ΜΕΡΟΣ Ⅰ: Η φλεγμονώδης διαδικασία ρυθμίζει την έκφραση και τον εντοπισμό του WT1 στα ποδοκύτταρα που οδηγεί σε νεφρική βλάβη
Mar 23, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Εισαγωγή
Γονίδιο του όγκου του Wilm-1(WTI) είναι ένα από τα κύρια γονίδια που εμπλέκονται στην επιβίωση των ποδοκυττάρων και στην αναποτελεσματική νεφρική διήθηση. Οι φλεγμονώδεις διεργασίες οδηγούν σενεφρόαποτυχίακαι αυτό μπορεί να συμβεί μέσω διαμόρφωσης του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1). WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) κωδικοποιεί έναν παράγοντα μεταγραφής, μια πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που έχει τέσσερις κύριες ισομορφές με εναλλακτικό μάτισμα στο εξόνιο 5(17AA±) και το εξόνιο 9(KTS±)(1). Το KTS-ισόμορφο έχει υψηλότερη συγγένεια για το DNA, το KTS plus συνεντοπίζεται με πρωτεΐνες ματίσματος στο κυτταρόπλασμα (2, 3). WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) παίζει καθοριστικό ρόλο στην εμβρυογένεση, κυρίως στη γοναδική καινεφρόανάπτυξη; στους ενήλικες, η έκφρασή του περιορίζεται σε εξειδικευμένα σπλαχνικά κύτταρα στονεφρό(ποδοκύτταρα) και είναι απαραίτητο για τη διατήρηση και τη ρύθμιση πολλών γονιδίων, όπως η ποδοκαλυξίνη, η νεφρίνη (NPHS1) και ο παράγοντας μεταγραφής ζευγαρωμένου κουτιού (4-6). Οι μεταλλάξεις ή η μείωση της έκφρασης του WTl μπορεί να οδηγήσουν σε μειωμένη έκφραση της νεφρίνης και της ποδοκαλυξίνης και σχετίζεται με νεφροπάθειες όπως η σπειραματοσκλήρωση (5, 7-10).
Το νεφρωσικό σύνδρομο είναι το πιο συχνό νεφρικό σύνδρομο στην παιδική ηλικία, η ιστολογική του ταξινόμηση είναι Ελάχιστη νεφρωτική μεταβολή, εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση και διάχυτη μεσαγγειακή σκλήρυνση και ανάλογα με την έκταση της απόκρισης στα στεροειδή ταξινομείται ως ευαίσθητο και ανθεκτικό νεφρωσικό σύνδρομο (11). .
επιδράσεις του cistanche: αντιφλεγμονώδης
Μετάλλαξη του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) αναφέρεται συνήθως σε παιδιά με νεφρωσικό σύνδρομο ανθεκτικό στα στεροειδή, μια σπάνια ασθένεια που επηρεάζει το 10-15 τοις εκατό των ασθενών με νεφρωσικό σύνδρομο(12,13). Περίπου το 80 τοις εκατό όλων των παιδιών με σποραδικό νεφρωσικό σύνδρομο ανταποκρίνονται στη θεραπεία με στεροειδή, ωστόσο, δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις στο WT1 (Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) σε μια μεγάλη μελέτη κοόρτης (14). Μείωση της έκφρασης του ανθεκτικού στα στεροειδή νεφρωσικού συνδρόμου και σε μικρότερο βαθμό σε ασθενείς με νεφρωσικό σύνδρομο ευαίσθητο στα στεροειδή (15). 24 ώρες μετά τη χορήγηση LPS, WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) μετατοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και συσχετίστηκε με μείωση της έκφρασης της νεφρίνης, ενός βασικού συστατικού για τη διατήρηση του διαφράγματος της σχισμής στα ποδοκύτταρα και απαραίτητο για τη σωστή σπειραματική διήθηση, δείχνοντας έτσι το WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) δρα ως μεταγραφικός παράγοντας για την ανοδική ρύθμιση του γονιδίου της νεφρίνης(16).
Σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα Α459 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNFa), μετατόπιση του WT1 (Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) έχει παρατηρηθεί πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα, υποδηλώνοντας ότι ένα φλεγμονώδες ερέθισμα μπορεί να αλλάξει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό και τη μεταγραφική του λειτουργία (17). Η φωσφορυλίωση μπορεί να παίζει ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφικής ρυθμιστικής δραστηριότητας του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) μέσω παρεμβολής στην πυρηνική μετατόπιση, καθώς και με αναστολή του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) Σύνδεση DNA(18) με φωσφορυλίωση που προκαλείται από την πρωτεϊνική κινάση εξαρτώμενη από cAMP των Ser-365 και Ser-393 στην περιοχή ψευδαργύρου δακτύλου (19).
Η σήψη είναι αποτέλεσμα της συστημικής φλεγμονώδους απόκρισης και χαρακτηρίζεται από την απελευθέρωση προ- και αντιφλεγμονωδών κυτοκινών που προκαλούνται από μόλυνση. Η οξεία νεφρική βλάβη είναι συχνή σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς παρουσία οξείας φλεγμονής και έχει ισχυρή σχέση με την εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής βλάβης (20,21). Υπάρχουν ενδείξεις ότι η φλεγμονή παίζει σημαντικό ρόλο σε βλάβες σε διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένωννεφρά(22). Σε αυτή την εργασία, αξιολογήσαμε την επίδραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών στη ρύθμιση του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) έκφραση και μετατόπισή της στο κυτταρόπλασμα.
Οφέλη από το cistanche tubulosa: αντικαρκινικό και αντι-όγκος
Υλικά και μέθοδοι
Ζωικό μοντέλο. Τα θηλυκά ποντίκια BALB/c (ηλικίας 8-10 εβδομάδων) ελήφθησαν από το Harland Mexico (Πόλη του Μεξικού, Μεξικό). Τα ποντίκια εγκλωβίστηκαν υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία δωματίου, υγρασία και φως (12/12 ώρες κύκλος φωτός-σκότους) με νερό και τροφή κατά βούληση. LPS του Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Πόλη του Μεξικού, Μεξικό) και ένα μόνο Η ένεση LPS χορηγήθηκε σε δόση 8 mg/kg ενδοπεριτοναϊκά(16). Το αλατούχο διάλυμα χρησιμοποιήθηκε για ποντίκια ελέγχου, χωρίς θεραπεία. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση 200 mg/kg διαλύματος πεντοβαρβιτάλης νατρίου στις 12,24,36,48 και 72 ώρες, με n=5 σε κάθε χρονικό σημείο και στη συνέχειανεφρόσυλλέχθηκαν ιστοί και αίμα. Τα ούρα συλλέχθηκαν πριν από τη θυσία των ζώων.
Δύο ποντίκια γιανεφρόΤα μοσχεύματα ενέθηκαν με 1 mg/kg LPS κάθε 2 ημέρες για να προκληθεί χρόνιανεφρό βλάβηως θετικό μάρτυρα (21). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με προηγούμενη έγκριση από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων της Σχολής Βιολογικών Επιστημών (CEIBA-2016-034).
Νεφρόμοσχεύματα. Από τονεφρόαπό ποντίκια BALB/c, φέτες ιστού πάχους 250-300 μ.μ. παρασκευάστηκαν με έναν τεμαχιστή ιστού Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, ΗΠΑ) στους 4 βαθμούς με σταθερή ροή ρυθμιστικού διαλύματος διττανθρακικού Krebs Henseleit (KB) που αεριζόταν με 5 τοις εκατό CO2. Οι φέτες συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα KB στους 4 βαθμούς.Νεφρότα μοσχεύματα απλώθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίων με Dulbecco's τροποποιημένο μέσο Eagle's medium/F12 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό και 5 τοις εκατό αντιβιοτικό-αντιμυκητιακό παράγοντα και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς C, με 5 τοις εκατό CO, και αναδεύτηκαν στους 25 σ.α.λ. Τα εκφυτεύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/ml TNFa (R& D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml ιντερλευκίνης 1 (IL1, R & D Systems) και 100 ng/ml LPS και αναλύθηκαν στους 6, 12°C και 24 ώρες μετά.
