερη για οι αγελάδες στο HC σε σύγκριση με τη δίαιτα LC (p < 0.05). Στις αγελάδες MP, η τάση ήταν προς την ίδια κατεύθυνση, με LC < MC < HC, αλλά δεν πέτυχε στατιστική σημασία. Στο γάλα, οι αγελάδες MP στη δίαιτα LC είχαν σημαντικά υψηλότερο SCC από εκείνες με δίαιτα MC ή HC (p < 0.05), ενώ στις αγελάδες PP η μη σημαντική τάση ήταν προς την αντίθετη κατεύθυνση . Οι συγκεντρώσεις της Ν-ακετυλ- -d-γλυκοζαμινιδάσης (NAGase) και της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) γάλακτος, ένζυμα γάλακτος ενδεικτικά της μαστίτιδας, ακολούθησαν τις ίδιες γενικές τάσεις με τις τιμές SCC, αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν από τα αρχεία υγείας. Οι αγελάδες MP σε δίαιτα HC δεν παρουσίασαν καμία περίπτωση μαστίτιδας (0/15) ενώ 4/14 (28,6%) των αγελάδων σε δίαιτα LC διαγνώστηκαν με κλινική μαστίτιδα εντός 16 ημερών από τον τοκετό. Η τάση ήταν και πάλι προς την αντίθετη κατεύθυνση για τις αγελάδες PP με μία από τις έξι (16,7%) στη δίαιτα LC με κλινική μαστίτιδα σε σύγκριση με μία περίπτωση κλινικής και δύο υποκλινικής μαστίτιδας στη δίαιτα HC (50%).

Πίνακας 2. Φλεγμονώδεις παράμετροι περίπου 14 ημέρες μετά τον τοκετό σύμφωνα με την ισοτιμία και τη δίαιτα 1,2.

2.3. Δεδομένα Γονιμότητας

Λεπτομέρειες για τα δεδομένα γονιμότητας δίνονται στον Πίνακα 3. Για τις αγελάδες MP, εκείνες που έκαναν δίαιτα LC χρειάστηκαν λίγο περισσότερο χρόνο για να συλλάβουν και χρειάστηκαν περισσότερες υπηρεσίες ανά σύλληψη από τις αγελάδες HC (2,4 ± 0).42 έναντι 1,6 ± 0.23), παρόλο που περισσότερες από τις αγελάδες HC είτε δεν εξυπηρετήθηκαν (απόφαση διαχείρισης) είτε απέτυχαν να συλλάβουν καθόλου (6{{1{{0}}.0% έναντι 71,4%). Καμία από αυτές τις διαφορές, ωστόσο, δεν ήταν σημαντική. Για τις αγελάδες PP, το αντίστροφο ίσχυε, με τις αγελάδες LC να έχουν το μικρότερο διάστημα μέχρι τη σύλληψη κατά 29 ημέρες (p < {{{0}}.05), με πέντε από τα έξι ζώα να συλλαμβάνουν την πρώτη τους υπηρεσία . Αντίθετα, η μισή ομάδα HC είτε δεν εξυπηρετήθηκε (n=2) είτε απέτυχε να συλλάβει (n=1), με τις τρεις που συνέλαβαν να απαιτούν 2,0 ± 0,41 υπηρεσίες ανά σύλληψη. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα η ομάδα HC να έχει σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία "σε μοσχάρι κατά" (ICB) (ρ < 0,05).

Πίνακας 3. Στοιχεία γονιμότητας κατά ισοτιμία και δίαιτα 1,2

2.4. Μεταγραφικά προφίλ λευκοκυττάρων σε αγελάδες που προσφέρουν διαφορετικές αναλογίες συμπυκνώματος

Το βόειο γονιδίωμα αναφοράς του ARS-UCD 1.2 που παρέχεται από το RefSeq (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly, πρόσβαση την 1η Μαΐου 2022) περιέχει 35.158 γονίδια, εκ των οποίων τα 19.001 γονίδια λευκοκυττάρων ήταν ποσοτικά μετρήσιμα κατά την ανάγνωση της αλληλουχίας στα αρχεία FASTQ αντιστοιχίστηκαν σε αυτό. Διαγράμματα ηφαιστείων που δείχνουν τα προφίλ έκφρασης και στις δύο αγελάδες MP και PP που λαμβάνουν τις τρεις διαφορετικές δίαιτες παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Στις αγελάδες MP, υπήρχαν 173 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) στη σύγκριση μεταξύ HC και LC, 126 μεταξύ MC και LC και 68 για HC έναντι MC (Συμπληρωματικό αρχείο S1A–C). Το διάγραμμα Venn επέδειξε ότι κανένα γονίδιο (κοινό DEG) δεν ήταν σημαντικό και στις τρεις διατροφικές συγκρίσεις (Εικόνα 2Α). Στις αγελάδες PP, υπήρχαν 460 DEG στη σύγκριση HC έναντι LC, 178 μεταξύ MC έναντι LC και 128 μεταξύ HC έναντι MC (Συμπληρωματικό Αρχείο S2A–C). Μόνο ένα κοινό γονίδιο (DCN, αλλαγή πτυχής (FC)=−7.3) ήταν σημαντικό και στις τρεις διατροφικές συγκρίσεις (Εικόνα 2Β). Αυτό κωδικοποιεί τη ντεκορίνη, μια πρωτεΐνη που παίζει ρόλο στη συναρμολόγηση των ινιδίων κολλαγόνου. Συνολικά, ήταν αξιοσημείωτο ότι ένας μεγαλύτερος αριθμός DEG βρέθηκε στις διατροφικές συγκρίσεις της έκφρασης γονιδίων λευκοκυττάρων στην PP από ό,τι στις αγελάδες MP παρά τα μικρότερα μεγέθη της ομάδας, με την πλειοψηφία αυτών των γονιδίων να ρυθμίζονται προς τα πάνω στη δίαιτα HC. Επιπλέον, υπήρξε μικρή επικάλυψη στα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν μεταξύ των διαφορετικών ηλικιακών ομάδων, όπως φαίνεται στα διαγράμματα Venn στο Σχήμα 3. Αυτό υποδηλώνει ότι οι δίαιτες είχαν διαφορετικές επιδράσεις στο μεταγραφικό λευκοκυττάρων σε αγελάδες ΡΡ και ΜΡ. Και στις δύο ηλικιακές ομάδες, οι μεγαλύτερες διαφορές βρέθηκαν μεταξύ των αγελάδων στις οποίες προσφέρθηκαν οι δίαιτες LC έναντι HC, επομένως εστιάσαμε σε αυτή τη σύγκριση στις επόμενες αναλύσεις.

Εικόνα 1. Τα ηφαίστεια δείχνουν τα προφίλ έκφρασης και στις δύο αγελάδες MP και PP που λαμβάνουν τρεις διαφορετικές δίαιτες. (A) MP αγελάδες HC έναντι LC, (B) αγελάδες MP HC έναντι MC, (C) αγελάδες MP MC έναντι LC, (D) PP HC έναντι LC, (E) PP HC έναντι MC και (F) ) PP MC εναντίον LC. HC: υψηλό συμπύκνωμα (n=6 σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP), MC: μεσαίο συμπύκνωμα (n=5 σε αγελάδες PP και n=15 σε αγελάδες MP ), και LC: χαμηλή συγκέντρωση (n=6 σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP). Οι αλλαγές στο fold μεταμορφώθηκαν2-. Οι πράσινες κουκκίδες υποδεικνύουν τα προς τα κάτω ρυθμισμένα γονίδια με p (BH) < 0.05 και διπλές αλλαγές Λιγότερο από ή ίσο με -1,5 και οι κόκκινες κουκκίδες υποδεικνύουν ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια με p (BH) < {{ 16}}.05 και αλλαγές στο πάσο Μεγαλύτερο ή ίσο με 1,5. Οι πορτοκαλί κουκκίδες υποδεικνύουν τα γονίδια με p (BH) < 0,05 αλλά αλλαγές απόλυτης πτυχής < 1,5.

Σχήμα 2. Διαγράμματα Venn που δείχνουν τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από τα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα μεταξύ των τριών διαιτητικών ομάδων σε (Α) πολύτοκες (MP) αγελάδες και (Β) πρωτότοκες (PP) αγελάδες. HC: υψηλό συμπύκνωμα (n=6 σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP), MC: μεσαίο συμπύκνωμα (n=5 σε αγελάδες PP και n=15 σε αγελάδες MP ) και LC: χαμηλή συγκέντρωση (n=6 σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP).

Σχήμα 3. Διαγράμματα Venn που δείχνουν τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια από τα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα μεταξύ των αγελάδων ΡΡ και ΜΡ στις συγκρίσεις του (Α) υψηλού συμπυκνώματος (HC) με το χαμηλό συμπύκνωμα (LC). (Β) HC με μέσο συμπύκνωμα (MC) και (C) MC με LC. HC: n=6 σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP, MC: n=5 σε αγελάδες PP και n=15 σε αγελάδες MP και LC: n {{5 }} σε αγελάδες PP και n=14 σε αγελάδες MP

2.5. Σύγκριση των προφίλ έκφρασης γονιδίων λευκοκυττάρων μεταξύ πολύτοκων αγελάδων που λαμβάνουν δίαιτα με υψηλή ή χαμηλή συγκέντρωση

Τα κορυφαία 20 ρυθμισμένα προς τα πάνω και προς τα κάτω DEG που κατατάσσονται με τις τιμές p (BH προσαρμοσμένα) στις αγελάδες MP που τρέφονται με HC σε σύγκριση με εκείνες που τρέφονται με δίαιτα LC δίνονται στο Συμπληρωματικό Αρχείο S1D, E. Μεταξύ των προς τα πάνω ρυθμιζόμενων DEG, οι περισσότερες συμμετείχαν στην GO λειτουργίες της διαδικασίας του ανοσοποιητικού συστήματος, του μεταβολισμού και της απόκρισης σε ερέθισμα, με πολλές πρωτεΐνες που κωδικοποιούν να έχουν πολλαπλούς ρόλους. Για παράδειγμα, το ALAS2 (που κωδικοποιεί την 50 -αμινολεβουλινική συνθάση 2) ​​παίζει ρόλο στη μεταβολική διαδικασία, την απόκριση σε ερέθισμα και την αναπτυξιακή διαδικασία. Το COL1A1 (αλυσίδα άλφα 1 κολλαγόνου τύπου Ι) και το DAB2 εμπλέκονται στον μεταβολισμό, την απόκριση σε ερέθισμα, τον πολυκύτταρο οργανισμό, την κίνηση και την ανάπτυξη. Τα κορυφαία 20 γονίδια με μείωση της ρύθμισης απεικονίζουν ένα σαφές θέμα των αλλαγών στην ανοσία με 14 συσχετισμένες DEG. Από αυτά, τα DMTB1, FGA, FGB και TF κωδικοποιούν αντιμικροβιακά πεπτίδια, τα ALB και TF κωδικοποιούν πρωτεΐνες αρνητικής οξείας φάσης (APP) και τα FGA και FGG κωδικοποιούν θετικές ΑΡΡ. Οκτώ γονίδια παίζουν ρόλο στο μεταβολισμό και 10 εμπλέκονται στην απόκριση σε ερέθισμα.

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

Οι DEG λευκοκυττάρων που προέρχονται από τη σύγκριση της HC με την ομάδα LC υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ανάλυση εμπλουτισμού GO. Τα 76 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG εμπλουτίστηκαν σημαντικά με 208 λειτουργίες, εκ των οποίων οι κορυφαίες 20 με βάση τις βαθμολογίες εμπλουτισμού φαίνονται στο Σχήμα 4Α. Αυτά συσχετίστηκαν με διάφορες πτυχές της κυτταρικής λειτουργίας, με τον αυξητικό παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια να δεσμεύεται από πάνω. Πολλές λειτουργίες σχετίζονταν με τον μεταβολισμό των πρωτεϊνών και των αμινοξέων (συμπεριλαμβανομένου των APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B και P2RY12 στις περισσότερες από αυτές), τη βιομεταλλοποίηση και την επεξεργασία κολλαγόνου (που περιλαμβάνει COL1A1, COL1A2, SPP1 και TUFT1) και την επικοινωνία των κυττάρων. Αντίθετα, οι κορυφαίες λειτουργίες των 97 μειωμένων DEGs είχαν ένα σαφές θέμα των διαφόρων διεργασιών ανοσολογικής άμυνας (Εικόνα 4Β) που συνδέονταν κυρίως με 20 DEG. Από αυτές, η FGA (μια θετική APP) υπορυθμίστηκε κατά 85-πλάσια στη σύγκριση HC έναντι LC. Ένα εργαλείο προγράμματος περιήγησης GO συνόψισε τις βιολογικές λειτουργίες των DEG που ρυθμίζονται προς τα πάνω και προς τα κάτω σε οκτώ σημαντικές κατηγορίες (Πίνακας 4). Εκτός από τη βιομεταλλοποίηση, όλες οι άλλες βιολογικές λειτουργίες, ειδικά αυτές που σχετίζονται με την ανοσολογική άμυνα, συσχετίστηκαν κατά κύριο λόγο με τους μειωμένους DEG.

Εικόνα 4. Κορυφαίες 20 συναρτήσεις GO που σχετίζονται με τα DEG που προέρχονται από συγκρίσεις HC έναντι LC. (A) MP με ανοδική ρύθμιση DEG, (B) MP με μειωμένη ρύθμιση DEG, (C) PP με ανοδική ρύθμιση DEG και (D) PP προς τα κάτω DEG.

Πίνακας 4. Σύνοψη των κύριων λειτουργιών εμπλουτισμού GO των λευκοκυττάρων DEG στη σύγκριση μεταξύ των πολυτοκών αγελάδων που λαμβάνουν δίαιτα με υψηλή (n=14) και χαμηλή (n=14) δίαιτα στην πρώιμη γαλουχία.

Πίνακας 4. Συνέχεια.

Τα συνδυασμένα προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένα DEG (n=173) εμπλουτίστηκαν σημαντικά με 23 μονοπάτια KEGG που σχετίζονταν κυρίως με διάφορες ανοσολογικές και μεταβολικές διεργασίες (Πίνακας 5). Οι καταρράκτες του συμπληρώματος και της πήξης βρίσκονταν στην κορυφή με οκτώ μειωμένα DEG (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 και VTN). Η φλεγμονώδης οδός της σηματοδότησης τύπου NOD συσχετίστηκε με έξι DEG (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z και OAS2), εκ των οποίων όλες εκτός από το MAPK10 είχαν μειωθεί. Η οδός πέψης και απορρόφησης πρωτεϊνών περιείχε έξι DEG, εκ των οποίων οι τρεις (COL1A1, COL1A2 και COL3A1) ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και τρεις υπορυθμίστηκαν (CELA2A, COL5A3 και ELN). Πέντε ρυθμισμένα προς τα κάτω DEG εμπλέκονταν στη σηματοδοτική οδό των υποδοχέων που ενεργοποιούνται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος (PPARs) (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 και PCK1). Οι οδοί της αλληλεπίδρασης εξωκυτταρικής μήτρας-υποδοχέα, η εστιακή προσκόλληση και η σηματοδότηση σφιγγολιπιδίου εμπλέκονται στη διατήρηση της δομής των κυττάρων και των ιστών.

Πίνακας 5. Σημαντικές οδοί που προσδιορίζονται από τον εμπλουτισμό της οδού KEGG που σχετίζονται με διαφορικά εκφρασμένα γονίδια λευκοκυττάρων στις πολύτοκες αγελάδες που προσέφεραν δίαιτα με υψηλή συγκέντρωση συμπυκνωμάτων (n=14) σε σύγκριση με εκείνες που προσφέρθηκαν δίαιτα χαμηλής συγκέντρωσης (n=14).

