Συν-ανοσοθεραπεία με βάση το λιπόσωμα με αγωνιστή TLR και CD47-Αποκλεισμός σημείου ελέγχου SIRP για αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Αφηρημένη:

Η αντικαρκινική ανοσία είναι βασικό συστατικό της θεραπείας του καρκίνου και μεσολαβείται κυρίως από την έμφυτη ανοσοαπόκριση, η οποία παίζει κρίσιμο ρόλο στην έναρξη και τη διαμόρφωση της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης. Τα αναδυόμενα στοιχεία έχουν προσδιορίσει τα έμφυτα σημεία ελέγχου του ανοσοποιητικού και τους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων, όπως το CD47 και ο υποδοχέας τύπου Toll 7 (TLR7), ως πολλά υποσχόμενους θεραπευτικούς στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου. Με βάση την πρωτεΐνη σύντηξης Fc-CV1, η οποία περιλαμβάνει μια παραλλαγή SIRP υψηλής συγγένειας (CV1) και το θραύσμα Fc του ανθρώπινου αντισώματος IgG1, εκμεταλλευτήκαμε ένα παρασκεύασμα που συνέδεσε το Fc-CV1 με λιποσώματα φορτωμένα με imiquimod (αγωνιστής TLR7). CILPs) για να στοχεύσετε ενεργά το CT26. Μοντέλα συγγενούς όγκου του παχέος εντέρου WT. Μελέτες in vitro αποκάλυψαν ότι τα CILP παρουσίασαν ανώτερες ιδιότητες παρατεταμένης απελευθέρωσης και αποτελεσματικότητα πρόσληψης κυττάρων σε σύγκριση με την ελεύθερη imiquimod. In vivo, οι δοκιμασίες απέδειξαν ότι οι CILPs εμφάνισαν πιο αποτελεσματική συσσώρευση σε όγκους και πιο σημαντικό αποτέλεσμα καταστολής όγκου από τις ομάδες ελέγχου. Αυτό το παρασκεύασμα ανοσοθεραπείας διέθετε τα πλεονεκτήματα των χαμηλών δόσεων και της χαμηλής τοξικότητας. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένας συνδυασμός θεραπείας ανοσολογικού αποκλεισμού (ICB) και έμφυτων αγωνιστών ανοσίας, όπως το παρασκεύασμα λιποσώματος Fc-CV1 και φορτωμένο με imiquimod που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη, θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μια εξαιρετικά αποτελεσματική στρατηγική για τη θεραπεία όγκων.

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

Λέξεις-κλειδιά:

imiquimod; λιπόσωμα; Fc-CV1; ανοσοθεραπεία; καρκίνο του παχέος εντέρου

1. Εισαγωγή

Η παγκόσμια συχνότητα του καρκίνου συνεχίζει να αυξάνεται ετησίως, αποτελώντας σοβαρή απειλή για την υγεία του παγκόσμιου πληθυσμού και επιβαρύνοντας βαριά τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης. Σύμφωνα με έκθεση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, το 2020, 19,29 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις καρκίνου και 9,96 εκατομμύρια θάνατοι από καρκίνο σημειώθηκαν παγκοσμίως [1]. Ωστόσο, με τη συνεχή πρόοδο στην κλινική διάγνωση, τη χειρουργική, την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία, η συνολική επιβίωση και η ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο έχουν βελτιωθεί σημαντικά. Συγκεκριμένα, η ανοσοθεραπεία, η οποία ξεκίνησε με το εμβόλιο Coley τη δεκαετία του 1890 [2], προηγείται τόσο της ακτινοθεραπείας όσο και της χημειοθεραπείας και έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο την τελευταία δεκαετία, ωφελώντας τους καρκινοπαθείς.

Η ανοσοθεραπεία όγκων έχει αναγνωριστεί για την εξαιρετική βιοσυμβατότητα και την υψηλή ειδικότητά της και είναι ικανή να επάγει ανοσολογικές αποκρίσεις για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων [3-5]. Δύο κύριες στρατηγικές για την ανοσοθεραπεία όγκου είναι η ενίσχυση του ανοσοποιητικού και η ομαλοποίηση του ανοσοποιητικού [6]. Τα πρότυπα ενίσχυσης του ανοσοποιητικού αποτελούνται κυρίως από θεραπεία με κυτοκίνη, θεραπευτικά εμβόλια όγκων και μονοκλωνικά αντισώματα. Οι υποδοχείς τύπου Toll (TLRs) θεωρούνται πιθανοί στόχοι για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου λόγω του ρόλου τους στην ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Οι αγωνιστές TLR έχουν αναπτυχθεί ως ανοσοενισχυτικό και μια ποικιλία αγωνιστών TLR υποβάλλονται σε κλινικές δοκιμές [7]. Το μονοφωσφορυλικό λιπίδιο Α και οι αγωνιστές imiquimod, TLR4 και TLR7, αντίστοιχα, έχουν λάβει έγκριση από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για κλινική εφαρμογή [7-9]. Το Imiquimod, ένας αγωνιστής TLR7 [9], ενεργοποιεί τις ανοσολογικές αποκρίσεις και ενισχύει την αντικαρκινική δραστηριότητα ενεργοποιώντας το TLR7 [10,11]. Η στρατηγική ομαλοποίησης του ανοσοποιητικού αντιπροσωπεύεται από φάρμακα αποκλεισμού σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος (ICB) που ρυθμίζουν την ελαττωματική προσαρμοστική ανοσοαπόκριση όγκου. Από τον πρώτο αναστολέα σημείου ελέγχου, το ipilimumab εγκρίθηκε για κλινική εφαρμογή στις ΗΠΑ το 2011, οι αναστολείς του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου, όπως οι αναστολείς PD1/PDL1, έχουν κάνει μια σημαντική ανακάλυψη στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου [12-14]. Εκτός από προσαρμοσμένα σημεία ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος παρόμοια με τα PD1/PDL1, ορισμένα έμφυτα σημεία ελέγχου του ανοσοποιητικού, όπως το SIRP -CD47, έχουν επίσης προσελκύσει μεγάλη προσοχή και έχουν γίνει τομείς σημαντικού ενδιαφέροντος στην ανάπτυξη φαρμάκων αντισωμάτων [15-17].