Πρωτεΐνη ούρων. Συλλέχθηκαν δείγματα ούρων σε κάθε παραπάνω χρονικό σημείο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και η λευκωματουρία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και με βάση το μέγεθος της ζώνης της αλβουμίνης ορού βοοειδών (16).
Προφλεγμονώδεις κυτοκίνες. Τα επίπεδα IL6, IL1 και TNFa μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας συνδεδεμένα με ένζυμο σάντουιτς (PeproTech, Mexico City, Mexico).
Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR). Ολικό RNA απομονώθηκε από νεφρικούς ιστούς χρησιμοποιώντας Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μονόκλωνο cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας κιτ αντίστροφης μεταγραφής cDNA υψηλής χωρητικότητας (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκε PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) με δοκιμασίες έκφρασης γονιδίου TaqMan. Πραγματοποιήθηκαν συγκριτικές αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο για κάθε δείγμα εις τριπλούν. Τα αστάρια για WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) προωθήθηκαν:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; αντίστροφα:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';και ανιχνεύστε FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;το πρωτόκολλο εκτελέστηκε για 95 μοίρες για 10 λεπτά και 40 κύκλους στις 94 μοίρες για 30 s και 64 βαθμούς C για τα 30s. Η σχετική έκφραση του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) το γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση 2-AACT(23) με γονίδιο γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) (Applied Biosystems) που χρησιμοποιείται για κανονικοποίηση.
θεραπεία νεφρικής νόσου εκχύλισμα κιστανσέ
Η έκφραση του mRNA της νεφρίνης προσδιορίστηκε με 3 ug cDNA και τους ακόλουθους εκκινητές: Εμπρός: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'και αντίστροφα:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'στους 94 βαθμούς για 30 s,60 βαθμός βαθμού για 30 δευτ. και 72 μοιρών μοιρών για 30 δευτ. για 30 κύκλους (372 bp)(16). Για την έκφραση του GAPDH, χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές: Εμπρός:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',αντίστροφα:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', με τις ακόλουθες συνθήκες αντίδρασης: 94 μοίρες για 40 δευτ., 60 μοίρες για 30 δευτ. και 72 μοίρες για 40 δευτ. για 35 κύκλους (452 bp). Έκφραση WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1):Εμπρός 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', αντίστροφη 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'σε 94 μοίρες για 40 δευτ., 64 μοίρες για 30 δευτ. και 72 μοίρες για 30 δευτ. για 3160 κύκλους (3160 bps). Η έκφραση του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) ισομορφές KTS±και 17 AA±(F2-Εκκινητές R2 για την ανίχνευση 17 AA συν /-και F{5}}R3 για την ανίχνευση ισομορφών KTS συν /-ματίσματος) διεξήχθη με συμβατική PCR σύμφωνα με τους Oji et .al.(24). Ο προσδιορισμός της έκφρασης της -ακτίνης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Lauxet αϊ. (25). Τα προϊόντα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου 10 τοις εκατό για την ισομορφή KTS± και ένα πήκτωμα αγαρόζης 2 τοις εκατό για την ισομορφή 17ΑΑ±.
Ανοσοφθορισμός. ονεφράαπό ποντίκια που έλαβαν LPS και μάρτυρες σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης, ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμό.