2.6. Σύγκριση μοτίβων έκφρασης γονιδίων λευκοκυττάρων μεταξύ πρωτότοκων αγελάδων που λαμβάνουν δίαιτες υψηλής ή χαμηλής συγκέντρωσης

Τα κορυφαία 20 κυκλοφορούντα DEG λευκοκυττάρων στις αγελάδες PP που τρέφονταν με HC σε σύγκριση με τις δίαιτες LC παρατίθενται στο Συμπληρωματικό Αρχείο S2D, E. Οι ανοσολογικές και μεταβολικές διεργασίες κυριαρχούσαν στις βιολογικές λειτουργίες των κορυφαίων ρυθμιζόμενων DEG, που περιέχουν 11 και 12 DEG αντίστοιχα. Μεταξύ αυτών, τα ACSL6, MMP9 και SLC11A1 εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των λευκοκυττάρων και τα ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 και PADI4 στην αναπτυξιακή διαδικασία. Το SLC40A1 είναι ένας σημαντικός μεταφορέας σιδήρου που παίζει βασικό ρόλο στην εξισορρόπηση των κυτταρικών και συστηματικών επιπέδων σιδήρου. Μερικά από αυτά τα DEG κωδικοποιούν πρωτεΐνες με πολλαπλές λειτουργίες. Για παράδειγμα, τα MMP9, DUSP1, SLC11A1 και COL1A2 σχετίζονται με τις περισσότερες από τις παραπάνω λειτουργίες GO. Οι βιολογικές λειτουργίες των ρυθμιζόμενων από την κορυφή προς τα κάτω DEG ήταν πιο διαφορετικές. Υπήρχαν οκτώ DEG που εμπλέκονταν στη διαδικασία του ανοσοποιητικού συστήματος, πέντε έπαιζαν ρόλους στο μεταβολισμό και δύο σχετίζονταν τόσο με τον πολλαπλασιασμό των λευκοκυττάρων όσο και με τη διαδικασία ανάπτυξης (EPCAM και FCRL3). Και πάλι, μερικά DEG, για παράδειγμα CD96 και FCRL3, κωδικοποιούν πρωτεΐνες με πολλαπλούς ρόλους.

Στις αγελάδες PP, 382 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG που προέρχονται από τη σύγκριση HC έναντι LC συσχετίστηκαν σημαντικά με 690 λειτουργίες GO, με τις κορυφαίες 20 να παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Γ. Όλα αυτά αφορούσαν 116 DEG (Συμπληρωματικό Αρχείο S2F) με διάφορες ανοσολογικές δραστηριότητες. Η κορυφαία λειτουργία ήταν η οδός σηματοδότησης του υποδοχέα της κυτταρικής επιφάνειας. Αυτό συσχετίστηκε με 43 DEG που περιλάμβαναν γονίδια που κωδικοποιούν πολλούς υποδοχείς για ανοσοσυνδέτες, όπως CXCR1, CXCR2, IL17RD και IL1RAP. Αυτή η λειτουργία είχε έξι σημαντικές υπολειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της οδού σηματοδότησης με τη μεσολάβηση λιποπολυσακχαρίτη (LPS) (PTAFR, TLR4 και SCARB1) και της οδού σηματοδότησης υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας που ρυθμίζεται από την ανοσοαπόκριση. Η κορυφαία υπολειτουργία στη ρύθμιση της διαδικασίας του πολυκύτταρου οργανισμού ήταν η ρύθμιση της παραγωγής κυτοκίνης, με 24 ρυθμιζόμενες προς τα πάνω DEGs, όπως τα MARK13, LTF και TLR4. Υπήρχαν λιγότερα DEG που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (μόνο 78) που συσχετίστηκαν με 298 σημαντικές λειτουργίες GO, με χαμηλότερες βαθμολογίες εμπλουτισμού και πιο ποικίλες βιολογικές διεργασίες. Το Σχήμα 4Δ δείχνει τις κορυφαίες 20 λειτουργίες. Ορισμένοι από αυτούς συσχετίστηκαν με πτυχές της ανοσίας, όπως η κυτταρική προσκόλληση, η ρύθμιση της παραγωγής μεσολαβητή της ανοσοαπόκρισης, η απόκριση στο LPS και η απόκριση σε μόρια βακτηριακής προέλευσης. Άλλα σχετίζονταν με τη διατήρηση της ομοιόστασης, όπως η κυτταρική επιφάνεια, η κυτταρόλυση, η διαμεμβρανική μεταφορά και η ενδοπεπτιδάση τύπου σερίνης. Η περίληψη των σημαντικών βιολογικών λειτουργιών που σχετίζονται τόσο με τα πάνω όσο και με τα μειωμένα DEG δημιούργησε επτά κατηγορίες (Πίνακας 6), με τη διαδικασία του ανοσοποιητικού συστήματος στην κορυφή και τις περισσότερες από τις άλλες λειτουργίες που σχετίζονται επίσης με την ανοσολογική άμυνα. Για παράδειγμα, η μετακίνηση εμπλουτίστηκε από τους DEG με χημειοτακτικές και ανοσολογικές ιδιότητες και αλληλεπίδραση μεταξύ των οργανισμών μεταξύ των ειδών, η οποία περιλαμβάνει τη θανάτωση παθογόνων που έχουν εισβάλει. Τόσο η κυτταρική διαδικασία όσο και η βιολογική ρύθμιση συσχετίστηκαν με μεγάλους αριθμούς DEG. Η κυτταρική διαδικασία (n=239 DEG) περιλάμβανε πολλές υπολειτουργίες που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση, τη θανάτωση κυττάρων, την ενεργοποίηση των ανοσοκυττάρων και τον πολλαπλασιασμό του κυτταρικού πληθυσμού. Η βιολογική ρύθμιση (125 DEGs) περιλαμβάνει επίσης πολλές ανοσολογικές δραστηριότητες, όπως ρύθμιση της διαδικασίας του ανοσοποιητικού συστήματος, κίνηση και απόκριση σε ερέθισμα. Όλες αυτές οι λειτουργίες περιείχαν κατά κύριο λόγο ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG στη δίαιτα HC.

Πίνακας 6. Σύνοψη των κύριων λειτουργιών εμπλουτισμού GO των DEG στη σύγκριση μεταξύ των πρωτότοκων αγελάδων που προσέφεραν δίαιτες με υψηλή (n=6) και χαμηλή (n=6) πυκνότητα στην πρώιμη γαλουχία.

Πίνακας 6. Συνέχεια.

Οι συνδυασμένες προς τα πάνω και προς τα κάτω DEGs (460) στις αγελάδες PP εμπλουτίστηκαν με 35 σημαντικές οδούς KEGG (Πίνακας 7). Πολλές συσχετίστηκαν με μεταβολικές διεργασίες που περιλαμβάνουν αμινοξέα (βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, αργινίνη και γλουταθειόνη), πρωτεΐνες, λιπίδια (αραχιδονικό οξύ, γλυκερολιπίδιο και χοληστερόλη), βιταμίνη Β6 και ορισμένες ορμόνες (αλδοστερόνη, κορτιζόλη, θυρεοειδής και αυξητική ορμόνη ). Αυτά τα μεταβολικά μονοπάτια εμπλουτίστηκαν κυρίως με τα DEG που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στη δίαιτα HC. Για παράδειγμα, η βιοσύνθεση αμινοξέων συσχετίστηκε με πέντε ρυθμισμένα προς τα πάνω DEGs (ARG2, ASS1, GPT2, SDS και SDSL), η οδός σύνθεσης, έκκρισης και δράσης της αυξητικής ορμόνης εμπλουτίστηκε με έξι ρυθμισμένες προς τα πάνω (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS , MAPK13 και SOCS3) και μία μειωμένη ρύθμιση (BCAR1) DEGs και ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος περιείχαν πέντε ρυθμιζόμενες προς τα πάνω DEGs (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 και TBXAS1). Αρκετά μονοπάτια που σχετίζονται με την ανοσολογική/φλεγμονώδη διαδικασία εμπλουτίστηκαν επίσης σημαντικά, και πάλι κυρίως με ρυθμισμένα προς τα πάνω DEGs. Αυτά περιελάμβαναν οδούς σηματοδότησης χημειοκίνης, MAPK και TNF και καταρράκτες συμπληρώματος και πήξης. Για παράδειγμα, η οδός σηματοδότησης χημειοκίνης περιείχε οκτώ ρυθμισμένα προς τα πάνω (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 και HCK) και δύο προς τα κάτω ρυθμισμένα DEG (BCAR1 και CCR5), η οδός σηματοδότησης TNF περιείχε έξι ρυθμιζόμενες προς τα πάνω DEGBBRE52, , FOS, MAPK13, MMP9 και SOCS3) και τα μονοπάτια σηματοδότησης MAPK περιείχαν 12 ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG, συμπεριλαμβανομένων των IL1A, MAP3K6 και MAPK13.

Πίνακας 7. Σημαντικές οδοί που προσδιορίζονται από τον εμπλουτισμό της οδού Kegg που σχετίζονται με διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια λευκοκυττάρων στις πρωτότοκες αγελάδες που προσέφεραν δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε συμπύκνωμα (n=6) σε σύγκριση με εκείνες στις οποίες προσφέρθηκε δίαιτα χαμηλής συγκέντρωσης (n=6).

3. Συζήτηση

Οι γαλακτοπαραγωγικές αγελάδες μετά τον τοκετό έχουν ομοιοστατικούς μηχανισμούς για τον έλεγχο της κατανομής των θρεπτικών ουσιών μεταξύ της γαλουχίας και άλλων σημαντικών λειτουργιών της ζωής, όπως η ανοσία και η ανάπτυξη [8]. Η κινητοποίηση των ιστών είναι μια φυσιολογική προσαρμογή των θηλαστικών για την υποστήριξη της γαλουχίας, αλλά ορισμένες αγελάδες παρουσιάζουν μεταβολική ανισορροπία [35,37]. Τέτοια ζώα βιώνουν υπερβολική κινητοποίηση λιπώδους ιστού, αντίσταση στην ινσουλίνη και συστηματική φλεγμονή που συμβάλλουν στην εξασθενημένη ανοσία που παρατηρείται συχνά αυτή τη στιγμή [38]. Αυτό σχετίζεται με φλεγμονώδεις μεσολαβητές όπως ο TNF και η IL6 [39,40]. Την ημέρα 14 μετά τον τοκετό, όταν συλλέχθηκαν τα κυκλοφορούντα δείγματα λευκοκυττάρων σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα είχαν επομένως εκτεθεί σε μια περίοδο φλεγμονώδους διέγερσης. Έχουμε αποδείξει χρησιμοποιώντας ανάλυση αλληλουχίας επόμενης γενιάς και ανάλυση βιοπληροφορικής ότι οι δίαιτες με διαφορετικές αναλογίες συμπυκνώματος παρήγαγαν διαφορετικά αποτελέσματα στο κυκλοφορούν μεταγραφικό λευκοκυττάρων σε αγελάδες PP και MP κατά την πρώιμη γαλουχία. Αυτό συνδέθηκε με διαφορές στην υγεία και τη γονιμότητά τους. Αυτές οι πληροφορίες έχουν προσθέσει νέα ευρήματα στην προηγούμενη έκθεσή μας σχετικά με τις διατροφικές επιδράσεις στην παραγωγή γάλακτος και στο ανοσοποιητικό [32].

3.1. Σύγκριση των επιπτώσεων της δίαιτας με υψηλή και χαμηλή συγκέντρωση συμπυκνωμάτων στις πολύτοκες αγελάδες

Οι αγελάδες MP στις δίαιτες HC είχαν υψηλότερο DMI από τις αγελάδες MC και LC και αυτό συσχετίστηκε με υψηλότερες κυκλοφοριακές συγκεντρώσεις τόσο της γλυκόζης όσο και του IGF{{0}}. Αυτό οδήγησε τις αγελάδες HC να βρίσκονται σε λιγότερο σοβαρό NEB και να παράγουν περισσότερο γάλα. Η δίαιτα HC διαμορφώθηκε για να καλύπτει τις ενεργειακές και πρωτεϊνικές απαιτήσεις τόσο για τη γαλουχία όσο και για τη διατήρηση της σωματικής ομοιόστασης και οι μετρήσεις μεταβολιτών επιβεβαίωσαν ότι η μεταβολική τους κατάσταση ήταν πράγματι καλύτερη από ό,τι για τις αγελάδες LC, με μικρότερη απαίτηση για κινητοποίηση ιστών για την κάλυψη των ενεργειακών απαιτήσεων. Αυτό θα βοηθήσει στην επιτάχυνση της επίλυσης των φλεγμονωδών διεργασιών μετά τον τοκετό, καθώς πολλές φλεγμονώδεις ασθένειες στην πρώιμη γαλουχία σχετίζονται ή προκαλούνται από μεταβολικές διαταραχές [38] και δείξαμε προηγουμένως ότι η φλεγμονή της μήτρας επιλύθηκε πιο γρήγορα σε αγελάδες με καλύτερη κατάσταση ενεργειακής ισορροπίας [2]. Στην παρούσα μελέτη, δεν υπήρχε διαφορά στην αναλογία των PMNs προς τα επιθηλιακά κύτταρα στον αυλό της μήτρας σύμφωνα με τη διατροφή στις αγελάδες MP. Αυτός ο δείκτης λαμβάνεται συχνά ως δείκτης κυτταρολογικής ενδομητρίτιδας [41]. Διαφορές ανάλογα με τη διατροφή, ωστόσο, παρατηρήθηκαν στον μαστικό αδένα καθώς οι αγελάδες LC είχαν υψηλότερο SCC και αυτό συσχετίστηκε με ένα μεγαλύτερο ποσοστό αυτών που εμφάνισαν κλινική μαστίτιδα κατά τη διάρκεια των πρώτων 16 DIM (28,6% έναντι 0% στο LC έναντι Ομάδες HC).

