Αξιολόγηση της επίδρασης της ανοσίας του βλεννογόνου του εμβολίου υπομονάδας του ιού της διάρροιας των βοοειδών E2Fc και E2Ft
Dec 21, 2023
Αφηρημένη:
Ταξινομημένη ως λοιμώδης νόσος κατηγορίας Β από τον Παγκόσμιο Οργανισμό για την Υγεία των Ζώων (OIE), η ιογενής διάρροια/ασθένεια του βλεννογόνου των βοοειδών είναι μια οξεία, εξαιρετικά μεταδοτική ασθένεια που προκαλείται από τον ιό της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών (BVDV). Τα σποραδικά ενδημικά του BVDV συχνά οδηγούν σε τεράστιες οικονομικές απώλειες στις βιομηχανίες γάλακτος και βοείου κρέατος. Για να ρίξουμε φως στην πρόληψη και τον έλεγχο του BVDV, αναπτύξαμε δύο νέα εμβόλια υπομονάδας εκφράζοντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης Ε2 του ιού της διάρροιας των βοοειδών (E2Fc και E2Ft) μέσω αιωρούμενων κυττάρων HEK293. Αξιολογήσαμε επίσης τις ανοσολογικές επιδράσεις των εμβολίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα δύο εμβόλια υπομονάδων προκάλεσαν μια έντονη ανοσολογική απόκριση του βλεννογόνου σε μόσχους. Μηχανιστικά, το E2Fc συνδέθηκε με τον υποδοχέα Fc (Fc RI) σε κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο (APCs) και προώθησε την έκκριση IgA, οδηγώντας σε ισχυρότερη ανοσοαπόκριση Τ-κυττάρων (τύπου Th1). Ο τίτλος εξουδετερωτικού αντισώματος που διεγείρεται από το εμβόλιο υπομονάδας E2Fc ανοσοποιημένο με βλεννογόνο έφτασε στο 1:64, το οποίο ήταν υψηλότερο από εκείνο του εμβολίου της υπομονάδας E2Ft και εκείνου του ενδομυϊκού αδρανοποιημένου εμβολίου. Τα δύο νέα εμβόλια υπομονάδων για την ανοσία του βλεννογόνου που αναπτύχθηκαν σε αυτή τη μελέτη, τα E2Fc και E2Ft, μπορούν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω ως νέες στρατηγικές για τον έλεγχο του BVDV ενισχύοντας την κυτταρική και χυμική ανοσία.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Λέξεις-κλειδιά: BVDV; εμβόλιο υπομονάδας; εμβολιασμός του βλεννογόνου; μοριακά ανοσοενισχυτικά; Υποδοχέας Fc; φερριτίνη
1. Εισαγωγή
Ο ιός της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών (BVDV), μαζί με τον ιό της οριακής νόσου (BDV) και τον ιό της πανώλης των χοίρων (CSFV), ανήκει στο γένος Pestivirus της οικογένειας Flaviviridae [1]. Ένας συνδυασμός επίμονης λοίμωξης (PI) και κυτταροπαθητικής λοίμωξης σε μόσχους συχνά οδηγεί σε σοβαρή νόσο του βλεννογόνου, με θνησιμότητα έως και 100% [2]. Το BVDV διανέμεται ευρέως στον κόσμο, με σχετικά υψηλό ποσοστό θετικών αντισωμάτων. Στην Κίνα, οι διαδεδομένοι τύποι είναι 1B, 1M και 1Q του τύπου-1 BVDV [3–5]. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε ότι ο ιός της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών τύπου 1 εισήχθη στην Κίνα τη δεκαετία του 1960 και ότι τουλάχιστον οκτώ γονότυποι BVDV{12}} κυκλοφορούν στην Κίνα. Μεταξύ αυτών, το 1B και το 1m είναι οι κύριοι γονότυποι [6]. Αυτό είναι σύμφωνο με την επιδημιολογική μας έρευνα για το BVDV στο Θιβέτ. Το σφαιρικό ιοσωμάτιο του BVDV έχει διάμετρο περίπου 40–60 nm και περιβάλλεται από μια κάψουλα. Το μονόκλωνο ιικό RNA γονιδίωμα του BVDV έχει μήκος περίπου 12,5 KB. Η ιική πολυπρωτεΐνη στη συνέχεια διασπάται από έναν συνδυασμό πρωτεασών ξενιστή και ιού σε τέσσερις δομικές (C, E0, E1, E2) και οκτώ μη δομικές (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) πρωτεΐνες [7, 8]. Το BVDV-E2 διαθέτει ισχυρή ανοσογονικότητα και τα στοιχεία έχουν δείξει ότι τα εξουδετερωτικά αντισώματα (NAbs) που προκαλούνται σε μολυσμένα ζώα στοχεύουν κυρίως την Ε2 [9]. Εν τω μεταξύ, τα πολυδύναμα εμβόλια υπομονάδας Ε2 που στοχεύουν κύρια κυκλοφορούντα στελέχη του BVDV μπορούν να παρέχουν μερική προστασία έναντι ομόλογων στελεχών. Ένα ανασυνδυασμένο εμβόλιο ερπητοϊού που κατασκευάστηκε με πρωτεΐνη BVDV E2 και πρωτεΐνη ιού έρπητα βοοειδών 1 (BoHV-1) D προκάλεσε ειδικές ανοσολογικές αποκρίσεις και στους δύο ιούς στον ξενιστή μετά από ενδορινική νεφελοποίηση [10]. Επομένως, μπορεί να είναι μια καλή στρατηγική για τον έλεγχο του BVDV χρησιμοποιώντας την ανοσοκυρίαρχη πρωτεΐνη BVDV E2 ως εμβόλιο υπομονάδας. Η ρινική κοιλότητα είναι πλούσια σε λεμφοκύτταρα και κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο, παρέχει ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον για ανοσοποίηση του βλεννογόνου και προστατεύει τα πρωτεϊνικά εμβόλια από την αποσταθεροποίηση από οξέα και αλκάλια. Επιπλέον, η ανοσοσφαιρίνη Α (IgA) που προκαλείται από ενδορρινικό εμβόλιο και τα λεμφοκύτταρα Β και Τ μόνιμης μνήμης στην ανώτερη αναπνευστική οδό είναι ικανά να μπλοκάρουν αποτελεσματικά την αντιγραφή του ιού [11]. Η ανοσοποίηση μέσω της ρινικής κοιλότητας όχι μόνο επάγει την ανοσία του βλεννογόνου αλλά διεγείρει επίσης συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις, οι οποίες ασκούν ανοσοπροστατευτικά αποτελέσματα. Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι τα αντιγόνα θα μπορούσαν να απελευθερωθούν πλήρως στο βλεννογόνο επιθήλιο στοχεύοντας εμβόλια υπομονάδας στον νεογνικό υποδοχέα Fc (FcRn) των Μ κυττάρων στο επιθήλιο του βλεννογόνου, διεγείροντας έτσι αποτελεσματικά συγκεκριμένες ανοσοαποκρίσεις [12-14]. Τα ανοσοποιητικά αποτελέσματα του ρινικού εκνεφώματος ενισχύονται σημαντικά με τη χρήση ενός διαλυτού ανασυνδυασμένου εμβολίου που σχηματίζεται από τη σύντηξη μοριακού ανοσοενισχυτικού και ανοσοποιητικού αντιγόνου [15]. Το IgGFc αλληλεπιδρά με τον FcRn στην επιφάνεια των ανοσοκυττάρων για να συμμετέχει στη μεταφορά του IgG μέσω των επιφανειών του βλεννογόνου, βελτιώνοντας την ανοσογονικότητα των πρωτεϊνών που έχουν συντηχθεί με Fc στα θηλαστικά [16]. Οι πρωτεΐνες σύντηξης IgGFc αναφέρθηκε ότι σχηματίζουν σταθερά διμερή μέσω δισουλφιδικών δεσμών στην περιοχή άρθρωσης Fc για να αυξήσουν τον χρόνο ημιζωής και τη σταθερότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, βελτιώνοντας επομένως τις κυτταρικές, βλεννογόνες και χυμικές ανοσοαποκρίσεις [17,18]. Νέα εμβόλια με τη μεσολάβηση του IgGFc έχουν εφαρμοστεί με επιτυχία στον ιό της γρίπης Α (HA-HuFc) [19] και στον ιό της πανώλης των χοίρων (CSFV-E2Fc) [20].
