Τραυματισμός ποδοκυττάρου μέσω αλληλεπίδρασης μεταξύ του Tlr8 και του ενδογενούς συνδετήρα του MiR-21 στον αποφρακωμένο και στον παράπλευρο νεφρό του

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche στυτική δυσλειτουργία που σχετίζονται με τα νεφρά

Ενώ η χρόνια νεφρική νόσος είναι διαδεδομένη στους ενήλικες, η αποφρακτική νεφροπάθεια (ΟΝ) έχει αναφερθεί τόσο σε νέους όσο και σε ηλικιωμένους ασθενείς. Στο ΟΝ, οι σωληναρισιακές βλάβες (TILs) έχουν διερευνηθεί ευρέως, αλλά οι σπειραματικές βλάβες (GLs) έχουν σε μεγάλο βαθμό παραμεληθεί. Εδώ, δείχνουμε έναν νέο μηχανισμό που βασίζεται στην ανάπτυξη GL στο ON σε νεαρά και ηλικιωμένα ποντίκια. Τα TIL αναπτύσσονται νωρίτερα από τα GL λόγω της διείσδυσης φλεγμονωδών κυττάρων στο σωληναριστήριο, αλλά τα GL αναπτύσσονται μετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα τύπου Toll 8 (Tlr8) ακόμη και αν δεν υπάρχουν φλεγμονώδη κύτταρα που διεισδύουν στο σπείραμα. Οι πρωτεΐνες TLR8 και ιντερλευκίνης 1 βήτα (IL1b) εντοπίζονται με μειωτικούς δείκτες ποδοκυτταρικής λειτουργίας (PFMs), υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση της σηματοδότησης TLR8 σε τραυματισμένα ποδοκύτταρα. Επιπλέον, τα σπειραματικά επίπεδα και τα επίπεδα στον ορό του miR-21, ενός ενδογενούς συνδέτη για το Tlr8, ήταν υψηλότερα στο μοντέλο ποντικού ON από ό,τι στον εικονικό έλεγχο. Η σπειραματική έκφραση του Tlr8 συσχετίζεται θετικά με το miR-21 και τις κατάντη κυτοκίνες Il1b και Il6 και συσχετίζεται αρνητικά με τα PFM (Nphs1 και Synpo). Δείχνουμε επίσης τον εντοπισμό των πρωτεϊνών TLR8 και IL1b με μειωμένα PFM τόσο σε αποφρακτικά όσο και σεεγγύησηνεφράμικρών και μεγάλων ποντικών. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης in vitro αποκάλυψαν υψηλότερη έκφραση του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του σε σπειράματα από αποφρακτικάνεφράμετά τη θεραπεία με miR- 21 σε σχέση με τον έλεγχο. Συμπερασματικά, η υπερέκφραση του Tlr8 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας εύλογος μηχανισμός που βασίζεται στην ανάπτυξη GL στο ΟΝ μέσω τραυματισμού των ποδοκυττάρων.

Λέξεις κλειδιά: χρόνια νεφρική νόσο,αποφρακτική νεφροπάθεια, ποδοκύτταρο, TLR8, απόφραξη και παράπλευρο νεφρό

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ), μια σημαντική ανησυχία για τη δημόσια υγεία, επικρατεί στο 8% -13% του γενικού πληθυσμού (1). Είναι συχνό σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας λόγω της γήρανσης της κοινωνίας. Η αποφρακτική νεφροπάθεια (ΟΝ) παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον για τους κλινικούς ιατρούς, καθώς έχει αναφερθεί σε ασθενείς από διαφορετικές ηλικιακές ομάδες. Το ON είναι θεραπεύσιμο και αναστρέψιμο, σε αντίθεση με άλλα ΧΝΝ (2, 3). Στα παιδιά, εμφανίζεται σε ένα από τα 1500 νεαρά άτομα και ο επιπολασμός του είναι τόσο υψηλός όσο 1 τοις εκατό -5 τοις εκατό στις ανεπτυγμένες χώρες (4, 5). Στους ενήλικες, ο επιπολασμός της ΟΝ κυμαίνεται από 5 στα 1000 έως 5 στα 10000 άτομα. Επιπλέον, ο επιπολασμός της χρόνιας μονόπλευρης ΟΝ είναι περίπου 0,5 τοις εκατό, ενώ αυτός της οξείας μονόπλευρης και χρόνιας αμφοτερόπλευρης ΟΝ είναι περίπου 0,1 τοις εκατό (4–7).

Η ΟΝ μπορεί να οδηγήσει σε οξεία νεφρική βλάβη ή ΧΝΝ, η οποία περιλαμβάνει προοδευτική μείωση της νεφρικής λειτουργίας και αλλοιώσεις στις νεφρικές δομές που διαρκούν περισσότερο από 3 μήνες (8, 9). Η μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρα (UUO) είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη στρατηγική για τη μελέτη της χρόνιας ΟΝ. Το ON σε ένα νεφρό UUO χαρακτηρίζεται από υπερτροφία, υδρονέφρωση, στρατολόγηση φλεγμονωδών κυττάρων στη διάμεση περιοχή, θάνατο σωληναριακών κυττάρων από υποξία και εναπόθεση κολλαγόνου στο διάμεσο σωληνάριο, ακολουθούμενη από ανάπτυξη σωληναριδικής ίνωσης (TF) (10).