Για να προσδιορίσετε τη θέση του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS, χρησιμοποιήθηκαν {0}}τμήματα νεφρικού ιστού πάχους που είχαν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρους μικροσκοπίου. Τα δείγματα αποκηρώθηκαν, διαπερατήθηκαν με Triton X-100 [0,1 τοις εκατό Triton με 1 τοις εκατό κιτρικό νάτριο σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS)] και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Οι ιστοί μπλοκαρίστηκαν με 20 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό σε PBS για 30 λεπτά και επωάστηκαν στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα με μονοκλωνικό αντίσωμα στο WT1 (Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) αραιωμένο 1:100 σε εμβρυϊκό βόειο ορό 10 τοις εκατό σε PBS. Μετά από πλύσεις με PBS, η παρουσία δεσμευμένου αντισώματος αναγνωρίστηκε με χρώση με κατσίκα αντι-ποντικού IgG Texas Red sc-2979 (Santa Cruz Biotechnology). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες βάφτηκαν με 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη. Τέλος, οι διαφάνειες τοποθετήθηκαν και εξετάστηκαν ποιοτικά χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο Olympus BX61W1 με αντικειμενικό στόχο εμβάπτισης 40× νερό και λογισμικό Fluoview 4.0a (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία).
Ανοσοϊστοχημεία. Για τον προσδιορισμό του φωσφορυλιωμένου (p)-WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) σε ποδοκύτταρα από ποντίκια που έλαβαν LPS, πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του p-WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) χρησιμοποιήθηκαν σερίνη 393,sc-12933 και 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες που περιείχαν τμήματα 4-μm νεφρικού ιστού αποκηρυώθηκαν και διαπερατήθηκαν Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι διαφάνειες εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός με αντικειμενικό εμβύθισης λαδιού 100× (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Γερμανία) .
Western blot. Η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε με 200 μΙ ρυθμιστικού λύσης (1 τοις εκατό Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl ρΗ 7,6) και η συγκέντρωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης DC (Bio-Rad). Η πρωτεΐνη (50 ug) διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 12 τοις εκατό και αναλύθηκε με στύπωμα western με WT1 (Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) [F6] αντισώματος sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-GAPDH (AB2302, Sigma, San Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Lumi-Light Western Blotting sc-2048 (Santa Cruz Biotechnology).
όφελος από το cistanche: προστασία των νεφρών
Αποτελέσματα
Επαγωγή τουνεφρόυλικές ζημιέςσε ποντίκια BALB/c από LPS. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η βλάβη των ποδοκυττάρων σχετίζεται με αυξημένη πρωτεϊνουρία. Η λευκωματίνη και η ολική πρωτεΐνη στα ούρα προσδιορίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης DC (Bio-Rad). Σημαντική αύξηση (p=0.001) της λευκωματίνης ούρων παρατηρήθηκε 12 ώρες μετά τη θεραπεία με LPS, με μέγιστη αύξηση στις 24 ώρες (215,87±1,41 ug/ml) σε σύγκριση με τον έλεγχο (15,53). ±5,0 ug/ml）(Εικόνα 1Α). Η συγκέντρωση της συνολικής πρωτεΐνης των ούρων παρατηρήθηκε να κορυφώνεται στις 36 ώρες (26,02±2,43 mg/ml) και ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τον έλεγχο (p=0,01) όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Η νεφρική βλάβη που προκλήθηκε από το LPS αναλύθηκε ιστολογικά Στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία, παρατηρήθηκε εστιακή σπειραματονεφρίτιδα στον ιστό των νεφρών, με τη μεγαλύτερη βλάβη να βρέθηκε στις 36 ώρες, αυξάνοντας το μέγεθος του σπειράματος, με μεσαγγειακή κυτταρικός πολλαπλασιασμός Στις 48 ώρες μετά, παρατηρήθηκε σταδιακή ανάκτηση του σπειράματος μέχρι τις 72 ώρες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C.