Οφέλη από σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Η κατάλληλη τροποποίηση της επιφάνειας επιτρέπει στα νανοσωματίδια να παραμένουν σταθερά στο κυκλοφορικό σύστημα του αίματος [21]. Χαρακτηρίζεται από μεγάλη επιφάνεια και κοίλη σφαιρική δομή, η φερριτίνη (Ft) αναφέρθηκε ότι σχηματίζει νανοσωματίδια 24 πανομοιότυπων πολυπεπτιδίων αυτοσυναρμολογώντας με μια ποικιλία εκφρασμένων πρωτεϊνών σύντηξης, οι οποίες προάγουν την αναγνώριση και πρόσληψη αντιγόνου από τα κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο. προκαλώντας ισχυρή ανοσολογική απόκριση [22,23]. Η φερριτίνη εφαρμόζεται ευρέως στην ανάπτυξη εμβολίων. Η ομοιοπολική ενσωμάτωση του αντιγόνου της περιοχής δέσμευσης υποδοχέα (RBD) της πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV{-2 και της αυτοσυναρμολογημένης μη αίμης φερριτίνης του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού έχει ως αποτέλεσμα μια ισχυρή παραγωγή εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Τα νανοσωματίδια πρωτεΐνης φερριτίνης έχουν επίσης μια ισχυρή ικανότητα να βελτιώνουν τη σταθερότητα του αντιγόνου, να ξεπερνούν τους βιολογικούς φραγμούς και να επιτυγχάνουν στοχευμένη παροχή. Καθώς τα νανοεμβόλια μπορούν να συλληφθούν αποτελεσματικά από δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα [24], τα νανοσωματίδια φερριτίνης είναι μια νέα και πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα για την παροχή αντιγόνου. Επί του παρόντος, τα κύρια διαθέσιμα εμβόλια για το BVDV είναι αδρανοποιημένα εμβόλια και εμβόλια υπομονάδας, και τα δύο απαιτούν χρονοβόρο και εντατικό εμβολιασμό με ενδομυϊκή ένεση. Εν τω μεταξύ, τα αδρανοποιημένα εμβόλια που παράγονται μέσω των κυττάρων MDBK είναι επιρρεπή να προκαλέσουν νεογνική πανκυτταροπενία βοοειδών (BNP) [25]. Ωστόσο, τα εμβόλια υπομονάδων έχουν δείξει ανώτερα προφίλ ασφάλειας [26]. Η ενδορινική ανοσοποίηση έχει αποδειχθεί ότι στοχεύει αντιγόνα στον υποδοχέα Fc R, προκαλώντας βλεννογονικές και συστηματικές ανοσοαποκρίσεις [15,16]. Ωστόσο, τα ανοσολογικά αποτελέσματα της ενδορινικής ανοσοποίησης με εμβόλια BVDV και η αποτελεσματικότητα του BVDV-E2 σε συνδυασμό με μοριακά ανοσοενισχυτικά (IgGFc και Ft) παραμένουν ελάχιστα μελετημένα. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη εμβολίων βλεννογόνου με πρωτεΐνη BVDV-E2 για τη βελτίωση της ανοσολογικής τους αποτελεσματικότητας αποτελεί κορυφαία προτεραιότητα σε αυτόν τον τομέα. Στην τρέχουσα μελέτη, εμβόλια υπομονάδας Fc ή Ft συντηγμένα με πρωτεΐνη Ε2 δημιουργήθηκαν σε κύτταρα HEK293. Τα ευρήματα έδειξαν ότι ο ρινικός εμβολιασμός με το εμβόλιο υπομονάδας BVDV E2Fc ήταν πιο αποτελεσματικός από τον ρινικό εμβολιασμό με το εμβόλιο υπομονάδας E2Ft, υποστηρίζοντας περαιτέρω τις ενδείξεις ότι η πρωτεΐνη σύντηξης E2Fc είναι μια πιο ισχυρή επιλογή εμβολίου υπομονάδας.
Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
2. Αποτελέσματα
2.1. Η έκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε αιωρούμενα κύτταρα ΗΕΚ293
Τα δομικά διαγράμματα των E2, E2Ft και E2Fc φαίνονται στο Σχήμα 1Α. Οι έμμεσοι προσδιορισμοί ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν αρχικά χρησιμοποιώντας διατηρημένο μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) BVDVE2 για να επαληθευτεί η ανοσοέκφραση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σύντηξης. Κύτταρα που διαμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιείχαν γονίδια E2, E2Ft ή E2Fc εξέπεμψαν ένα φθορίζον σήμα, ενώ τα κύτταρα που είχαν υποστεί ψευδή επεξεργασία δεν εμφάνισαν φθορίζον σήμα (Εικόνα 1Β). Αυτό έδειξε ισχυρή έκφραση των E2, E2Ft και E2Fc σε κύτταρα HEK293. Για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι πρωτεΐνες εκφράζονται εκκριτικά, συλλέχθηκαν τα υπερκείμενα των κυττάρων ΗΕΚ293 που διαμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιείχαν γονίδια E2, E2Ft ή E2Fc μετά από 6 ημέρες. Τα επίπεδα ανοσοέκφρασης κάθε πρωτεΐνης αναλύθηκαν με στύπωμα Western με αντίσωμα BVDV-E2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κύτταρα που διαμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιέχουν γονίδια των E2, E2Ft και E2Fc εξέφρασαν αντίστοιχες πρωτεΐνες με μοριακές μάζες 45 kDa, 60 kDa και 80 kDa, αντίστοιχα (Εικόνα 1C). Τα αποτελέσματα χρώσης SDS-PAGE και Coomassie blue έδειξαν ότι οι ζώνες κάθε δείγματος ήταν συνεπείς με τα αποτελέσματα της κηλίδωσης (Σχήμα 1D). Για να εξασφαλιστεί η εξειδίκευση και η ακρίβεια για την ανίχνευση της ανοσοέκφρασης πρωτεΐνης, διεξήχθησαν πρώτα δοκιμασίες προ-απορρόφησης του mAb BVDV-E2 και ακολουθήθηκαν από δοκιμασίες ιικής αντιγραφής και στύπωμα Western για να πιστοποιηθεί η ειδικότητα του BVDV E2 mAb. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το αντίσωμα μπορεί να αντιδράσει μόνο στην πρωτεΐνη BVDV-E2 (Εικόνα S1). Συνολικά, τα στοιχεία έδειξαν ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες E2, E2Fc και E2Ft εκφράστηκαν άφθονα στα κύτταρα HEK293.
Σχήμα 1. Ανοσο-έκφραση και ταυτοποίηση πρωτεϊνών E2, E2Ft και E2Fc σε κύτταρα HEK293. (Α) Τα διαγράμματα κατασκευής των BVDV-E2, BVDV-E2Ft και BVDV-E2Fc. (Β) Ανίχνευση της ανοσοέκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με IFA. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με E2, E2Fc ή E2Ft, τα κύτταρα HEK293 σταθεροποιήθηκαν για IFA. Το μονοκλωνικό αντίσωμα BVDV E2 και το IgG αντι-ποντικού FITC-κατσίκας εφαρμόστηκαν ως πρωτεύον και δευτερεύον αντίσωμα, αντίστοιχα. Ο πυρήνας χρωματίστηκε με DAPI (μπλε). Η γραμμή κλίμακας αντιπροσωπεύει 20 μm. (Γ) Ανίχνευση καθαρισμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με στύπωμα Western. (Δ) Ταυτοποίηση καθαρισμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με SDS-PAGE.
2.2. Ενεργοποίηση του APC-Fc RI από το BVDV-E2Fc
Η αναγνώριση αντιγόνου του BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) από τα μακροφάγα παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης. Προκειμένου να ανιχνευθεί το αποτέλεσμα ενεργοποίησης της πρωτεΐνης σύντηξης στο ανοσοποιητικό σύστημα, η λειτουργία αναγνώρισης και η φαγοκυτταρική δραστηριότητα της πρωτεΐνης σύντηξης από βόειους κυψελιδικούς μακροφάγους (ΒΑΜ) επαληθεύτηκαν in vitro. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CD64 (Fc RI), που ανιχνεύθηκε από σημασμένους με Cy3-δείκτες αντισώματος IgG κατσίκας κατά του κουνελιού (κόκκινο), εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη σε μακροφάγα βοοειδών. Το E2Fc ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας IgG αντι-ποντικού κατσίκας (πράσινος φθορισμός). Οι εικόνες συγχωνεύτηκαν για την ανάλυση του συνεντοπισμού CD64 (Fc RI) και E2Fc σε βόειους κυψελιδικούς μακροφάγους (κίτρινο χρώμα· Εικόνα 2Α). Αντίθετα, το CD64 δεν συνεντοπίστηκε με E2 ή E2Ft. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μετατόπιση της πρωτεΐνης σύντηξης E2Fc κατά μήκος του βλεννογόνου φραγμού έγινε με τη μεσολάβηση του Fc RI.
Εικόνα 2. Ενεργοποίηση του APC-Fc RI από το BVDV-E2Fc. (Α) Ανάλυση συνεντοπισμού CD64 (Fc RI) με πρωτεΐνη E2Fc σε BAM ανιχνεύθηκε με ομοεστιακή μικροσκοπία. Το CD64 (Fc RI) σε BAM χρωματίστηκε με αντι-CD64 κουνελιού και Cy{10}}επισημασμένο με IgG κατσίκας αντι-κουνελιού ως πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα, αντίστοιχα.
Η φαγοκυττάρωση, η πρόσληψη σωματιδίων από τα μακροφάγα, μετρήθηκε ως ο ρυθμός φαγοκυττάρωσης. Τα ποσοστά φαγοκυττάρωσης συζευγμένων με FITC μικροσφαιρών, πρωτεΐνης E2, E2Ft και E2Fc από τα βόεια κυψελιδικά μακροφάγα ήταν 28,9%, 55,6%, 57,1% και 65,6% αντίστοιχα. Με άλλα λόγια, ο ρυθμός φαγοκυττάρωσης του E2Fc ήταν υψηλότερος από αυτόν του E2Ft, γεγονός που απέδειξε περαιτέρω ότι η σύλληψη των αντιγόνων από τα μονοκύτταρα ολοκληρώθηκε με τη δέσμευση ενός συγκεκριμένου υποδοχέα στην επιφάνειά του με αντίστοιχους συνδέτες. Ωστόσο, τα κυψελιδικά μακροφάγα βοοειδών δεν διέθεταν υποδοχείς για τις πρωτεΐνες E2 και E2Ft και αφαίρεσαν μόνο ξένα σώματα μέσω φαγοκυττάρωσης, που είναι η πιο βασική αμυντική μέθοδος του σώματος (Εικόνα 2Β).