Η TF είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της νεφρικής νόσου τελικού σταδίου και βασικός καθοριστικός παράγοντας της προοδευτικής νεφρικής βλάβης (11). Η TF έχει διερευνηθεί εκτενώς σε μοντέλα ON, αλλά τα δεδομένα σχετικά με τη σπειραματική βλάβη, ιδιαίτερα τις ανωμαλίες του φραγμού αίματος-ούρων (BUB), είναι σπάνια (8, 9, 12). Περαιτέρω, μελέτες έχουν διερευνήσει σωληναρισιακές βλάβες (TILs) στον παράπλευρο νεφρό σε μονόπλευρη ΟΝ, αλλά οι σπειραματικές βλάβες (GLs) έχουν παραμεληθεί σε μεγάλο βαθμό (12). Αρκετές αναφορές έχουν αποκαλύψει τη συμμετοχή των περισωληναρίων τριχοειδών αγγείων στην εξέλιξη των TILs στο πειραματικό ON (13, 14). Ωστόσο, το σπείραμα και το σπειραματικό τριχοειδές παροχετεύονται στα σωληνοειδή τμήματα του νεφρώνα και των περισωληναριακών τριχοειδών, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η σπειραματονεφρίτιδα μπορεί επίσης να επηρεάσει το διάμεσο του σωληναρίου. Οι προηγούμενες μελέτες μας έχουν επισημάνει τη συμβολή του τραυματισμού σε εγγενή σπειραματικά κύτταρα, κυρίως των ποδοκυττάρων, στην GL και την επακόλουθη ανάπτυξη TIL σε ένα μοντέλο ποντικού αυτοάνοσης νόσου λόγω της υπερέκφρασης διαφορετικών υποδοχέων τύπου Toll (TLRs) (15-18).

Το σπειραματικό τριχοειδές ενδοθήλιο και τα ποδοκύτταρα είναι σημαντικοί φύλακες πύλης που περιλαμβάνουν BUBs. Μεταξύ αυτών των δύο επιθηλίων, τα ποδοκύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε σήματα κινδύνου, συμπεριλαμβανομένων των συνδέτη TLR, όπως τα μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με τον κίνδυνο (DAMPs) ή τα μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με το παθογόνο (PAMPs), λόγω του μοναδικού εντοπισμού τους στα σπειράματα (15). Ως εκ τούτου, η αλληλεπίδραση μεταξύ των TLRs στα ποδοκύτταρα και των ενδογενών συνδετών τους πιστεύεται ότι συμβάλλει στον τραυματισμό των ποδοκυττάρων σε μη μολυσματικές καταστάσεις. Στην παρούσα μελέτη, επικεντρωθήκαμε στην ανάπτυξη της GL τόσο στους αποφραγμένους όσο και στους παράπλευρους νεφρούς νεαρών και ηλικιωμένων ποντικών, καθώς η ΟΝ απαντάται συχνά τόσο σε νέους όσο και σε μεγαλύτερους ανθρώπους. Διευκρινίσαμε ότι το GL αναπτύχθηκε στο ΟΝ λόγω τραυματισμού των ποδοκυττάρων μέσω της υπερέκφρασης του Tlr8 σε ποδοκύτταρα τόσο από αποφραγμένους όσο και από παράπλευρους νεφρούς νεαρών και ηλικιωμένων ποντικών.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ηθική δήλωση και στέγαση πειραματικών ζώων Όλα τα πειράματα με πειραματόζωα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων της Σχολής Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου του Χοκάιντο (αρ. έγκρισης 16- 0124). Οι συγγραφείς ακολούθησαν τον εγκεκριμένο οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων του Πανεπιστημίου Hokkaido, Faculty of Veterinary Medicine (εγκεκριμένο από την Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Ποντίκια C57BL/6N ηλικίας έξι εβδομάδων αγοράστηκαν από την Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Ιαπωνία) και διατηρήθηκαν σε συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα σε περιβάλλον φωτός-σκότους 1:1. Στα πειραματόζωα χορηγήθηκε κατά βούληση τροφή και πόσιμο νερό.

Πειραματικός Σχεδιασμός Χρησιμοποιήσαμε τόσο μικρά (9 εβδομάδες) όσο και μεγάλα (12 μηνών) ποντίκια. Ποντίκια από κάθε ηλικιακή ομάδα (n=4) υποβλήθηκαν είτε σε εικονική επέμβαση (ομάδα ελέγχου) είτε σε UUO (2, 7, 11 και 21 ημέρες) για να δημιουργήσουν ένα νεφρό μοντέλου ON, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας (13).

Προετοιμασία δείγματος Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με ένα μείγμα αναισθητικών παραγόντων όπως περιγράφηκε προηγουμένως (16) και υπέστησαν ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος μέσω της μηριαίας αρτηρίας για ανάλυση δεικτών ορού. Τόσο οι UUO όσο και οι παράπλευροι νεφροί συλλέχθηκαν και κόπηκαν σε λεπτές φέτες. Οι φέτες νεφρού στερεώθηκαν με 10 τοις εκατό ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης (NBF), 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA) και 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη (GTA) για ιστοπαθολογικές, ανοσοϊστοχημικές και ηλεκτρονικές μικροσκοπικές μελέτες, αντίστοιχα.

Ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμός NBF σταθεροποιημένα μπλοκ παραφίνης κόπηκαν σε πάχος 2 mm και χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ Schiff-αιματοξυλίνη (PAS-H) για να εξεταστεί η νεφρική ιστοπαθολογία. Πραγματοποιήθηκε ανοσοανίχνευση κυτταρικών δεικτών όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (16) για Β κύτταρα (Β220), Τ κύτταρα (CD3), τριχοειδές ενδοθήλιο (CD31), IL1b, μακροφάγους (Iba1), ποδοκύτταρα (ποδοσίνη και συναπτοποδίνη) και TLR8. Οι συνθήκες χρώσης παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Ιστοπλανομετρία PAS-H και ανοσοχρωματισμένες τομές νεφρού μετατράπηκαν σε εικονικές διαφάνειες χρησιμοποιώντας Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Ιαπωνία). Τα θετικά κύτταρα μετρήθηκαν από τυχαία επιλεγμένα 20 σπειράματα ή 20 εστίες από το διάμεσο του σωληναρίου σε μεγέθυνση 400x χρησιμοποιώντας το λογισμικό NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Εικόνες 20 σπειραμάτων από τομές χρωματισμένες με PAS-H καταγράφηκαν επίσης σε 400x από κάθε ποντίκι χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Όλα σε Ένα BZ-X710 (Keyence, Osaka, Ιαπωνία). Η σπειραματική μεσαγγειακή περιοχή και το μέγεθος μετρήθηκαν από εικόνες που λήφθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή BZ-X (Keyence).

Απομόνωση Σπειραμάτων για Εκχύλιση και Καλλιέργεια RNA Σπειράματα από ψευδοχειρουργημένους νεφρούς και UUO νεφρούς απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (16). Εν συντομία, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν βαθιά και εγχύθηκαν μέσω της αριστερής κοιλίας με 40 mL ισορροπημένου διαλύματος άλατος Hank (HBSS) που περιείχε Dynabeads (8 × 107, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Έγινε εκτομή του νεφρού

και κομμένο σε μικρά κομμάτια. Τα κύτταρα στη συνέχεια υπέστησαν πέψη με κολλαγενάση Α (1 mg/mL, Roche, Basel, Switzerland) και δεοξυριβονουκλεάση Ι (100 U/ml, Life Technologies) σε HBSS στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Το εναιώρημα που περιέχει τον χωνευμένο ιστό πιέστηκε απαλά μέσω ενός φίλτρου κυττάρων 100-mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας ένα πεπλατυσμένο γουδοχέρι. Το προκύπτον κυτταρικό εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 200 χ g για 5 λεπτά και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 2 ml HBSS. Σπειράματα που περιέχουν Dynabeads συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας έναν συμπυκνωτή μαγνητικών σωματιδίων (Life Technologies) και χρησιμοποιήθηκαν για απομόνωση RNA.

Αντίστροφη μεταγραφή και PCR σε πραγματικό χρόνοΟλικό RNA απομονώθηκε από σπειράματα χρησιμοποιώντας κιτ RNeasy (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Το cDNA συντέθηκε από ολικό RNA με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το ένζυμο ReverTra Ace ανάστροφης μεταγραφάσης (Toyobo, Osaka, Ιαπωνία) και τυχαίους εκκινητές dT (Promega). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου με κύριο μείγμα Brilliant III SYBR Green QPCR και Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Η έκφραση του σπειραματικού γονιδίου κανονικοποιήθηκε στην έκφραση του Actb. Τα χρησιμοποιούμενα ζεύγη εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 2.

Αντίστροφη μεταγραφή και PCR σε πραγματικό χρόνο με βάση το TaqManΤο συνολικό RNA, συμπεριλαμβανομένου του microRNA (miRNA) στα απομονωμένα σπειράματα, απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ miRNeasy (Qiagen). Οι εκκινητές RT μίσχου-βρόχου ειδικών για miRNA, η αντίστροφη μεταγραφάση, το ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφής, τα dNTPs και ο αναστολέας της RNase χρησιμοποιήθηκαν για την αντιστροφή της μεταγραφής του συνολικού RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Πραγματοποιήθηκε PCR σε πραγματικό χρόνο με το cDNA που προέκυψε χρησιμοποιώντας miR-21- ειδικούς εκκινητές TaqMan και ειδικούς ανιχνευτές (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) και Mx3000P (Agilent Technologies).

In vitro Θεραπεία Απομονωμένων Σπειραμάτων με ΜιμικάΤα σπειράματα απομονώθηκαν από ψευδοχειρουργημένα και UUOνεφράμετά από 11 ημέρες απόφραξης. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) μέσο (Fujifilm Wako, Ιαπωνία) που περιείχε 300 σπειράματα κατανεμήθηκε σε κάθε φρεάτιο μιας 96-πλάκας καλλιέργειας φρεατίων (TPP, Trasadingen, Ελβετία) και υποβλήθηκε σε θεραπεία με PBS, αρνητικό μάρτυρα και μίμηση miR-21 (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Νότια Κορέα) σε 1 pmol/μL για 4 ώρες στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2. Η έκφραση του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του μετρήθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσηςΓια ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης ρουτίνας (SEM), μικρόνεφρό φέτεςσταθεροποιήθηκαν με 2,5 τοις εκατό GTA για 4 ώρες και μετα-μονιμοποιήθηκαν με 1 τοις εκατό τετροξείδιο του οσμίου για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επεξεργασία με 1 τοις εκατό ταννικό οξύ για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με 1 τοις εκατό τετροξείδιο του οσμίου για 1 ώρα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0.5 τοις εκατό και 1 τοις εκατό ταννικό οξύ για 10 λεπτά και 1 ώρα, αντίστοιχα.Νεφρόφέτεςαφυδατώθηκαν με αύξουσες ποιότητες αλκοόλης, μεταφέρθηκαν σε 3-οξικό βουτυλεστέρα και τελικά ξηράνθηκαν με ξηραντήρα HCP-2 κρίσιμου σημείου (Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε διασκορπισμό ιόντων και στη συνέχεια εξετάστηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης S-4100 σε επιταχυνόμενη τάση 12 kV.