Εικόνα 1. Επίδραση συστηματικής φλεγμονής στο νεφρό.Συγκεντρώσεις λευκωματίνης ούρων (Α) και πρωτεΐνης ούρων (Β) ως δείκτες νεφρικής βλάβης σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με λιποπολυσακχαρίτη. Γ: Αντιπροσωπευτική εικόνα νεφρικής ιστολογίας ποντικού (χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης) σε διαφορετικούς χρόνους (12,24,36,48 και 72 ώρες) μετά την ένεση λιποπολυσακχαρίτη, με σύγκριση ενός μοντέλου χρόνιας φλεγμονής, μεγέθυνσης 100×. Σημαντικά διαφορετικό στο: *n<><0,0]><0.00>
Παραγωγή των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών TNFa και IL1 στον ορό από ποντικούς που έλαβαν LPS. Για να επιβεβαιωθεί ότι η νεφρική βλάβη προκλήθηκε από το LPS, τα επίπεδα των προφλεγμονωδών κυτοκινών μετρήθηκαν με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. Αύξηση του TNFa και του I1 παρατηρήθηκε μετά από 12 ώρες (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5 ng/ml) και έως 36 ώρες (4,44±0,1 ng/ml,18 ±0,9 ng/ml αντίστοιχα) θεραπείας με LPS, που αρχίζει να μειώνεται στη συνέχεια (Εικόνα 2Α και Β). Η έκφραση της IL6 αυξήθηκε στις 12 ώρες (49,5 ng/ml) και στις 36 ώρες (23,5 ng/ml) μετά τη θεραπεία, όντας σημαντικά υψηλότερη από τον έλεγχο (Εικόνα 2C).
Εικόνα 2. Χρονική πορεία των επιπέδων των προφλεγμονωδών κυτοκινών παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNFa).(Α), ιντερλευκίνη 1 (LL1)(Β) και IL6(C) στον ορό από ποντίκια μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση λιποπολυσακχαρίτη. Σημαντικά διαφορετικό σε: *p Μικρότερο ή ίσο με 0.05,**p Μικρότερο από ή ίσο με 0.01 και ***p Μικρότερο ή ίσο με 0,001 .
Έκφραση γονιδίου WTI σε ιστό νεφρού από ποντίκια που έλαβαν LPS. Για να απαντήσουμε στο κεντρικό μας ερώτημα εάν το WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) ρυθμίστηκε από τη φλεγμονώδη διαδικασία και αυτό είχε νεφρικές επιδράσεις, τη συνολική έκφραση του WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) προσδιορίστηκε το γονίδιο σε δείγματα νεφρών από ποντίκια με συστηματική φλεγμονή σε διαφορετικούς χρόνους κατά την πορεία της φλεγμονής. WT1(Γονίδιο του όγκου του Wilm-1) Το mRNA ήταν χαμηλότερο ανά πάσα στιγμή που αναλύθηκε σε σχέση με τον έλεγχο, με τη χαμηλότερη σχετική έκφραση στις 36 ώρες και την υψηλότερη στις 12 ώρες μετά την πρόκληση συστηματικής φλεγμονής όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Επιπλέον, καθορίστηκε εάν η θεραπεία με LPs προκάλεσε τροποποίηση της έκφρασης του εξονίου 5(17 AA±) και KTS± του WTI της ισομορφής με PCR. Τα δεδομένα έδειξαν ότι δεν υπήρξε απορρύθμιση της έκφρασης αυτών των ισομορφών καθώς παρατηρήθηκε η ίδια συμπεριφορά με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία σε όλη τη συστημική φλεγμονώδη διαδικασία που προκλήθηκε από LPS (Εικόνα 3Β). Η πρωτεΐνη WT1 φάνηκε με στύπωμα western να μειώνεται καθ' όλη τη διάρκεια της φλεγμονώδους διαδικασίας, με μια ελαφρά ανάκτηση στις 36 ώρες μετά τη θεραπεία, ωστόσο, η ποσότητα της WT1 ήταν μικρότερη από αυτή του μάρτυρα χωρίς θεραπεία (Εικόνα 3C και D).
