Μέρος 1: Η γερανιόλη βελτιώνει τον νεφρικό τραυματισμό που προκαλείται από τη δοξορουβικίνη μέσω αλλαγής της αντιοξειδωτικής κατάστασης, της φλεγμονής και της απόπτωσης: πιθανοί ρόλοι του NF-kB και του Nrf2/Ho-1

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: Μεσολαβούμενη από δοξορουβικίνηνεφρική δυσλειτουργίαείναι ένα σοβαρό πρόβλημα στη θεραπεία του καρκίνου. Συνεπώς, αυτή η εργασία διερεύνησε την ικανότητα της γερανιόλης να ρυθμίζει την επαγόμενη από τη δοξορουβικίνηνεφρική βλάβηχρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αρουραίου. Οι αρουραίοι κατανεμήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες: έλεγχος, δοξορουβικίνη (20 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή, ενδοπεριτοναϊκή), δοξορουβικίνη συν 100 mg/kg γερανιόλης και δοξορουβικίνη συν 200 mg/kg γερανιόλης. Μια εφάπαξ ένεση δοξορουβικίνης πυροδότησε νεφρική δυσλειτουργία, όπως αποδεικνύεται από τις αλλοιωμένες τιμές κρεατινίνης ορού, αζώτου ουρίας αίματος και λευκωματίνης. προκάλεσε επίσης ιστολογικές αλλαγές στην αρχιτεκτονική των νεφρών. Επιπλέον, η δοξορουβικίνη ενίσχυσε την υπεροξείδωση των λιπιδίων ενώ μείωσε τη μειωμένη δραστηριότητα της γλουταθειόνης, της καταλάσης και την έκφραση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης και της δισμουτάσης του υπεροξειδίου. Είναι ενδιαφέρον ότι η προ-θεραπεία με γερανιόλη διέσωσε τις επαγόμενες από τη δοξορουβικίνη αλλοιώσεις στις αντιοξειδωτικές παραμέτρους των νεφρών, την ενζυματική δραστηριότητα και την έκφραση φλεγμονωδών και μεσολαβούντων στην απόπτωση γονιδίων και πρωτεϊνών. Επιπλέον, η προφυλακτική θεραπεία με γερανιόλη διατήρησε τα περισσότερα ιστολογικά χαρακτηριστικά των νεφρών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η γερανιόλη θα μπορούσε να προστατεύσει από τη μεσολάβηση της δοξορουβικίνηςνεφρική δυσλειτουργία. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να αποσαφηνιστούν οι μηχανισμοί των προστατευτικών επιδράσεων της γερανιόλης έναντι της νεφρικής δυσλειτουργίας που προκαλείται από τη δοξορουβικίνη.

Λέξεις-κλειδιά: δοξορουβικίνη; φλεγμονή; οξειδωτικό στρες? απόπτωση; νεφρική βλάβη? geraniol

1. Εισαγωγή

Από την ανακάλυψή του, το αντικαρκινικό φάρμακο ανθρακυκλίνης doxorubicin (Dox) έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς κατά των συμπαγών όγκων και των αιματολογικών κακοηθειών. Μεταξύ των πιο συχνών παρενεργειών του είναι η νεφροτοξικότητα, που περιγράφεται ως νεφρική δυσλειτουργία με μειωμένη διήθηση, επαναρρόφηση και απέκκριση, η οποία σχετίζεται με σημαντικό κίνδυνο νοσηρότητας και θνησιμότητας. Περίπου το 60 τοις εκατό των καρκινοπαθών που λαμβάνουν χημειοθεραπεία αναπτύσσουν νεφροτοξικότητα, περιορίζοντας τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του Dox[5,6]. Ενώ οι θεμελιώδεις διεργασίες που προκαλούν νεφροτοξικότητα με τη μεσολάβηση Dox παραμένουν άγνωστες, η βιβλιογραφία προτείνει ότι οι πιθανοί συνεισφέροντες περιλαμβάνουνοξειδωτικό στρες, φλεγμονή, καιαπόπτωση. Ειδικότερα, τα στοιχεία δείχνουν ότι η μείωση που σχετίζεται με το Doxοξειδωτικό στρες, φλεγμονή, και τα αποπτωτικά συμβάντα μπορεί να βοηθήσουν στη μείωση της νεφρικής τοξικότητας του φαρμάκου.

Ο πυρηνικός παράγοντας (προερχόμενος από ερυθροειδές 2)-όπως 2 (Nrf2) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ευαίσθητος στην οξειδοαναγωγή με αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και κυτταροπροστατευτικές ικανότητες που συντηρούν τα κυτταρικά αμυντικά συστήματα. Κατά το οξειδωτικό στρες, το Nrf2 απελευθερώνει την κυτταροπλασματική αναστολή της πρωτεΐνης, η οποία εισέρχεται στον πυρήνα και ενεργοποιεί αρκετά γονίδια που εμπλέκονται στην αντιοξειδωτική άμυνα, όπως η οξυγενάση της αίμης-1(Ho-1), η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx), η καταλάση ( CAT) και υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) [14-19]. Η θεραπεία με Dox έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τόσο τις εκφράσεις του mRNA όσο και των πρωτεϊνών του Nrf2 και, ως εκ τούτου, εκείνη των κατάντη αντιοξειδωτικών γονιδίων και πρωτεϊνών, οδηγώντας σε τοξικότητα των νεφρών.