Το σημείο ελέγχου SIRP -CD47 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά το 1999 [18,19]. Το SIRP είναι ένας υποδοχέας CD47 που εκφράζεται στους νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήματος [20] και στα μυελοειδή κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μονοκυττάρων, των μακροφάγων, των κοκκιοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων. Το CD47 είναι ένα «αυτοεπισημαινόμενο μόριο» που εκφράζεται σε όλα σχεδόν τα φυσιολογικά κύτταρα και υπερεκφράζεται στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα [21]. Στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, το CD47 συνδέεται με το SIRP, αναστέλλοντας τη φαγοκυττάρωση που προκαλείται από μακροφάγους, η οποία είναι ένα σημαντικό μέσο ανοσολογικής διαφυγής του όγκου [22]. Έχει αποδειχθεί ότι η φαγοκυττάρωση των μακροφάγων εντός του μικροπεριβάλλοντος του όγκου μπορεί να ενισχυθεί όταν η δέσμευση του CD47 και του SIRP αποκλείεται [20-25]. Ως εκ τούτου, αναστολείς του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου που μπλοκάρουν την οδό CD47/SIRP έχουν αναπτυχθεί και εφαρμοστεί στη θεραπεία του καρκίνου [26].

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε έναν συνδυασμό imiquimod και πρωτεΐνης σύντηξης (Fc-CV1) για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η CV1 είναι μια τροποποιημένη ανθρώπινη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη SIRP που έχει 50,{4}}πλάσια συγγένεια για το CD47 από την αρχική πρωτεΐνη [27]. Το Fc-CV1 κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την τεχνολογία "Knobs-into-holes", με βάση το μονομερές CV1 και το τμήμα Fc του ανθρώπινου IgG1. Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της κακής θεραπευτικής αποτελεσματικότητας και της συστημικής τοξικότητας που σχετίζονται με την imiquimod [28,29], παρασκευάσαμε νανολιποσώματα μέσω της μεθόδου έγχυσης αιθανόλης. Τα νανολιποσώματα έχουν τα χαρακτηριστικά χαμηλής τοξικότητας στην παροχή φαρμάκου [30,31]. Στη συνέχεια, το imiquimod ενθυλακώθηκε σε λιποσώματα τα οποία συζεύχθηκαν στην επιφάνεια Fc-CV1. Τέλος, αυτό το νέο νανο-παρασκεύασμα μπορεί να παραδώσει ενεργά αγωνιστές TLR7 σε ιστούς όγκου και έχει διπλές λειτουργίες ως φάρμακο ICB και αγωνιστής TLR. Χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία του CD{21}} CT26.WT μοντέλου συγγενούς όγκου του παχέος εντέρου [32].

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Χαρακτηρισμός LPs (κενά λιποσώματα), ILPs (Μη CD47-Στοχευμένα λιποσώματα με ενθυλάκωση Imiquimod), CLP (Στοχευμένα λιποσώματα CD47) και CILPs (Συζευγμένο Fc-CV1 σε Imiquimod (TLR7-sadostome)

Τα CILP παρασκευάστηκαν επιτυχώς με έγχυση αιθανόλης και τη μέθοδο βαθμίδωσης θειικού αμμωνίου. Το Σχήμα 1Α δείχνει τη διαδικασία σύνθεσης των CILP. Μια ανάλυση TEM έδειξε ότι τα CILP ήταν σφαιρικά και ομοιόμορφα σε σχήμα (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, το αποτέλεσμα DLS αποκάλυψε ότι το μέγεθος σωματιδίων των τεσσάρων λιποσωμάτων ήταν μονοτροπική κατανομή (Εικόνα 1C). Ο ρυθμός δέσμευσης (BR) επαληθεύτηκε με SDS-PAGE, το οποίο εμφανίζεται στο Σχήμα 1D, Ε. Το Σχήμα 1Δ δείχνει το μοριακό βάρος του Fc-CV1 και τη σχετική φωτεινότητα της ζώνης των CILP που υποβάλλονται σε διαπίδυση και προδιαπίδυση. Το BR υπολογίστηκε ότι είναι 67,13 ± 37,10% μέσω της πυκνομετρίας σάρωσης της εικόνας J ηλεκτροφορητικών ζωνών (Εικόνα 1Ε), παρέχοντας τη δυνατότητα CD{14}} να στοχεύουν κύτταρα όγκου.

Εικόνα 1. (Α) Σχηματική απεικόνιση της σύνθεσης των CILPs. (Β) εικόνα TEM των CILP

Χρησιμοποιήθηκε HPLC για την ανίχνευση της αποτελεσματικότητας ενθυλάκωσης (EE) της imiquimod (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1A, το ελεύθερο imiquimod έδειξε μια σημαντική μονή κορυφή, ενώ τα CLP δεν εμφάνισαν κορυφή υπό τις ίδιες συνθήκες δοκιμής (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B). Επομένως, είναι εφικτό να ανιχνευθούν τα CILP απευθείας κάτω από τις συνθήκες δοκιμής. Όπως αναμενόταν, οι τιμές ανίχνευσης των CILPs πριν και μετά την αιμοκάθαρση θεωρήθηκαν ως η συνολική περιεκτικότητα σε φάρμακο και η περιεκτικότητα σε φάρμακο στα λιποσώματα, αντίστοιχα (Συμπληρωματικό Σχήμα S1C, D). Η ΕΕ του imiquimod υπολογίστηκε ότι είναι 85,44 ± 4,11%. Σε σύγκριση με το αναφερόμενο σύστημα χορήγησης φαρμάκου με παθητική φόρτωση [33-35], αυτή η μελέτη πέτυχε υψηλότερη αποτελεσματικότητα ενθυλάκωσης και μια πιο βολική διαδικασία προετοιμασίας.

Το DLS έδειξε ότι οι διάμετροι των LP ήταν 111,567 ± 0,655 nm, ενώ τα CLP, ILP και CILP έδειξαν ένα ελαφρώς μεγαλύτερο μέγεθος 117,467 ± 0,34{{1{0} } nm, 120.233 ± 0.776 nm και 13{{30}}.033 ± 0.974 nm, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Οι αλλαγές στο μέγεθος αυτών των λιποσωμάτων μπορεί να αποδοθούν στην τροποποίηση του Fc-CV1 και του imiquimod. Το PDI ήταν κοντά στο 0,1 (Πίνακας 1), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα οχήματα διανομής φαρμάκων ήταν εξαιρετικά ομοιογενή στη διανομή τους. Επιπλέον, οι τιμές ζήτα δυναμικού των LPs, CLPs, ILPs και CILPs μετρήθηκαν ότι είναι -2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV και 7−0,00 mV αντιστοίχως. , υποδηλώνοντας ότι το επιφανειακά συζευγμένο Fc-CV1 και η εγκλεισμένη σε κάψουλα imiquimod είχαν μικρή επίδραση στο φορτίο των λιποσωμάτων.