Οι περισσότεροι από τους DEG που εντοπίστηκαν στην ανάλυση του μεταγραφώματος των λευκοκυττάρων εμπλέκονταν σε ανοσολογικές και/ή μεταβολικές διεργασίες, όπως αναμενόταν σε έναν πληθυσμό ανοσοκυττάρων. Η πιο σημαντική οδός KEGG ήταν ο καταρράκτης του συμπληρώματος και της πήξης, που περιελάμβανε έξι από τα πιο υψηλά υπορυθμισμένα γονίδια στις αγελάδες HC. Από αυτά, το CFB κωδικοποιεί τον παράγοντα Β του συμπληρώματος, ένα συστατικό της εναλλακτικής οδού ενεργοποίησης του συμπληρώματος. Τα FGA, FGB και FGG κωδικοποιούν τρεις υπομονάδες του ινωδογόνου παράγοντα πήξης, ένα βασικό συστατικό του θρόμβου αίματος που είναι επίσης σημαντικό στη δέσμευση βακτηρίων στα αιμοπετάλια [42]. Η υψηλού μοριακού βάρους μορφή κινινογόνου, που κωδικοποιείται από το KNG1, είναι επίσης απαραίτητη για την πήξη του αίματος και το κινινογόνο απελευθερώνει βραδυκινίνη, ένα πεπτίδιο με διάφορες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της αντιβακτηριακής και αντιμυκητιακής δράσης. Η βιτρονεκτίνη, που κωδικοποιείται από το VTN, εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση της οδού πήξης και στην επούλωση των πληγών, ενώ η περιοχή δέσμευσης της ηπαρίνης παρέχει αντιμικροβιακές ιδιότητες. Το PROC κωδικοποιεί μια γλυκοπρωτεΐνη πλάσματος της οποίας η ενεργοποιημένη μορφή περιέχει μια περιοχή πρωτεάσης σερίνης που λειτουργεί στην αποικοδόμηση των ενεργοποιημένων μορφών των παραγόντων πήξης V και VIII, ενώ το SERPINA1 κωδικοποιεί έναν αναστολέα πρωτεάσης σερίνης οι στόχοι του οποίου περιλαμβάνουν πλασμίνη, θρομβίνη και ενεργοποιητή πλασμινογόνου. Η ανοδική ρύθμιση του συμπληρώματος και του καταρράκτη πήξης έχει προηγουμένως αποδειχθεί στον ιστό του μαστού ως μια πρώιμη απόκριση του ξενιστή στο E. coli ή τον σταφυλόκοκκο. λοίμωξη του aureus [43]. Καθώς αυτή η οδός εκφράστηκε περισσότερο στις αγελάδες που ακολουθούσαν δίαιτα LC, αυτό υποστηρίζει στοιχεία για μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης μαστίτιδας σε αυτά τα ζώα.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Μια άλλη κορυφαία λειτουργία που συνοψίστηκε από το πρόγραμμα περιήγησης GO ήταν η διαδικασία θανάτωσης παθογόνων (αλληλεπίδραση μεταξύ των οργανισμών μεταξύ των ειδών), η οποία συσχετίστηκε με 14 μειωμένα DEG στις αγελάδες HC (Πίνακας 4). Αυτό περιελάμβανε έναν αριθμό γονιδίων που εμπλέκονται στην αντιική δράση (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 και RSAD2) που εκφράστηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα. Από αυτά, η IFNB1 κωδικοποιεί την ιντερφερόνη βήτα 1 ενώ τα άλλα είναι όλα γονίδια που διεγείρονται από την ιντερφερόνη [44,45]. Όλα αποτελούν επίσης μέρος της οδού σηματοδότησης του υποδοχέα τύπου NOD (NLR). Οι NLRs είναι υποδοχείς αναγνώρισης κυτταροπλασματικών προτύπων που ενεργοποιούνται από διάφορα μη αυτοσυστατικά, συμπεριλαμβανομένης της βακτηριακής πεπτιδογλυκάνης, που δυνητικά προκαλεί την έναρξη NF-kappa B-/AP{21}}εξαρτώμενης έκφρασης προφλεγμονωδών κυτοκινών, έκφραση ιντερφερονών τύπου Ι, αυτοφαγία και φλεγμονή [46]. Η πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι αυτή η οδός ρυθμίστηκε προς τα πάνω στα λευκοκύτταρα από αγελάδες μολυσμένες με E. coli [47]. Ένα άλλο γονίδιο που αναγνωρίστηκε ήταν το MPO, το οποίο κωδικοποιεί τη μυελοϋπεροξειδάση, ένα ένζυμο που αποθηκεύεται σε αζουρόφιλους κόκκους PMN και μακροφάγους. Απελευθερώνεται στο εξωκυττάριο υγρό κατά τη διάρκεια φλεγμονωδών διεργασιών και έχει χρησιμοποιηθεί ως δείκτης φλεγμονής και οξειδωτικού στρες [48]. Το IL1R2 κωδικοποιεί ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέων ιντερλευκίνης 1 και ήταν ένα από τα πιο σημαντικά μειωμένα DEG που εντοπίστηκαν στις αγελάδες MP. Αυτό μπορεί να δεσμεύσει τον υποδοχέα IL1A, IL1B και ιντερλευκίνης 1, τύπου Ι (IL1R1/IL1RA), αλλά δρα ως υποδοχέας δόλωμα για να αναστέλλει τη δραστηριότητα του συνδέτη.

Το γονίδιο με τη σημαντικότερη διαφορική έκφραση μεταξύ των αγελάδων MP στις διαφορετικές δίαιτες ήταν το FCER1A, με χαμηλότερη έκφραση στις αγελάδες HC. Αυτό κωδικοποιεί μια υπομονάδα του υποδοχέα IgE, ο οποίος είναι ο εκκινητής των αλλεργικών αποκρίσεων που θα μπορούσαν να έχουν εξελιχθεί για να προάγουν την άμυνα του ξενιστή έναντι των παρασίτων μέσω της απελευθέρωσης μεσολαβητών όπως η ισταμίνη [49]. Είναι ενδιαφέρον ότι το FCER1A ήταν ένα από τα μόλις 18 γονίδια των οποίων το επίπεδο έκφρασης αναγνωρίστηκε ως διάκριση μεταξύ της γονιμότητας των δαμαλίδων του βοείου κρέατος [50]. Ο ακριβής ρόλος του στα βοοειδή παραμένει απροσδιόριστος, αλλά σε μια δοκιμή εμβολίου σε μόσχους που μολύνθηκαν πειραματικά με τον οικονομικά σημαντικό παρασιτικό νηματώδη Ostertagia ostertagi, τα επίπεδα έκφρασής του στο αίμα συσχετίστηκαν θετικά με τον αριθμό των μαστοκυττάρων και αρνητικά με τον αριθμό των σκουληκιών [51]. Τρία άλλα ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια στις αγελάδες HC με κάποια ανοσολογική λειτουργία ήταν τα ALAS2, GZMB και LIF. Το ALAS2 κωδικοποιεί την 50 -αμινολεβουλινική συνθάση 2, ένα μιτοχονδριακά εντοπισμένο ένζυμο ειδικό για τα ερυθροειδή που καταλύει το πρώτο και περιοριστικό του ρυθμού βήμα στη βιοσυνθετική οδό της αίμης. Η αίμη είναι ένας ουσιαστικός συμπαράγοντας σε μια ποικιλία βασικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς οξυγόνου, ενώ μεταλλάξεις σε αυτό το γονίδιο έχουν συνδεθεί με μια ποικιλία ανθρώπινων ασθενειών συμπεριλαμβανομένης της αναιμίας [52]. Το GZMB κωδικοποιεί μια προπρωτεΐνη που εκκρίνεται από φυσικά κύτταρα φονείς και κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα και υφίσταται επεξεργασία για να δημιουργήσει μια ενεργή πρωτεάση που επάγει την απόπτωση των κυττάρων-στόχων και επίσης επεξεργάζεται τις κυτοκίνες και αποικοδομεί τις πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής μήτρας [53]. Ο ανασταλτικός παράγοντας της λευχαιμίας κυτοκίνης, που κωδικοποιείται από το LIF, αναγνωρίστηκε αρχικά μέσω της συμμετοχής στη διαφοροποίηση των μακροφάγων, αλλά έχει επίσης αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου και στην εγκατάσταση της εγκυμοσύνης σε διάφορα είδη, συμπεριλαμβανομένων των βοοειδών [54].

Οι DEG που προέρχονται από τη σύγκριση HC έναντι LC στις αγελάδες MP εμπλουτίστηκαν επίσης με αρκετές σημαντικές οδούς που σχετίζονται με το μεταβολισμό της γλυκόζης, των πρωτεϊνών και των λιπαρών οξέων. Αυτά περιελάμβαναν τέσσερις μειωμένες DEG που εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης PPAR (APOA2, APOC3, FABP1 και PCK1). Σε αυτή τη μελέτη, τρεις κύριες ισομορφές PPAR (A, D, G) ανιχνεύθηκαν στον πληθυσμό των λευκοκυττάρων. Αν και η έκφραση των ίδιων των PPARs δεν επηρεάστηκε από τη διατροφή, αυτή η οδός μπορεί να επηρεάσει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων, τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων και τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις [55,56] και συμβάλλει στη μεταβολική προσαρμογή σε περιορισμένη παροχή θρεπτικών συστατικών επαγωγή γονιδίων που εμπλέκονται στην οξείδωση [57]. Η μεταβολική οδός της ρετινόλης επίσης ρυθμίστηκε προς τα κάτω στις αγελάδες HC, με χαμηλότερη έκφραση των RBP4 και TTR (που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη που δεσμεύει τη ρετινόλη και την τρανσθυρετίνη, αντίστοιχα), τα οποία λειτουργούν ως μεταφορείς ρετινόλης στο αίμα. Η αλληλεπίδραση της ρετινόλης με το μονοπάτι σηματοδότησης PPAR επηρεάζει τη μεταγραφή πολλών άλλων κατάντη γονιδίων [58]. Το APOA2 και το APOC3 μαζί με το APOH αποτελούν επίσης μέρος της μεταβολικής οδού της χοληστερόλης. Η χοληστερόλη είναι ένα κύριο συστατικό της πλασματικής μεμβράνης και επηρεάζει τόσο την οργάνωση όσο και τη λειτουργία της [59,60]. Πρόσφατες μελέτες έχουν υπογραμμίσει τον αναδυόμενο ρόλο της χοληστερόλης ως σημαντικό ρυθμιστή της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσολογικής δραστηριότητας [61].

Η οδός γλυκόλυσης/γλυκονεογένεσης συσχετίστηκε με τρεις μειωμένες DEG στις αγελάδες που τρέφονταν με HC (ADH1C, ALDOB και PCK1). Από αυτά, το PCK1 κωδικοποιεί τη φωσφοενολοπυροσταφυλική καρβοξυκινάση 1 η οποία δρα ως το κύριο σημείο ελέγχου για τη ρύθμιση της γλυκονεογένεσης. Αυτό το ένζυμο, μαζί με το GTP, καταλύει το σχηματισμό της φωσφοενολοπυρουβικής από οξαλοξικό άλας, με την απελευθέρωση διοξειδίου του άνθρακα και ΑΕΠ. Η ενεργοποίηση των ανοσολογικών/φλεγμονωδών οδών προάγει τη μεταγραφή των γλυκονεογόνων γονιδίων μέσω του υποδοχέα 4 (TLR4) [62]. Αυτό μπορεί να αναγκάσει τα κύτταρα του ανοσοποιητικού να αλλάξουν το μεταβολισμό της γλυκόζης τους από την οξειδωτική φωσφορυλίωση προς τη γλυκόλυση για να παράγουν ενέργεια και θρεπτικά συστατικά που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό και την παραγωγή μορίων του ανοσοποιητικού [12,63]. Αυτό οδηγεί σε αυξημένη ζήτηση για γλυκόζη, η οποία ανταγωνίζεται την απαίτηση παραγωγής γαλακτικού [64].

Συνοπτικά, οι διαφορές γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των αγελάδων MP στις δίαιτες HC και LC παρέχουν ενδείξεις μεγαλύτερης ρυθμισμένης ανοσολογικής δραστηριότητας και φλεγμονής στις αγελάδες LC. Αυτό συνοδεύτηκε από υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης μαστίτιδας. Αντίθετα, γονίδια που κωδικοποιούν ορισμένες πρωτεΐνες που είναι πιθανό να ωφελήσουν την υγεία και τη γονιμότητα, όπως το ALAS2 και το LIF, ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στις αγελάδες HC. Αυτό υποστηρίζει τους μεταβολικούς δείκτες που μετρήθηκαν που δείχνουν ότι υπήρχε βελτιωμένη κατάσταση EBAL στις αγελάδες MP σε δίαιτα HC, η οποία πιθανώς βοήθησε στην προστασία τους από την ανάπτυξη μολυσματικών ή μεταβολικών ασθενειών.

3.2. Σύγκριση των επιπτώσεων της δίαιτας υψηλής και χαμηλής συγκέντρωσης στις πρωτότοκες αγελάδες

Ομοίως με τις αγελάδες MP, οι αγελάδες PP στη δίαιτα HC είχαν επίσης υψηλότερο DMI, κατά περίπου 4 kg/ημέρα, αλλά η απόδοση γάλακτος δεν αυξήθηκε σημαντικά. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις κυκλοφορούσες συγκεντρώσεις γλυκόζης, NEFA, BHB ή IGF-1, με μόνο την ουρία να είναι υψηλότερη στη δίαιτα LC. Αντίθετα, υπήρχαν πιο σημαντικές διαφορές στην έκφραση του γονιδίου λευκοκυττάρων μεταξύ των διαιτητικών ομάδων απ' ό,τι στις αγελάδες MP, με 460 έναντι 173 DEGs να εντοπίστηκαν στις συγκρίσεις HC έναντι LC, εκ των οποίων το 83% ρυθμίστηκε προς τα πάνω στις αγελάδες PP στη δίαιτα HC. Μόνο ένα μικρό ποσοστό των DEG επικαλύπτονταν μεταξύ των δύο ηλικιακών ομάδων (Εικόνα 3), υποδηλώνοντας ότι οι αλλαγές στη λειτουργία των λευκοκυττάρων στη δίαιτα πρώιμης γαλουχίας ήταν πιο ευαίσθητες στις αγελάδες PP από ό,τι στις αγελάδες MP. Περιμέναμε ότι η δίαιτα HC θα ωφελούσε τις αγελάδες PP αυξάνοντας το DMI τους και ικανοποιώντας πλήρως τις υπολογιζόμενες διατροφικές απαιτήσεις σε αδιάσπαστη και μεταβολιζόμενη πρωτεΐνη. Το EBAL ήταν πράγματι βελτιωμένο στη δίαιτα HC, αλλά η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε πολύ μεγαλύτερη ρύθμιση προς τα πάνω των γονιδίων που εμπλέκονται στην ανοσολογική άμυνα. Οι αγελάδες που τρέφονταν με HC είχαν επίσης υψηλότερη αναλογία PMN: UEC στη μήτρα τους μαζί με αριθμητικά μεγαλύτερο SCC και περισσότερες περιπτώσεις μαστίτιδας. Αυτό υποδηλώνει ότι στην πραγματικότητα ήταν περισσότερο, παρά λιγότερο, επιρρεπείς σε ασθένειες. Βρήκαμε προηγουμένως ότι τα ουδετερόφιλα που συλλέχθηκαν από τις αγελάδες PP σε αυτή τη μελέτη τις πρώτες τρεις εβδομάδες της γαλουχίας είχαν σημαντικά υψηλότερο δείκτη φαγοκυττάρου και οξειδωτικό δείκτη έκρηξης σε σύγκριση με τις αγελάδες MP, αλλά οι 2-επιδράσεις της δίαιτας και της ισοτιμίας στην αυτές οι μετρήσεις δεν αναφέρθηκαν [32].