Στατιστική ανάλυσηΟι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (se). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ένα μη παραμετρικό Mann-Whitney U-test (P < 0.05).="" το="" τεστ="" kruskal-wallis="" χρησιμοποιήθηκε="" για="" τη="" σύγκριση="" τριών="" ή="" περισσότερων="" πληθυσμών="" και="" πραγματοποιήθηκαν="" πολλαπλές="" συγκρίσεις="" χρησιμοποιώντας="" τη="" μέθοδο="" του="" scheffe="" μόλις="" παρατηρήθηκαν="" σημαντικές="" διαφορές="" (p="">< 0.05).="" η="" συσχέτιση="" μεταξύ="" των="" δύο="" παραμέτρων="" αναλύθηκε="" χρησιμοποιώντας="" τη="" δοκιμή="" συντελεστή="" συσχέτισης="" κατάταξης="" του="" spearman="" (p=""><>

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

TILs και GLs στα Αποφρακτικά Νεφρά Νεαρών ΠοντικώνΑρχικά εξετάσαμε τα TILs και τα GLs σε νεφρούς που χειρουργήθηκαν ψευδώς και UUO νεαρών ποντικών που υποβλήθηκαν σε απόφραξη για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Ενώ οι ψευδοχειρουργημένοι νεφροί εμφάνισαν φυσιολογικό σωληναριστήριο (Εικόνα 1Α), οι αποφρακμένοι νεφροί μετά από 2 ημέρες UUO έδειξαν TILs και χαρακτηρίστηκαν από τη διάταση των σωληναρίων. μερικά σωληνάρια περιείχαν επίσης εκμαγεία ούρων. Τέτοιες βλάβες αυξάνονταν με την πρόοδο της απόφραξης (Εικόνα 1Α). Τα GLs, κυρίως σπειραματοσκλήρωση, παρατηρήθηκαν στο τελευταίο στάδιο στις 21 ημέρες μετά την UUO και χαρακτηρίστηκαν από την εναπόθεση θετικών στο περιοδικό οξύ-Schiff (PAS) υλικών. Η σπειραματική δομή ήταν φυσιολογική τόσο στους εικονικούς όσο και στους πρώιμους νεφρούς UUO (2, 7 και 11 ημέρες) (Εικόνα 1Β). Ο αριθμός των σπειραματικών κυττάρων είχε την τάση να αυξάνεται μέχρι την ημέρα-11 μετά την απόφραξη και έτεινε να μειώνεται την ημέρα-21 στους νεφρούς UUO (Εικόνα 1C). Η σπειραματική μεσαγγειακή συσσώρευση είχε την τάση να αυξάνεται από 7 ημέρες μετά την απόφραξη (Εικόνα 1D).

απουσίαζε στο κέντρο των σπειραμάτων των νεφρών UUO στις 21 ημέρες μετά την απόφραξη (Εικόνα 1ΣΤ). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αποκάλυψε μια σημαντική μείωση των PFMs (Nphs1 και Synpo) στους νεφρούς UUO 21 ημέρες μετά την απόφραξη (Εικόνα 1G). Επιπλέον, η ανάλυση SEM αποκάλυψε φυσιολογικές διεργασίες ποδοκυττάρου (PFPs) σε νεφρούς που χειρουργούνται ψευδώς. Ωστόσο, η εξάλειψη της PFP και οι δομές που μοιάζουν με μικρολάχνες αναφέρθηκαν σε νεφρούς UUO 21 ημέρες μετά την απόφραξη (Εικόνα 1Η). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την εμφάνιση τραυματισμού των ποδοκυττάρων στον αποφρακωμένο νεφρό 21 ημέρες μετά την απόφραξη.

Τα διηθητικά ανοσοκύτταρα απουσιάζουν στον αποφρακωμένο νεφρό Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων συσχετίζεται με τα διεισδυτικά ανοσοκύτταρα στο σπειράμα (13, 16, 18). Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τη διήθηση των Β- και Τ-κυττάρων καθώς και των μακροφάγων σε TIL και GL νεφρών ψευδοχειρουργούμενων και UUO (Εικόνα 2). Πολυάριθμα διεισδυτικά Β-, Τ-κύτταρα και μακροφάγοι παρατηρήθηκαν στα TIL των νεφρών UUO όλες τις ημέρες μετά την απόφραξη, αλλά ήταν σχεδόν απούσα ή λίγα στα σπειράματα τόσο των εικονικών όσο και των UUO νεφρών (Εικόνες 2A–E). Ο αριθμός των Β-, Τ-κυττάρων και των μακροφάγων ήταν πολύ λίγος στο σπείραμα (δεδομένα δεν φαίνονται) αλλά σημαντικά υψηλότερος στο

σωληναριστήριο των νεφρών 2-, 7-, 11- και 21-ημέρας σε σύγκριση με αυτό του εικονικού νεφρού (Εικόνα 2ΣΤ). Επομένως, τα διεισδυτικά ανοσοκύτταρα μπορεί να συμβάλλουν στην ανάπτυξη TILs στον αποφρακωμένο νεφρό. Ωστόσο, άλλοι παράγοντες μπορεί να σχετίζονται με την ανάπτυξη GL.