Εικόνα 3. Επίδραση λιποπολυσακχαρίτη (LPS) στην έκφραση του γονιδίου Wilms'tumor I (WT1) σε ιστό νεφρού από ποντικούς με συστηματική φλεγμονή.A: Σχετική έκφραση του WTI mRNA.B: Σχετική έκφραση των ισομορφών KTS± και 17IAA± του WT1.C: Επίπεδα πρωτεΐνης WTI με ανοσοστύπωμα μετά από θεραπεία με LPS και D: Πυκνότητα ανοσοστύπωσης για WT1. Σημαντικά διαφορετική σε:**p Λιγότερο από ή ίσο με 0.01 και ***p Μικρότερο ή ίσο με 0,001,
Φωσφορυλίωση και εντοπισμός του WTI σε βιοψίες νεφρού ποντικών που έλαβαν LPS. Ένα σημαντικό γεγονός στη μετα-μεταφραστική διαμόρφωση της πρωτεΐνης WTI είναι η φωσφορυλίωση του αμινοξέος 393, η οποία προκαλεί τη μετατόπιση της πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα. Προσδιορίστηκε η φωσφορυλίωση και ο εντοπισμός του WT1 σε δείγματα νεφρών από ποντικούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS. Η φωσφορυλίωση του WT1 αναλύθηκε με ιστοχημεία, υποδεικνύοντας την παρουσία φωσφορυλιωμένης WT1 στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων σε τμήματα νεφρικού ιστού ξεκινώντας 12 ώρες μετά την πρόκληση συστημικής φλεγμονής και διατηρώντας μέχρι τις 72 ώρες. Το WT1 φωσφορυλιώθηκε σε αμινοξέα 3633 όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Η θέση της πρωτεΐνης WT1 αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό. Η θέση του WT1 στα ποδοκύτταρα σε δείγματα νεφρών από ποντικούς που έλαβαν LPS ήταν κυρίως κυτταροπλασματική, ενώ στα ποδοκύτταρα από τα δείγματα ελέγχου, η θέση ήταν ασαφής (Εικόνα 4Β).
Εικόνα 4. Φωσφορυλίωση και εντοπισμός του όγκου Wilms' I (WTI) σε δείγματα νεφρών από ποντικούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με λιποπολυσακχαρίτη.Α: Ανοσοϊστοχημική χρώση για φωσφορυλιωμένο (p)-WTI που δείχνει αύξηση σε φωσφορυλιωμένη σε σερίνη 393 και 363 ξεκινώντας 12 ώρες μετά τη χορήγηση LPS (μεγέθυνση 100× στο μικροσκόπιο φωτός). Β: Εντοπισμός του WTI με ανοσοφθορισμό στο νεφρό. Παραδείγματα που δείχνουν μικρό πυρηνικό εντοπισμό του WT1(τετράγωνα) 36 ώρες μετά τη χορήγηση λιποπολυσακχαρίτη (μεγέθυνση 40× στο ομοεστιακό μικροσκόπιο).DAP1:4,6-Διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη.
Τροποποίηση της έκφρασης του WTI και της νεφρίνης σε νεφρούς από ποντίκια που έλαβαν LPS. Η θέση του WT1 στο κύτταρο επηρεάζει τη βιολογική του δραστηριότητα. Έχει αναφερθεί ότι το κυτταροπλασματικό WT1 δεν ασκεί μεταγραφική δράση. Για αυτό το λόγο, η έκφραση του WT1 και του mRNA της νεφρίνης αναλύθηκε με PCR σε δείγματα νεφρών από ποντικούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS (Εικόνα 5Α). Η PCR έδειξε μείωση στο mRNA της νεφρίνης από 24 σε 48 ώρες, με αύξηση στις 72 ώρες (Εικόνα 5Β ), ενώ η έκφραση του mRNA του WTI αυξήθηκε στις 12 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε κατά τις κρίσιμες ώρες της φλεγμονής και της νεφρικής βλάβης (24 και 36 ώρες) και (Εικόνα 5Β).