2.3. Ισχυρές βλεννογονικές και χυμικές ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από το E2Fc In Vivo
Η διαδικασία ανοσοποίησης μόσχου απεικονίζεται στο Σχήμα 3Α. Τα επίπεδα IgA και SIgA που παράγονται από μόσχους ανοσοποιημένους με την πρωτεΐνη σύντηξης ανιχνεύθηκαν με έμμεση ELISA. Δείγματα ορού, κοπράνων και ρινικού βλεννογόνου συλλέχθηκαν και ανιχνεύθηκαν με ένα εμπορικό κιτ ELISA. Η ανοσοποιημένη με E2Fc ομάδα εμφάνισε τα υψηλότερα επίπεδα IgA και SIgA στον ορό και τον βλεννογόνο, τόσο σε ενδομυϊκά όσο και σε ζώα ανοσοποιημένα με βλεννογόνο (ρ < 0.01) (Εικόνα 3Β, Γ). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα IgA μεταξύ της ομάδας που ανοσοποιήθηκε με E2- E2- και της ομάδας που ανοσοποιήθηκε με E2Ft, αλλά διέφεραν στα επίπεδα SIgA (p < 0,05). Συμπερασματικά, η πρωτεΐνη σύντηξης E2Fc ήταν σε θέση να επάγει πιο ισχυρές βλεννογονικές και χυμικές ανοσοαποκρίσεις από άλλες πρωτεΐνες.
2.4. Το E2Fc μπορεί να προκαλέσει ισχυρότερες ανοσοαποκρίσεις των Τ-κυττάρων (Τύπος Th1) κατά του BVDV σε σύγκριση με το E2Ft In Vivo
Η κυτοκίνη IFN τύπου Th{{0}}που εκφράζεται από Τ κύτταρα και ΝΚ κύτταρα μεσολαβεί στην κυτταρική ανοσία, η οποία είναι απαραίτητη για την κάθαρση του ιού. Για την ανίχνευση της κατανομής των CD4+ και CD{4}} Τ κυττάρων που εκφράζουν IFN σε μόσχους, απομονώθηκαν λεμφοκύτταρα από το PBMC των μόσχων 35 ημέρες μετά την ανοσοποίηση. Τα λεμφοκύτταρα διεγέρθηκαν με απενεργοποιημένο BVDV και ακολούθως εφαρμόστηκε κυτταρομετρία ροής για τον εντοπισμό των κυττάρων Τ που εκκρίνουν IFN{- -CD4+ και CD8+. Ομάδες ανοσοποιημένες με βλεννογόνο με E2Fc και E2Ft εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερες αναλογίες IFN- -εκκρίνοντας CD4+ και CD{15}} Τ κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα Ε2. Η ομάδα που ανοσοποιήθηκε με βλεννογόνο με E2Fc είχε υψηλότερο επίπεδο IFN- -εκκρίνοντας CD3+ προερχόμενων από CD8+ Τ κυττάρων από την ομάδα που ανοσοποιήθηκε με απενεργοποιημένο BVDV (p < 0,05) (Εικόνα 4). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα κύτταρα Τ CD{4+ που εκκρίνουν IFN{- -προερχόμενα από CD3+ μεταξύ των ομάδων με ανοσοποιημένο με βλεννογόνο E2Fc και με απενεργοποιημένο BVDV. Συνοπτικά, τόσο η ενδομυϊκή ένεση όσο και η ανοσοποίηση του βλεννογόνου με E2Fc επάγουν ισχυρότερες ανοσοαποκρίσεις των Τ-κυττάρων (τύπου Th1) έναντι του BVDV σε σύγκριση με το E2Ft.
Σχήμα 3. Το διάγραμμα ροής των πειραμάτων ανοσοποίησης μόσχου και οι βλεννογονικές και χυμικές ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από E2Fc in vivo. (Α) Διάγραμμα ροής εμβολίου κατασκευής υπομονάδας BVDV και πειράματος ανοσοποίησης μόσχων. (Β, Γ) Η μέτρηση των επιπέδων (Β) IgA και (C) εκκριτικού IgA στα ρινικά επιχρίσματα, τα κόπρανα και τα δείγματα ορού που συλλέχθηκαν την ημέρα 14 μετά τη δευτερογενή ανοσοποίηση με ELISA. n=5, * p < 0.05 και ** p < 0,01
Σχήμα 4. Ανοσοποιητικές αποκρίσεις Τ-κυττάρων έναντι του BVDV in vivo. Ποσοστό (A) CD4+ IFN- + Τ κυττάρων και (B) CD8+ IFN- + Τ κυττάρων μετά από διέγερση σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος βοοειδών. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 και ** ** p < 0,0001.
2.5. Η ανοσοποίηση με εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας αυξάνει την περιεκτικότητα σε κυτοκίνες τύπου Th1-
Για να επαληθεύσουμε την επίδραση του εμβολίου ανασυνδυασμένης υπομονάδας στις κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις, αναλύσαμε τα επίπεδα πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων και κυτοκίνης στο περιφερικό αίμα των ανοσοποιημένων μόσχων. Αρχικά, συλλέχθηκαν αντιπηκτικά από μόσχους 49 ημέρες μετά την ανοσοποίηση. Τα λεμφοκύτταρα διεγέρθηκαν από το αδρανοποιημένο με υπεριώδη ακτινοβολία BVDV μετά τον διαχωρισμό και μετρήθηκαν οι συσχετισμένοι δείκτες. Σε σύγκριση με την ομάδα PBS, οι δείκτες διέγερσης λεμφοκυττάρων (SI) των ομάδων που ανοσοποιήθηκαν με τα εμβόλια υπομονάδας (E2, E2Fc και E2Ft) ήταν όλοι αυξημένοι σε διαφορετικούς βαθμούς, με τον υψηλότερο δείκτη διέγερσης λεμφοκυττάρων (p < 0). 001) στις ανοσοποιημένες με E2Fc και στις αδρανοποιημένες ομάδες εμβολίου (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, εμπορικά κιτ ELISA σάντουιτς διπλού αντισώματος κατά βόειου IFN-, IL{-2 και IL{-4 εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση επιπέδων κυτοκινών τύπου Th{{1- και Th{2-στο περιφερικό αίμα ανοσοποιημένων μόσχων. Σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν PBS, τα επίπεδα IFN- και IL-2 που εκφράζονται σε ανοσοποιημένους μόσχους ήταν σημαντικά υψηλότερα από την IL-4 στις 49 ημέρες μετά την ανοσοποίηση. Τα επίπεδα της IFN- ήταν υψηλότερα στην ομάδα IN-E2Fc από ό,τι στην ομάδα του αδρανοποιημένου εμβολίου (p < 0,05), αλλά δεν υπήρχε διαφορά στην IL{-2 και την IL{-4 μεταξύ των IM-E2Fc και τις αδρανοποιημένες ομάδες εμβολίων (Εικόνα 5Β–Δ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εμβόλιο υπομονάδας IN-E2Fc προήγαγε σημαντικά την κυτταρική ανοσολογική απόκριση τύπου Th1- σε μόσχους.
Εικόνα 5. Η αύξηση της περιεκτικότητας των κυτοκινών τύπου Th1-μετά την ανοσοποίηση με εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας. (Α) Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος των μόσχων μετά από ανοσοποίηση 49 ημέρες ανιχνεύθηκε με κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων. (B–D) Οι κυτοκίνες Th1 και Th2 σε υπερκείμενα λεμφοκυττάρων ανιχνεύθηκαν με κιτ ELISA σάντουιτς διπλού αντισώματος βόειου IFN-, IL-2, IL-4. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 και *** p < 0.00
2.6. Ειδικά για BVDV αντισώματα μπορούν να προκληθούν ισχυρά από ανασυνδυασμένα εμβόλια υπομονάδων E2Ft και E2Fc in Vivo
Τα ειδικά για το BVDV αντισώματα ανιχνεύθηκαν με ELISA προκειμένου να διερευνηθεί η χυμική ανοσοαπόκριση που προκαλείται από τα εμβόλια υπομονάδων E2, E2Ft και E2Fc. Τα ειδικά για το BVDV αντισώματα δεν μπορούσαν να ανιχνευθούν σε όλους τους μόσχους πριν από την ανοσοποίηση. Τα επίπεδα των αντισωμάτων που προκλήθηκαν από τα εμβόλια υπομονάδων E2Ft και E2Fc ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά της ομάδας Ε2 21 ημέρες μετά την έναρξη (πρώτη δόση) της ανοσοποίησης (p < 0.00 1). Τα επίπεδα αντισωμάτων για την ανοσία του βλεννογόνου στις 35 ημέρες (14 ημέρες μετά τη δεύτερη δόση) και 49 ημέρες (14 ημέρες μετά την τρίτη δόση) διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων E2Ft και E2 (ρ < 0,05). Επιπλέον, το E2Fc ήταν σημαντικά υψηλότερο από το E2 (p < 0,001). Το επίπεδο αντισωμάτων της ομάδας ανοσοποίησης του βλεννογόνου (ομάδες IN-E2Ft και IN-E2Fc) ήταν υψηλότερο από αυτό της ομάδας ενδομυϊκής ένεσης (ομάδες IM-E2Ft και IM-E2Fc) και το επίπεδο αντισωμάτων της ομάδας του απενεργοποιημένου εμβολίου δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό από αυτό της ομάδας IN-E2Fc (Εικόνα 6). Συνολικά, τα ανασυνδυασμένα εμβόλια υπομονάδων E2Ft και E2Fc μπόρεσαν να προκαλέσουν ισχυρές χυμικές ανοσοαποκρίσεις και η ανοσία του βλεννογόνου ήταν ανώτερη από εκείνη της ενδομυϊκής ένεσης, υποδεικνύοντας ότι τα εμβόλια ανασυνδυασμένων υπομονάδων E2Fc και E2Ft ήταν εξαιρετικά αντιγονικά.