Έκφραση Διαφορετικών Μελών της Οικογένειας TLR και Κατάντη Κυτοκινών σε Ψευδοχειρουργημένους και Αποφρακμένους Νεφρούς Νεαρών Ποντικών Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει υψηλότερη έκφραση διαφορετικών TLRs σε ποδοκύτταρα ασθενών νεφρών (15, 16, 19, 20). Είναι ενδιαφέρον ότι τα δεδομένα μας αποκάλυψαν μια σημαντικά υψηλότερη έκφραση των Tlr8 και Tlr9 στα σπειράματα που απομονώθηκαν από την ομάδα ημερών UUO 21- από ότι στα σπειράματα της εικονικής ομάδας (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση των κατάντη κυτοκινών των μελών της οικογένειας TLR στα σπειράματα από εικονικές και UUO 21-ημέρες ομάδες και βρήκαμε σημαντική ανοδική ρύθμιση στην έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τόσο την ιντερλευκίνη 1 βήτα (Il1b) όσο και την ιντερλευκίνη 6 (Il6) στην ομάδα UUO σε σύγκριση με εκείνη στην εικονική ομάδα (Εικόνα 3Β).

Το TLR8 συνεντοπίστηκε με PFM Καθώς η έκφραση των Tlr8 και Tlr9 ήταν υψηλή στα σπειράματα που απομονώθηκαν από τον αποφρακωμένο νεφρό, εξετάσαμε τον εντοπισμό τους με χρώση ανοσοφθορισμού. Η πρωτεΐνη TLR8 δεν ανιχνεύθηκε σε ψευδοχειρουργημένους νεφρούς (Εικόνα 4Α) αλλά εντοπίστηκε με τη συναπτοποδίνη PFM στον νεφρό UUO (Εικόνα 4Β). Επιπλέον, δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης TLR9 στο νεφρό είτε από ποντίκια που χειρουργήθηκαν ψευδώς είτε από ποντίκια UUO (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Παραγωγή IL1b από ποδοκύτταρα στον αποφρακωμένο νεφρό νεαρών ποντικών Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η έκφραση της σπειραματικής Il1b (μιας κατάντη κυτοκίνης της οικογένειας TLR) ήταν σημαντικά υψηλότερη στον νεφρό UUO στις 21 ημέρες από εκείνη στον ψευδή νεφρό. Επομένως, εξετάσαμε την πηγή της IL1b στα σπειράματα των νεφρών UUO με χρώση ανοσοφθορισμού. Η έκφραση της πρωτεΐνης IL1b δεν ανιχνεύθηκε στα σπειράματα των ψευδών νεφρών, αλλά παρατηρήθηκε στα σπειράματα των νεφρών UUO (Εικόνες 4C, D). Επιπλέον, η IL1b εντοπίστηκε με PFM podocin (Εικόνα 4D).

στο UUOνεφρόστις 21 ημέρες από αυτή στην απάτηνεφρό.Επομένως, εξετάσαμε την πηγή της IL1b στα σπειράματα των νεφρών UUO με χρώση ανοσοφθορισμού. Η έκφραση της πρωτεΐνης IL1b δεν ανιχνεύθηκε στα σπειράματα του εικονικούνεφράαλλά παρατηρήθηκε στα σπειράματα του UUOνεφρά(Εικόνες 4Γ, Δ). Επιπλέον, η IL1b εντοπίστηκε με PFM podocin (Εικόνα 4D).

Αυξημένο επίπεδο του πιθανού ενδογενούς προσδέματος Tlr8 σε ποντίκια μοντέλου ON Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το miR-21 χρησιμεύει ως πρόσδεμα για το TLR8 (21). Επομένως, συγκρίναμε τόσο τα σπειραματικά επίπεδα όσο και τα επίπεδα του miR στον ορό μεταξύ της εικονικής και της ομάδας UUO 21-ημέρας. Είναι ενδιαφέρον ότι η ομάδα UUO 21-ημέρας έδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σπειραματικού miR-21 από ότι στην ψευδή ομάδα (P < 0.05),="" ωστόσο,="" αυξανόμενη="" τάση="" mir="" ορού{="" {10}}="" παρατηρήθηκε="" στην="" πρώτη="" ομάδα="" σε="" σχέση="" με="" την="" δεύτερη="" (p="0.06)" (εικόνα="">

Συσχέτιση της έκφρασης Tlr8 με τον συνδέτη του miR-21 και τα PFM στο εμπόδιοΝεφρόΌπως φαίνεται στον Πίνακα 3, παρατηρήσαμε μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ της σπειραματικής έκφρασης του Tlr8 mRNA και του ενδογενούς συνδέτη του (miR-21) καθώς και των κατάντη κυτοκινών Il1b και Il6. Από την άλλη πλευρά, ήταν εμφανής μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ του mRNA Tlr8 και των PFM Nphs1 και Synpo.

In vitro διέγερση σπειραμάτων με miR{{0}} Μίμηση Ενεργοποιεί την έκφραση του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του Η έκφραση του Tlr8 είχε την τάση να αυξάνεται (P=0.06) αλλά οι κατάντη κυτοκίνες του (Ifng και Il1b) αυξήθηκαν σημαντικά (P <0,05 και 0,01) στα σπειράματα των ψευδών ποντικών μετά

θεραπεία με μίμηση miR-21 σε σύγκριση με αυτή στα σπειράματα ποντικών που έλαβαν θεραπεία με PBS και μιμητικό αρνητικό μάρτυρα (Εικόνα 5Α). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του στα σπειράματα ψευδών ποντικών μετά από θεραπεία με μιμητές (Πίνακας 4). Η έκφραση του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του ήταν σημαντικά υψηλότερη στα σπειράματα του UUOνεφρά, μετά από θεραπεία με μίμηση miR-21 από αυτά στα σπειράματα του UUOνεφράυποβλήθηκε σε επεξεργασία με PBS και μιμητικό αρνητικό μάρτυρα (Εικόνα 5Β). Ανιχνεύτηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του στα σπειράματα των νεφρών UUO μετά από θεραπεία με μιμητικά, ενδεικτική της υψηλότερης ενεργοποίησης του μονοπατιού του πυρηνικού παράγοντα κάπα Β (NF-kB) με τη μεσολάβηση Tlr8- και έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών στον αποφραγμένο νεφρό (Πίνακας 4).