Πίνακας 1. Οι διάμετροι, ζήτα-δυναμικό, PDI και EE των LPs, CLPs, ILPs και CILPs, αντίστοιχα.

2.2. Αποτελεσματικότητα πρόσληψης κυττάρων in vitro

Η αποτελεσματικότητα πρόσληψης κυττάρων των CILPs αξιολογήθηκε μέσω της έντασης φθορισμού του Cy5 που λαμβάνεται από κύτταρα CT26.WT χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης υψηλού περιεχομένου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, σε σύγκριση με τις ελεύθερες ομάδες Cy5 και ILP-Cy5, οι ομάδες CILPs-Cy5 επέδειξαν ισχυρότερη ικανότητα πρόσληψης κυττάρων μετά από 30 λεπτά επώασης. Αυτά τα αποτελέσματα συμπέραναν ότι το Fc-CV1 ενίσχυσε την ικανότητα ενδοκυτταρικής παροχής λιποσωμάτων φορτωμένων με imiquimod λόγω της ειδικής συγγένειας με τον υποδοχέα Fc-CV1, οδηγώντας σε ένα πιο ισχυρό αντικαρκινικό αποτέλεσμα.

Εικόνα 2. Οι εικόνες των κυττάρων CT26.WT μετά από επώαση με τα ελεύθερα Cy5, ILPs-Cy5 και CILPs-Cy5 (κόκκινο) για 0,5 ώρες και χρώση με DAPI (μπλε). Γραμμή κλίμακας: 50 μm. (n {{10}}). * p < 0,05; **** p < 0,0001

2.3. Καμπύλες απελευθέρωσης λιποσωμάτων

Οι καμπύλες απελευθέρωσης φαρμάκου της ελεύθερης imiquimod, ILPs και CILPs μετρήθηκαν σε περιβάλλον προσομοίωσης in vivo. Το σχήμα 3 δείχνει ότι η ελεύθερη imiquimod απελευθερώθηκε εξ ολοκλήρου μετά από 1 ώρα, ενώ ο ρυθμός απελευθέρωσης (RR) της imiquimod που ενθυλακώθηκε με ILPs και CILPs ήταν μόνο 54,75 ± 4.08% και 39,70 ± 0,05% στις 12 ώρες , αντίστοιχα. Επιπλέον, η αργή απελευθέρωση της imiquimod σε ILPs και CILPs θα μπορούσε να κλείσει με την ιδιότητα ελεγχόμενης απελευθέρωσης φαρμάκου των λιποσωμάτων. Το RR της imiquimod σε ILP και CILP δεν έδειξε σημαντική διαφορά στις 96 ώρες, υποδεικνύοντας ότι η "μετά την εισαγωγή" επέδειξε αμελητέα επίδραση στη σταθερότητα της μεμβράνης των λιποσωμάτων.

Σχήμα 3. Καμπύλες απελευθέρωσης Imiquimod του ελεύθερου imiquimod, ILPs και CILPs σε PBS στους 37 ◦C. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Μελέτη Κυτταροτοξικότητας

Για τη μελέτη της κυτταροτοξικότητας των CILP in vitro, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία CCK{{0}} σε κύτταρα CT26.WT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα CILPs σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0,1–1 μg/mL) δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα, κάτι που συνάδει με την ασφάλεια της θεραπείας ανοσοποίησης. Η κυτταρική βιωσιμότητα μειώθηκε ελαφρώς μετά από θεραπεία με 5 μg/mL imiquimod, πιθανώς λόγω του ROS και του ανοσογονικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από το ενδοπλασματικό δίκτυο που προκαλείται από το imiquimod [36]. Επιπλέον, τα CILPs οδηγούν σε σημαντική μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, γεγονός που αποδίδεται στη συνεργιστική επίδραση της imiquimod και του Fc-CV1.

Εικόνα 4. Η βιωσιμότητα των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με Fc-CV1, imiquimod, CLPs, ILPs και CILPs για 24 ώρες. Η συγκέντρωση του Fc-CV1 και του imiquimod ήταν και τα δύο 0–10 μg/mL. * p < 0.05, ** p < 0.01, ns=δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές

2.5. Μελέτη Βιοκατανομής

Η κατανομή και η συσσώρευση διαφορετικών σκευασμάτων σε όγκους και κύρια όργανα επηρεάζει άμεσα το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, τα σήματα φθορισμού παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ζωοτομής κοντά στο υπέρυθρο για να αξιολογηθεί η κατανομή και η συσσώρευση διαφορετικών σκευασμάτων σε όγκους και κύρια όργανα μετά από 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η συνολική ένταση φθορισμού των ILPs-Cy5 και CILPs-Cy5 ήταν υψηλότερη από την ελεύθερη Cy5, υποδεικνύοντας ότι τα λιποσώματα είχαν μια ιδιότητα μακράς κυκλοφορίας in vivo. Επιπλέον, η ένταση φθορισμού της ομάδας θεραπείας CILPs-Cy5 ήταν η υψηλότερη στον ιστό όγκου, κάτι που θα μπορούσε να αποδοθεί στην επίδραση στόχευσης όγκου των προσδεμάτων Fc-CV1, ενισχύοντας έτσι το αντινεοπλασματικό αποτέλεσμα. Εντυπωσιακά, η ένταση φθορισμού των ήπατων και των σπλήνων ήταν πιο ισχυρή από άλλα όργανα, κάτι που πιθανώς οφείλεται στη φαγοκυττάρωση των λιποσωμάτων από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES) στο ήπαρ και τους νεφρούς [37].

Εικόνα 5. Η κατανομή του φθορισμού Cy5-σε όγκους και κύρια όργανα στις 24 ώρες μετά την ενδοφλέβια χορήγηση. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (n=3). **** p < 0.0001

2.6. In Vivo Μελέτη Αναστολής Όγκων

Το θεραπευτικό πρόγραμμα (Εικόνα 6Α) και τα αποτελέσματα διαφορετικών παρασκευασμάτων φαίνονται στο Σχήμα 6. Σε σύγκριση με τις ομάδες PBS και LP, άλλες ομάδες θεραπείας εμφάνισαν ορισμένα ογκοκατασταλτικά αποτελέσματα. Σημειωτέον, ο όγκος του όγκου ήταν ελάχιστος μετά τη θεραπεία με CILPs, υποδηλώνοντας ότι οι CILPs διέθεταν εξαιρετικό ογκοκατασταλτικό αποτέλεσμα (Εικόνα 6Β).