Εικόνα 6. Ανίχνευση αντισωμάτων στα δείγματα ορού ανοσοποιημένων μόσχων με ELISA την ημέρα 0, 21, 35 και 49 μετά την ανοσοποίηση. n=5, * p < 0.05 και *** p < 0,001
2.7. Εξουδετερωτικά αντισώματα κατά του BVDV που προκαλούνται από εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας in vivo
Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από τη σφαγίτιδα φλέβα των μόσχων στις 0, 21, 35 και 49 ημέρες μετά την πρώτη ανοσοποίηση. Τα δείγματα ορού διαχωρίστηκαν ασηπτικά και αδρανοποιήθηκαν σε λουτρό νερού στους 56 ◦C για 30 λεπτά. Διεξήχθησαν δοκιμασίες εξουδετέρωσης για τον προσδιορισμό των επιπέδων αντισωμάτων στον διαχωρισμένο ορό. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι του BVDV ανιχνεύθηκαν σε ομάδες ανοσοποιημένες με βλεννογόνο με εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας, με τον τίτλο του εξουδετερωτικού αντισώματος E2Fc έως 1:64. Αυτό είναι συγκρίσιμο με το αδρανοποιημένο εμβόλιο και καλύτερο από τα ενδομυϊκά εγχυόμενα εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας E2Ft και E2Fc (Εικόνα 7).
Εικόνα 7. Ανίχνευση εξουδετερωτικών αντισωμάτων στα δείγματα ορού ανοσοποιημένων μόσχων την ημέρα 0, 21, 35 και 49 μετά την ανοσοποίηση. Τα αδρανοποιημένα δείγματα ορού αραιώθηκαν και προεπωάστηκαν με 200 TCID50 BVDV XZ02 για 1 ώρα. Δείγματα ορού στη συνέχεια προστέθηκαν σε κύτταρα σε τρυβλία 96-πηγαδιών και επωάστηκαν για 72 ώρες. Ως πρωτεύοντα και δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αντίσωμα κουνελιού αντι-Ε2 και συζευγμένο με FITC κατσίκα αντι-κουνελιού IgG. n=5, * p < 0,05 και ** p < 0,01
3. Συζήτηση
Έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη Ε2 που εκφράζεται σε κύτταρα θηλαστικών είναι πιο αποτελεσματική στην εξουδετέρωση της προστασίας έναντι του BVDV από την πρωτεΐνη Ε2 που λαμβάνεται από το σύστημα έκφρασης εντόμων βακουλοϊού (brE2) [27]. Η καλλιέργεια σε εναιώρημα κυττάρων θηλαστικών χαρακτηρίζεται από απλούστερη διαδικασία και υψηλότερη απόδοση [28]. Τα αιωρούμενα κύτταρα HEK293 είναι ικανά να αναπτυχθούν υπό συνθήκες χωρίς ορό και ο αριθμός των κυττάρων είναι πολλαπλάσιος από αυτόν της προσκολλημένης καλλιέργειας, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή αντισωμάτων μεγάλης κλίμακας [29]. Η αποτελεσματικότητα έκφρασης του pcDNA3.1 σε συνδυασμό με το σύστημα παροδικής έκφρασης ευκαρυωτικών κυττάρων εναιωρήματος που εφαρμόστηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν σχετικά υψηλή και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορούσε να συλλεχθεί έξι ημέρες μετά τη διαμόλυνση, με συγκέντρωση έως 30 mg·L-1, η οποία ήταν επαρκής για μεταγενέστερη εφαρμογή σε ζώα.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Ο ιός της διάρροιας των βοοειδών εισβάλλει κυρίως στην ανώτερη αναπνευστική οδό και στην πεπτική οδό, γεγονός που προκαλεί ρινόρροια, βήχα, δύσπνοια, αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος και λευκοπενία και ακολουθείται από ιαιμία μόλις εισέλθει ο ιός στο αίμα. Επομένως, ο εισπνεόμενος ενδορινικός εμβολιασμός θα μπορούσε να παρέχει πιο αποτελεσματική προστασία από τα εμβόλια που χορηγούνται απευθείας σε σημεία μόλυνσης από ιούς. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι η ενδορινική ανοσοποίηση μπορεί να παρουσιάσει αντιγόνα στους υποδοχείς FcR και να προκαλέσει βλεννογονικές και συστηματικές ανοσοαποκρίσεις [16]. Επιπλέον, το βόειο IgG1Fc ήταν ικανό να δεσμεύεται στο βόειο Fc R, έναν υποδοχέα υψηλής συγγένειας για το IgG [30]. Τα αποτελέσματά μας παρείχαν στοιχεία ότι το Fc από το βόειο IgG1 θα μπορούσε να συνδεθεί με το Fc RI σε κυψελιδικά μακροφάγα βοοειδών (BAM) για να επιτευχθεί διαβλεννογονική μεταφορά. Αυτό θα μπορούσε να παρατείνει τη μακροζωία της πρωτεΐνης σύντηξης στο σώμα και να προωθήσει την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι το επίπεδο SIgA που προκαλείται από ανοσοποιημένο με βλεννογόνο E2Fc ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό του ανοσοποιημένου με βλεννογόνο E2 (p < 0.{{30}}1). Ωστόσο, μόνο μια μικρή διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ της ενδομυϊκής ένεσης ομάδας E2Fc και της ανοσοποιημένης με βλεννογόνο E2 ομάδας. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι ο βλεννογόνος του λεπτού εντέρου και οι μεσεντερικοί λεμφαδένες θα απελευθέρωναν μια μικροσκοπική ποσότητα SIgA ως απόκριση στην ενδομυϊκή ένεση με E2Fc ανοσοενισχυμένο με 1313VG. Τα επίπεδα της IFN- που προκλήθηκαν από την ανοσοποίηση του βλεννογόνου με E2Fc ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά της ανοσοποίησης του βλεννογόνου με E2 (p < 0,01), της ενδομυϊκής ανοσοποίησης με E2Fc και της ανοσοποίησης του βλεννογόνου με E2Ft. Τα επίπεδα της IL-2 που προκλήθηκαν από την ανοσοποίηση του βλεννογόνου με E2Fc ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά της ανοσοποίησης του βλεννογόνου με Ε2 και της ενδομυϊκής ανοσοποίησης με E2Ft (ρ < 0,01). Στο επόμενο βήμα, τα συνολικά επίπεδα αντισωμάτων ανιχνεύθηκαν μετά την τρίτη ανοσοποίηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανοσοποίηση του βλεννογόνου με E2Fc προκάλεσε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα συνολικών αντισωμάτων σε σύγκριση με την ανοσοποίηση του βλεννογόνου με Ε2 (p < 0,001), ενώ τα επίπεδα αντισωμάτων που προκλήθηκαν από το E2Fc που χορηγήθηκε ενδομυϊκά και το ανοσοποιημένο από το βλεννογόνο E2 ήταν συγκρίσιμα με το ενδομυϊκά ενέσιμο ομάδα. Τα συνολικά ανοσολογικά αποτελέσματα της ανοσοποίησης του βλεννογόνου του εμβολίου υπομονάδας E2Fc ήταν ανώτερα από εκείνα της ενδομυϊκής ανοσοποίησης. Η ανοσοποίηση του βλεννογόνου του E2Fc όχι μόνο προκάλεσε την έκκριση SIgA αλλά προκάλεσε επίσης ειδική κυτταρική ανοσοαπόκριση τύπου Th1- και χυμική ανοσοαπόκριση.
Αναφέρθηκε ότι η γλυκοπρωτεΐνη CSFV E2 που εμφανίζεται στην επιφάνεια των νανοκλωβών φερριτίνης προκάλεσε ισχυρή έκφραση των έμφυτων ανοσοκυτοκινών IL-4 και IFN- σε κουνέλια [31]. Ένα εμβόλιο νανοσωματιδίων που αναπτύχθηκε με ομοιοπολική δέσμευση αυτοσυναρμολογημένης φερριτίνης στον τομέα δέσμευσης υποδοχέα (RBD) του SARS-CoV{-2 αποδείχθηκε επίσης ότι προκαλεί μια ισχυρή χυμική και κυτταρική ανοσολογική απόκριση [24]. Η ρινική κοιλότητα είναι πλούσια σε λεμφικό ιστό που σχετίζεται με το βλεννογόνο και δείξαμε ότι τα επίπεδα SIgA που προκαλούνται από ανοσοποιημένο με βλεννογόνο E2Ft ήταν υψηλότερα από εκείνα του E2 (p < 0.05). Τα CD{14}} και τα CD8+ Τ κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα E2Ft ανοσοποιημένης με βλεννογόνο από ό,τι στην ομάδα Ε2 (p < 0,01). Τα CD4+ και τα CD8+ Τ κύτταρα παίζουν ζωτικό ρόλο στην άμυνα έναντι της ιογενούς λοίμωξης [32]. Τα αποτελέσματα της δοκιμής εξουδετέρωσης και της ανάλυσης αντισωμάτων έδειξαν επίσης ότι η ανοσοποίηση του βλεννογόνου με E2Ft ήταν πιο αποτελεσματική από την ανοσοποίηση με ενδομυϊκά E2Ft και E2. Αυτό οφείλεται πιθανώς στο ότι το σύστημα αναγνώρισης και παρουσίασης αντιγόνου του οργανισμού φαγοκυτταρώνει αποτελεσματικά τη φερριτίνη (E2Ft) με πολυμερή 24 υπομονάδων, με αποτέλεσμα μια ευαίσθητη και αποτελεσματική απόκριση αντισωμάτων in vivo. Τα αντισώματα εκκρίνονται από τα πλασματοκύτταρα και τα εξουδετερωτικά επίπεδα αντισωμάτων είναι ένας σημαντικός δείκτης για την ανίχνευση των επιδράσεων του ανοσοποιητικού. Όταν η ισχύς του εξουδετερωτικού αντισώματος του εμβολίου BVDV είναι μεγαλύτερη από 1:24, υποδηλώνει ότι το εμβόλιο είναι ανοσογόνο [33].
Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές εξουδετέρωσης για την αξιολόγηση των επιπέδων εξουδετερωτικών αντισωμάτων που προκαλούνται από ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Ε2. Ως εκ τούτου, το σφαγιτιδικό φλεβικό αίμα των ανοσοποιημένων μόσχων συλλέχθηκε για να ανιχνευθεί το επίπεδο των αντισωμάτων IgG στον ορό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα ανοσοποιημένα μοσχάρια παρήγαγαν διαφορετικούς βαθμούς εξουδετερωτικών αντισωμάτων 14 ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση. Τα επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε μόσχους της ομάδας E2Fc ανοσοποιημένης με βλεννογόνο και της ομάδας του αδρανοποιημένου εμβολίου αυξήθηκαν σημαντικά και παρέμειναν στο 1:64 στις 14 ημέρες μετά την τρίτη ανοσοποίηση (τίτλοι εξουδετερωτικών αντισωμάτων ανιχνεύθηκαν μέχρι την έκτη εβδομάδα). Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων των ανοσοποιημένων με βλεννογόνο E2 και E2Ft και ενδομυϊκά ανοσοποιημένων ομάδων E2Fc και E2Ft διατηρήθηκαν μεταξύ 1:8 και 1:16. Συμπεραίνουμε ότι τα αντιγόνα του ανασυνδυασμένου εμβολίου E2Fc απελευθερώνονται αργά από τον υποδοχέα Fc, προκαλώντας επομένως παρατεταμένες χυμικές και κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Αντίθετα, τα άλλα εμβόλια τεσσάρων υπομονάδων παραμένουν σύντομα στο σώμα λόγω της έλλειψης αντίστοιχου υποδοχέα. Ως εκ τούτου, μπορεί να χρειαστεί ένας αναμνηστικός εμβολιασμός ή μια αλλαγή ανοσοενισχυτικού για να επιτευχθούν τα αναμενόμενα ανοσολογικά αποτελέσματα.
Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
4. Υλικά και Μέθοδοι
4.1. Ιός και κύτταρα
Το στέλεχος BVDV XZ02 τύπου 1b (αριθμός πρόσβασης GenBank: MF278652) απομονώθηκε από το Θιβέτ και καλλιεργήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα νεφρού βοοειδών Madin-Darby (MDBK). Ο ιός της επιδημικής διάρροιας χοίρων (PEDV) διατηρήθηκε στο εργαστήριό μας. Τα κύτταρα MDBK αγοράστηκαν από την ATCC (ATCC-CCL-22) και διατηρήθηκαν στο DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, China) και τα κύτταρα κυψελιδικών μακροφάγων βοοειδών (BAM) διατηρήθηκαν στο RPMI{ {8}} (Cat NO. SH30027, Cytiva, Shanghai, China); όλα τα μέσα περιείχαν 10% αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό αλόγου (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA,) και επωάστηκαν στους 37 ◦C σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα με 5% CO2. Εναιωρημένα κύτταρα HEK293 αγοράστηκαν από την ATCC (ATCC CRL-1573) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΚΟΡ293 χωρίς ορό (Cat ΝΟ. M21201121A, KAIRUI-biotech, Zhuhai, China).
4.2. Αντισώματα και κιτ δοκιμών
Τα ακόλουθα αντισώματα και κιτ δοκιμής χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: αντίσωμα αντι-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK). Αντίσωμα αντι-ποντικού HRP-κατσίκας (Cat ΝΟ. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-αντίσωμα κατσίκας κατά ποντικού (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-κατσίκα αντι-ποντικού αντίσωμα (Cat ΝΟ. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (Fc RI) αντίσωμα (Cat ΝΟ. abs135850, Absin, Shanghai, China); Alexa Fluor® 488 αντίσωμα κατσίκας κατά IgG ποντικού (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); Cy{17}}αντίσωμα IgG κατσίκας κατά κουνελιού (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, UK); FITC συζευγμένες μικροσφαίρες (Cat ΝΟ. 17155, Polysciences, Warrington, ΡΑ, USA); FITC-CD4 αντίσωμα (Cat ΝΟ. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8 αντίσωμα (Cat ΝΟ. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN-αντίσωμα (Cat ΝΟ. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); Αντίσωμα FITC-κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Τα κιτ και τα αντιδραστήρια περιλαμβάνουν κιτ ανίχνευσης αντισωμάτων BVDV-E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, China); Κιτ ανίχνευσης IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Κίνα); Κιτ ανίχνευσης SIgA (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Κίνα); Κιτ ανίχνευσης IFN (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, Κίνα); Κιτ ανίχνευσης IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, Κίνα); Κιτ ανίχνευσης IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Κίνα); TA{47}} αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Κίνα); Μέσο διαχωρισμού λεμφοκυττάρων (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).
4.3. Κατασκευή Πλασμιδίων
Το κολοβωμένο Ε2 (που θα αναφέρεται ως Ε2 στη συνέχεια) δημιουργήθηκε με την αφαίρεση της διαμεμβρανικής περιοχής του Ε2 (αριθμός εισαγωγής ακολουθίας γονιδίου: MF278652) χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ πρόσβαση στις 12 Ιανουάριος 2023) και προσθήκη ετικέτας ιστιδίνης στο C-άκρο (Εικόνα 1Α). Η γονιδιακή αλληλουχία φαίνεται στο Συμπληρωματικό Υλικό S1. Το πλασμίδιο E2Fc κατασκευάστηκε προσθέτοντας ένα θραύσμα Fc που περιέχει την περιοχή άρθρωσης του βόειου IgG1 (αριθμός πρόσβασης: x62916.1) στο C-τελικό του Ε2 με την τακτική θέση της περιοχής Ε2-συνθετικού εύκαμπτου πεπτιδίου-άρθρωσης -CH2-CH3 domain-6 × His [20]. Η γονιδιακή αλληλουχία φαίνεται στο Συμπληρωματικό Υλικό S2. Το πλασμίδιο E2Ft κατασκευάστηκε συνδέοντας το Ε2 με τη φερριτίνη Helicobacter pylori (υπολείμματα 5-167) μέσω του συνδέτη (Gly)3Ser [34]. Η γονιδιακή αλληλουχία φαίνεται στο Συμπληρωματικό Υλικό S3. Το πεπτίδιο σήματος IL-2 προστέθηκε στο Ν-άκρο των E2, E2Fc και E2Ft για να διευκολυνθεί η εκκριτική έκφραση [35]. Τα γονίδια στόχοι (E2, E2Ft και E2Fc) κλωνοποιήθηκαν σε pcDNA3.1 με BamHI και XhoI, αντίστοιχα.
4.4. Έκφραση και Καθαρισμός Πρωτεϊνών
Περίπου 10{{3{35}}}} mL αιωρούμενων κυττάρων HEK293 στο εκθετικό στάδιο (περίπου 2~4 x 106 κύτταρα/mL) επιμολύνθηκαν με αντίστοιχα πλασμίδια. Εν συντομία, 5 ml KPM (ρυθμιστικό διάλυμα επιμόλυνσης) και 100 μg αποστειρωμένου πλασμιδικού DNA προστέθηκαν σε έναν αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρησης και 5 mL KPM και 500 μL TA-293 (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuha ) αντιδραστήρια επιμόλυνσης προστέθηκαν σε άλλο αποστειρωμένο σωλήνα φυγοκέντρησης. Στη συνέχεια, ένα αραιωμένο αντιδραστήριο επιμόλυνσης προστέθηκε στο αραιωμένο πλασμίδιο και αναμίχθηκε επιμελώς. Μετά από επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ένα σύμπλοκο αντιδραστηρίου μορφομετατροπής DNA προστέθηκε στα κύτταρα, συνοδευόμενο από ανακίνηση. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ◦C με 5% CO2 με ταχύτητα ανακίνησης 140 rpm/min. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν έξι ημέρες μετά τη διαμόλυνση με φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στις 12,000 rpm/min και διηθήθηκαν με ένα φίλτρο 0,22 mm για να απομακρυνθούν τα υπολειμματικά κυτταρικά υπολείμματα. Οι στήλες χρωματογραφίας συγγένειας νικελίου (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό συγγένειας με επισήμανση ιστιδίνης (His) των πρωτεϊνών E2, E2Ft και E2Fc [36]. Εν συντομία, δείγματα 100 mL προστέθηκαν σε στήλες συγγένειας με ρυθμό 1 mL/min. Οι στήλες στη συνέχεια πλύθηκαν με πέντε όγκους στήλης (CV) ρυθμιστικού διαλύματος Α (0,1 Μ PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) με ρυθμό 1 mL/min. Τέλος, βαθμιδώσεις συγκέντρωσης ιμιδαζόλης (από 0 έως 500 mM) αφέθηκαν να ρέουν διαμέσου της στήλης με ρυθμό 1 mL/min για τη συλλογή του υγρού που αντιστοιχεί στην κύρια κορυφή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με ένα κιτ ανίχνευσης πρωτεΐνης BCA. Οι συλλεγμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για ανάλυση στυπώματος Western.
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
4.5. Western Blot
Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE. Αφού μεταφέρθηκαν στη μεμβράνη φίλτρου NC, οι πρωτεΐνες μπλοκαρίστηκαν με 2% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη όλη τη νύχτα στους 4 ◦C και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου . Αφού πλύθηκαν τρεις φορές με TBS-T, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα αντι-ποντικού HRP-κατσίκας (Cat ΝΟ. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού πλύθηκε τρεις φορές με TBS-T, το σύστημα χημειοφωταύγειας ECL χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της ανοσοέκφρασης πρωτεΐνης.
4.6. Έμμεσος Ανοσοφθορισμός
Για την ανίχνευση ανοσοφθορισμού της ανοσοέκφρασης των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, τα κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν E2, E2Ft και E2Fc. 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Αφού πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, τα κύτταρα διαπερατήθηκαν με 0.5% Trition-X100 για 15 λεπτά. Μετά από μια εντατική πλύση με PBS, τα κύτταρα στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 2% BSA και επωάστηκαν με ένα αραιωμένο 1:500 BVDV E2 μονοκλωνικό αντίσωμα (που παρασκευάστηκε στο εργαστήριό μας) στους 37 ◦C για 2 ώρες. Cy3 (Cat ΝΟ. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) ή συζευγμένα με FITC αντισώματα κατσίκας κατά ποντικού (Cat ΝΟ. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) εφαρμόστηκαν ως το δευτερεύον αντίσωμα. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) [37].
