Μια Μικκυλιακή Σκεύασμα Κερσετίνης Αποτρέπει τη Νεφροτοξικότητα της Σισπλατίνης

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I.Colino, & et al.

Το αντιοξειδωτικό φλαβονοειδέςκερσετίνηέχει αποδειχθεί ότι προλαμβάνεινεφροτοξικότητασε ζωικά μοντέλα και σε κλινική μελέτη και είναι επομένως ένας πολλά υποσχόμενος υποψήφιος προφυλακτικός υπό ανάπτυξη.Κερσετίνηη διαλυτότητα είναι πολύ χαμηλή, γεγονός που εμποδίζει την κλινική εφαρμογή. Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να μελετήσει, σε αρουραίους, τη βιοδιαθεσιμότητα και την νεφροπροστατευτική αποτελεσματικότητα ενός μικκυλιακού σκευάσματος του Pluronic F127-ενθυλακωμένοκερσετίνη(P-κερσετίνη), με βελτιωμένη υδροδιαλυτότητα. Ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση P-κερσετίνηοδηγεί σε αυξημένη συγκέντρωση στο πλάσμα και βιοδιαθεσιμότητα τουκερσετίνησε σύγκριση με την ισομοριακή χορήγηση φυσικώνκερσετίνη. Επιπλέον, Π-κερσετίνηδιατηρεί τις συνολικές νεφροπροστατευτικές ιδιότητες και ακόμη και ελαφρώς βελτιώνει ορισμένες παραμέτρους της νεφρικής λειτουργίας, σε σύγκριση με τις φυσικέςκερσετίνη. Συγκεκριμένα, Π-κερσετίνημείωσε την αύξηση της κρεατινίνης πλάσματος (από 3,4±0,5 σε 1,2±0,3 mg/dL) και της ουρίας (από 490,9±43,8 σε 184,1± 50.1 mg/dL) και τη μείωση της κάθαρσης κρεατινίνης (από {{20}}.08±0.02 σε 0.58±0.19 mL/min) που προκαλείται από το νεφροτοξικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο σισπλατίνη, και βελτίωσε τις ιστολογικές ενδείξεις σωληναριακής βλάβης. Αυτή η νέα σύνθεση με ενισχυμένες κινητικές και βιοφαρμακευτικές ιδιότητες θα επιτρέψει την περαιτέρω εξερεύνηση τουκερσετίνηως υποψήφιο νεφροπροστατευτικό σε χαμηλότερες δόσεις και με οδούς χορήγησης προσανατολισμένους στην κλινική χρήση του.

Λέξεις-κλειδιά:σισπλατίνη;νεφροτοξικότητα; φλαβονοειδές;κερσετίνη; Νεφροπροστασία? βιοδιαθεσιμότητα;νεφρό;μικκύλια; διαλυτότητα; διατύπωση

Πρόληψη τηςνεφροτοξικότητα

Κάντε κλικ στο Cistanche para que sirve για νεφρική νόσο

1. Εισαγωγή

Φάρμακονεφροτοξικότητααποτελεί σοβαρή ιατρική και οικονομική ανησυχία [1,2], με το 25 τοις εκατό από τα 100 πιο χρησιμοποιούμενα φάρμακα στις μονάδες εντατικής θεραπείας να είναι νεφροτοξικά [3], καινεφροτοξικότηταείναι επίσης μια σημαντική αιτία πτώσης υποψηφίου κατά τη διαδικασία ανακάλυψης φαρμάκων 4]. Η σισπλατίνη είναι ένας αντικαρκινικός παράγοντας με βάση την πλατίνα που χρησιμοποιείται συχνά στη θεραπεία μιας ποικιλίας στερεών κακοήθων νεοπλασμάτων [5,6]. Σχεδόν το 30 τοις εκατό των ασθενών εμφανίζουν ενδείξειςνεφροτοξικότητακατά τη διάρκεια των πρώτων δέκα ημερών μετά τη χορήγηση της σισπλατίνης, γεγονός που θέτει σημαντικό περιορισμό στη δοσολογία και τη θεραπευτική της αποτελεσματικότητα [5-8]. Οξεία σισπλατίνηνεφροτοξικότηταπροκαλεί μια σωληνοπάθεια που προέρχεται από μια 5-πτυχή συσσώρευση στα επιθηλιακά κύτταρα του εγγύς σωληνίσκου, σε σχέση με τη συγκέντρωσή του στο πλάσμα [9-1l], και σε μικρότερο βαθμό στο άπω σωληνάριο [12,13 ].