Οι διεργασίες του ανοσοποιητικού συστήματος που προσδιορίστηκαν στη σύγκριση HC έναντι LC περιελάμβαναν ανοδική ρύθμιση των οδών σηματοδότησης υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας και αναγνώρισης προτύπων, χημειοταξία, παραγωγή κυτοκίνης και μετανάστευση λευκοκυττάρων στις αγελάδες που τρέφονταν με HC. Τα αναγνωρισμένα DEG συσχετίστηκαν με μια ποικιλία μηχανισμών άμυνας του ανοσοποιητικού, συμπεριλαμβανομένης μιας ποικιλίας αντιμικροβιακών πεπτιδίων (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 και SLC11A). Αυτά δεν μπορούν μόνο να σκοτώσουν τους εισβαλλομένους οργανισμούς άμεσα αλλά και να βοηθήσουν ρυθμίζοντας άλλες ανοσολογικές και αντιμικροβιακές διεργασίες [65-67]. Η ανοδική ρύθμιση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων στα μεταγραφικά προφίλ των λευκοκυττάρων έχει αποδειχθεί προηγουμένως σε αγελάδες με κλινική μαστίτιδα [47,68] και μητρίτιδα/ενδομητρίτιδα [69,70]. Η λειτουργία προσκόλλησης λευκοκυττάρων συσχετίστηκε με 16 ρυθμισμένα προς τα πάνω και πέντε προς τα κάτω DEG στα ζώα που τρέφονταν με HC. Η προσκόλληση των λευκοκυττάρων στα τοιχώματα των τριχοειδών είναι ένα ζωτικής σημασίας πρώτο βήμα για να μπορέσουν να μεταναστεύσουν από το αίμα και την κυκλοφορία προς τα σημεία ιστικής βλάβης, μόλυνσης και φλεγμονής [71]. Τόσο οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου όσο και κυττάρου-μήτρας επηρεάζουν τον φαινότυπο των λευκοκυττάρων και η απορρύθμιση των οδών προσκόλλησης μπορεί να οδηγήσει σε επίμονη ενεργοποίηση λευκοκυττάρων με ανεπίλυτη φλεγμονή [72]. Από τα ρυθμισμένα προς τα πάνω DEG που εντοπίστηκαν, τα ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 και THY1 εμπλέκονται στην εξαγγείωση [73,74] ενώ τα FN1, NRP1, TNFAIP6 και VCAN έχουν πιθανούς ρόλους στη διακίνηση λευκοκυττάρων και λειτουργούν σε φλεγμονώδεις ιστούς [72, 75]. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους υποδοχείς χημειοκίνης CXCR1 και CXCR2 ρυθμίστηκαν επίσης προς τα πάνω στις αγελάδες που τρέφονταν με HC. Αυτά είναι και τα δύο σημαντικά για τη διέγερση της χημειοταξίας του PMN προς τα σημεία μόλυνσης καθώς και για την ενεργοποίηση βιοχημικών διεργασιών που σκοτώνουν τα εισβάλλοντα βακτήρια [76].

Από τα υπορυθμισμένα γονίδια που σχετίζονται με την προσκόλληση σε αγελάδες που τρέφονται με HC, το BCAR1 κωδικοποιεί μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη γνωστή ως cas με συμμετοχή στην κινητικότητα των κυττάρων, την απόπτωση και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου [77]. Οι πολυμορφισμοί στο BCAR1 είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με SCC και αντοχή στη μαστίτιδα [78]. Το ADGRG1 (επίσης γνωστό ως GPR56) κωδικοποιεί έναν υποδοχέα συζευγμένο με πρωτεΐνη G που δεσμεύει το κολλαγόνο 3 και την τρανσγλουταμινάση 2, και τα δύο συστατικά του στρώματος ιστού. Το ADGRG1 αποδείχθηκε ότι παίζει ρόλο στα ανθρώπινα φυσικά φονικά κύτταρα (NK), στα οποία αναστέλλει την κυτταροτοξικότητά τους [79]. Η δική του έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από ενεργοποίηση που προκαλείται από κυτοκίνη, η οποία θα συμφωνούσε με τα αποτελέσματα που εμφανίζονται εδώ. Η πρωτεΐνη CD96 δρα επίσης ως ανασταλτικός υποδοχέας σημείου ελέγχου στα κύτταρα ΝΚ [80]. Προηγούμενες μελέτες για αλλαγές στο μεταγραφικό των λευκοκυττάρων κατά τη διάρκεια της μεταβατικής περιόδου βρήκαν επίσης αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με τη διαενδοθηλιακή μετανάστευση αν και με διαφορετικά συμπεράσματα, αναφέροντας είτε ενεργοποίηση μετά τον τοκετό [81] είτε αναστολή [82], αντίστοιχα. Η ανάλυσή μας εντόπισε επίσης έναν αριθμό διαφορών στα μονοπάτια σηματοδότησης του μεταβολισμού των αμινοξέων σε αγελάδες PP με δίαιτα HC σε σύγκριση με εκείνες στη δίαιτα LC, που σχετίζονται με ένζυμα που κωδικοποιούνται από πέντε ρυθμισμένα προς τα πάνω DEGs (ARG2, ASS1, GPT2, SDS και SDSL). . Από αυτά, το ASS1 κωδικοποιεί τη συνθάση ηλεκτρικής αργινίνης 1, η οποία καταλύει το προτελευταίο στάδιο της βιοσυνθετικής οδού αργινίνης, ενώ το ARG2 κωδικοποιεί την αργινάση, καταλύοντας την υδρόλυση της αργινίνης σε ορνιθίνη και ουρία. Η L-αργινίνη μπορεί επίσης να μετατραπεί σε μονοξείδιο του αζώτου, ένα μόριο σηματοδότησης που παίζει βασικό ρόλο στην παθογένεση της φλεγμονής [83]. Η γλουταμινική-πυρουβική τρανσαμινάση 2 (GPT2) είναι ένα μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αναστρέψιμη τρανσαμινάση μεταξύ αλανίνης και 2-οξογλουταρικού για τη δημιουργία πυροσταφυλικού και γλουταμικού. Αυτό το γονίδιο ρυθμίζεται προς τα πάνω υπό συνθήκες μεταβολικού στρες και παίζει ρόλο στην οδήγηση της γλυκονεογένεσης από το μεταβολισμό των αμινοξέων [84]. Η αφυδατάση της σερίνης (SDS) κωδικοποιεί ένα ένζυμο που μετατρέπει τη L-σερίνη σε πυροσταφυλικό και αμμωνία, ενώ η αφυδατάση της σερίνης (SDSL) προβλέπεται να εμπλέκεται στην οδό της βιοσύνθεσης της ισολευκίνης από τη θρεονίνη.

Η οδός του μεταβολισμού της χοληστερόλης συσχετίστηκε με τέσσερις αυξημένες DEG στη δίαιτα HC (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 και SORT1). Αυτό μπορεί να οδηγήσει στη συσσώρευση χοληστερόλης στα λευκοκύτταρα των αγελάδων που τρέφονται με HC και να προάγει τη φλεγμονή, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της σηματοδότησης TLR, της ενεργοποίησης των φλεγμονωδών σωμάτων και της μεγαλύτερης παραγωγής μονοκυττάρων και ουδετερόφιλων στο μυελό των οστών και στον σπλήνα [85]. Η οδός του μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος με πέντε ρυθμισμένα προς τα πάνω DEGs (όπως αναφέρθηκαν προηγουμένως) οδηγεί στην παραγωγή καταρράκτες προ- και αντιφλεγμονωδών προϊόντων, όπως προσταγλανδίνες και λευκοτριένια [86]. Η οδός μεταβολισμού των γλυκερολιπιδίων συσχετίστηκε με τέσσερις ρυθμιζόμενες προς τα πάνω DEGs (DGAT2, DGKG, GK και GPAT3) που κωδικοποιούν για λιπογονικά γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση της τριακυλογλυκερόλης. Η συσσώρευσή του μπορεί να προκαλέσει ενεργοποίηση λευκοκυττάρων και φλεγμονή [87,88]. Όλα αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η δίαιτα HC ρυθμίζει προς τα πάνω τις μεταβολικές οδούς των λευκοκυττάρων στις αγελάδες PP με τρόπο που αύξησε τις ανοσολογικές/φλεγμονώδεις αποκρίσεις τους. Προηγούμενη εργασία σε αγελάδες επικεντρώθηκε κυρίως στην ξηρή περίοδο και έχει δείξει ότι η υπερβολική σίτιση και το υψηλό BCS αυτή τη στιγμή προάγουν την επακόλουθη κινητοποίηση των λιπιδίων και μια αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση κατά την περίοδο του τοκετού [34]. Στην παρούσα μελέτη, η αναλογία PMN μήτρας: UEC και η τάση προς υψηλότερο SCC υποστηρίζουν την πρόταση ότι υπήρξε αυξημένη μετανάστευση λευκοκυττάρων στη μήτρα και τον μαστικό αδένα στις αγελάδες PP που έλαβαν δίαιτα HC. Αν και αυτό είναι ένα βασικό συστατικό της άμυνας του ανοσοποιητικού, η υπερενεργοποίηση μπορεί να συμβάλει στην υπερ-φλεγμονή. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος για να επιβεβαιωθούν αυτά τα ευρήματα.

3.3. Ομοιότητες στην απόκριση στη δίαιτα από πολύτοκες και πρωτότοκες αγελάδες

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/L, υψηλότερες από τις συγκεντρώσεις που επιτεύχθηκαν στα ζώα που τρέφονταν με LC στην παρούσα μελέτη [91]. Όσον αφορά τα δεδομένα μεταγραφής γονιδίων λευκοκυττάρων, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα DEGs που προέρχονται από τη σύγκριση HC έναντι LC και στις δύο ηλικιακές ομάδες εμπλουτίστηκαν με την οδό της πέψης και απορρόφησης πρωτεΐνης, στην οποία τα γονίδια που κωδικοποιούν διάφορες ισομορφές κολλαγόνου παίζουν σημαντικό ρόλο . Μεταξύ αυτών, υπήρχαν τρία ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια κολλαγόνου (COL1A1, COL1A2 και COL3A1) και στις δύο αγελάδες MP και PP και ένα γονίδιο κολλαγόνου με μειωμένη ρύθμιση (COL5A3) στις αγελάδες MP. Οι τιμές έκφρασής τους στα δείγματα ήταν μικρές, αλλά οι διαφορές ήταν σημαντικές. Μέρος αυτού του RNA μπορεί να προέρχεται από ινοκύτταρα, έναν κυτταρικό πληθυσμό που περιλαμβάνει μόλις 0.1–0.5% των μη ερυθροκυτταρικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα [92,93]. Το κολλαγόνο είναι ένας μακροχρόνιος ενισχυτής του ανοσοποιητικού που εμπλέκεται σε πολλές ανοσολογικές/φλεγμονώδεις διεργασίες [93,94]. Η αυξημένη παραγωγή του στο κυκλοφορούν αίμα από τη δίαιτα HC μπορεί επομένως να επηρεάσει τη λειτουργία των λευκοκυττάρων.

3.4. Επιπτώσεις για τη Γονιμότητα

Πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η αλληλένδετη μεταβολική και ανοσοποιητική κατάσταση και η συχνότητα εμφάνισης ασθενειών των αγελάδων στην πρώιμη γαλουχία έχουν σημαντική επίδραση στη μετέπειτα γονιμότητά τους (π.χ. [38,95]). Η δική μας εργασία έδειξε ότι οι αγελάδες MP με χαμηλή συγκέντρωση IGF-1 στα 14 DIM είχαν λιγότερες πιθανότητες να συλλάβουν καθόλου [37]. Πιο πρόσφατα, αναφέραμε ότι το 63% των αγελάδων με χαμηλό IGF-1 αυτή τη στιγμή αντιμετώπισαν περισσότερα από ένα προβλήματα υγείας κατά τη διάρκεια των πρώτων 35 DIM τους σε σύγκριση με μόνο το 26% των αγελάδων με υψηλό IGF-1. Αυτό περιελάμβανε περισσότερα ζώα με λοιμώξεις της μήτρας και κλινική μαστίτιδα [10]. Οι Foley et al. [69] διαφοροποιήθηκε μεταξύ υγιών αγελάδων, οι οποίες ήταν σε θέση να αποκαταστήσουν την ομοιόσταση εντός 3 εβδομάδων μετά τον τοκετό, και άλλων που παρουσίασαν μια πιο σοβαρή και παρατεταμένη φλεγμονώδη απόκριση που στη συνέχεια συνέχισε να αναπτύσσει κλινική ενδομητρίτιδα. Μια συσχέτιση με το περιφερικό αίμα καταδείχθηκε από τους Galvão et al. [96] που έδειξε ότι τα ουδετερόφιλα από αγελάδες σε χειρότερο EBAL είχαν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε γλυκογόνο σε επτά DIM και αυτά τα ζώα εμφάνισαν περισσότερες παθήσεις της μήτρας, δυνητικά σχετιζόμενες με τη μειωμένη διαθεσιμότητα οξειδωτικών καυσίμων για ανοσοαποκρίσεις. Η κλινική μαστίτιδα στην πρώιμη γαλουχία σχετίζεται επίσης με αυξημένα ποσοστά απώλειας εμβρύου πριν από την εμφύτευση, με κάποιες ενδείξεις ότι ένα χαμηλό BCS αυξάνει περαιτέρω τον κίνδυνο [97]. Έχει προταθεί ένας αριθμός μηχανισμών που σχετίζονται με την παραγωγή κυτοκίνης και προσταγλανδίνης και άλλους φλεγμονώδεις μεσολαβητές που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ωοθήκη και/ή να προκαλέσουν δυσμενές περιβάλλον στη μήτρα [98,99]. Τα δεδομένα γονιμότητας που ελήφθησαν από τις αγελάδες στη μελέτη μας υποστήριξαν τα ευρήματα που σχετίζονται με την ανοσολογική κατάσταση και την υγεία τους στην πρώιμη γαλουχία. Οι αγελάδες MP στη δίαιτα LC χρειάστηκαν αριθμητικά περισσότερο S/C σύμφωνα με το φτωχότερο EBAL τους μαζί με στοιχεία από την ανάλυση του μεταγραφώματος λευκοκυττάρων για πιο ενεργή ανοσολογική άμυνα σε εξέλιξη, όπως υποστηρίζεται από την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης μαστίτιδας. Αντίθετα, οι αγελάδες PP στη δίαιτα HC χρειάστηκαν πολύ περισσότερο χρόνο για να συλλάβουν και λιγότερες έμειναν έγκυες σε σύγκριση με τις αγελάδες που τρέφονταν με LC. Είχαν περισσότερες ενδείξεις φλεγμονής στην αρχή της εγκυμοσύνης, παρόλο που το υπολογισμένο EBAL τους ήταν καλύτερο. Προς το παρόν, οι υποκείμενοι μηχανισμοί που προκαλούν την κακή κατάσταση υγείας και τη γονιμότητά τους είναι αβέβαιοι, αν και έχουμε βρει επίσης στοιχεία που βασίζονται στην παγκόσμια γονιδιακή έκφραση αυξημένης ηπατικής φλεγμονής και ίνωσης (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe and Wathes, μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις) .