Εικόνα 6. (Α) Σχηματική απεικόνιση της θεραπείας κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου στο μοντέλο όγκου CT26.WT. (Β) Οι καμπύλες ανάπτυξης του όγκου του όγκου κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας. (Γ) Σχετικές φωτογραφίες όγκου και (Δ) βάρος του όγκου που συλλέχθηκαν από διαφορετικές ομάδες θεραπείας την ημέρα 17. (Ε) Η σχετική αναλογία σωματικού βάρους του σωματικού βάρους σε σύγκριση με 0 ημέρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Στο τέλος του πειράματος, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι τους αφαιρέθηκαν, φωτογραφήθηκαν και ζυγίστηκαν για να προσδιοριστεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα διαφορετικών παρασκευασμάτων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C, D, η ομάδα θεραπείας των CILPs είχε τους μικρότερους και ελαφρύτερους όγκους σε σύγκριση με άλλες ομάδες, αποδεικνύοντας ότι οι CILP είχαν τα μεγαλύτερα ογκοκατασταλτικά αποτελέσματα. Ο Πίνακας 2 δείχνει ότι ο ρυθμός αναστολής ανάπτυξης όγκου των CILPs υπολογίστηκε ότι είναι 84,35%. Επιπλέον, το ποσοστό καταστολής όγκων 84,35% ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό των ομάδων CLPs και ILPs, και αυτό σημαίνει ότι υπάρχει συνεργική επίδραση του αποκλεισμού του άξονα «μην με φας» και της ενεργοποίησης της ανοσολογικής απόκρισης . Σε σύγκριση με το ισοδύναμο παρασκεύασμα in vitro (2,5-5 μg/mL), ο υψηλότερος ρυθμός αναστολής σχετιζόταν στενά με εκείνον της ανοσοαπόκρισης που ενεργοποιήθηκε από το σκεύασμα και εμπόδιζε τον μηχανισμό ανοσολογικής διαφυγής in vivo, ο οποίος δεν ήταν διαθέσιμος in vitro.

Πίνακας 2. Τα δεδομένα του βάρους του όγκου και της αναστολής ανάπτυξης όγκου (TGI) διαφόρων ομάδων θεραπείας.

2.7. Τα CILPs αύξησαν τη διήθηση των Τ-κυττάρων και την έκκριση της IFN

Για να διερευνηθεί το περιβάλλον ανοσοκυττάρων των όγκων, το ανοσοκύτταρο που επάγεται από CILPs αναλύθηκε ανοσοϊστοχημικά στο τέλος της αντικαρκινικής δοκιμασίας. Τα CD4+ και CD8+ Τ κύτταρα αυξήθηκαν στα τμήματα όγκου των ομάδων CILPs (Εικόνα 7). Η ταυτόχρονη χορήγηση Fc-CV1 και θεραπείας με imiquimod οδήγησε σε σημαντική διήθηση των CD4+ και CD8+ Τ κυττάρων. Επιπλέον, υπήρχε σημαντική έκκριση IFN στους όγκους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CILPs, η οποία οφειλόταν στο ότι τα CILPs ενεργοποίησαν τον υποδοχέα τύπου Toll 7 και ενεργοποίησαν την ανοσολογική απόκριση.

Εικόνα 7. Ανοσοϊστοχημεία ιστών όγκου ποντικού. Τα θετικά κύτταρα βάφονται καφέ. Γραμμή κλίμακας, 50 μm (n=5).

2.8. Αξιολόγηση βιοασφάλειας CILPs

Η βιοασφάλεια της θεραπείας με τη μεσολάβηση CILPs ήταν επίσης ένας σημαντικός δείκτης όσον αφορά την πρόσβαση στη θεραπευτική αξιολόγηση. Κατά τη διάρκεια της μελέτης αναστολής όγκου in vivo, τα CILPs δεν προκάλεσαν σημαντική απώλεια βάρους κατά την περίοδο της θεραπείας (Εικόνα 6D). Οι βιοχημικές παράμετροι του ήπατος και του νεφρού ήταν όλες στο φυσιολογικό εύρος σύμφωνα με το τυπικό εύρος αναφοράς των ποντικών (Πίνακας 3) και η ιστολογία οργάνων δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές, υποδεικνύοντας ότι τα CILPs διέθεταν εξαιρετική βιοασφάλεια (Εικόνα 8). Αυτά τα ευρήματα είναι ζωτικής σημασίας για την αξιολόγηση της δυνατότητας των CILPs ως ασφαλούς και αποτελεσματικού ανοσοθεραπευτικού παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου.

Πίνακας 3. Οι βιοχημικές παράμετροι του ήπατος και του νεφρού

Εικόνα 8. Χρώση H&E (αιματοξυλίνη και ηωσίνη) των κύριων οργάνων. Γραμμή κλίμακας, 50 μm (n=3)

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Υλικά

Το Imiquimod αγοράστηκε από τη MedChem Express (Σαγκάη, Κίνα). Το Fc-CV1 παρασχέθηκε από το State Key Laboratory of Antibody Drugs and Targeted Therapy. Χοληστερόλη, υδρογονωμένη λεκιθίνη (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS και DSPE-PEGCy5 αγοράστηκαν από την Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Κίνα). Τα 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) ελήφθησαν από την Keygen Biotech (Nanjing, Κίνα). Το θειικό αμμώνιο ελήφθη από την Sinopharm (Σαγκάη, Κίνα). Μεθανόλη (χρωματογραφικός βαθμός) και ακετονιτρίλιο (χρωματογραφικός βαθμός) αγοράστηκαν από την Aladdin Reagent Company (Σαγκάη, Κίνα). Τα άλλα αντιδραστήρια είναι όλα εγχώριας αναλυτικής ποιότητας. Κυτταρική γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικού CT26. Το WT παρασχέθηκε από την Cell Bank της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε επωαστήρα κυττάρων στο μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) σε 5% CO2 και 95% αέρα. Θηλυκά ποντίκια BALB/c 4-6 εβδομάδων προμηθεύτηκαν από την Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Κίνα).