Εντοπισμός TLR8 και τραυματισμός των ποδοκυττάρων στους παράπλευρους νεφρούς νεαρών ποντικώνΟι ψευδοχειρουργημένοι νεφροί έδειξαν φυσιολογικό σπειράμα, ενώ οι παράπλευροι νεφροί είχαν σπειραματική υπερτροφία, αυξημένο αριθμό σπειραματικών κυττάρων και διαστολή των σπειραματικών τριχοειδών αγγείων (Εικόνα 6Α). Τα σπειράματα από ψευδοχειρουργημένους νεφρούς ήταν θετικά για έκφραση συναπτοποδίνης και δεν είχαν έκφραση TLR8 (Εικόνα 6Β). Από την άλλη πλευρά, οι παράπλευροι νεφροί έχασαν την έκφραση της συναπτοποδίνης στο κέντρο των σπειραμάτων αλλά έδειξαν έκφραση TLR8 κατά μήκος του σπειραματικού ρυθμού (Εικόνα 6C). Επιπλέον, η πρωτεΐνη TLR8 συνεντοπίστηκε με συναπτοποδίνη (Εικόνα 6C). Οι ψευδοχειρουργημένοι νεφροί έδειξαν φυσιολογική έκφραση της ποδοκίνης αλλά όχι έκφραση της IL1b στα σπειράματα (Εικόνα 6D). Ωστόσο, τα σπειράματα εντός του παράπλευρου νεφρού έχασαν την έκφραση της ποδοκίνης στο κέντρο αλλά είχαν έκφραση IL1b κατά μήκος του σπειραματικού ρυθμού (Εικόνα 6Ε). Περαιτέρω, η πρωτεΐνη IL1b εντοπίστηκε με ποδοκίνη (Εικόνα 6Ε). Η ανάλυση SEM αποκάλυψε φυσιολογικούς PFP σε νεφρούς ποντικού που χειρουργήθηκαν ψευδώς, αλλά η εξάλειψη της PFP και οι δομές που μοιάζουν με μικρολάχνες ήταν ορατές στους παράπλευρους νεφρούς (Εικόνα 6F).

Εντοπισμός TLR8 και Τραυματισμός Ποδοκυττάρων στους Αποφραμένους και Παράπλευρους Νεφρούς Ηλικιωμένων ΠοντικώνΟι ψευδοχειρουργημένοι νεφροί έδειξαν φυσιολογική έκφραση της συναπτοποδίνης αλλά δεν αποκάλυψαν χρώση για την πρωτεΐνη TLR8 στα σπειράματά τους (Εικόνα 7Α). Είναι ενδιαφέρον ότι τόσο οι παράπλευροι νεφροί όσο και οι νεφροί UUO έδειξαν απώλεια έκφρασης συναπτοποδίνης στο κέντρο των σπειραμάτων, αλλά διατήρησαν την έκφραση TLR8 κατά μήκος του σπειραματικού ιστού (Εικόνες 7Β, Γ). Η πρωτεΐνη TLR8 εντοπίστηκε με συναπτοποδίνη στους παράπλευρους και UUO νεφρούς (Εικόνες 7Β, C). Οι ψευδοχειρουργημένοι νεφροί παρουσίασαν ομοίως φυσιολογική έκφραση ποδοκίνης αλλά δεν είχαν έκφραση IL1b στα σπειράματά τους (Εικόνα 7D). Από την άλλη πλευρά, τόσο οι παράπλευροι νεφροί όσο και οι νεφροί UUO έχασαν την έκφραση της ποδοκίνης στο κέντρο των σπειραμάτων αλλά εμφάνισαν έκφραση IL1b κατά μήκος του σπειραματικού τμήματος (Εικόνες 7Ε, ΣΤ). Η θετική χρώση βρέθηκε ότι εντοπίζεται με ποδοκίνη στα σπειράματα των παράπλευρων νεφρών και της UUO (Εικόνες 7Ε, ΣΤ). Η εξέταση SEM αποκάλυψε φυσιολογικά PFP σε νεφρούς ποντικιού που χειρουργήθηκαν ψευδώς, εξάλειψη PFP και δομές που μοιάζουν με μικρολάχνες τόσο στους παράπλευρους όσο και στους UUO νεφρούς των ηλικιωμένων ποντικών (Εικόνα 7G).