Η σωληνοπάθεια σισπλατίνης παρουσιάζει ηλεκτρολυτικές διαταραχές (κυρίως υπομαγνησιαιμία και υποκαλιαιμία) καιοξύςνεφρόβλάβη(AKI). Το AKI είναι ένα κοινό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από απότομη μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR), σοβαρή αζωθαιμία και, συχνά, ολιγουρία ή ανουρία [7,14]. Επιπλέον, η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που αυξάνει τη νεφρική αγγειακή αντίσταση και βλάπτει την αυτορρύθμιση συμβάλλει επίσης στην επαγόμενη από τη σισπλατίνη AKI[9]. Συνήθως, το AKI είναι μια αναστρέψιμη κατάσταση, η οποία ωστόσο έχει σχετικό αντίκτυπο στα αποτελέσματα των ασθενών, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης ενδονοσοκομειακής θνησιμότητας (πάνω από το 50 τοις εκατό των περιπτώσεων μεταξύ των βαρέως πασχόντων), της παρατεταμένης νοσηλείας, του πρόσθετου κόστους υγειονομικής περίθαλψης και, στη μέση και μακροπρόθεσμα σενάρια, αυξημένος κίνδυνος ανάπτυξηςχρόνια νεφρική νόσοςκαι της γενικής και καρδιαγγειακής νοσηρότητας [7,14]. Σε υποκυτταρικό και μοριακό επίπεδο, η σωληναριακή κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης προκαλείται από μιτοχονδριακή βλάβη, η οποία περιορίζει την αναπνοή, προκαλεί οξειδωτικό στρες και προκαλεί αποπτωτικό και νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο και επιβλαβή φλεγμονώδη απόκριση [13,15,16]. Το οξειδωτικό στρες αναγνωρίζεται ως κεντρικός μηχανισμός κυτταροτοξικότητας της σισπλατίνης καινεφροτοξικότητα[12,13,15-17], που προκύπτει από την αυξημένη παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου και έναν εξασθενημένο ενδογενή αντιοξειδωτικό φραγμό ενζύμων [5,7,18].

Αποτελεσματικά προφυλακτικά μέτρα για τη σισπλατίνηνεφροτοξικότηταθέτουν μια ανεκπλήρωτη κλινική ανάγκη για τη βελτίωση του φαρμακοτοξικολογικού προφίλ και τη μεγιστοποίηση της χρησιμότητάς του. Οι υπάρχουσες προληπτικές στρατηγικές, συμπεριλαμβανομένης της εντατικής ενυδάτωσης, έχουν δείξει μόνο περιορισμένη προστασία [6,19]. Νέες στρατηγικές που βασίζονται στη συγχορήγηση νεφροπροστατευτικών είναι υπό ανάπτυξη. Τα υποψήφια νεφροπροστατευτικά περιλαμβάνουν σκευάσματα μαγνησίου |6,9 και, κυρίως, μια ποικιλία αντιοξειδωτικών [6,20,21]. Τα φλαβονοειδή είναι μια οικογένεια νεφροπροστατευτικών πολυφαινολικών προϊόντων που προέρχονται από λαχανικά, φρούτα, ξηρούς καρπούς και κρασί, με ισχυρές αντιοξειδωτικές ιδιότητες [22].Κερσετίνηείναι ένα χαρακτηριστικό φλαβονοειδές που ασκεί πολλά ευεργετικά αποτελέσματα [23,24], συμπεριλαμβανομένης της δέσμευσης ενεργών ειδών οξυγόνου, της καταστολής της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, της ενδοθηλιακής προστασίας, της ρύθμισης της φλεγμονής, της αναστολής της απόπτωσης, της καταστολής του όγκου και της νεφροπροστασίας. Συγχορήγηση τουκερσετίνηπαράλληλα με τη θεραπεία με σισπλατίνη σε ένα μοντέλο ζωικού όγκου παρέχει νεφροπροστασία χωρίς να παρεμβαίνει στην αντικαρκινική δράση |25,26]. Στην πραγματικότητα, εντοπίστηκε μια ενημερωμένη μετα-ανάλυσηκερσετίνηως ένας πολλά υποσχόμενος υποψήφιος ως νευροπροστάτης για περαιτέρω κλινική ανάπτυξη [21]. Με συνέπεια, μια πρόσφατη κλινική μελέτη ανέφερε προστατευτική επίδραση τουκερσετίνησχετικά με τη νεφροπάθεια που προκαλείται από σκιαγραφική ουσία (CIN) [27].