Εικόνα 5. Ανάλυση της έκφρασης mRNA της νεφρίνης (NPHS1) και του όγκου Wilms' 1 (WT1).Α: Στην ανάλυση της έκφρασης mRNA, το NPHSI και το WTI μειώθηκαν στις 24, 36 και 48 ώρες μετά την πρόκληση συστημικής φλεγμονής χρησιμοποιώντας λιποπολυσακχαρίτη. Β: Ποσοτικοποίηση των ζωνών που φαίνονται στο Α με πυκνομετρία και κανονικοποιούνται με έκφραση σε 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης.
Τα μοσχεύματα νεφρού που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TNFa και IL1 ρυθμίζουν την έκφραση του WTI και της νεφρίνης. Για να προσδιοριστεί εάν οι κυτοκίνες ρυθμίζουν την έκφραση του WT1, τα νεφρικά μοσχεύματα καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις κυτοκίνες TNFa και IL1 για 6,12 και 24 ώρες για να αναλυθεί η έκφραση του WT1 και της νεφρίνης με PCR. Η έκφραση mRNA της νεφρίνης μειώθηκε και η έκφραση mRNA του WTI αυξήθηκε στις 24 ώρες σε νεφρικά εκφυτεύματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa και ILlb (Εικόνα 6).
Εικόνα 6. Ανάλυση της έκφρασης της νεφρίνης (NPHS1) και του Wilms'tumor 1 (WT1)mRNA σε νεφρικά μοσχεύματα.Α: Επίπεδα έκφρασης mRNA NPHSi και WTI σε διαφορετικούς χρόνους σε νεφρικά εκφυτεύματα που εκτέθηκαν σε 10 ng/ml παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNF) και 20 nglml ιντερλευκίνης 16 (IL16)B: Σχετική έκφραση που λήφθηκε χρησιμοποιώντας πυκνομετρική ανάλυση του προϊόν σήματος. Οι ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με κανονικοποίηση σε 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης.
Εντοπισμός WTI σε νεφρικά εκφυτεύματα με ανοσοφθορισμό. Για να προσδιοριστεί εάν τα TNFa και IL ήταν υπεύθυνα για την αλλαγή στον εντοπισμό της πρωτεΐνης WT1, τα εκφυτεύματα νεφρού ποντικού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TNFa και L1 και LPS για 24 ώρες. Σε εκφυτεύματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ILLb και LPS, ήταν εμφανής ένας πυρήνας/κυτταροπλασματικός εντοπισμός της πρωτεΐνης WTl και στα εκφυτεύματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TNFa, παρατηρήθηκε κυτταροπλασματικός εντοπισμός της πρωτεΐνης WT1. Εν τω μεταξύ, σε μάρτυρες χωρίς θεραπεία, παρατηρήθηκε κυρίως πυρηνικός εντοπισμός του WT1 (Εικόνα 7).
Εικόνα 7. Εντοπισμός της πρωτεΐνης Wilms'tumor 1 (WTI) με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας Red TX (WT1) και 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) (πυρήνας) σε ποδοκύτταρα από εκφυτεύματα νεφρού που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με l0 ng/ml παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα (TNFa), 20 ng/ml ιντερλευκίνης 16 (L1B) και λιποπολυσακχαρίτη (LPS).Μειωμένος πυρηνικός εντοπισμός των WTas που εμφανίζεται στα εκφυτεύματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNFa σε σύγκριση με τον πυρηνικό/κυτταροπλασματικό εντοπισμό του WTI υπό θεραπείες IL1 και LPS. Μεγέθυνση, 40×.