Ο πυρηνικός παράγοντας-kB (NF-kB) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την έκφραση πολλών φλεγμονωδών γονιδίων. Ως το κεντρικό σχήμα του μονοπατιού NF-kB, το οποίο ενεργοποιείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), μπορεί να προκαλέσει φλεγμονώδη απόκριση και επακόλουθο τραυματισμό ιστού [8,22,23]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το Dox προκαλεί φλεγμονή και αυξάνει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως η ιντερλευκίνη-6(IL-6), η ιντερλευκίνη-1 βήτα (L-1 ), και παράγοντας νέκρωσης όγκου-άλφα(TNF-)[11,13]. Επιπλέον, η αυξημένη παραγωγή ROS μετά από νεφρική βλάβη που προκαλείται από το Dox έχει αποδειχθεί ότι παίζει βασικό ρόλο στην ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικής οδού μέσω της μιτοχονδριακής αστάθειας. Βασικοί καθοριστικοί παράγοντες αυτής της οδού είναι οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με τα μιτοχόνδρια Bax και Bcl-2. μια ισορροπημένη αναλογία Bcl-2 προς Bax αποτρέπει την απόπτωση, ενώ η ανισορροπία οδηγεί σε αυξημένη διαπερατότητα της μεμβράνης και διαρροή του κυτοχρώματος c στο κυτοσόλιο, το οποίο ενεργοποιεί την κασπάση-9(Casp-9) και την κασπάση{ {21}} (Casp-3). Μια τέτοια ενεργοποίηση γενικά οδηγεί σε κατακερματισμό του DNA και κυτταρικό θάνατο.

Έχει μεγάλο ενδιαφέρον η μεγιστοποίηση της κλινικής χρήσης των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων με ταυτόχρονη ελαχιστοποίηση των αρνητικών επιπτώσεών τους. Αντίστοιχα, έχουν γίνει ερευνητικές προσπάθειες για τη διερεύνηση της χρήσης διαφόρων παραγόντων σε συνδυασμό με το Dox για τη βελτίωση των δυσμενών επιπτώσεών του [13,30,31]. Τα φυτικά εκχυλίσματα και τα βιοενεργά συστατικά τους έχουν αναγνωριστεί από καιρό για την ικανότητά τους να μειώνουν την τοξικότητα που προκαλείται από φάρμακα. Η γερανιόλη είναι άκυκλη μονοτερπενική αλκοόλη που βρίσκεται σχεδόν σε όλα τα αιθέρια έλαια, όπως αυτά από τζίντζερ, τριαντάφυλλο, πορτοκάλι, λεβάντα και λεμόνι [32,33]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η γερανιόλη έχει διάφορες ευεργετικές ιδιότητες, όπως κατά του έλκους, αντικαρκινικό [35], αντικαταθλιπτικό [36], αντιφλεγμονώδες [33] και, επιπλέον, μπορεί να ανακουφίσει τη διαβητική νεφροπάθεια [37] .

Από όσο γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν επί του παρόντος συγκεκριμένες πληροφορίες σχετικά με τις προληπτικές επιδράσεις της γερανιόλης έναντι της νεφροτοξικότητας που προκαλείται από το Dox. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε τα αποτελέσματα και τους πιθανούς μηχανισμούς της δράσης της γερανιόλης στον τραυματισμό που προκαλείται από το Dox μέσω των οδών σηματοδότησης NF-kB και Nrf2/Ho-1 στους νεφρούς των αρουραίων Wistar.

2. Υλικό και Μέθοδοι

2.1.Ζώα

Οι αρσενικοί αρουραίοι Wistar προμηθεύτηκαν από το κέντρο φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου King Saud (KSU) στο Ριάντ της Σαουδικής Αραβίας. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε ελεγχόμενες συνθήκες, όπως διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (25 ± 1 βαθμός) με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών και είχαν απεριόριστη πρόσβαση στο νερό και μια τυπική δίαιτα, όπως εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Τοπικής Ιδρυματικής Μελέτης του KSU (REC) με αριθμό εξουσιοδότησης KSU-SE-19-122.