Ένας ισχυρός περιορισμός στην πιθανή εφαρμογή τουκερσετίνη(που μοιράζονται τα φλαβονοειδή γενικά) είναι η χαμηλή υδροδιαλυτότητά του που προκύπτει από τη χημική του δομή και τα τμήματα του, τα οποία μειώνουν την απορρόφησή του στο μικρό έντερο και επομένως τη βιοδιαθεσιμότητα και την αποτελεσματικότητά του [23,24, 28]. Είναι ενδιαφέρον ότι η λιπόφοβη γλυκόζηκερσετίνηΟι συζυγείς (γλυκοζίτες) είναι ουσιαστικά πιο βιοδιαθέσιμοι από τις λιπόφιλες αγλυκόνες, επειδή οι τελευταίες είναι λιγότερο διαλυτές στον εντερικό αυλό [24]. Στην πραγματικότητα,κερσετίνηΟι γλυκοζίτες από τα κρεμμύδια δείχνουν τον υψηλότερο ρυθμό απορρόφησης και το διαιτητικό λίπος ενισχύεταικερσετίνηαπορρόφηση αγλυκόνης στο μικρό έντερο [29]. Η πολύ χαμηλή υδροδιαλυτότητα τουκερσετίνηόχι μόνο εμποδίζει την κλινική χρήση του με πρακτικές οδούς χορήγησης (δηλαδή από του στόματος, ενδοαγγειακή) αλλά περιορίζει επίσης την προκλινική έρευνα. Ωστόσο, σε ζωικά μοντέλα, εναλλακτικές οδοί (δηλαδή, ενδοπεριτοναϊκή) με εναιωρήματα φαρμάκων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για σκοπούς απόδειξης της ιδέας [25,26].

Κερσετίνηέχουν αναπτυχθεί σκευάσματα με νέα υλικά φορείς που φέρουν βελτιωμένη υδροδιαλυτότητα, των οποίων οι βιοϊατρικές ιδιότητες πρέπει να δοκιμαστούν. Τα πλουρονικά πολοξαμερή είναι μια κατηγορία υλικών φορέων που φιλοξενούν και ενισχύουν την απορρόφηση αδιάλυτων στο νερό ενώσεων λόγω της ικανότητάς τους να σχηματίζουν μικκύλια σε υδατικά περιβάλλοντα [30]. Εδώ, υποθέσαμε ότι ένα μικκυλιακό σκεύασμα τουκερσετίνηενθυλακωμένο με Pluronic F127 που περιγράφηκε προηγουμένως [31, θα διατηρήσει τις νεφροπροστατευτικές ιδιότητες του φυσικούκερσετίνηενώ προσφέρει βελτιωμένα βιοφαρμακευτικά χαρακτηριστικά για χειρισμό, σύνθεση και χορήγηση.

Αποτρέψεινεφροτοξικότητα:κερσετίνη

2. Αποτελέσματα

Πραγματοποιήθηκε μελέτη βιοδιαθεσιμότητας και νεφροπροστασίας με τη νέα σύνθεση mi-cellarκερσετίνηενθυλακωμένο με Pluronic F127[31, και την παραδοσιακή μας σύνθεση του φυσικούκερσετίνη|25,26|(βλ. παρακάτω Υλικά και Μέθοδοι). Ενώ αυτό το τελευταίο ήταν ένα εναιώρημα που περιείχε ένα τανυστικό, το πρώτο ήταν ένα αλατούχο διάλυμα χωρίς επιπλέον πρόσθετα. Η παραδοσιακή μας σύνθεση του φυσικούκερσετίνηήταν κατάλληλο μόνο για πειραματικούς σκοπούς, κατακρημνιζόταν όταν έμεινε ακίνητο και ήταν πιο δύσκολο να χειριστεί και να εγχυθεί. Αντίθετα, το μικκυλιακό σκεύασμα συμπεριφέρθηκε ως διάλυμα και δεν παρουσίασε ενοχλήσεις κατά τη χρήση.