3.5. Περιορισμοί της Μελέτης

Υπήρχαν λιγότερες διαθέσιμες αγελάδες ΡΡ ανά ομάδα, και αυτό μείωσε τη στατιστική ισχύ των αναλύσεων που σχετίζονται με τους φαινότυπους. Απαιτείται επομένως περαιτέρω μελέτη με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος για να επιβεβαιωθούν οι διατροφικές επιδράσεις στην αναπαραγωγή και στις ασθένειες. Στην παρούσα μελέτη, εξάγαμε όλο το RNA από ολόκληρο το περιφερικό αίμα χρησιμοποιώντας σωλήνες Tempus και το σύστημα απομόνωσής του. Αυτό προσφέρει ευκολία συλλογής για μια μεγάλης κλίμακας αγροτική μελέτη, αλλά δεν διαχωρίζει τους κυτταρικούς τύπους, που θα περιλαμβάνουν λεμφοκύτταρα Τ και Β, φυσικά κύτταρα φονείς, αιμοπετάλια, μονοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα (ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και βασεόφιλα) και ινοκύτταρα. Τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης που παρουσιάζονται έχουν επομένως επηρεαστεί από πιθανές επιδράσεις θεραπείας στις σχετικές αναλογίες συγκεκριμένων τύπων κυττάρων επιπλέον των επιμέρους μεταγραφικών αλλαγών τους. Αυτά τα αποτελέσματα βασίζονται επίσης σε επίπεδα γονιδιακής μεταγραφής και δεν περιλαμβάνουν πληροφορίες για τη μετα-μεταφραστική επεξεργασία τους, η οποία θα επηρεάσει επίσης την ποσότητα της λειτουργικής πρωτεΐνης που παράγεται.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Ζώα και δίαιτες

Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν βάσει του νόμου περί ζώων (επιστημονικές διαδικασίες) του 1986 και καλύπτονταν από τον αριθμό άδειας χρήσης έργου Home Office PPL2754 και ένα Πιστοποιητικό Διορισμού για την Εγκατάσταση. Η εργασία εγκρίθηκε επίσης από την Επιτροπή Δεοντολογίας και Πρόνοιας του Ινστιτούτου Γεωργίας Τροφίμων και Βιοεπιστημών (AFBI, Μπέλφαστ, Βόρεια Ιρλανδία, Ηνωμένο Βασίλειο). Εξήντα δύο αγελάδες γαλακτοπαραγωγής Holstein-Friesian στρατολογήθηκαν από το κοπάδι AFBI. Μεταξύ αυτών, 18 ήταν PP (γαλουχία 1) και 44 MP με αριθμούς γαλουχίας 2–7 (3,5 ± 1,28) και όλες οι αγελάδες ήταν υγιείς όπως εξετάστηκαν από τον κτηνίατρο. Το βάρος τοκετού ήταν 680 ± 62 (Μέση ± ΣΜΝ) kg για αγελάδες MP και 550 ± 39 kg για αγελάδες ΡΡ. Μετά τον τοκετό, οι αγελάδες PP και MP χωρίστηκαν σε τρεις διατροφικές ομάδες, με την κατανομή σε κάθε ηλικιακή ομάδα ισορροπημένη για την προβλεπόμενη ικανότητα μετάδοσης για λίπος συν πρωτεΐνη (kg), BW πριν από τον τοκετό και BCS. Οι αγελάδες MP ήταν επίσης ισορροπημένες για την ισότητα και την προηγούμενη γαλουχία 305-ημέρα απόδοση γάλακτος. Στις αγελάδες προσφέρθηκε είτε (1) χαμηλό συμπύκνωμα (LC, 30% συμπύκνωμα συν 70% ενσίρωση χόρτου, n=6 για PP και n=14 για MP). (2) μεσαίο συμπύκνωμα (MC, 50% συμπύκνωμα συν 50% ενσίρωση χόρτου, n=6 για PP και n=15 για MP) ή (3) υψηλό συμπύκνωμα (HC, 70% συμπύκνωμα συν 30% ενσίρωμα χόρτου, n=6 για PP και n=15 για MP) δίαιτες (ποσοστά σε βάση ξηρής ουσίας). Το συμπύκνωμα για κάθε θεραπεία διαμορφώθηκε για να επιτευχθεί μια κοινή συγκέντρωση ολικής ακατέργαστης πρωτεΐνης (CP) για καθένα από τα LC, MC και HC (152, 152 και 154 g/kg DM αντίστοιχα), ενώ η υπολογιζόμενη συνολική μεταβολιζόμενη ενέργεια διατροφής ( ΜΕ) τα περιεχόμενα ήταν 12,0, 12,4 και 12,8 MJ/kg DM. Οι δίαιτες εκτιμήθηκε ότι παρέχουν 1556, 1997 και 2420 g/ημέρα αποτελεσματική αποικοδομήσιμη πρωτεΐνη της μεγάλης κοιλίας. 559, 733 και 888 g/d διαιτητική μη αποικοδομήσιμη πρωτεΐνη και 1346, 1817 και 2275 g/d μεταβολιζόμενη πρωτεΐνη για LC, MC και HC, αντίστοιχα. Η πρόσβαση στα σιτηρέσια θεραπείας ελεγχόταν από ένα σύστημα σίτισης Calan Broadbent (American Calan Inc., Northwood, NH, ΗΠΑ) συνδεδεμένο με ένα ηλεκτρονικό σύστημα αναγνώρισης, το οποίο επέτρεπε την καθημερινή καταγραφή των ατομικών προσλήψεων αγελάδων. Οι δίαιτες για κάθε θεραπεία προσφέρθηκαν στο 107% της πρόσληψης των προηγούμενων ημερών για να διασφαλιστεί η ad libitum κατανάλωση. Σε όλες τις αγελάδες προσφέρθηκε επίσης ένα επιπλέον 0,5 kg συμπύκνωμα σε κάθε άρμεγμα μέσω ενός συστήματος σίτισης στο σαλόνι για να βοηθήσει στη διατήρηση της αποτελεσματικής ροής αγελάδων. Η παρούσα μελέτη ήταν μέρος ενός ευρύτερου έργου και οι πλήρεις λεπτομέρειες για τις προσφερόμενες δίαιτες, τη διαχείριση της διατροφής και τη σύνθεση των ζωοτροφών περιγράφηκαν προηγουμένως [32].

4.2. Συλλογή δεδομένων φαινοτύπου αγελάδας

Τα σωματικά βάρη καταγράφηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ζυγαριές. Το BCS υπολογίστηκε σε περίπου 14 DIM [100]. Όλες οι αγελάδες αρμέγονταν δύο φορές την ημέρα και καταγράφηκαν οι ημερήσιες αποδόσεις τους. Τα δείγματα γάλακτος αναλύονταν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ανάλυση μεσαίας υπέρυθρης ακτινοβολίας για συγκεντρώσεις πρωτεΐνης, λίπους και λακτόζης και μετρήθηκαν τα σωματικά κύτταρα γάλακτος. Επιπρόσθετα πρωινά δείγματα γάλακτος (2 × 8 mL) συλλέχθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και αποθηκεύτηκαν στους -18 ◦C για την ανάλυση της LDH (EC. 1.1.1.27) και της NAGase (EC 3.2.1.30) χρησιμοποιώντας φθοριομετρικούς προσδιορισμούς [101]. Η ενεργειακά διορθωμένη απόδοση γάλακτος (ECM, kg/ημέρα) υπολογίστηκε σύμφωνα με τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν στην ομάδα μας [32]. Το EBAL κάθε αγελάδας υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [102].

Η κλινική μαστίτιδα διαγνώστηκε χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους που βασίζονται σε καθημερινές παρατηρήσεις για μη φυσιολογικές αλλαγές στην εμφάνιση γάλακτος (π.χ. νιφάδες, θρόμβοι), ποιότητα, απόδοση γάλακτος και φλεγμονώδεις αποκρίσεις του μαστού (ερυθρότητα, οίδημα, ζέστη ή πόνος). Οι μετρήσεις SCC γάλακτος μαζί με τις κλινικές διαγνώσεις χρησιμοποιήθηκαν για να κατηγοριοποιηθούν οι αγελάδες σε τρεις ομάδες. Οι υγιείς αγελάδες ορίστηκαν ως με SCC < 100,000 κύτταρα/mL γάλακτος και χωρίς κλινικά συμπτώματα. Οι υποκλινικά μαστιώδεις αγελάδες ορίστηκαν ως με SCC μεταξύ 100,{3}} και 400,000 κυττάρων/mL γάλακτος και χωρίς εμφανή κλινικά συμπτώματα. Οι αγελάδες που διαγνώστηκαν ότι είχαν κλινική μαστίτιδα είχαν SCC > 400,{7}} κύτταρα/mL γάλακτος και εμφάνισαν μερικά από τα παραπάνω κλινικά συμπτώματα. Οι αγελάδες γονιμοποιήθηκαν στον παρατηρούμενο οίστρο χρησιμοποιώντας κανονική πρακτική της αγέλης και τα δεδομένα γονιμότητας για τη διάρκεια της επακόλουθης γαλουχίας ή μέχρι τη θανάτωση του ζώου ανακτήθηκαν από τα αρχεία της αγέλης. Τα δεδομένα που αναφέρθηκαν περιελάμβαναν ημέρες έως την πρώτη υπηρεσία (DFS), ημέρες έως τη σύλληψη (ημέρες ανοιχτές), υπηρεσίες ανά σύλληψη και το ποσοστό των αγελάδων που συνέλαβαν. Επιπλέον, τα δεδομένα σύλληψης βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια βαθμολογία 4-πόντος στη γάμπα ανά (ICB) ως (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 ημέρες, ή (4) απέτυχε να συλλάβει ή θανατώθηκε.

4.3. Κυτταρολογική Ανάλυση Μήτρας

Ένα δείγμα κυτταροβούρτσας μήτρας (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Γερμανία) λήφθηκε από κάθε αγελάδα σε περίπου 14 DIM για την αξιολόγηση της κυτταρολογίας του ενδομητρίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [103]. Μια διπλά προστατευμένη κυτταροβούρτσα οδηγήθηκε χειροκίνητα μέσω του τραχήλου της μήτρας στη μήτρα, ο εσωτερικός προφυλακτήρας εξωθήθηκε από τον εξωτερικό προφυλακτήρα και η βούρτσα περιστράφηκε απαλά προς το τοίχωμα του ενδομητρίου. Στη συνέχεια, η βούρτσα αποσύρθηκε στον εσωτερικό προφυλακτήρα και αφαιρέθηκε. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες για κυτταρολογική εξέταση παρασκευάστηκαν με κύλιση της κυτταροβούρτσας σε καθαρή γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου και στερέωση του δείγματος με Fisherbrand™ CytoPrep™ Cytology Fixative (Fishers Scientific, Blanchardstown, Ιρλανδία). Οι σταθερές διαφάνειες στάλθηκαν στη Σχολή Κτηνιατρικής του UCD, University College του Δουβλίνου, Ιρλανδία για επεξεργασία και χρωματίστηκαν με τροποποιημένη χρώση Giemsa. Η κυτταρολογική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε μετρώντας τα UEC PMN σε μεγέθυνση 400x (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Γερμανία) και προσδιορίζοντας την αναλογία τους, υπολογίζοντας κατά μέσο όρο μετρήσεις 10 πεδίων υψηλής ισχύος ανά διαφάνεια.

4.4. Ανάλυση Κυκλοφορούντων Μεταβολιτών και IGF-1

Στις 14 ± 2 (μέσος όρος ± STD) ημέρες μετά τον τοκετό, συλλέχθηκαν 10 mL δειγμάτων αίματος από τη σφαγίτιδα φλέβα όλων των αγελάδων σε σωλήνες Na ηπαρίνης για το πλάσμα και απλούς σωλήνες για ορό. Μετά τον διαχωρισμό του πλάσματος ή του ορού με φυγοκέντρηση, αποθηκεύτηκαν στους -20 ◦C μέχρι την ανάλυση. Οι συγκεντρώσεις γλυκόζης πλάσματος, ουρίας, BHB, NEFA και χοληστερόλης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [20,25]. Εν συντομία, η συγκέντρωση NEFA στον ορό προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ACS-ACOD χρησιμοποιώντας κιτ NEFA C (Wako, Neuss, Γερμανία). Η γλυκόζη του πλάσματος προσδιορίστηκε ποσοτικά με μια ενζυματική μέθοδο (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Δανία). Η ΒΗΒ ορού προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 340 nm λόγω της παραγωγής ΝΑϋΗ σε αλκαλικό ρΗ παρουσία αφυδρογονάσης ΒΗΒ. Η ουρία ορού αναλύθηκε με φασματοφωτομετρία. Οι συντελεστές διακύμανσης εντός και μεταξύ της ανάλυσης (CV) ήταν σε όλες τις περιπτώσεις κάτω από το 3 και 4 τοις εκατό, αντίστοιχα, τόσο για χαμηλά όσο και για υψηλά δείγματα ελέγχου. Οι συγκεντρώσεις του IGF ορού-1 ποσοτικοποιήθηκαν με ραδιοανοσοδοκιμασία μετά από εκχύλιση με όξινη αιθανόλη [104]. Το CV εντός της ανάλυσης ήταν 12,4, 7,5 και 9,9% για δείγματα χαμηλού, μεσαίου και υψηλού ελέγχου, αντίστοιχα.

4.5. Εξαγωγή RNA αίματος

Δείγματα αίματος για εξαγωγή RNA συλλέχθηκαν μέσω σφαγίτιδας φλεβοκέντησης από όλες τις αγελάδες σε 14 ± 2 DIM σε σωλήνες RNA αίματος Tempus (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK). Οι σωλήνες ανακινήθηκαν έντονα για 15–20 δευτερόλεπτα αμέσως μετά τη συλλογή, στη συνέχεια καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για εξαγωγή RNA. Το RNA πλήρους αίματος εξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης Tempus Spin RNA (Thermo-Fisher) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ένας Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) με κιτ Nano Agilent RNA 6000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ποσότητας και της ακεραιότητας RNA. Επιπλέον, η ποσότητα και η καθαρότητα επικυρώθηκαν με NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). Τα δεδομένα ποιότητας συνοψίζονται στο Συμπληρωματικό Αρχείο S3. Αυτό έδειξε ότι όλα τα δείγματα RNA είχαν λογική ακεραιότητα (αριθμός RIN > 8,7, 9,3 ± 0,3) και καθαρότητα (260/280 μεταξύ 2,01 και 2,15, μέση ± STD 2,10 ± 0,03), επομένως κανένα ζώο δεν αφαιρέθηκε από την ανάλυση. Το RNA αποθηκεύτηκε στους -80 ◦C για επακόλουθο προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA.

4.6. RNA-Αλληλουχία, Χαρτογράφηση και Ποσοτικοποίηση

Το εξαγόμενο RNA λευκοκυττάρων αναλύθηκε σε αλληλουχία στην πλατφόρμα Illumina NextSeq 500 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [68]. Εν συντομία, χρησιμοποιώντας τον σταθμό εργασίας χειρισμού υγρών epMotion (Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία) 750 ng ολικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα σε βιβλιοθήκες αλληλουχίας cDNA με το κιτ Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold (Illumina, San Diego, CA, USA ). Οι συγκεντρωμένες βιβλιοθήκες cDNA αναλύθηκαν σε αλληλουχία Illumina NextSeq 500 σε αναγνώσεις ενός άκρου μήκους 75 νουκλεοτιδίων για να φτάσουν κατά μέσο όρο 33,5 εκατομμύρια αναγνώσεις ανά δείγμα. Τα ακατέργαστα αρχεία FASTQ κατατέθηκαν στο Ευρωπαϊκό Αρχείο Νουκλεοτιδίων (E-MTAB-9347 και E-MTAB-9431). Όλες οι αναλύσεις αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen, Manchester, UK). Κάθε δείγμα περιείχε τις αναγνώσεις από τέσσερις λωρίδες και συγχωνεύτηκαν σε ένα αρχείο fastq. Η ποιότητα τόσο των ακατέργαστων όσο και των περικομμένων αρχείων fastq αξιολογήθηκε μετά από ένα Illumina Pipeline 1.8 και τυχόν αποτυχημένες αναγνώσεις αφαιρέθηκαν. Στη συνέχεια, οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν σε ένα συγκρότημα Bos taurus γονιδιώματος αναφοράς (ARS-UCD1.2 που παρέχεται από το RefSeq στη διεύθυνση https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly, πρόσβαση την 1η Ιανουαρίου 2021) και ποσοτικοποιήθηκαν ως αναγνώσεις ανά γονίδιο, αναγνώσεις ανά εκατομμύριο κιλοβάσης (RPKM) και μεταγραφές ανά εκατομμύριο κιλοβάσης (TPM). Αυτά αποθηκεύτηκαν ως αρχεία γονιδιακής έκφρασης (GE) στον πάγκο εργασίας CLC Genomics για να χρησιμοποιηθούν για την ακόλουθη ανάλυση της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης.