4.7. APC-Στόχευση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σύντηξης E2Fc
Πραγματοποιήθηκε ανάλυση εντοπισμού ανοσοφθορισμού για να επιβεβαιωθεί η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης BVDV-E2Fc στο Fc RI σε βόειους κυψελιδικούς μακροφάγους (BAM). Εν συντομία, 3 μg καθαρισμένου E2, E2Ft ή E2Fc προστέθηκαν σε βόειους κυψελιδικούς μακροφάγους. Μετά από επώαση για 12 ώρες στους 37 ◦C, τα κύτταρα πλύθηκαν με 0.1% BSA σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη/ακετόνη (1:1) στους 20 ◦ ΝΤΟ. Τα κύτταρα στη συνέχεια διαπερατήθηκαν με 0,5% Trition-X100 για 15 λεπτά και μπλοκαρίστηκαν με 2% BSA στους 37°C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν με το μονοκλωνικό αντίσωμα BVDV E2 (πηγή ποντικού, παρασκευάστηκε στο εργαστήριό μας) και βόειο CD64 (Fc RI) πολυκλωνικό αντίσωμα (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China) για 2 η. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και καλύφθηκαν με Alexa Fluor® 488 κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Cat ΝΟ. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) και σημασμένο με Cy{29}}αντίσωμα κατσίκας κατά IgG κουνελιού (Cat ΝΟ. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI. Οι εικόνες φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας εντοπισμό ανοσοφθορισμού (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).
4.8. Προσδιορισμός Φαγοκυτταρικού Ρυθμού Μακροφάγων Κυψελίδων Βοειδών
Για τον προσδιορισμό των επιδράσεων των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών E2, E2Ft και E2Fc στη φαγοκυττάρωση των κυψελιδικών μακροφάγων βοοειδών (BAM), κυψελιδικά μακροφάγα βοοειδών σε συγκέντρωση 1 × 106 κύτταρα/mL προεπωάστηκαν με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες E2, E2Ft ή E2Fc (οι συγκεντρώσεις προσαρμόστηκαν όλες στα 350 ng/mL) για 4 ώρες. Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS, 10 μL συζευγμένων με FITC μικροσφαιρών (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) και 990 μL του μέσου RPMI-1640 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο . Μετά από 2 ώρες επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθούν οι εξωκυτταρικές συζευγμένες με FITC μικροσφαιρίδια. Τα προσκολλημένα μακροφάγα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη (Gibco) που περιείχε 0,05% EDTA, και η πέψη τερματίστηκε με το πλήρες μέσο 1640 μετά από πλήρη πέψη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα προστέθηκαν στην ανώτερη στιβάδα των 10 mL PBS με 0,45 g γλυκόζης και 0,3 g BSA, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση βαθμίδωσης στα 400 x g για 10 λεπτά. Τα διαχωρισμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν με 800 μL PBS. Η ένταση φθορισμού στα 488 nm προσδιορίστηκε από το κυτταρόμετρο ροής Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA).
4.9. Διαδικασία προετοιμασίας και ανοσοποίησης εμβολίου
HEK{{0}}εκφρασμένα E2, E2Ft και E2Fc γαλακτωματοποιήθηκαν με ανοσοενισχυτικό IMS 1313VG (Seppic, Γαλλία) σε ίσες αναλογίες σε τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης 200 μg/mL και αποθηκεύτηκαν στους 4 ◦C μετά την επιθεώρηση ποιότητας. BVDV-E0 και BVDV-E2 αρνητικά σε αντίσωμα (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) 3-μοσχάρια μηνών (n=35) ήταν χωρισμένος σε επτά ίσες ομάδες. Μόσχοι σε τέσσερις ομάδες ανοσοποιήθηκαν με ρινικό βλεννογόνο (in) με PBS, E2, E2Ft και E2Fc, αντίστοιχα. Τα μοσχάρια στις υπόλοιπες τρεις ομάδες ενέθηκαν ενδομυϊκά (im) με αδρανοποιημένα εμβόλια E2Ft, E2Fc και BVDV ως θετικό έλεγχο (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, China). Τα μοσχάρια εμβολιάστηκαν τις ημέρες 1, 21 και 35 του πειράματος και κάθε μόσχος εμβολιάστηκε με 1 mL εμβολίου με συγκέντρωση πρωτεΐνης 200 μg/mL. Συλλέχτηκε αίμα από μόσχους τις ημέρες 1, 21, 35 και 49 του πειράματος για άλλους δείκτες (Εικόνα 3Α). Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Έρευνας του Κολλεγίου Κτηνιατρικής του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Huazhong, Hubei, Κίνα (αρ. HZAUCA-2022-0011).
4.10. Παραγωγή IgA στα κόπρανα και στον ορό
Ρινικά επιχρίσματα, περιττώματα και δείγματα ορού μόσχων συλλέχθηκαν την ημέρα 14 μετά τη δευτερογενή ανοσοποίηση. Τα φρέσκα κόπρανα αγελάδας αραιώθηκαν σε ένα εναιώρημα κοπράνων 15% με PBS, το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στους 18, 000× g στους 4 ◦C για 30 λεπτά και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για μετέπειτα χρήση. Τα ρινικά επιχρίσματα συλλέχθηκαν περιστρέφοντας το αποστειρωμένο βαμβάκι βαθιά μέσα στη ρινική κοιλότητα της αγελάδας για 6-8 στροφές. Τα επιχρίσματα τοποθετήθηκαν σε ένα σωλήνα PBS που περιείχε 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και αναμίχθηκαν εκτενώς. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 18,000× g στους 4 ◦C για 10 λεπτά και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για μελλοντική χρήση. Δείγματα αίματος βοοειδών συλλέχθηκαν με αντιπηκτικό σωλήνα που περιείχε αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) και τα δείγματα ορού ελήφθησαν με φυγοκέντρηση των δειγμάτων αίματος στους 4 ◦C και 400 g για 5 λεπτά. Τα IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China) και SIgA ανιχνεύθηκαν με το κιτ ELISA (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
4.11. Ανάλυση Κυτταρομετρίας Ροής
Οι συχνότητες των IFN- -που παράγουν CD3+ CD{4+ και CD3+ CD8+ Τ κυττάρων μεταξύ των CD3+ λεμφοκυττάρων στο αίμα ήταν αναλύονται με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Τα δείγματα συλλέχθηκαν 14 ημέρες μετά την αναμνηστική ανοσοποίηση [36]. Τα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) επαναιωρήθηκαν και αραιώθηκαν σε 1 × 106 κύτταρα/mL με πλήρες μέσο RPMI{10}}, διεγέρθηκαν με αδρανοποιημένο με UV BVDV XZ02 (MOI=0.1) και επωάστηκαν στους 37 ◦C με 5% CO2 για 72 ώρες. Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε κονκαναβαλίνη Α (Con A) (5 μg/mL, Sigma). Ο αναστολέας μεταφοράς πρωτεΐνης brefeldin A (BFA, 3 μg/mL, eBioscience) προστέθηκε σε όλα τα δείγματα 12 ώρες πριν από τη συλλογή των κυττάρων για να εμποδίσει την έκκριση IFN. Ποσότητα 200 μL του κυττάρου μεταφέρθηκε σε σωλήνες FCM και χρωματίστηκε με το επισημασμένο με FITC αντίσωμα CD4 (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) για 30 λεπτά στους 4◦C στο σκοτάδι. Αφού πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα CD8 σημασμένο με R-PE (Cat ΝΟ. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Αφού πλύθηκαν τρεις φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν με το αντίσωμα αντι-βόειας IFN- ποντικού (Cat ΝΟ. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) για 20 λεπτά στο σκοτάδι για ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 1% FBS. Η κυτταρομετρία ροής διεξήχθη με το κυτταρόμετρο ροής FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ΗΠΑ) και τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38].
4.12. Πολλαπλασιασμός Λεμφοκυττάρων και Ανίχνευση Κυτοκινών
Τα αντιπηκτικά μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) κάθε μόσχου απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μέσο διαχωρισμού λεμφοκυττάρων (Cat ΝΟ. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, ΜΟ, USA) την ημέρα 49 μετά την ανοσοποίηση. Τα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος βοοειδών αραιώθηκαν με το μέσο FBS 1640 10% σε 1 χ 106 κύτταρα/mL. Στη συνέχεια, 100 μL αραιωμένων κυττάρων προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-πηγαδιού και διεγέρθηκαν με αδρανοποιημένο με UV BVDV, κονκαναβαλίνη (θετικός έλεγχος) ή μέσο καλλιέργειας (αρνητικός έλεγχος), αντίστοιχα. Μετά από 72 ώρες επώασης στους 37 ◦C με 5% CO2, 30 μL MTS προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα συνέχισαν να καλλιεργούνται στους 37 ◦C για 1 ώρα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 492 nm μετρήθηκε με έναν αυτοματοποιημένο αναλυτή μικροπλακών. Ο τίτλος πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων κάθε δείγματος προσδιορίστηκε με δείκτη διέγερσης (SI). Υπολογίστηκε το SI=(OD δείγματος-OD του τυφλού ελέγχου)/(OD αρνητικού δείγματος-OD του τυφλού δείγματος ελέγχου) [39]. Η ιντερφερόνη (IFN)-, η ιντερλευκίνη (IL)-2 και η ιντερλευκίνη (IL)-4 ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA. Εν συντομία, τα PBMCs απομονώθηκαν και αραιώθηκαν σε 4 x 106 κύτταρα/mL με μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS και τοποθετήθηκαν σε 24-πλάκες καλλιέργειας ιστού φρεατίου. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με απενεργοποιημένο BVDV XZ02 (MOI=1) για 48 ώρες στους 37 ◦C και το υπερκείμενο στη συνέχεια συλλέχθηκε. Το IFN- (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China), IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, China) και IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Τα επίπεδα Nanjing, Κίνα) ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντίστοιχα κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το περιεχόμενο των IFN-, IL-2 και IL-4 στο δείγμα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την τυπική καμπύλη.