3.2. Παρασκευή λευκών λιποσωμάτων

Αρχικά, 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000 και 4,7095 mg χοληστερόλης ζυγίστηκαν με ακρίβεια και διαλύθηκαν σε 0,1 mL αιθανόλης (HSPC: DSPE-PEG2000: χοληστερόλη:{12}}5.{12}}5.{12}}5. μοριακή αναλογία 5,05:39,3). Δεύτερον, το διάλυμα αιθανόλης εγχύθηκε ταχέως σε ένα προθερμασμένο διάλυμα θειικού αμμωνίου (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) μέσω μιας σύριγγας και στη συνέχεια επωάστηκε για 30 λεπτά στους 65 ◦C με μαγνητική ανάδευση. Στη συνέχεια, το παρασκευασμένο διάλυμα εξωθήθηκε διαδοχικά μέσω των πολυανθρακικών μεμβρανών (Avanti, Alabaster, AL, USA). το μέγεθος ήταν 200 nm, 100 nm και 50 nm, αντίστοιχα. Τέλος, το προκύπτον διάλυμα ήταν τα τυφλά λιποσώματα (LPs) με συγκέντρωση λιπιδίου 22,5 mg/mL.

3.3. Παρασκευή λιποσωμάτων στοχευμένων με Imiquimod-ενθυλακωμένων CD47

Πρώτα, το DSPE-PEG2000-NHS διαλύθηκε σε ddH2O (60 ◦C) και στη συνέχεια αναμίχθηκε με Fc-CV1 και επωάστηκε σε αναδευόμενο τραπέζι σε θερμοκρασία δωματίου για 5 ώρες (Fc-CV1:DSPEG2000- NHS=12:1 μοριακή αναλογία). Ο μηχανισμός χημικής αντίδρασης της σύνδεσης μεταξύ Fc-CV1 και DSPE-PEG2000-NHS περιλάμβανε τον εστέρα NHS να αντιδρά με την πρωτοταγή αμίνη στο Fc-CV1 και σχημάτισε ένα συζυγές επιτραπέζιου δεσμού αμίνης. Το παρασκευασμένο διάλυμα αναμίχθηκε αναλογικά με LPs και επωάστηκε στους 60 ◦C για 1 ώρα για να εισαχθεί το Fc-CV1 σε λιποσώματα, το οποίο ονομάστηκε "μετά την εισαγωγή" [38]. Οι αναλογίες του μίγματος ήταν ότι 2,25 mg Fc-CV1 τροποποιήθηκαν ανά 22,5 mg λιποσωμάτων. Στη συνέχεια ελήφθησαν τα CD47 στοχευμένα λιποσώματα (CLPs).

Στη συνέχεια, τα CLP τοποθετήθηκαν σε σάκο αιμοκάθαρσης (300 kDa) και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι HEPES (10 mM, ρΗ=7.4) για 1 ώρα για να απομακρυνθεί το θειικό αμμώνιο και το υπολειμματικό Fc-CV1 στην εξωτερική υδατική φάση. Τα CLP που υποβλήθηκαν σε διαπίδυση επωάστηκαν με διάλυμα imiquimod (5 mg/mL) σε αναλογία 1 mg προς 7 μmol ολικών φωσφολιπιδίων σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι PBS (300 kDa) τρεις φορές για να εξαλειφθεί η μη ενθυλακωμένη imiquimod, η οποία αναφέρεται στο η τεχνική βαθμίδωσης θειικού αμμωνίου [39]. Στη συνέχεια ελήφθησαν τα CILP. Επιπρόσθετα, παρασκευάστηκαν τα λιποσώματα που είναι ενθυλακωμένα με ιμικουιμόδη (ILP) που δεν στοχεύουν47-. Τα CLP και τα ILP θεωρήθηκαν ως ο έλεγχος για τα CILP.

3.4. Χαρακτηρισμός

Η μορφολογία αυτών των λιποσωμάτων φωτογραφήθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM, Joel, Τόκιο, Ιαπωνία). Το μέγεθος, το δυναμικό ζήτα και ο δείκτης διασποράς πολυμερούς (PDI) αυτών των λιποσωμάτων προσδιορίστηκαν με δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) και ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός (ELS) χρησιμοποιώντας τον Sizer Zeta Malvern ZSE (Malvern, UK). Ο ρυθμός δέσμευσης (BR) του Fc-CV1 που εισήχθη σε λιποσώματα μετρήθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης λαυρυλοθειικού νατρίου 15% (SDS-PAGE) και λογισμικού Image J (Bethesda, MD, USA). Η αποτελεσματικότητα ενθυλάκωσης (EE) της imiquimod ανιχνεύθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC, Thermo Fisher Scientific, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ).

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

3.5. In vitro μελέτη πρόσληψης κυττάρων

Η in vitro κυτταρική πρόσληψη αυτών των λιποσωμάτων προσδιορίστηκε από την αθροιστική ένταση φθορισμού του Cy5 στο CT26. WT κύτταρα. Το DSPE-PEG-Cy5 επωάστηκε με CILPs και ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs ή ILPs=1:5 αναλογία μάζας) στους 60 ◦C για 1 ώρα, αντίστοιχα, και στη συνέχεια φθορίζοντα λιποσώματα που ονομάστηκαν CILPs-Cy5 και ILPs-Cy5 ελήφθησαν. Κύτταρα CT26.WT σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίου και χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο, n=3). Αφού η συρροή των κυττάρων έφτασε στο 50-70%, κάθε ομάδα επωάστηκε με ελεύθερο Cy5, ILPs-Cy5 και CILPs-Cy5, αντίστοιχα, για 30 λεπτά στους 37 ◦C, όπου οι τελικές συγκεντρώσεις του Cy5 ήταν 1 μg/mL σε 0,1 mL RPMI 1640 μέσο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ακινητοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 10 μL DAPI (1 μg/μL) για 10 λεπτά αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τέλος, η πρόσληψη κάθε ομάδας κυττάρων καταγράφηκε από ένα σύστημα απεικόνισης υψηλού περιεχομένου (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) μετά από δύο φορές πλύση με PBS.