4.7. Ανάλυση Διαφορικής Γονιδιακής Έκφρασης μεταξύ των Διατροφικών Ομάδων

Πριν από την ανάλυση διαφορικής έκφρασης για τη διατροφική επίδραση, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) με τις τιμές RPKM για να προσδιορίσουμε τις ακραίες τιμές, και αυτό έδειξε ότι δύο αγελάδες (Blood020009, MP και Blood020103, PP) ήταν ακραίες τιμές πληθυσμού και ως εκ τούτου εξαιρέθηκαν από περαιτέρω ανάλυση (Συμπληρωματικό Αρχείο S4A). Η ανάλυση του κύριου συστατικού έδειξε επίσης ότι υπήρχε μόνο περιορισμένη επικάλυψη στο συνολικό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των αγελάδων PP και MP (Συμπληρωματικό Αρχείο S2B). Αυτό υποστήριξε τον αρχικό σχεδιασμό της μελέτης για την ανάλυση κάθε ηλικιακής ομάδας ξεχωριστά. Τα αρχεία GE που προέρχονται από όλα τα μεμονωμένα δείγματα διαχωρίστηκαν επομένως ανά ηλικιακή ομάδα (PP, n=5–6 ανά ομάδα και MP, n=14–15 ανά ομάδα). Οι DEGs μεταξύ των διατροφικών ομάδων σε αγελάδες PP ή MP ταυτοποιήθηκαν με το CLC Genomics Workbench V21 μέσω μιας μονόδρομης διαδικασίας ANOVA. Τα ποσοστά ψευδούς ανακάλυψης (FDR) για πολλαπλές δοκιμές προσαρμόστηκαν με τον Benjamini–Hochberg (BH) και η σημασία θεωρήθηκε στο p <0,05. Οι αλλαγές αναδίπλωσης (FCs) υπολογίστηκαν ως η αναλογία γονιδιακής έκφρασης της ομάδας υψηλότερου συμπυκνώματος προς τη χαμηλότερη ομάδα συμπυκνώματος (π.χ. HC έναντι LC, MC έναντι LC ή HC έναντι MC) εάν η τιμή της ομάδας υψηλότερου συμπυκνώματος ήταν μεγαλύτερη από εκείνη της ομάδας με το χαμηλότερο συμπύκνωμα (θετική αλλαγή πτυχής, ανοδική ρύθμιση). Εάν η τιμή της ομάδας με το χαμηλότερο συμπύκνωμα ήταν μεγαλύτερη από εκείνη της ομάδας με το υψηλότερο συμπύκνωμα, χρησιμοποιήθηκε η αναλογία της ομάδας χαμηλότερου συμπυκνώματος προς την ομάδα υψηλότερου συμπυκνώματος (π.χ. LC έναντι HC, MC έναντι HC και LC έναντι MC ) (αρνητική αλλαγή πτυχής, καθοδική ρύθμιση). Επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση οι DEG που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και προς τα κάτω με μια αλλαγή απόλυτης πτυχής μεγαλύτερη από ή ίση με 1,5 μεταξύ των διατροφικών ομάδων.

4.8. Ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας (GO).

Τα DEG που προέκυψαν από συγκρίσεις ζευγών μεταξύ των διατροφικών ομάδων εισήχθησαν στο Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, USA) για ανάλυση εμπλουτισμού GO για διερεύνηση των βιολογικών λειτουργιών και αλληλεπιδράσεων μεταξύ των DEG και της σχετικής εγκυκλοπαίδειας του Κιότο Μονοπάτια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) με γονιδίωμα Bos taurus ARS-UCD1.2. Χρησιμοποιήθηκε το ακριβές τεστ Fisher με προσαρμογή BH και η στατιστική σημασία λήφθηκε υπόψη στο p < 0.05.

4.9. Στατιστική Ανάλυση Δεδομένων Φαινοτύπου

Τα δεδομένα που προέρχονται από όλες τις αγελάδες χωρίστηκαν αρχικά ανά ηλικιακή ομάδα (αγελάδες PP και MP), σύμφωνα με το σχεδιασμό της μελέτης. Οι τιμές του DMI, BW, παραμέτρων γάλακτος, EBAL, BCS, κυκλοφορούντων μεταβολιτών (γλυκόζη, ουρία, BHB, NEFAs, χοληστερόλη και IGF{{0}}), SCC (λογαριθμικά μετασχηματισμένος) και αριθμός κυττάρων της μήτρας και οι λόγοι τους συνοψίστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SE). Χρησιμοποιήθηκε στατιστική ανάλυση για τη σύγκριση των διαφορών μεταξύ των διατροφικών ομάδων χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA ενσωματωμένη στο πακέτο λογισμικού SPSS V28 (Chicago, IL, USA). Η ομοιογένεια της διακύμανσης για κάθε μεταβλητή δοκιμάστηκε με τα στατιστικά του Levene πριν από την ANOVA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομοιογένεια μεταξύ των ομάδων για ECM, EBAL, γλυκόζη, ουρία, BHB και IGF-1 στις αγελάδες PP δεν επιτεύχθηκε, επομένως εφαρμόστηκε λογαριθμικός μετασχηματισμός για αυτές τις μεταβλητές. Όπου η ANOVA έδειξε σημαντική, πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές συγκρίσεις με τη μέθοδο LSD του Fisher για να προσδιοριστεί η πηγή των διαφορών. Καθώς η ομοιογένεια της διακύμανσης για τα δεδομένα του SCC γάλακτος και της κυτταρολογίας της μήτρας δεν μπορούσε να επιτευχθεί μετά από λογαριθμικό μετασχηματισμό, αυτές οι μεταβλητές δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA Kruskal–Wallis με πολλαπλές συγκρίσεις του Dunn. Τα δεδομένα γονιμότητας δοκιμάστηκαν με τη μέθοδο Wilcoxon. Σε όλες τις περιπτώσεις, η σημασία θεωρήθηκε στο p < 0,05.

5. Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη υποστηρίζει παλαιότερες εργασίες για την επίδειξη σαφών συνδέσεων μεταξύ της μεταβολικής κατάστασης των αγελάδων στην πρώιμη γαλουχία και της ανοσοποιητικής τους λειτουργίας. Οι περισσότερες προηγούμενες έρευνες που στόχευαν στη βελτίωση της υγείας μετά τον τοκετό μέσω της καλύτερης διατροφής επικεντρώθηκαν στην περίοδο πριν τον τοκετό και έδειξαν ότι η υπερβολική σίτιση και το υψηλό BCS αυτή τη στιγμή προάγουν την επακόλουθη κινητοποίηση των λιπιδίων και μια αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση κατά την περίοδο του τοκετού [34]. Αντίθετα, αξιολογήσαμε εάν είναι δυνατή η αλλαγή της λειτουργικότητας του ανοσοποιητικού μετά τον τοκετό αλλάζοντας τη δίαιτα κατά τη γαλουχία. Διαπιστώσαμε ότι η απόκριση σε πρόσθετη συμπύκνωση συμπυκνώματος, η οποία παρείχε μια δίαιτα σχεδιασμένη για να καλύψει τις ενεργειακές και πρωτεϊνικές απαιτήσεις του ζώου, παρήγαγε διαφορετικά αποτελέσματα στο μεταγραφικό των λευκοκυττάρων σε αγελάδες MP και PP. Στις αγελάδες MP, η δίαιτα HC ήταν σαφώς ωφέλιμη, καθώς τα λευκοκύτταρα της αγελάδας LC είχαν αυξομειώσεις του συμπληρώματος και του καταρράκτη πήξης και έμφυτους μηχανισμούς άμυνας του ανοσοποιητικού έναντι των παθογόνων. Αντίθετα, τα λευκοκύτταρα στις αγελάδες PP στη δίαιτα HC έδειξαν μεγαλύτερες ανοσολογικές/φλεγμονώδεις αποκρίσεις και είχαν υψηλότερη αναλογία PMN: UEC, υποδηλώνοντας αυξημένη μετανάστευση λευκοκυττάρων στη μήτρα. Αυτές οι αγελάδες είχαν στη συνέχεια μεγαλύτερο διάστημα τοκετού έως τη σύλληψη, υποδηλώνοντας φτωχότερη γονιμότητα. Απαιτείται περαιτέρω εργασία με μεγαλύτερους αριθμούς αγελάδων για την επιβεβαίωση της διατροφικής επίδρασης στη γονιμότητα και για την πληρέστερη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο διαφέρουν οι μεταβολικές αποκρίσεις της μετά τον τοκετό δίαιτας στα νεότερα ζώα.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Mallard, BA; Dekkers, JC; Ιρλανδία, MJ; Leslie, KE; Sharif, S.; Vankampen, CL; Wagter, L.; Wilkie, BN. J. Dairy Sci. 1998, 81, 585–595. [CrossRef] [PubMed]

2. Wathes, DC; Cheng, Ζ.; Chowdhury, W.; Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Morris, ΓΔ; Patton, J.; Murphy, JJ Το αρνητικό ενεργειακό ισοζύγιο μεταβάλλει την παγκόσμια γονιδιακή έκφραση και τις ανοσολογικές αποκρίσεις στη μήτρα των γαλακτοπαραγωγών αγελάδων μετά τον τοκετό. Physiol. Genom. 2009, 39, 1–13. [CrossRef]

3. Ingvartsen, KL; Moyes, K. Διατροφή, ανοσοποιητική λειτουργία και υγεία βοοειδών γαλακτοπαραγωγής. Animal 2013, 7 (Suppl. 1), 112–122. [CrossRef] [PubMed]

4. Kehrli, ME, Jr.; Nonnecke, BJ; Roth, JA Μεταβολές στη λειτουργία των ουδετερόφιλων των βοοειδών κατά την περίοδο του τοκετού. Είμαι. J. Vet. Res. 1989, 50, 207–214. [PubMed]

5. Ster, C.; Loiselle, MC; Lacasse, P. Επίδραση της συγκέντρωσης μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων ορού μετά τον τοκετό στη λειτουργικότητα των ανοσοκυττάρων βοοειδών. J. Dairy Sci. 2012, 95, 708–717. [CrossRef] [PubMed]

6. Lacetera, Ν.; Scalia, D.; Bernabucci, U.; Ronchi, Β.; Pirazzi, D.; Nardone, Α. Λειτουργία λεμφοκυττάρων σε αγελάδες με υπερβολική προετοιμασία κατά τον τοκετό. J. Dairy Sci. 2005, 88, 2010–2016. [CrossRef] [PubMed]

7. Nonnecke, BJ; Kimura, Κ.; Goff, JP; Kehrli, ME, Jr. Επιδράσεις του μαστικού αδένα στις λειτουργικές ικανότητες πληθυσμών μονοπύρηνων λευκοκυττάρων αίματος από αγελάδες κατά τον τοκετό. J. Dairy Sci. 2003, 86, 2359–2368. [CrossRef]

8. Habel, J.; Sundrum, A. Αναντιστοιχία κατανομής γλυκόζης μεταξύ διαφορετικών λειτουργιών ζωής στη μεταβατική περίοδο των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής. Animals 2020, 10, 1028. [CrossRef]

9. Horst, EA; Kvidera, SK; Baumgard, LH Προσκεκλημένη ανασκόπηση: Η επίδραση της ανοσολογικής ενεργοποίησης στην υγεία και την απόδοση των αγελάδων μετάβασης-Μια κριτική αξιολόγηση των παραδοσιακών δογμάτων. J. Dairy Sci. 2021, 104, 8380–8410. [CrossRef]

10. Wathes, DC; Becker, F.; Buggiotti, L.; Crowe, MA; Ferris, C.; Foldager, L.; Grelet, C.; Hostens, Μ.; Ingvartsen, KL; Marchitelli, C.; et al. Συσχετίσεις μεταξύ των συγκεντρώσεων του κυκλοφορούντος IGF-1, της κατάστασης της νόσου και του μεταγραφήματος των λευκοκυττάρων σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής πρώιμης γαλουχίας. Μηρυκαστικά 2021, 1, 147–177. [CrossRef]

11. Dimeloe, S.; Burgener, AV; Grahlert, J.; Hess, C. Μεταβολισμός Τ-κυττάρων που διέπει την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. μια σπονδυλωτή όψη. Immunology 2017, 150, 35–44. [CrossRef] [PubMed]

12. Loftus, RM; Finlay, DK Ανοσομεταβολισμός: Ο κυτταρικός μεταβολισμός μετατρέπεται σε ρυθμιστή του ανοσοποιητικού. J. Biol. Chem. 2016, 291, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

13. Bauman, DE; Currie, WB Καταμερισμός των θρεπτικών ουσιών κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και της γαλουχίας: Μια ανασκόπηση των μηχανισμών που περιλαμβάνουν την ομοιόσταση και την ομοιόσταση. J. Dairy Sci. 1980, 63, 1514–1529. [CrossRef] [PubMed]

14. Drackley, JK ADSA Foundation Scholar Award. Βιολογία των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής κατά τη μεταβατική περίοδο: Τα τελευταία σύνορα; J. Dairy Sci. 1999, 82, 2259–2273. [CrossRef] [PubMed]

15. Jabbour, HN; Πωλήσεις, KJ; Catalano, RD; Norman, JE Φλεγμονώδεις οδοί στη γυναικεία αναπαραγωγική υγεία και νόσο. Reproduction 2009, 138, 903–919. [CrossRef]

16. Pascottini, OB; LeBlanc, SJ Τροποποίηση της ανοσολογικής λειτουργίας στη μήτρα των βοοειδών πριν από τον τοκετό. Theriogenology 2020, 150, 193–200. [CrossRef]

17. Sheldon, IM; Lewis, GS; LeBlanc, S.; Gilbert, RO Ορισμός της νόσου της μήτρας μετά τον τοκετό στα βοοειδή. Theriogenology 2006, 65, 1516–1530. [CrossRef]

18. Kuhla, B. Ανασκόπηση: Προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και υποθαλαμική φλεγμονή: Επιπτώσεις για ανεπαρκή πρόσληψη τροφής αγελάδων γαλακτοπαραγωγής μετάβασης. Animal 2020, 14, s65–s77. [CrossRef]

19. Ingvartsen, KL; Moyes, KM Παράγοντες που συμβάλλουν στην ανοσοκαταστολή στην αγελάδα γαλακτοπαραγωγής κατά την περίοδο του τοκετού. Jpn. J. Vet. Res. 2015, 63 (Suppl. 1), S15–S24.