4.13. Ορολογικές εξετάσεις
Για την ανίχνευση αντισωμάτων Ε2/Ε0, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από κάθε μόσχο τις ημέρες 0, 21, 35 και 49 μετά την ανοσοποίηση. Τα δείγματα ορού συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση δειγμάτων αίματος στα 1000 x g για 20 λεπτά. Τα δείγματα ορού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τις απαιτήσεις του κιτ ανίχνευσης αντισωμάτων BVDV E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Οι μικροπλάκες επικαλυμμένες με το αντιγόνο BVBV Ε2 εξισορροπήθηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 50 μL αρνητικού μάρτυρα, θετικού ελέγχου και δειγμάτων ορού προστέθηκαν στη μικροπλάκα, αντίστοιχα. Ποσότητα 50 μL αντισώματος ανίχνευσης σημασμένου με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HRP) προστέθηκε στη συνέχεια στη μικροπλάκα και επωάστηκε στους 37 ◦C για 60 λεπτά. Αφού πλύθηκε πέντε φορές με ένα ρυθμιστικό έκπλυσης, προστέθηκε ένα χρωμογόνο διάλυμα για να μετρηθεί η απορρόφηση της συσκευής ανάγνωσης μικροπλάκας στα 450 nm για να προσδιοριστεί το επίπεδο του αντισώματος Ε2 σε κάθε ομάδα ανοσοποίησης. Η μέθοδος ορού αραίωσης σταθερού ιού χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του επιπέδου εξουδετερωτικού αντισώματος των δειγμάτων ορού. Εν συντομία, τα πλήρως αδρανοποιημένα δείγματα ορού του ανοσοποιητικού αραιώθηκαν κατά 2-1 έως 2-12 και 50 µL ορού σε κάθε τίτλο αραίωσης προστέθηκαν σε τρυβλία 96-πηγαδιών. Στη συνέχεια, 50 μL αραιωμένου διαλύματος ιού που περιέχει τον ιό 200 TCID50- BVDV XZ02 προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες ανακινήθηκαν απαλά και αναμίχθηκαν. Μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ◦C, κύτταρα MDBK με συγκέντρωση 5 x 105 κύτταρα/mL προστέθηκαν σε τρυβλία 96- φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ◦C σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα με 5% CO2 για 72 ώρες. Για την ανίχνευση της εξουδετερωτικής δράσης των δειγμάτων ορού, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το Ε{40}ειδικό αντίσωμα ως πρωτεύον αντίσωμα (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) και συζευγμένο με FITC IgG κατσίκας αντι-κουνελιού ως δευτερεύον αντίσωμα, (Cat ΝΟ. AS011, ABclonal, Boston, ΜΑ, ΗΠΑ). Ένα τυπικό πράσινο φθορίζον σήμα έδειξε την απουσία εξουδετέρωσης. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (TE2000, Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία). Ο τίτλος εξουδετέρωσης ορού υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Reed-Muench και η μέγιστη αραίωση του ορού που θα μπορούσε να αναστείλει πλήρως τον φθορισμό προσδιορίστηκε ως ο τίτλος εξουδετέρωσης του ορού.
4.14. Ανίχνευση ειδικότητας μονοκλωνικού αντισώματος BVDV E2
Διεξήχθησαν αρχικά δοκιμές προ-απορρόφησης του μονοκλωνικού αντισώματος BVDV Ε2, ακολουθούμενες από δοκιμασίες ιικής αντιγραφής και στύπωμα Western για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του BVDV E2 mAb. Για τον προσδιορισμό ιικής αντιγραφής, 400 TCID50 BVDV προεπωάστηκαν με PBS και 100 μg ή 200 μg Ε2 mAb στους 37 ◦C για 1 ώρα, αντίστοιχα. Μετά την επώαση, το προκατεργασμένο BVDV εμβολιάστηκε σε κύτταρα MDBK και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ◦C σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στους 18 ή 24 hpi (ώρα μετά τη μόλυνση) και το RNA εκχυλίστηκε με αντιδραστήριο TRIZOL. Διεξήχθη RT-qPCR για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του γονιδίου BVDV Ε2. Για τη δοκιμασία Western blot, το mAb E2 προεπωάστηκε με Tween20, πρωτεΐνη PEDV S ή πρωτεΐνη BVDV E2 σε TBS-T για 2 ώρες στους 4 ◦C, αντίστοιχα. Η προκατεργασμένη Ε2 mAb υποβλήθηκε σε δοκιμασία στυπώματος Western ως το πρωτεύον αντίσωμα για την ανίχνευση της αντίδρασης στην πρωτεΐνη BVDV Ε2 ή PEDV S.
4.15. Στατιστική ανάλυση
Για όλες τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism. Το μη ζευγαρωμένο t-test δύο ουρών χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων και την παραγωγή των τιμών p (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1· ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SD.
5. Συμπεράσματα
Στη μελέτη μας, εκφράστηκαν τρεις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, BVDV-E2, BVDV-E2Ft και BVDV-E2Fc, και δημιουργήθηκαν αντίστοιχα εμβόλια υπομονάδας. Οι δοκιμές in vivo έδειξαν ότι το εμβόλιο υπομονάδας E2Fc ήταν πιο αποτελεσματικό από το E2Ft και το E2, τόσο σε βλεννογόνο όσο και σε ενδομυϊκή ανοσοποίηση. Επιβεβαιώσαμε ότι οι τίτλοι αντισωμάτων εξουδετέρωσης που προκλήθηκαν από τα ανοσοποιημένα με βλεννογόνο E2Fc και E2Ft ήταν 1:64 και 1:16, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι το E2Fc συνδέθηκε με Fc RI σε βόειους κυψελιδικούς μακροφάγους για να επιτευχθεί διαβλεννογονική μεταφορά. Ο εμβολιασμός του βλεννογόνου του πολυδύναμου εμβολίου υπομονάδας E2Fc του κύριου επιδημικού στελέχους του BVDV βελτίωσε σημαντικά τα ανοσολογικά αποτελέσματα και είναι κατάλληλο για πρακτική χρήση. Η μελέτη μας παρέχει μια λύση στον χρονοβόρο και χρονοβόρο συμβατικό εμβολιασμό με τη χρήση ενός εμβολίου βλεννογόνου. Η πρωτεΐνη BVDV E2 είναι ιδανικός στόχος για την εξουδετέρωση αντισωμάτων και οι πρωτεΐνες σύντηξης E2Fc και E2Ft που κατασκευάζονται σε αυτή τη μελέτη αναμένεται να εφαρμοστούν περαιτέρω ως ασφαλή και αποτελεσματικά εμβόλια υπομονάδας κατά της μόλυνσης από BVDV.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Πρόγραμμα εκρίζωσης για τον ιό της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών στο Orkney 2001 έως 2008. Κτηνίατρος. Rec. 2010, 167, 566–570. [CrossRef]
2. Peterhans, Ε.; Schweizer, M. BVDV: Ένας παρασιτοϊός που προκαλεί ανοχή στην έμφυτη ανοσοαπόκριση. Biologicals 2013, 41, 39–51. [CrossRef]
3. Zhong, F.; Li, Ν.; Huang, Χ.; Guo, Υ.; Chen, Η.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Γενετική τυποποίηση και επιδημιολογική παρατήρηση του ιού της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών στη Δυτική Κίνα. Virus Genes 2011, 42, 204-207. [CrossRef]
4. Deng, Υ.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, Η.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Γονιδιωματικός χαρακτηρισμός απομονώσεως ιού ιογενούς διάρροιας βοοειδών από χοίρους. Αψίδα. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]
5. Deng, Υ.; Sun, CQ; Cao, SJ; Lin, Τ.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, Η.; et al. Υψηλός επιπολασμός του ιού 1 της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών σε κινεζικά κοπάδια χοίρων. Κτηνίατρος. Microbiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]
6. Wang, L.; Wu, Χ.; Wang, C.; Song, C.; Bao, J.; Du, J. Η προέλευση και η μετάδοση του ιού ιογενούς διάρροιας των βοοειδών τύπου 1 στην Κίνα αποκαλύφθηκε με φυλοδυναμική ανάλυση. Res. Κτηνίατρος. Sci. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]