3.6. Η Μελέτη Έκδοσης Imiquimod

Οι καμπύλες απελευθέρωσης διαφόρων φορτωμένων με φάρμακο λιποσωμάτων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αιμοκάθαρσης (300 kDa) και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με το ελεύθερο διάλυμα imiquimod. Εν συντομία, 0.6 mL ILPs, CILPs και το διάλυμα imiquimod συσκευάστηκαν χωριστά στους σάκους αιμοκάθαρσης και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 500 mL διαλύματος PBS (pH=7.4, 37 ◦C). Εξήχθησαν ίσοι όγκοι δειγμάτων από τους σάκους σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 και 96 ώρες) και ο ρυθμός απελευθέρωσης (RR) του imiquimod υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

όπου το Sund και το Sd αντιπροσώπευαν την περιοχή κορυφής HPLC του imiquimod σε παρασκευάσματα που υποβλήθηκαν σε προδιάλυση και διαπίδυση σε διάφορους χρόνους, αντίστοιχα (n=3).

3.7. Η κυτταροτοξικότητα των CILPs

CT{{{0}}. Κύτταρα WT σπάρθηκαν σε 96-πλάκα φρεατίου (1 × 104/φρεάτιο, n=3) και καλλιεργήθηκαν σε 100 μL μέσου RPMI 1640 μέχρι τη συρροή έφτασε σχεδόν το 70%. Προκειμένου να προσδιοριστεί η κυτταροτοξικότητα των CILPs, το μέσο RPMI 1640 αφαιρέθηκε από κάθε φρεάτιο και αντικαταστάθηκε με ένα σύμπλοκο διάλυμα CILPs και μέσου RPMI 1640, με συγκεντρώσεις Fc-CV1 και imiquimod που κυμαίνονται από 0 έως 10 μg/mL. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα σύμπλοκο διάλυμα για 24 ώρες. Επιπλέον, τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με Fc-CV1, CLPs, διάλυμα imiquimod και ILPs σε παρόμοια συγκέντρωση θεωρήθηκαν ομάδες ελέγχου. Τα κύτταρα που επιβίωσαν ανιχνεύθηκαν με ανάλυση CCK-8 μετά από 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή θεωρήθηκε 100%.

3.8. Μελέτη Βιοκατανομής

Εννέα θηλυκά ποντίκια BALB/c ενέθηκαν υποδόρια με CT26. Τα κύτταρα WT (5 × 105) στη δεξιά πλευρά και αυτά τα ποντίκια που φέρουν όγκο χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (n=3). Οι όγκοι του όγκου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας παχύμετρο και υπολογίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο:

Όταν ο όγκος του όγκου έφτασε στο 100 mm3, το ελεύθερο Cy5, ILP-Cy5 και CILPs-Cy5 εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε δόση Cy5 0,4 mg/kg. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την ενδοφλέβια ένεση, ο όγκος, η καρδιά, το ήπαρ, ο σπλήνας, ο πνεύμονας και ο νεφρός αφαιρέθηκαν. Τα σήματα φθορισμού των όγκων και των κύριων οργάνων ανιχνεύθηκαν από το σύστημα οπτικής απεικόνισης IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. In Vivo Μελέτη Αναστολής Όγκων

Τριάντα πέντε θηλυκά ποντίκια BALB/c χωρίστηκαν τυχαία σε επτά ομάδες (n=5) και 5 × 105 CT26. Τα κύτταρα WT εγχύθηκαν υποδορίως στη δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Όταν το μέγεθος του όγκου του ποντικού ήταν περίπου 100 mm3, ξεκίνησε η θεραπεία. Τα PBS, LPs, imiquimod, Fc-CV1, ILPs, CLPs και CILPs ενέθηκαν ενδοφλεβίως τις ημέρες 0, 4, 8 και 12. Η δόση της imiquimod ήταν 2,5 mg/kg στην πρώτη και δεύτερη ένεση και 5 mg/kg στην τρίτη και τέταρτη ένεση. Σε όλες τις ενέσεις, η δόση του Fc-CV1 ήταν 5 mg/kg. Σε αυτή τη δόση, η συγκέντρωση του φαρμάκου στο σώμα ήταν 2,5-5 μg/mL, γεγονός που άσκησε κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα σε ένα πείραμα in vitro. Οι διάμετροι του όγκου και το σωματικό βάρος μετρούνταν κάθε μέρα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Την ημέρα 17, αφαιρέθηκαν οι όγκοι των ποντικών και μετρήθηκαν τα βάρη τους. Η αναστολή ανάπτυξης όγκου (TGI) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:

3.10. Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία των CD4, CD8 και IFN πραγματοποιήθηκε σε ιστούς όγκου σύμφωνα με ένα τυπικό πρωτόκολλο. Μετά την αποπαραφίνη και την επανυδάτωση του τμήματος παραφίνης των τμημάτων των ιστών όγκου, προστέθηκε 3% BSA στον κύκλο για να καλύψει τον ιστό και στη συνέχεια σφραγίστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές χρωματίστηκαν με τα αντισώματα CD4, CD8 και IFN (Servicebio, Wuhan, China) όλη τη νύχτα στους 4 ◦C και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα (επισημασμένο με HRP, Servicebio, Wuhan, China) σε θερμοκρασία δωματίου για 50 λεπτά. μετά από δύο πλύσεις με PBS. Στο τέλος, οι τομές οπτικοποιήθηκαν στο μικροσκόπιο (Nikon, E100, Τόκιο, Ιαπωνία) μετά από αντίδραση με τον χρωμογόνο παράγοντα DAB.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

3.11. Αξιολόγηση βιοασφάλειας CILPs

Στο τέλος της μελέτης αναστολής όγκου, συλλέχθηκαν όλοι οι όγκοι και μετρήθηκε το βάρος αυτών των όγκων. Οι βιοχημικές παράμετροι, συμπεριλαμβανομένης της τρανσαμινάσης της αλανίνης (ALT), της ασπαρτικής τρανσαμινάσης (AST), της κρεατινίνης (CREA) και της ουρίας (UREA), ανιχνεύθηκαν στο αίμα ποντικών. Νωποί ιστοί όγκου και κύρια όργανα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη χρησιμοποιώντας μηχανή ενσωμάτωσης (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Κίνα). Φέτες ιστού με πάχος 5 μm κόπηκαν μέσω του μικροτόμου (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Κίνα) και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E) σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Στη συνέχεια, οι φέτες χρώσης παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο (Nikon, Ε100, Τόκιο, Ιαπωνία).

3.12. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Το επίπεδο σημαντικότητας μεταξύ των ομάδων δοκιμάστηκε με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 ορίστηκε ως σημαντική διαφορά.