ΣΥΖΗΤΗΣΗΕΠΙ

Ο επιπολασμός είναι συχνός σε βρέφη καθώς και σε ηλικιωμένα άτομα (4-7). Ως εκ τούτου, υποβάλαμε νεαρά και ηλικιωμένα ποντίκια σε UUO για να μιμηθούν την κατάσταση ON ατόμων διαφορετικών ηλικιακών ομάδων και εξετάσαμε TILs και GLs. Στον αποφρακωμένο νεφρό, η εξέλιξη των TILs ήταν εμφανής σε προγενέστερο στάδιο απόφραξης (2 ημέρες). Ωστόσο, η εξέλιξη των GLs μαζί με τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων παρατηρήθηκε σε μεταγενέστερο στάδιο. Ο παράπλευρος νεφρός παρουσίασε GLs και τραυματισμό των ποδοκυττάρων ταυτόχρονα. Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι ο τραυματισμός των ποδοκυττάρων εμφανίζεται τόσο στους αποφραγμένους όσο και στους παράπλευρους νεφρούς, αν και η αρχική προσβολή μπορεί να ποικίλλει. Οι προηγούμενες μελέτες μας έχουν επισημάνει τη συσχέτιση μεταξύ της βλάβης των ποδοκυττάρων και της διήθησης των ανοσοκυττάρων στο σπειράμα (13, 16, 18). Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη δεν παρατηρήθηκε διήθηση ανοσοκυττάρων στα σπειράματα είτε ψευδών είτε αποφραγμένων νεφρών. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τη συμμετοχή άλλων παραγόντων στη βλάβη των ποδοκυττάρων στον αποφρακωμένο νεφρό. Υποθέσαμε ότι τα σήματα κινδύνου (DAMPs ή PAMP), είτε κυκλοφορικής προέλευσης είτε που προέρχονται από κατεστραμμένο σωληναριακό επιθήλιο, μπορεί να συμβάλλουν στον τραυματισμό των ποδοκυττάρων στο ΟΝ, λόγω της μοναδικής του θέσης στο σπειράμα. Είναι σημαντικό ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ DAMPs και TLRs έχει αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των μη μολυσματικών ασθενειών (15). Διαφορετικά μέλη της οικογένειας TLR εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη πλάσματος ή στα ενδοκυτταρικά κυστίδια (22) και χαρακτηρίζονται ως έμφυτοι ανοσολογικοί αισθητήρες που αναγνωρίζουν αποτελεσματικά τα DAMP ή τα PAMP. Μετά την ενεργοποίηση από τα αντίστοιχα DAMP ή PAMP, τα TLR ενίσχυσαν την έκφραση των κατάντη κυτοκινών μέσω της οδού NF-kB και προκάλεσαν το αμυντικό σύστημα του ξενιστή (22). Επιπλέον, τα DAMP αναμεταδίδουν την παρουσία τραυματισμού ιστού σε κύτταρα του ανοσοποιητικού ή τοπικά εγγενή κύτταρα, και κατά συνέπεια επιδεινώνουν τη βλάβη των ιστών (23-26). Είναι σημαντικό ότι όλα τα TLR ενεργοποιούν την οδό NF-kB που ελέγχει την έκφραση μιας σειράς φλεγμονωδών γονιδίων κυτοκίνης (27). Επιπλέον, η ενεργοποίηση των TLR σηματοδοτεί τις κατάντη οδούς τους για να ενεργοποιήσουν το NF-kB, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη φλεγμονή και συνδέεται με την παθογένεση των κατεστραμμένων ιστών (28). Οι Shichita et al. αποκάλυψε τις παθολογικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενδογενών προσδεμάτων και των TLR2 ή TLR4, οι οποίες συμβάλλουν στην ισχαιμική εγκεφαλική βλάβη (25). Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης δείξει την ικανότητα των μελών της οικογένειας TLR να επάγουν TILs στους νεφρούς (TLR2, 4, 5, 7, και 11) και GLs (TLR1–6, 8, και 9) (17, 29–33 ). Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε τραυματισμό των ποδοκυττάρων σε αποφρακμένους και παράπλευρους νεφρούς και διευκρινίσαμε το

ρόλους διαφορετικών μελών της οικογένειας TLR που μπορεί να συμβάλλουν στον τραυματισμό των ποδοκυττάρων (15, 16, 19, 20). Όπως υποθέσαμε, η σπειραματική έκφραση των Tlr8 και Tlr9 ήταν υψηλότερη στα σπειράματα που απομονώθηκαν από το νεφρό UUO από ό,τι σε αυτά από ποντίκια που χειρουργήθηκαν ψευδώς. Επιπλέον, η σπειραματική έκφραση των φλεγμονωδών κυτοκινών που σχετίζονται με την οδό NF-kB, συμπεριλαμβανομένων των Il1b και Il6, ήταν υψηλότερη στον νεφρό UUO στις 21 ημέρες μετά την απόφραξη. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η οδός NF-kB με τη μεσολάβηση TLR παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της GL στον αποφρακτικό νεφρό. Σε αντίθεση με άλλα μέλη της οικογένειας TLR, τα TLR8 και TLR9 ανιχνεύονται στα ενδοσώματα των κυττάρων. Το TLR8 αναγνωρίζει μονόκλωνα RNA και βραχέα δίκλωνα RNA από μικροοργανισμούς και ενεργοποιεί την παραγωγή αρκετών κυτοκινών που διαμεσολαβούνται από NF-kB (22). Από την άλλη πλευρά, το TLR9 αναγνωρίζει δίκλωνα DNA και ενεργοποιεί το μονοπάτι NF-kB για την παραγωγή κυτοκινών κατάντη (16, 34). Σε αυτή τη μελέτη, αναγνωρίσαμε μόνο τον εντοπισμό της πρωτεΐνης TLR8 μαζί με τη συναπτοποδίνη PFM στα σπειράματα. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν επίσης ότι τόσο το TLR8 όσο και το TLR9 συνεντοπίζονται με PFMs και ενεργοποιούν την προκαλούμενη από NF-kB φλεγμονώδη παραγωγή κυτοκίνης για να προκαλέσουν τραυματισμό των ποδοκυττάρων (15, 16). Επιπλέον, άλλες μελέτες έχουν δείξει την παθολογική συσχέτιση μεταξύ των διαμεσολαβούμενων από TLR μονοπατιών και της βλάβης των ποδοκυττάρων in vitro (34, 35). Banas et al. αποκάλυψε την αλληλεπίδραση του TLR4 στα ποδοκύτταρα με το ανοσοποιητικό σύστημα κατά την ανάπτυξη της GL (35). Έτσι, τα ποδοκύτταρα μπορεί να συμβάλλουν στην ανοσολογική επιτήρηση μέσω των οδών που διαμεσολαβούνται από το TLR. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε τόσο την έκφραση του γονιδίου TLR8 όσο και τον εντοπισμό της πρωτεΐνης στα ποδοκύτταρα του αποφραγμένου νεφρού καθώς και την υψηλότερη έκφραση των κατάντη κυτοκινών στο σπείραμα. Ως εκ τούτου, συμπεραίνουμε ότι τα μονοπάτια με τη μεσολάβηση του TLR8-συμβάλλουν στην ανάπτυξη της GL μέσω τραυματισμού των ποδοκυττάρων στον αποφρακωμένο νεφρό.