20. Wathes, DC; Cheng, Ζ.; Salavati, Μ.; Buggiotti, L.; Takeda, Η.; Tang, L.; Becker, F.; Ingvartsen, KI; Ferris, C.; Hostens, Μ.; et al. Σχέσεις μεταξύ μεταβολικών προφίλ και γονιδιακής έκφρασης σε ήπαρ και λευκοκύτταρα αγελάδων γαλακτοπαραγωγής στην πρώιμη γαλουχία. J. Dairy Sci. 2021, 104, 3596–3616. [CrossRef]

21. Pinedo, P.; Melendez, P. Διαταραχές του ήπατος που σχετίζονται με μεταβολικές ανισορροπίες σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής. Κτηνίατρος. Clin. Ν. Am. Food Anim. Πρακτική. 2022, 38, 433–446. [CrossRef] [PubMed]

22. Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Kenny, DA; Diskin, MG; Patton, J.; Murphy, JJ; Wathes, DC Αλληλεπιδράσεις μεταξύ αρνητικού ενεργειακού ισοζυγίου (NEB) και ρύθμισης του IGF στο ήπαρ των γαλακτοπαραγωγών αγελάδων. Domest. Anim. Endocrinol. 2008, 34, 31–44. [CrossRef] [PubMed]

23. Kobayashi, Υ.; Boyd, CK; Bracken, CJ; Lamberson, WR; Keisler, DH; Lucy, MC Ο αγγελιοφόρος του ριβονουκλεϊκού οξέος του υποδοχέα μειωμένης αυξητικής ορμόνης (GHR) στο ήπαρ των βοοειδών κατά τον τοκετό προκαλείται από μια ειδική προς τα κάτω ρύθμιση του GHR 1A που σχετίζεται με μειωμένο αυξητικό παράγοντα Ι που μοιάζει με ινσουλίνη. Endocrinology 1999, 140, 3947-3954. [CrossRef]

24. Kvidera, SK; Horst, EA; Abuajamieh, Μ.; Mayorga, EJ; Fernandez, MV; Baumgard, LH Απαιτήσεις γλυκόζης ενός ενεργοποιημένου ανοσοποιητικού συστήματος σε θηλάζουσες αγελάδες Holstein. J. Dairy Sci. 2017, 100, 2360–2374. [CrossRef] [PubMed]

25. Cheng, Ζ.; Wylie, Α.; Ferris, C.; Ingvartsen, KL; Wathes, DC; Gplus, EC Επίδραση των επιπέδων διατροφής και μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων στα παγκόσμια μεταγραφικά προφίλ σε κυκλοφορούντα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής πρώιμης γαλουχίας. J. Dairy Sci. 2021, 104, 10059–10075. [CrossRef]

26. Wathes, DC; Fenwick, Μ.; Cheng, Ζ.; Bourne, Ν.; Llewellyn, S.; Morris, ΓΔ; Kenny, D.; Murphy, J.; Fitzpatrick, R. Επίδραση του αρνητικού ενεργειακού ισοζυγίου στην κυκλικότητα και τη γονιμότητα στην αγελάδα γαλακτοπαραγωγής υψηλής παραγωγής. Theriogenology 2007, 68 (Suppl. 1), S232–S241. [CrossRef]

27. Santos, JE; Bisinotto, RS; Ribeiro, ES Μηχανισμοί που υποκρύπτουν μειωμένη γονιμότητα σε ανωοθυλώδεις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής. Theriogenology 2016, 86, 254–262. [CrossRef]

28. Pascottini, OB; Leroy, J.; Opsomer, G. Δυσπροσαρμογή στη μεταβατική περίοδο και συνέπειες στη γονιμότητα των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής. Αναπαραγωγή. Dom. Anim. 2022, 57 (Suppl. 4), 21–32. [CrossRef]

29. Leroy, JL; Valckx, SD; Jordaens, L.; De Bie, J.; Desmet, KL; Van Hoeck, V.; Britt, JH; Marei, WF; Bols, PE Διατροφή και μητρική μεταβολική υγεία σε σχέση με την ποιότητα των ωαρίων και των εμβρύων: Κριτικές απόψεις για το τι μάθαμε από το μοντέλο γαλακτοπαραγωγής αγελάδων. Αναπαραγωγή. Γόνιμη. Dev. 2015, 27, 693–703. [CrossRef]

30. Coffey, MP; Hickey, J.; Brotherstone, S. Γενετικές πτυχές της ανάπτυξης των αγελάδων γαλακτοπαραγωγής Holstein-Friesian από τη γέννηση έως την ωριμότητα. J. Dairy Sci. 2006, 89, 322-329. [CrossRef]

31. Wathes, DC; Cheng, Ζ.; Bourne, Ν.; Taylor, VJ; Coffey, βουλευτής; Brotherstone, S. Διαφορές μεταξύ πρωτότοκων και πολυτοκών αγελάδων γαλακτοπαραγωγής στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ μεταβολικών χαρακτηριστικών, απόδοσης γάλακτος και βαθμολογίας κατάστασης σώματος στην περίοδο πριν τον τοκετό. Domest. Anim. Endocrinol. 2007, 33, 203–225. [CrossRef] [PubMed]

32. Little, MW; Wylie, ARG; O'Connell, NE; Welsh, MD; Grelet, C.; Bell, MJ; Gordon, Α.; Ferris, CP Ανοσολογικές επιδράσεις της αλλαγής του επιπέδου συμπύκνωσης σε μια δίαιτα βασισμένη σε ενσίρωση χόρτου για αγελάδες Holstein Friesian πρώιμης γαλουχίας. Animal 2019, 13, 799–809. [CrossRef] [PubMed]

33. Buggiotti, L.; Cheng, Ζ.; Salavati, Μ.; Wathes, CD; Γονότυπος συν Περιβάλλον, Γ. Σύγκριση του μεταγραφώματος στα κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα στην πρώιμη γαλουχία μεταξύ πρωτότοκων και πολυτοκών αγελάδων παρέχει στοιχεία για αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία. BMC Genom. 2021, 22, 693. [CrossRef] [PubMed]

34. Cardoso, FC; Kalscheur, KF; Drackley, JK Symposium review: Διατροφικές στρατηγικές για βελτιωμένη υγεία, παραγωγή και γονιμότητα κατά τη μεταβατική περίοδο. J. Dairy Sci. 2020, 103, 5684–5693. [CrossRef] [PubMed]

35. Ingvartsen, KL Ασθένειες που σχετίζονται με τη διατροφή και τη διαχείριση στην αγελάδα μετάβασης. Anim. Feed Sci. Τεχνολ. 2006, 126, 175–213. [CrossRef]

36. Ferris, CP; Gordon, FJ; Patterson, DC; Mayne, CS; McCoy, MA Μια βραχυπρόθεσμη σύγκριση της απόδοσης τεσσάρων συστημάτων παραγωγής γάλακτος που βασίζονται σε λιβάδια για αγελάδες γαλακτοπαραγωγής που γεννιούνται το φθινόπωρο. Grass Forage Sci. 2003, 58, 8. [CrossRef]

37. Taylor, VJ; Cheng, Ζ.; Pushpakumara, PG; Beever, DE; Wathes, DC Σχέσεις μεταξύ των συγκεντρώσεων στο πλάσμα του αυξητικού παράγοντα-Ι που μοιάζει με ινσουλίνη σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής και της γονιμότητάς τους και της απόδοσης γάλακτος. Κτηνίατρος. Rec. 2004, 155, 583–588. [CrossRef]

38. LeBlanc, SJ Αλληλεπιδράσεις του μεταβολισμού, της φλεγμονής και της υγείας της αναπαραγωγικής οδού κατά την περίοδο μετά τον τοκετό σε γαλακτοπαραγωγά βοοειδή. Αναπαραγωγή. Domc. Anim. 2012, 47 (Suppl. 5), 18–30. [CrossRef]

39. Vailati-Riboni, M.; Kanwal, Μ.; Bulgari, Ο.; Meier, S.; Ιερέας, NV; Burke, CR; Kay, JK; McDougall, S.; Mitchell, MD; Walker, CG; et al. Η βαθμολογία της κατάστασης του σώματος και το επίπεδο διατροφής πριν από τον τοκετό επηρεάζουν τους ρυθμιστές του μεταβολισμού και της φλεγμονής του μεταγραφώματος του λιπώδους ιστού σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής που βόσκουν κατά τη μεταβατική περίοδο. J. Dairy Sci. 2016, 99, 758–770. [CrossRef]

40. Trevisi, Ε.; Minuti, A. Εκτίμηση της έμφυτης ανοσοαπόκρισης στην περιγεννητική αγελάδα. Res. Κτηνίατρος. Sci. 2018, 116, 47–54. [CrossRef]

41. Druker, SA; Sicsic, R.; van Straten, Μ.; Goshen, Τ.; Kedmi, Μ.; Raz, T. Διάγνωση κυτταρολογικής ενδομητρίτιδας σε πρωτότοκες έναντι πολύτοκες αγελάδες γαλακτοπαραγωγής. J. Dairy Sci. 2022, 105, 665–683. [CrossRef] [PubMed]

42. Hamzeh-Cognasse, Η.; Laradi, S.; Osselaer, JC; Cognasse, F.; Garraud, O. Η μείωση του παθογόνου Amotosalen-HCl-UVA δεν μεταβάλλει τον μεταβολισμό μετά την αποθήκευση του διαλυτού συνδέτη CD40, του συνδέτη Ox40 και της ιντερκευκίνης-27, των κυτοκινών που γενικά συνδέονται με σοβαρά ανεπιθύμητα συμβάντα. Vox Sang. 2015, 108, 205–207. [CrossRef] [PubMed]

43. de Greeff, Α.; Zadoks, R.; Ruuls, L.; Toussaint, M.; Nguyen, TK; Downing, Α.; Rebel, J.; Stockhofe-Zurwieden, N.; Smith, H. Πρώιμη απόκριση ξενιστή στον μαστικό αδένα μετά από πειραματική πρόκληση Streptococcus uberis σε δαμαλίδες. J. Dairy Sci. 2013, 96, 3723–3736. [CrossRef] [PubMed]

44. Cheng, Ζ.; Chauhan, L.; Barry, AT; Abudureyimu, Α.; Oguejiofor, CF; Chen, Χ.; Wathes, DC Η οξεία λοίμωξη από τον ιό της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών αναστέλλει την έκφραση γονιδίων που διεγείρονται από την ιντερφερόνη tau στο ενδομήτριο βοοειδών. Biol. Αναπαραγωγή. 2017, 96, 1142–1153. [CrossRef]

45. Schoggins, JW Γονίδια που διεγείρονται από την ιντερφερόνη: Τι κάνουν όλοι; Annu. Rev. Virol. 2019, 6, 567–584. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Ohto, U. Μηχανισμοί ενεργοποίησης και ρύθμισης υποδοχέων τύπου NOD βασισμένοι στη δομική βιολογία. Εμπρός. Immunol. 2022, 13, 953530. [CrossRef]

47. Cheng, Ζ.; Palma-Vera, S.; Buggiotti, L.; Salavati, Μ.; Becker, F.; Werling, D.; Wathes, DC; Gplus, EC Μεταγραφική ανάλυση των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων που ελήφθησαν κατά την ανάκτηση από κλινική μαστίτιδα που προκλήθηκε από Escherichia coli σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής Holstein. Animals 2022, 12, 2146. [CrossRef]

48. Loria, V.; Dato, Ι.; Graziani, F.; Biasucci, LM Myeloperoxidase: Ένας νέος βιοδείκτης φλεγμονής σε ισχαιμική καρδιακή νόσο και οξέα στεφανιαία σύνδρομα. Διαμεσολαβητής. φλεγμονή. 2008, 2008, 135625. [CrossRef]

49. Olivera, Α.; Beaven, MA; Τα μαστοκύτταρα Metcalfe, DD σηματοδοτούν τη σημασία τους για την υγεία και τις ασθένειες. J. Allergy Clin. Immunol. 2018, 142, 381–393. [CrossRef]

50. Dickinson, SE; Griffin, BA; Elmore, MF; Kriese-Anderson, L.; Elmore, JB; Dyce, PW; Rodning, SP; Τα προφίλ μεροληψίας, FH Transcriptome στα περιφερικά λευκά αιμοσφαίρια κατά τη στιγμή της τεχνητής γονιμοποίησης διακρίνουν τις δαμαλίδες με διαφορετικό δυναμικό γονιμότητας. BMC Genom. 2018, 19, 129. [CrossRef]

51. Van Meulder, F.; Van Coppernolle, S.; Borloo, J.; Rinaldi, Μ.; Li, RW; Chiers, Κ.; Van den Broeck, W.; Vercruysse, J.; Claerebout, Ε.; Geldhof, P. Η εξωκυττάρωση με κόκκους της κοκκιολυσίνης και του γρανζύμου Β ως δυνητικός βασικός μηχανισμός στην επαγόμενη από εμβόλιο ανοσία σε βοοειδή έναντι του νηματώδους Ostertagia ostertagi. Μολύνω. Immun. 2013, 81, 1798–1809. [CrossRef] [PubMed]

52. Taylor, JL; Brown, BL Δομική βάση για τη δυσρύθμιση της συνθάσης του αμινολεβουλινικού οξέος σε ανθρώπινες ασθένειες. J. Biol. Chem. 2022, 298, 101643. [CrossRef] [PubMed]

53. Trapani, JA; Sutton, VR Granzyme B: Προ-αποπτωτικές, αντιικές και αντικαρκινικές λειτουργίες. Curr. Γνώμη. Immunol. 2003, 15, 533-543. [CrossRef] [PubMed]

54. Campanile, G.; Baruselli, PS; Limone, Α.; D'Occhio, MJ Τοπική δράση κυτοκινών και ανοσοκυττάρων στην επικοινωνία μεταξύ της σύλληψης και της μήτρας κατά την κρίσιμη περίοδο της πρώιμης ανάπτυξης του εμβρύου, της προσκόλλησης και της εμφύτευσης-Επιπτώσεις για την επιβίωση του εμβρύου στα βοοειδή: Μια ανασκόπηση. Theriogenology 2021, 167, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

55. Bougarne, Ν.; Weyers, Β.; Desmet, SJ; Deckers, J.; Ray, DW; Staels, Β.; De Bosscher, K. Molecular Actions of PPARalpha στον μεταβολισμό των λιπιδίων και τη φλεγμονή. Ενδοκρ. Αναθ. 2018, 39, 760–802. [CrossRef]

56. Sobolev, VV; Tchepourina, Ε.; Korsunskaya, IM; Geppe, NA; Chebysheva, SN; Soboleva, AG; Mezentsev, A. Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα PPAR-γάμα στην παθογένεση της ψωρίασης, των κυττάρων του δέρματος και των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2022, 23, 9708. [CrossRef]

57. Song, S.; Attia, RR; Connaughton, S.; Niesen, MI; Ness, GC; Elam, MB; Hori, RT; Cook, GA; Το Park, ο υποδοχέας άλφα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος EA (PPARalpha) και ο συνενεργοποιητής PPAR γάμμα (PGC-1alpha) επάγουν την παλμιτοϋλτρανσφεράση ΙΑ καρνιτίνης (CPT-1A) μέσω ανεξάρτητων γονιδιακών στοιχείων. ΜοΙ. Κύτταρο. Endocrinol. 2010, 325, 54–63. [CrossRef]

58. Ziouzenkova, Ο.; Plutzky, J. Μεταβολισμός ρετινοειδών και αποκρίσεις πυρηνικών υποδοχέων: Νέες ιδέες για τη συντονισμένη ρύθμιση του συμπλέγματος PPAR-RXR. FEBS Lett. 2008, 582, 32–38. [CrossRef]

59. Espenshade, PJ; Hughes, AL Ρύθμιση σύνθεσης στερολών σε ευκαρυώτες. Annu. Αιδ. Genet. 2007, 41, 401-427. [CrossRef]

60. Van Meer, G.; Voelker, DR; Feigenson, GW Μεμβρανικά λιπίδια: Πού βρίσκονται και πώς συμπεριφέρονται. Nat. Rev. ΜοΙ. Κύτταρο. Biol. 2008, 9, 112–124. [CrossRef]

61. Aguilar-Ballester, M.; Herrero-Cervera, Α.; Vinue, Α.; Martinez-Hervas, S.; Gonzalez-Navarro, H. Επίδραση του μεταβολισμού της χοληστερόλης στη λειτουργία των ανοσοκυττάρων και στην αθηροσκλήρωση. Nutrients 2020, 12, 2021. [CrossRef] [PubMed]