2.2. Πειραματικό σχέδιο

Αυτή η έρευνα εξέτασε συνολικά 32 αρσενικούς αρουραίους Wistar βάρους 190-210 g, που κατανεμήθηκαν σε τέσσερις ομάδες. Στους αρουραίους δόθηκε μια εβδομάδα για να προσαρμοστούν στο περιβάλλον πριν από τη μελέτη. Η ομάδα φορέα, επίσης γνωστή ως ομάδα ελέγχου, αποτελούνταν από αρουραίους στους οποίους δόθηκε από του στόματος σκεύασμα φυσιολογικού ορού. Η ομάδα II αποτελούνταν από αρουραίους που έλαβαν Dox (20 mg/kg ενδοπεριτοναϊκή εφάπαξ δόση) την ημέρα 17 [11]. Στους αρουραίους της ομάδας Ⅲ Ι και IV δόθηκαν προφυλακτικές δόσεις γερανιόλης (από το στόμα) στα 100 και 200 ​​mg/kg, αντίστοιχα, για 18 ημέρες, και την ημέρα 17 υποβλήθηκαν, ομοίως, σε Dox (20 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή). Την ημέρα 18, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία χρησιμοποιώντας συνδυασμό κεταμίνης/ξυλαζίνης σε ελεγχόμενο περιβάλλον. Το αίμα συλλέχθηκε και απομονώθηκε ορός και αφαιρέθηκαν και οι δύο νεφροί και καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο. Πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές, γονιδιακές και πρωτεϊνικές δοκιμασίες έκφρασης στους κατεψυγμένους ιστούς. Για ιστολογική εξέταση, δείγματα ιστού νεφρού πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό. Καθ' όλη τη διάρκεια της έρευνας, δεν υπήρξε καμία ένδειξη αγωνίας ή θανάτου σε πειραματόζωο.

2.3. Προσδιορισμός δεικτών νεφρικής λειτουργίας

Για να απομονωθεί ο ορός από το αίμα που συλλέχθηκε τη στιγμή της θυσίας, δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 2000 × g σε προψυγμένο φυγόκεντρο. Ο ορός που ελήφθη στη συνέχεια αναλύθηκε για να ποσοτικοποιηθεί η λευκωματίνη, το άζωτο ουρίας αίματος (BUN) και η κρεατινίνη. Αξίες τουνεφρική λειτουργίαΟι δείκτες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, USA.

2.4.Εποτίμηση Υπεροξείδωσης Λιπιδίων

Η υπεροξείδωση των λιπιδίων αξιολογήθηκε στους ιστούς των νεφρών όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Ohkawa et al., με ελαφρές τροποποιήσεις.

2.5. Ποσοτικοποίηση μειωμένης γλουταθειόνης

Τα επίπεδα ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) στο νεφρικό μετα-μιτοχονδριακό υπερκείμενο υγρό (PMS) μετρήθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Sedlak και Lindsay, με μικρές τροποποιήσεις.

2.6. Ποσοτικοποίηση της Δραστικότητας της Καταλάσης

Η δραστικότητα της CAT στο νεφρικό PMS προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Claiborne, με μικρή τροποποίηση.

2.7. Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης (RT-qPCR)

Το TRIZolTMreagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή του συνολικού RNA από τους ιστούς των νεφρών σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα και η ποσότητα των εκχυλισμένων δειγμάτων RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, USA). Το απομονωμένο RNA στη συνέχεια μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, USA) και η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, USA) στο Applied Biosystems 7500 Fast Real- Σύστημα Time PCR. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η προσέγγιση AACt για τον προσδιορισμό της σχετικής έκφρασης διαφόρων γονιδίων μεταξύ των ομάδων, με το GAPDH να χρησιμοποιείται ως το γονίδιο της οικιακής φροντίδας. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τις αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (IDT, Leuven, Βέλγιο).

2.8. Ανάλυση ανοσοστυπώματος

Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη όπως περιγράφεται από τους Alasmari et al. [41]. Εν συντομία, οι απομονωμένες πρωτεΐνες (30-50 ug) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά από αποκλεισμό με 5 τοις εκατό ξηρό γάλα χωρίς λιπαρά για 60 λεπτά, οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς με εκλεκτικά πρωτογενή αντισώματα (κατά Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, σχισμένη κασπάση{{ 14}}, Bcl-2, Bax και GAPDH, αραίωση 1:1000). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν, στη συνέχεια επωάστηκαν για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με κατάλληλα συζευγμένα με HRP δευτερεύοντα αντισώματα (αραίωση: 1:5000). Το κιτ αντιδραστηρίων ECL και ο εξοπλισμός απεικόνισης γέλης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της παρουσίας πρωτεϊνών στη μεμβράνη.

2.9.Ιστοπαθολογικές Μελέτες

Οι ιστοί των νεφρών στερεώθηκαν εκ των υστέρων σε φορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τομή και χρώση παραφίνης. Χρησιμοποιήθηκε μικροτόμος για την κοπή τμημάτων παραφίνης σε πάχος 3 μm. Τα κομμένα τμήματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την απομάκρυνση του κεριού και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας χρωστική αιματοξυλίνη συν ηωσίνη (Η&Ε) για ιστοπαθολογική εξέταση. Οι ιστολογικές εικόνες των νεφρών ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια κάμερα DP72 συνδεδεμένη με ένα μικροσκόπιο Olympus BX.

2.10.Ανάλυση Δεδομένων

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα που βασίζεται σε υπολογιστή Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, USA) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις (μέσος όρος± SD). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη συγκριτική δοκιμή του Tukey, με τιμή p μικρότερη από 0.05 που δείχνει στατιστική σημαντικότητα (p<>