3.13. Ηθική των Ζώων

Όλες οι διαδικασίες και οι συστάσεις που αφορούν τα ζώα εγκρίθηκαν από την Ειδική Επιτροπή Δεοντολογίας της Επιστημονικής Έρευνας του Πανεπιστημίου Liaocheng ακολουθώντας τις εθνικές οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση των ζώων εργαστηρίου (Κωδικός Έγκρισης: 2022111010; Ημερομηνία Έγκρισης: 1 Νοεμβρίου 2022).

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

4. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, αναπτύχθηκαν με επιτυχία λιποσώματα στοχευμένα με CD47-ενθυλακωμένα με imiquimod και τα in vitro αποτελέσματα απέδειξαν ότι τα CILP είχαν καλύτερη παρατεταμένη απελευθέρωση και συγκεκριμένη επίδραση στόχευσης. Τα in vivo αποτελέσματα έδειξαν ότι το παρασκεύασμα μπορούσε να απορροφηθεί αποτελεσματικά από κύτταρα όγκου και ότι επέδειξε εξαιρετική αποτελεσματικότητα θεραπείας όγκου και βιοασφάλεια λόγω της διπλής λειτουργίας της ανοσοαπόκρισης και του έμφυτου αποκλεισμού του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου. Ως εκ τούτου, τα λιποσώματα που είναι ενθυλακωμένα με imiquimod συζευγμένα με το Fc-CV1 φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενα νέα νανοϊατρική για τη βελτίωση της θεραπείας του όγκου έκφρασης CD47. Η ανοσοθεραπεία που βασίζεται στην έμφυτη ανοσία μπορεί να χρησιμεύσει ως γενική στρατηγική κατά της ανάπτυξης όγκου για συνεργιστικούς συνδυασμούς με ICB στο μέλλον.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Sung, Η.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, Μ.; Soerjomataram, Ι.; Jemal, Α.; Bray, F. Παγκόσμιες Στατιστικές Καρκίνου 2020: Εκτιμήσεις Globocan επίπτωσης και θνησιμότητας παγκοσμίως για 36 καρκίνους σε 185 χώρες. CA Cancer J. Clin. 2021, 71, 209–249. [CrossRef] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr. Snook, AE Talkin' Toxins: From Coleys to Modern Cancer Immunotherapy. Toxins 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, Τ.; Parajuli, Ρ.; Lamichhane, Ν.; Jakubski, S.; Lamichhane, Ρ.; Deshmukh, RR Ανοσοθεραπείες και Συνδυαστικές Στρατηγικές για Ανοσο-Ογκολογία. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2020, 21, 5009. [CrossRef]

4. Hegde, PS; Chen, DS Top 10 Προκλήσεις στην Ανοσοθεραπεία Καρκίνου. Immunity 2020, 52, 17–35. [CrossRef]

5. Jain, KK Personalized Immuno-Oncology. Med. Princ. Πρακτική. 2021, 30, 1–16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. A Shift Paradigm in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization. Cell 2018, 175, 313–326. [CrossRef]

7. Hussein, WM; Liu, TY; Skwarczynski, Μ.; Toth, I. Toll-Like Receptor Agonists: A Patent Review (2011–2013). Γνώμη εμπειρογνωμόνων. Εκεί. Ελαφρό κτύπημα. 2014, 24, 453–470. [CrossRef]

8. Chi, Η.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TB; Jin, G.; Sha, O. Αντι-Ογκική Δραστηριότητα των Αγωνιστών Υποδοχέων 7 που μοιάζουν με Toll. Εμπρός. Pharmacol. 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. Wang, Υ.; Zhang, S.; Li, Η.; Wang, Η.; Zhang, Τ.; Hutchinson, MR; Yin, Η.; Wang, X. Ρυθμιστές μικρών μορίων υποδοχέων που μοιάζουν με το Toll. Λογ. Chem. Res. 2020, 53, 1046–1055. [CrossRef] [PubMed]

10. Le Mercier, Ι.; Poujol, D.; Sanlaville, Α.; Sisirak, V.; Gobert, Μ.; Durand, Ι.; Dubois, Β.; Treilleux, Ι.; Marvel, J.; Vlach, J.; et al. Η προώθηση του όγκου από ενδοογκικά πλασμακυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα αντιστρέφεται από τη θεραπεία με συνδέτη Tlr7. Cancer Res. 2013, 73, 4629–4640. [CrossRef]

11. Ma, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Οι Tlr7 Αγωνιστές Imiquimod και Gardiquimod Βελτιώνουν την ανοσοθεραπεία με βάση το DC για το μελάνωμα σε ποντίκια. Κύτταρο. ΜοΙ. Immunol. 2010, 7, 381-388. [CrossRef]

12. Billan, S.; Kaidar-Person, Ο.; Gil, Z. Θεραπεία μετά την Πρόοδο στην Εποχή της Ανοσοθεραπείας. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. Darvin, Ρ.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Immune Checkpoint Inhibitors: Recent Progress and Potential Biomarkers. Exp. ΜοΙ. Med. 2018, 50, 1–11. [CrossRef] [PubMed]

14. Li, Β.; Chan, HL; Chen, P. Immune Checkpoint Inhibitors: Basics and Challenges. Curr. Med. Chem. 2019, 26, 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. Jia, Χ.; Yan, Β.; Tian, ​​Χ.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway Μεσολαβεί στην Ανοσολογική Διαφυγή και Ανοσοθεραπεία Καρκίνου. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 3281–3287. [CrossRef]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA The Promise of Macrophage Directed Checkpoint Inhibitors in Myeloid Malignancies. Βέλτιστη πρακτική και έρευνα. Clin. Haematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, WA Έμφυτοι αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού: Η επόμενη σημαντική ανακάλυψη στην ιατρική ογκολογία; ΜοΙ. Καρκίνος Θερ. 2021, 20, 961–974. [CrossRef]

18. Jiang, Ρ.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Η πρωτεΐνη που σχετίζεται με την ιντεγκρίνη είναι ένας συνδέτης για το μόριο νευρικής προσκόλλησης P84. J. Biol. Chem. 1999, 274, 559–562. [CrossRef]