62. Mamedova, LK; Yuan, Κ.; Laudick, AN; Fleming, SD; Mashek, ΓΔ; Bradford, BJ Η σηματοδότηση του υποδοχέα 4 τύπου Toll απαιτείται για την επαγωγή της έκφρασης γλυκονεογονικού γονιδίου από το παλμιτικό σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατικού καρκινώματος. J. Nutr. Biochem. 2013, 24, 1499–1507. [CrossRef] [PubMed]

63. Soto-Heredero, G.; Gomez de Las Heras, MM; Gabande-Rodriguez, Ε.; Oller, J.; Mittelbrunn, M. Glycolysis-Ένας βασικός παίκτης στη φλεγμονώδη απόκριση. FEBS J. 2020, 287, 3350–3369. [CrossRef] [PubMed]

64. Kominsky, DJ; Campbell, EL; Colgan, SP Μεταβολικές αλλαγές στην ανοσία και τη φλεγμονή. J. Immunol. 2010, 184, 4062–4068. [CrossRef]

65. Afacan, NJ; Yeung, AT; Pena, OM; Hancock, RE Θεραπευτική δυνατότητα των αμυντικών πεπτιδίων του ξενιστή σε λοιμώξεις ανθεκτικές στα αντιβιοτικά. Curr. Pharm. Des. 2012, 18, 807–819. [CrossRef]

66. Auvynet, C.; Rosenstein, Y. Πολυλειτουργικά αμυντικά πεπτίδια ξενιστή: Αντιμικροβιακά πεπτίδια, οι μικροί αλλά μεγάλοι παίκτες στην έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία. FEBS J. 2009, 276, 6497–6508. [CrossRef]

67. Hilchie, AL; Wuerth, Κ.; Hancock, RE Ανοσολογική διαμόρφωση από πολύπλευρα κατιονικά αμυντικά πεπτίδια ξενιστή (αντιμικροβιακά). Nat. Chem. Biol. 2013, 9, 761–768. [CrossRef]

68. Cheng, Ζ.; Buggiotti, L.; Salavati, Μ.; Marchitelli, C.; Palma-Vera, S.; Wylie, Α.; Takeda, Η.; Tang, L.; Crowe, MA; Wathes, DC; et al. Παγκόσμια μεταγραφικά προφίλ των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων σε αγελάδες πρώιμης γαλουχίας με κλινική ή υποκλινική μαστίτιδα. ΜοΙ. Biol. Απ. 2021, 48, 4611–4623. [CrossRef]

69. Foley, C.; Chapwanya, Α.; Callanan, JJ; Whiston, R.; Miranda-CasoLuengo, R.; Lu, J.; Meijer, WG; Lynn, DJ; O'Farrelly, C.; Meade, KG Ολοκληρωμένη ανάλυση των τοπικών και συστηματικών αλλαγών που προηγούνται της ανάπτυξης κυτταρολογικής ενδομητρίτιδας μετά τον τοκετό. BMC Genom. 2015, 16, 811. [CrossRef]

70. Machado, VS; Silva, TH Προσαρμοστική ανοσία στη μήτρα μετά τον τοκετό: Πιθανή χρήση εμβολίων για τον έλεγχο της μητρίτιδας. Theriogenology 2020, 150, 201–209. [CrossRef]

71. Ley, Κ.; Hoffman, HM; Kubes, Ρ.; Cassatella, MA; Zychlinsky, Α.; Hedrick, CC; Catz, SD Neutrophils: Νέες ιδέες και ανοιχτές ερωτήσεις. Sci. Immunol. 2018, 3, eaat4579. [CrossRef] [PubMed]

72. Wahl, SM; Feldman, GM; McCarthy, JB Ρύθμιση προσκόλλησης και σηματοδότησης λευκοκυττάρων σε φλεγμονές και ασθένειες. J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 789-796. [CrossRef] [PubMed]

73. Schubert, Κ.; Polte, Τ.; Bonisch, U.; Schader, S.; Holtappels, R.; Hildebrandt, G.; Lehmann, J.; Simon, JC; Anderegg, U.; Saalbach, A. Thy-1 (CD90) ρυθμίζει την εξαγγείωση των λευκοκυττάρων κατά τη διάρκεια της φλεγμονής. Ευρώ. J. Immunol. 2011, 41, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

74. Dreymueller, D.; Prussmeyer, J.; Schumacher, J.; Fellendorf, S.; Hess, FM; Seifert, Α.; Babendreyer, Α.; Bartsch, JW; Ludwig, Α. Η μεταλλοπρωτεϊνάση ADAM8 προάγει τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων in vitro και σε οξεία φλεγμονή των πνευμόνων. Είμαι. J. Physiol. Πνευμονικό Κύτταρο. ΜοΙ. Physiol. 2017, 313, L602–L614. [CrossRef]

75. Kostelnik, KB; Barker, Α.; Schultz, C.; Mitchell, TP; Rajeeve, V.; White, IJ; Aurrand-Lions, Μ.; Nourshargh, S.; Cutillas, Ρ.; Nightingale, TD Dynamic διακίνηση και ανακύκλωση του JAM-C είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. PLoS Biol. 2019, 17, e3000554. [CrossRef] [PubMed]

76. Stillie, R.; Farooq, SM; Gordon, JR; Stadnyk, AW Η λειτουργική σημασία πίσω από την έκφραση δύο τύπων υποδοχέα IL-8 στο PMN. J. Leukoc. Biol. 2009, 86, 529–543. [CrossRef]

77. Bouton, AH; Riggins, RB; Bruce-Staskal, PJ Λειτουργίες της πρωτεΐνης προσαρμογέα Cas: Σύγκλιση σήματος και προσδιορισμός κυτταρικών αποκρίσεων. Oncogene 2001, 20, 6448-6458. [CrossRef]

78. Chen, Χ.; Cheng, Ζ.; Zhang, S.; Werling, D.; Wathes, DC Συνδυάζοντας μελέτες συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα και αναλύσεις δεδομένων διαφορικής γονιδιακής έκφρασης εντοπίζονται υποψήφια γονίδια που επηρεάζουν τη μαστίτιδα που προκαλείται από δύο διαφορετικά παθογόνα στην αγελάδα γαλακτοπαραγωγής. Ανοίξτε το J. Anim. Sci. 2015, 5, 358–393. [CrossRef]

79. Chang, GW; Hsiao, CC; Peng, ΥΜ; Vieira Braga, FA; Kragten, NA; Remmerswaal, EB; van de Garde, MD; Straussberg, R.; Konig, GM; Κωστένης, Ε.; et al. Ο υποδοχέας GPR56/ADGRG1 συζευγμένος με πρωτεΐνη G προσκόλλησης είναι ένας ανασταλτικός υποδοχέας σε ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ. Κύτταρο. Rep. 2016, 15, 1757–1770. [CrossRef]

80. Bi, J.; Tian, ​​Z. NK κυτταρική δυσλειτουργία και ανοσοθεραπεία σημείου ελέγχου. Εμπρός. Immunol. 2019, 10, 1999. [CrossRef]

81. Minuti, Α.; Gallo, Α.; Lopreiato, V.; Bruschi, S.; Piccioli-Cappelli, F.; Uboldi, Ο.; Trevisi, E. Επίδραση του μεγέθους της γέννας στο μεταβολικό και αμινοξικό προφίλ πριν από τον τοκετό σε κουνέλι. Animal 2020, 14, 2109–2115. [CrossRef] [PubMed]

82. Crookenden, MA; Moyes, KM; Kuhn-Sherlock, Β.; Lehnert, Κ.; Walker, CG; Loor, JJ; Mitchell, MD; Murray, Α.; Dukkipati, VSR; Vailati-Riboni, M.; et al. Μεταγραφική ανάλυση των κυκλοφορούντων ουδετερόφιλων σε μεταβολικά στρεσαρισμένες περιμερικές αγελάδες γαλακτοπαραγωγής. J. Dairy Sci. 2019, 102, 7408–7420. [CrossRef] [PubMed]

83. Sharma, JN; Al-Omran, Α.; Parvathy, SS Ο ρόλος του μονοξειδίου του αζώτου σε φλεγμονώδεις ασθένειες. Inflammopharmacology 2007, 15, 252-259. [CrossRef] [PubMed]

84. Martino, MR; Gutierrez-Aguilar, Μ.; Yiew, NKH; Lutkewitte, AJ; Singer, JM; McCommis, KS; Ferguson, D.; Liss, KHH; Yoshino, J.; Renkemeyer, MK; et al. Η σίγαση της τρανσαμινάσης 2 της αλανίνης στο διαβητικό ήπαρ εξασθενεί την υπεργλυκαιμία μειώνοντας τη γλυκονεογένεση από τα αμινοξέα. Cell Rep. 2022, 39, 110733. [CrossRef] [PubMed]

85. Ψηλός, AR; Yvan-Charvet, L. Χοληστερόλη, φλεγμονή και έμφυτη ανοσία. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 104–116. [CrossRef]

86. Wathes, D.; Cheng, Ζ.; Mareiy, W.; Fouladi-Nasht, A. Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και γονιμότητα σε θηλυκά θηλαστικά: Μια ενημέρωση. CABI Rev. 2013, 8, 1–14. [CrossRef]

87. Alipour, Α.; van Oostrom, AJ; Israeljan, Α.; Verseyden, C.; Collins, JM; Frayn, KN; Plokker, TW; Elte, JW; Castro Cabezas, M. Λευκοκυτταρική ενεργοποίηση από λιποπρωτεΐνες πλούσιες σε τριγλυκερίδια. Αρτηριοσκληρυντικός. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 792-797. [CrossRef]

88. Castoldi, Α.; Monteiro, LB; van Teijlingen Bakker, Ν.; Sanin, DE; Rana, Ν.; Corrado, Μ.; Cameron, AM; Hassler, F.; Matsushita, Μ.; Caputa, G.; et al. Η σύνθεση τριακυλογλυκερόλης ενισχύει τη φλεγμονώδη λειτουργία των μακροφάγων. Nat. Commun. 2020, 11, 4107. [CrossRef]

89. Bell, AW Ρύθμιση του μεταβολισμού των οργανικών θρεπτικών συστατικών κατά τη μετάβαση από την όψιμη εγκυμοσύνη στην πρώιμη γαλουχία. J. Anim. Sci. 1995, 73, 2804–2819. [CrossRef]

90. Moore, DAPSU; Varga, G. BUN και MUN: Δοκιμή αζώτου ουρίας σε γαλακτοπαραγωγά βοοειδή. Επιτομή 1996, 18, 712–720.

91. Wathes, DC; Bourne, Ν.; Cheng, Ζ.; Mann, GE; Taylor, VJ; Coffey, MP Πολλαπλές αναλύσεις συσχέτισης μεταβολικών και ενδοκρινικών προφίλ με τη γονιμότητα σε πρωτότοκες και πολύτοκες αγελάδες. J. Dairy Sci. 2007, 90, 1310–1325. [CrossRef] [PubMed]

92. Abe, R.; Donnelly, SC; Peng, Τ.; Bucala, R.; Metz, CN Περιφερικά ινοκύτταρα αίματος: Οδός διαφοροποίησης και μετανάστευση στις θέσεις του τραύματος. J. Immunol. 2001, 166, 7556–7562. [CrossRef] [PubMed]

93. Schreier, S.; Triampo, W. Ο πληθυσμός σπανίων κυττάρων που κυκλοφορεί στο αίμα. Τι είναι και σε τι χρησιμεύει; Cells 2020, 9, 790. [CrossRef] [PubMed]

94. Lynn, ΑΚ; Yannas, IV; Bonfield, W. Αντιγονικότητα και ανοσογονικότητα κολλαγόνου. J. Biomed. Μητήρ. Res. 2004, 71, 343-354. [CrossRef]

95. Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Heiser, Α.; Loor, JL; Meier, S.; Mitchell, MD; Phyn, CVC; Turner, SA Fertility and the transition γαλακτοπαραγωγική αγελάδα. Αναπαραγωγή. Γόνιμη. Dev. 2017, 30, 85–100. [CrossRef]

96. Galvao, KN; Flaminio, MJ; Brittin, SB; Sper, R.; Fraga, Μ.; Caixeta, L.; Ricci, Α.; Φρουρός, CL; Μπάτλερ, WR; Gilbert, RO Συσχέτιση μεταξύ της νόσου της μήτρας και των δεικτών κατάστασης ουδετερόφιλων και συστημικής ενέργειας σε θηλάζουσες αγελάδες Holstein. J. Dairy Sci. 2010, 93, 2926–2937. [CrossRef]

97. Dahl, MO; Maunsell, FP; De Vries, Α.; Galvao, KN; Risco, CA; Hernandez, JA Στοιχεία ότι η μαστίτιδα μπορεί να προκαλέσει απώλεια εγκυμοσύνης σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής: Συστηματική ανασκόπηση μελετών παρατήρησης. J. Dairy Sci. 2017, 100, 8322–8329. [CrossRef]

98. Hansen, PJ; Soto, Ρ.; Natzke, RP Μαστίτιδα και γονιμότητα στα βοοειδή-πιθανή εμπλοκή φλεγμονής ή ανοσολογική ενεργοποίηση στην εμβρυϊκή θνησιμότητα. Είμαι. J. Reprod. Immunol. 2004, 51, 294–301. [CrossRef]

99. Malinowski, Ε.; Gajewski, Z. Μαστίτιδα και διαταραχές γονιμότητας σε αγελάδες. Πολ. J. Vet. Sci. 2010, 13, 555–560.

100. Edmonson, AJ; Lean, IJ; Weaver, LD; Farver, Τ.; Webster, GA Ένα διάγραμμα βαθμολόγησης κατάστασης σώματος για αγελάδες γαλακτοπαραγωγής Holstein. J. Dairy Sci. 1989, 72, 11. [CrossRef]

101. Larsen, Τ.; Rontved, CM; Ingvartsen, KL; Vels, L.; Bjerring, M. Ενζυμική δραστηριότητα και πρωτεΐνες οξείας φάσης στο γάλα που χρησιμοποιούνται ως δείκτες οξείας κλινικής μαστίτιδας που προκαλείται από E. coli LPS. Animal 2010, 4, 1672–1679. [CrossRef] [PubMed]

102. Krogh, ΜΑ; Hostens, Μ.; Salavati, Μ.; Grelet, C.; Sorensen, MT; Wathes, DC; Ferris, CP; Marchitelli, C.; Signorelli, F.; Napolitano, F.; et al. Διακύμανση μεταξύ και εντός της αγέλης στους βιοδείκτες αίματος και γάλακτος σε αγελάδες Holstein στην πρώιμη γαλουχία. Animal 2020, 14, 1067–1075. [CrossRef] [PubMed]

103. Buggiotti, L.; Cheng, Ζ.; Wathes, DC; Gplus, EC Η εξόρυξη των μη χαρτογραφημένων αναγνώσεων σε δεδομένα RNA-Seq βοοειδών αποκαλύπτει τον επιπολασμό του ιού του έρπητα βοοειδών-6 στις ευρωπαϊκές αγελάδες γαλακτοπαραγωγής και τις σχετικές αλλαγές στον φαινότυπο και στο μεταγραφικό τους λευκοκυττάρου. Ιοί 2020, 12, 1451. [CrossRef] [PubMed]

104. Beltman, ME; Forde, Ν.; Furney, Ρ.; Carter, F.; Roche, JF; Lonergan, Ρ.; Crowe, MA Χαρακτηρισμός της έκφρασης του ενδομητρικού γονιδίου και των μεταβολικών παραμέτρων σε μοσχαρίσιες δαμαλίδες που παράγουν βιώσιμα ή μη έμβρυα την Ημέρα 7 μετά τη σπερματέγχυση. Αναπαραγωγή. Γόνιμη. Dev. 2010, 22, 987–999. [CrossRef] [PubMed]