7. Tautz, Ν.; Tews, BA; Meyers, G. The Molecular Biology of Pestiviruses. Adv. Virus Res. 2015, 93, 47–160.
8. Becher, Ρ.; Tautz, N. RNA ανασυνδυασμός σε παρασιτοϊούς: Αλληλουχίες κυτταρικού RNA σε ιικά γονιδιώματα υπογραμμίζουν το ρόλο των παραγόντων ξενιστή για την ιική εμμονή και τη θανατηφόρα νόσο. RNA ΒίοΙ. 2011, 8, 216–224. [CrossRef]
9. Li, Υ.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Υ. Κρυσταλλική δομή γλυκοπρωτεΐνης Ε2 από ιό ιογενούς διάρροιας βοοειδών. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2013, 110, 6805–6810. [CrossRef]
10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP Ένα ανασυνδυασμένο εμβόλιο με φορέα ερπητοϊού βοοειδών-4 που χορηγείται μέσω ενδορινικής νεφελοποίησης προκαλεί τίτλους αντισωμάτων εξουδετέρωσης του ιού στα βοοειδή. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [CrossRef]
11. Ainai, Α.; van Riet, Ε.; Ito, R.; Ikeda, Κ.; Senchi, Κ.; Suzuki, Τ.; Tamura, SI; Asanuma, Η.; Odagiri, Τ.; Tashiro, Μ.; et al. Ανθρώπινες ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από ένα ενδορινικά αδρανοποιημένο εμβόλιο γρίπης H5. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]
12. Kang, Η.; Yan, Μ.; Yu, Q.; Yang, Q. Χαρακτηριστικά του ρινικού λεμφικού ιστού (NALT) και της ικανότητας ρινικής απορρόφησης στο κοτόπουλο. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]
13. Ye, L.; Zeng, R.; Bai, Υ.; Roopenian, DC; Zhu, X. Αποτελεσματικός εμβολιασμός του βλεννογόνου με τη μεσολάβηση του νεογνικού υποδοχέα Fc. Nat. Biotechnol. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]
14. Pabst, R. Βλεννογόνος εμβολιασμός με την ενδορινική οδό. Λεμφοειδής ιστός που σχετίζεται με τη μύτη (NALT) - Διαφορές δομής, λειτουργίας και ειδών. Vaccine 2015, 33, 4406-4413. [CrossRef]
15. Zhang, Υ.; Zhou, Ζ.; Zhu, SL; Zu, Χ.; Wang, Ζ.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Ένα νέο εμβόλιο πρωτεΐνης σύντηξης RSV F-Fc μειώνει τον τραυματισμό των πνευμόνων που προκαλείται από λοίμωξη από αναπνευστικό συγκυτιακό ιό. Antivir. Res. 2019, 165, 11–22. [CrossRef]
16. Wiedinger, Κ.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Ισοτυπικά ειδικά αποτελέσματα στη στόχευση υποδοχέα γάμμα Fc του PspA χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες σύντηξης ως στρατηγική εμβολιασμού κατά της μόλυνσης από Streptococcus pneumoniae. Vaccine 2020, 38, 5634–5646. [CrossRef]
17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Ζ.; Pleass, RJ Fc-fusion πρωτεΐνες: Νέες εξελίξεις και μελλοντικές προοπτικές. ΕΜΒΟ ΜοΙ. Med. 2012, 4, 1015–1028. [CrossRef]
18. Chen, Χ.; Zeng, F.; Huang, Τ.; Cheng, L.; Liu, Η.; Gong, R. Optimization on Fc for Improvement of Stability and Aggregation Resistance. Curr. Pharm. Biotechnol. 2016, 17, 1353–1359. [CrossRef]
19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, Ρ.; Colaco, CA; Bailey, CR; Shelton, Η.; Molesti, Ε.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM χωρίς ανοσοενισχυτικό ανοσοενισχυτικό με πρωτεΐνες σύντηξης αιμοσυγκολλητίνης-Fc ως προσέγγιση για εμβόλια γρίπης. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [CrossRef]
20. Li, J.; Li, Χ.; Ma, Η.; Ren, Χ.; Hao, G.; Zhang, Η.; Zhao, Ζ.; Fang, Κ.; Li, Χ.; Rong, Ζ.; et al. Αποτελεσματικός εμβολιασμός του βλεννογόνου ενός νέου ιού της κλασικής πανώλης των χοίρων E2-Συντηγμένη πρωτεΐνη Fc με τη μεσολάβηση του νεογνικού υποδοχέα Fc. Vaccine 2020, 38, 4574–4583. [CrossRef]
21. Zhen, Ζ.; Tang, W.; Todd, Τ.; Xie, J. Ferritins ως νανοπλατφόρμες για απεικόνιση και χορήγηση φαρμάκων. Γνώμη εμπειρογνωμόνων. Drug Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]
22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, Ε.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Αυτοσυναρμολογούμενα νανοσωματίδια πρωτεΐνης στο σχεδιασμό εμβολίων. Υπολογιστής. Struct. Biotechnol. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]
23. Jacob, SI; Khogeer, Β.; Bampos, Ν.; Sheppard, Τ.; Schwartz, R.; Lowe, CR Ανάπτυξη και Εφαρμογή Συνθετικών Συνδετών Συνάφειας για τον Καθαρισμό Αντιγόνων Γρίπης με βάση τη Φερριτίνη. Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]
24. Μα, Χ.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Υ.; Zhang, Υ.; Zhang, Χ.; Deng, J.; Chen, Τ.; Τραγούδι, Ζ.; et al. Τα εμβόλια νανοσωματιδίων που βασίζονται στον τομέα δέσμευσης υποδοχέα (RBD) και το επτάδιο επανάληψης (HR) του SARS-CoV-2 προκαλούν ισχυρές προστατευτικές ανοσοαποκρίσεις. Immunity 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]
25. Benedictus, L.; Bell, CR Οι κίνδυνοι από τη χρήση αλλογενών κυτταρικών γραμμών για την παραγωγή εμβολίων: Το παράδειγμα της νεογνικής πανκυτταροπενίας των βοοειδών. Expert Rev. Vaccines 2017, 16, 65–71. [CrossRef]
26. Pecora, Α.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, Α.; Leunda, MR; Odeon, Α.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spiteler, Μ.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; et al. Ασφάλεια και αποτελεσματικότητα ενός εμβολίου υπομονάδας γλυκοπρωτεΐνης Ε2 που παράγεται σε κύτταρα θηλαστικών για την πρόληψη της πειραματικής μόλυνσης με τον ιό της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών σε βοοειδή. Κτηνίατρος. Res. Commun. 2012, 36, 157–164. [CrossRef]
27. Thomas, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME? Brownlie, J. Αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των υποψηφίων εμβολίων υπομονάδας Ε2 εκφρασμένων θηλαστικών και βακουλοϊού στον ιό της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών. Vaccine 2009, 27, 2387-2393. [CrossRef]
28. Arena, TA; Harms, PD; Μεταμόλυνση Wong, AW υψηλής απόδοσης κυττάρων HEK293 για Παροδική Παραγωγή Πρωτεϊνών. Μέθοδοι ΜοΙ. Biol. 2018, 1850, 179–187.
29. Venereo-Sanchez, Α.; Gilbert, R.; Simoneau, Μ.; Caron, Α.; Chahal, Ρ.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, Χ.; Henry, Ο.; Kamen, A. Αιμοσυγκολλητίνη και σωματίδια που περιέχουν νευραμινιδάση που παράγονται σε καλλιέργεια εναιωρήματος ΗΕΚ-293: Ένα αποτελεσματικό υποψήφιο εμβόλιο γρίπης. Vaccine 2016, 34, 3371–3380. [CrossRef]
30. Yan, Υ.; Li, Χ.; Wang, Α.; Zhang, G. Μοριακή κλωνοποίηση και ταυτοποίηση πλήρους μήκους cDNA που κωδικοποιεί υποδοχέα Fc υψηλής συγγένειας για βόειο IgG (Fc γάμμα RI). Κτηνίατρος. Immunol. Ανοσοπαθόλη. 2000, 75, 151-159. [CrossRef]
31. Zhao, Ζ.; Chen, Χ.; Chen, Υ.; Li, Η.; Fang, Κ.; Chen, Η.; Li, Χ.; Qian, P. A Self-Assembling Ferritin nanoplatform for Designing Classical Swine Fever Vaccine: Elicitation of Potent Neutralizing Antibody. Vaccines 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]
32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Τσεν, ΜΟΥ; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; et al. Ο ενδορινικός εμβολιασμός μόνο με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σύντηξης αντιγόνου-FLIPr προκαλεί μακροχρόνιες συστηματικές αποκρίσεις αντισωμάτων και ευρείες αποκρίσεις Τ-κυττάρων. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]
33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, Α.; Acosta, Μ.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, Α. Ένα νέο εμβόλιο υπομονάδας BVDV στοχευόμενου MHC-II προκαλεί μια εξουδετερωτική ανοσολογική απόκριση σε ινδικά χοιρίδια και βοοειδή. Transbound. Emerg. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]
34. Ma, Η.; Li, Χ.; Li, J.; Zhao, Ζ.; Zhang, Η.; Hao, G.; Chen, Η.; Qian, P. Η ανοσοποίηση με μια ανασυνδυασμένη σύντηξη του τροποποιημένου GP5 με τον ιό του αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου χοίρου και τη φερριτίνη προκαλεί ενισχυμένη προστατευτική ανοσία στους χοίρους. Virology 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]
35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, Α.; Algaissi, Α.; Peng, ΒΗ; Tai, W.; et al. Κατασκευάζοντας μια σταθερή κυτταρική σειρά CHO για την έκφραση ενός αντιγόνου εμβολίου MERS-coronavirus. Vaccine 2018, 36, 1853–1862. [CrossRef]
36. Bellini, Μ.; Riva, Β.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, Μ.; Mingozzi, F.; Visioli, Α.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; et al. Κατασκευασμένα νανοσωματίδια φερριτίνης για την παρακολούθηση βιοφωταύγειας της παράδοσης νανοφαρμάκων στον καρκίνο. Small 2020, 16, e2001450. [CrossRef]
37. Zhang, Η.; Li, Χ.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, Ρ. Η γλυκοπρωτεΐνη Ε2 του ιού της κλασικής πανώλης των χοίρων που εκφράζεται από τον βακουλοϊό επάγει τις προστατευτικές ανοσολογικές αποκρίσεις σε κουνέλια. Vaccine 2014, 32, 6607–6613. [CrossRef]
38. Yuan, L.; Wen, Κ.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Οι ειδικές για τον ιό Saif, LJ εντερικές αποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων που παράγουν IFN-γ που προκαλούνται από μόλυνση από ανθρώπινο ροταϊό και εμβόλια συσχετίζονται με την προστασία έναντι της διάρροιας από ροταϊό σε γνοτοβιοτικούς χοίρους. Vaccine 2008, 26, 3322-3331. [CrossRef]
39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Ενισχυμένη προστατευτική ανοσολογική απόκριση στο εμβόλιο υπομονάδας PCV2 με συγχορήγηση ανασυνδυασμένης γάμμα χοίρου IFN σε ποντικούς. Vaccine 2013, 31, 833-838. [CrossRef]