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το miR-21, ένας ενδογενής συνδέτης του TLR8, μπορεί να φτάσει και να συνδεθεί με τον TLR8 σε κυτταρικά ενδοσώματα, όπου μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση της οδού NFkB με τη μεσολάβηση TLR8- και έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών (21). Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σπειραματικού miR-21 καθώς και αυξημένα επίπεδα miR ορού-21 στον νεφρό UUO από εκείνα στους εικονικούς ελέγχους και καταδείξαμε τη συσχέτισή του με τη σπειραματική έκφραση του Tlr8 . Είναι ενδιαφέρον ότι τα σπειράματα από τους νεφρούς UUO που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μίμηση miR-21 έδειξαν υψηλότερη έκφραση του Tlr8 και των κατάντη κυτοκινών του σε σύγκριση με εκείνα στα σπειράματα από εικονικά ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μίμηση miR{10}}, υποδεικνύοντας αυξημένη διαθεσιμότητα ενδογενούς miR -21 από κατεστραμμένους ιστούς στον αποφραγμένο νεφρό και την ενεργοποίηση της υπερέκφρασης του Tlr8 στους νεφρούς UUO σε σύγκριση με αυτή ενός εικονικού. Μαζί, συμπεραίνουμε ότι ένας μεγαλύτερος όγκος miR-21 στον αποφρακωμένο νεφρό φθάνει στα ενδοσώματα στα ποδοκύτταρα και επάγει την ενεργοποίηση της οδού NF-kB με τη μεσολάβηση Tlr8- και την έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών. Αυτές οι κυτοκίνες, με τη σειρά τους, συμμετέχουν στην ανάπτυξη της GL μέσω τραυματισμού των ποδοκυττάρων.

Η IL1b είναι μία από τις σημαντικές κατάντη κυτοκίνες της οδού NF-kB, που παράγεται κυρίως από τα ποδοκύτταρα στο σπείραμα υπό συνθήκες ασθένειας. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η IL1b προκαλεί τραυματισμό των ποδοκυττάρων μειώνοντας τα PFM (36, 37). Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε υψηλότερη σπειραματική έκφραση της Il1b και εντοπισμό της με PFMs, τα οποία εμφάνισαν μειωμένη έκφραση. Επιπλέον, η σπειραματική έκφραση του Il1b συσχετίστηκε με το Tlr8 και έτεινε να συσχετίζεται με την έκφραση των PFMs (Nphs1 και Synpo). Επομένως, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι παράγοντες κατάντη του Tlr8, συμπεριλαμβανομένων των Il1b και Il6, μπορεί να προκαλέσουν τραυματισμό των ποδοκυττάρων στον αποφρακωμένο νεφρό μειώνοντας την έκφραση PFM.

Οι παράπλευροι νεφροί νεαρών ποντικών παρουσίασαν επίσης GLs και απώλεια PFM. Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε από το SEM, το οποίο αποκάλυψε τραυματισμό των ποδοκυττάρων στον παράπλευρο νεφρό. Βρήκαμε επίσης υψηλότερα επίπεδα miR στον ορό-21 στο μοντέλο ποντικιού ON. Επιπλέον, η πρωτεΐνη IL1b συνεντοπίστηκε με PFM. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το miR-21 του ορού αλληλεπιδρά με το TLR8 στα ποδοκύτταρα του παράπλευρου νεφρού και ενεργοποιεί την παραγωγή των κατάντη κυτοκινών, η οποία με τη σειρά της μειώνει τη λειτουργία των ποδοκυττάρων και τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων. Παρατηρήθηκε επίσης τραυματισμός των ποδοκυττάρων στους αποφραγμένους και παράπλευρους νεφρούς των ηλικιωμένων ποντικών μέσω ενός μηχανισμού παρόμοιου με αυτόν που παρατηρήθηκε σε νεαρά ποντίκια.

Συμπερασματικά (Εικόνα 8), η σπειραματική έκφραση miR-21 είναι αυξημένη μετά από μονόπλευρη απόφραξη του ουρητήρα, όπου αλληλεπιδρά με το TLR8 στα ποδοκύτταρα και προκαλεί την παραγωγή κατάντη κυτοκινών (Il1b και Il6) υποδηλώνοντας ενεργοποίηση της οδού NF-kB. Τα υψηλότερα επίπεδα κυτοκινών μειώνουν τα PFM, με αποτέλεσμα τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων και την επακόλουθη ανάπτυξη των GL. Τα αυξημένα επίπεδα miR στον ορό-21 ενεργοποιούν το TLR8 στα ποδοκύτταρα του παράπλευρου νεφρού και επάγουν GL μέσω τραυματισμού των ποδοκυττάρων. Επομένως, αυτή η μελέτη δείχνει ξεκάθαρα την ανάπτυξη GL σε αποφρακμένους και παράπλευρους νεφρούς μέσω τραυματισμού των ποδοκυττάρων μετά από υπερέκφραση Tlr8.