19. Seiffert, Μ.; Cant, C.; Chen, Ζ.; Rappold, Ι.; Brugger, W.; Kanz, L.; Brown, EJ; Ullrich, Α.; Η Buhring, HJ ανθρώπινη ρυθμιστική πρωτεΐνη σήματος εκφράζεται σε φυσιολογικά, αλλά όχι σε υποσύνολα λευχαιμικών μυελοειδών κυττάρων και μεσολαβεί στην κυτταρική προσκόλληση που περιλαμβάνει τον αντιυποδοχέα του Cd47. Blood 1999, 94, 3633-3643. [CrossRef]

20. Matlung, HL; Szilagyi, Κ.; Barclay, NA; van den Berg, TK Ο άξονας σηματοδότησης Cd47-Sirpalpha ως έμφυτο σημείο ελέγχου του ανοσοποιητικού στον καρκίνο. Immunol. Αναθ. 2017, 276, 145–164. [CrossRef] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, Α.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Ρόλος του Cd47 ως δείκτης του εαυτού στα ερυθρά αιμοσφαίρια. Science 2000, 288, 2051–2054. [CrossRef]

22. Li, Ζ.; Li, Υ.; Gao, J.; Fu, Υ.; Hua, Ρ.; Jing, Υ.; Cai, Μ.; Wang, Η.; Tong, T. The Role of Cd47-Sirpalpha Immune Checkpoint in Tumor Immune Evasion and Innate Immunotherapy. Life Sci. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Pirro, Μ.; Jaafari, MR; Hatamipour, Μ.; Sahebkar, A. Cd47: Ρόλος στο ανοσοποιητικό σύστημα και εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου. Κύτταρο. Oncol. 2020, 43, 19–30. [CrossRef]

24. Huang, Υ.; Ενδέχεται.; Gao, Ρ.; Yao, Z. Targeting Cd47: The Achievements and Concerns of Current Studies on Cancer Immunotherapy. J. Thorac. Dis. 2017, 9, E168–E174. [CrossRef]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Υ.; Pi, J.; Xu, Η.; Zhao, Η.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Advances in Anti-Tumor Treatments Targeting the Cd47/Sirpalpha Axis. Εμπρός. Immunol. 2020, 11, 18. [CrossRef] [PubMed]

26. Liu, Χ.; Ρυ, Υ.; Cron, Κ.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, Η.; Peng, Η.; Fu, YX; Xu, MM Ο αποκλεισμός Cd47 ενεργοποιεί την καταστροφή ανοσογόνων όγκων που μεσολαβούν από κύτταρα Τ. Nat. Med. 2015, 21, 1209–1215. [CrossRef] [PubMed]

27. Weiskopf, Κ.; Δαχτυλίδι, AM; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, AM; Volkmer, AK; Ozkan, Ε.; Fernhoff, NB; van de Rijn, Μ.; Weissman, IL; et al. Σχεδιασμένες παραλλαγές Sirpalpha ως ανοσοθεραπευτικά ανοσοενισχυτικά σε αντικαρκινικά αντισώματα. Science 2013, 341, 88–91. [CrossRef]

28. Xiong, Ζ.; Το Ohlfest, JR Τοπικό Imiquimod έχει θεραπευτικές και ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις κατά των ενδοκρανιακών όγκων. J. Immunother. 2011, 34, 264–269. [CrossRef]

29. Kamath, Ρ.; Darwin, Ε.; Arora, Η.; Nouri, K. A Review on Imiquimod Therapy and Discussion on Optimal Management of Basal Cell Carcinomas. Clin. Έρευνα Ναρκωτικών. 2018, 38, 883–899. [CrossRef]

30. Liu, Υ.; Κάστρο Μπράβο, KM; Liu, J. Targeted Liposomal Drug Delivery: A Nanoscience and Biophysical Perspective. Νανοκλίμακα Horiz. 2021, 6, 78–94. [CrossRef] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, Α.; Gohari, Ο.; Roointan, Α.; Karimi, Μ.; Hamblin, MR Nanopharmaceuticals and Nanomedicines Currently on the Market: Challenges and Opportunities. Nanomedicine 2019, 14, 93–126. [CrossRef]

32. Zhou, Χ.; Jiao, L.; Qian, Υ.; Dong, Q.; Sun, Υ.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Υ.; et al. Επανατοποθέτηση της αζελνιδιπίνης ως διπλού αναστολέα που στοχεύει στα μονοπάτια Cd47/Sirpalpha και Tigit/Pvr για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Νί, Κ.; Luo, Τ.; Culbert, Α.; Kaufmann, Μ.; Jiang, Χ.; Lin, W. Metal-Organic Framework Nanoscale Co-Delivers Tlr-7 αγωνιστές και αντισώματα αντι-Cd47 για τη ρύθμιση των μακροφάγων και την ενορχήστρωση της ανοσοθεραπείας του καρκίνου. Μαρμελάδα. Chem. Soc. 2020, 142, 12579–12584. [CrossRef]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Φωτοθερμική θεραπεία με ανοσοενισχυτικά νανοσωματίδια μαζί με το σημείο ελέγχου αποκλεισμού για την αποτελεσματική ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Nat. Commun. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Long, Υ.; Guo, R.; Liu, Χ.; Tang, Χ.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Ζ.; Li, Μ.; He, Q. Πολυλειτουργική χημειο-ανοσοθεραπεία βασισμένη σε πολυμερή μικκύλια με αποκλεισμό του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου για την αποτελεσματική θεραπεία του ορθοτοπικού και μεταστατικού καρκίνου του μαστού. Acta Pharm. Αμαρτία. Β 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. Huang, SW; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; et al. Το Imiquimod έχει αντικαρκινικές επιδράσεις προκαλώντας ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο και ενισχύεται από τον γλυκολυτικό αναστολέα 2-δεοξυγλυκόζη. J. Investig. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.ε6. [CrossRef] [PubMed]

37. Wang, Β.; Αυτός, Χ.; Zhang, Ζ.; Zhao, Υ.; Feng, W. Metabolism of Nanomaterials in Vivo: Blood Circulation and Organ Clearance. Λογ. Chem. Res. 2013, 46, 761–769. [CrossRef]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, Μ.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, Α.; Jaafari, MR Targeting, Bio Distributive and Tomor Growth Inhibiting Characteration of Anti-Her2 Affibody Coupling to Liposomal Doxorubicin Using Balb/C Mice Bearing Tubo Tubo. Int. J. Pharm. 2016, 505, 89–95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Παπαχατζόπουλος, Δ. Παρασκευή λιποσωμάτων και χαρακτηρισμός μεγέθους. Μέθοδοι Enzymol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]