2.1.Μελέτη βιοδιαθεσιμότητας

Ως μέθοδος συγκριτικής βιοδιαθεσιμότητας, η εξέλιξη τουκερσετίνη(Q) η συγκέντρωση στο πλάσμα μελετήθηκε μετά από ένα μόνο ενδοπεριτοναϊκό βλωμό φυσικού και P-κερσετίνη(PQ). Το Σχήμα 1 δείχνει τη μέση τιμήκερσετίνηκαμπύλες επιπέδων πλάσματος που λαμβάνονται μετά τη χορήγηση μιας δόσηςκερσετίνηή Π-κερσετίνη. Οι μέγιστες συγκεντρώσεις φαρμάκου (Cmax) που παρατηρήθηκαν στις ομάδες Q και PQ ήταν 1,14±1,28 ug/mL και 8,90 ±4,62 ug/mL, αντίστοιχα, δηλ. 7,8-πλάσια αύξηση για το P-κερσετίνη, υποδεικνύοντας ότι το μικκυλιακό σκεύασμα αύξησε την απορρόφηση του φαρμάκου.

Σχήμα 1. Εξέλιξη της συγκέντρωσης της κερκετίνης στο πλάσμα μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση ενός μόνο βλωμού ισομοριακής Ρ-κουερσετίνης και φυσικής κερκετίνης.

Οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) (n=5 ανά ομάδα). *Π<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">κερσετίνη(50mg/kg,ip.);PQ:100mg/kgi.pP-κερσετίνη(περιέχει 50 mg/kgκερσετίνη).

Πίνακας 1. Φαρμακοκινητικές παράμετροι μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση P-quercetin και φυσικής quercetin (n=5 ανά ομάδα).

Ε: κερσετίνη(50mg/kg, ip;PQ: P-κερσετίνη(100 mg/kg, ip).AUCo24:περιοχή κάτω από τη μερική καμπύλη. AUCo: περιοχή κάτω από τη συνολική καμπύλη. MRT: μέσος χρόνος παραμονής;t1/2:ημιζωή αποβολής; X: κλίση τερματικής φάσης.

Ο Πίνακας 1 δείχνει τις ανεξάρτητες από το μοντέλο φαρμακοκινητικές παραμέτρους τουκερσετίνησε αρουραίους μετά τη χορήγηση μιας εφάπαξ δόσης βλωμού φυσικούκερσετίνηή Π-κερσετίνη. Ο χρόνος στη Cmax αυξήθηκε από 15 λεπτά (για φυσικόκερσετίνη) έως 1 ώρα (για την P κερσετίνη). Αυτή η καθυστέρηση μπορεί να αποδοθεί στη διαρκή απελευθέρωση τουκερσετίνηαπό το μικκυλιακό σκεύασμα. Η συνολική έκθεση των αρουραίων στο φλαβονοειδές ήταν σημαντικά υψηλότερη για το P-κερσετίνη, όπως αποδεικνύεται από τη μεγαλύτερη περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) που μεταφράζεται σε 302,5 τοις εκατό υψηλότερη βιοδιαθεσιμότητα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υψηλότερη διαλυτότητα του μικκυλιακού σκευάσματος ενισχύει την απορρόφησή του.

2.2. Μελέτη αποτελεσματικότητας Nephroprotectioe 2.2.1.Φυσιολογική κατάσταση

Όπως αποδεικνύεται από την εξέλιξη του σωματικού βάρους (Εικόνα 2α), η γενική υγεία επιδεινώθηκε μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη, σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου. Ούτε φυσικόκερσετίνηούτε Ρ-κερσετίνητροποποίησε σημαντικά την επίδραση της σισπλατίνης. Ωστόσο, και τα δύοκερσετίνηθεραπείες απέτρεψαν σχεδόν πλήρως την αύξηση τουνεφρόαναλογία βάρους σώματος που προκαλείται από σισπλατίνη (Εικόνα 2β), μια παράμετρος που είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με το μέγεθος της τριβής σενεφροτοξικότητα[32].

Εικόνα 2. Εξέλιξη της γενικής κατάστασης υγείας. (α) Ποσοστιαία διακύμανση στο σωματικό βάρος μέσω του πειράματος· (β) Αναλογία νεφρού/σωματικού βάρους την ημέρα 9.

Οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SEM (n=3-5 ανά ομάδα). *Π<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP συν Q:κερσετίνη(50 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3. CP συν PQ:P-κερσετίνη(100 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3.

2.2.2. Εκτίμηση νεφρικής λειτουργίας και νεφρικού ιστού

Σύμφωνα με διεθνή κριτήρια, το AKI ορίζεται και διαγιγνώσκεται σύμφωνα με τις αυξήσεις στη συγκέντρωση κρεατινίνης στο πλάσμα (Crp)[33-35], έναν υποκατάστατο δείκτη του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR). Άλλες παράμετροι, όπως η συγκέντρωση ουρίας στο πλάσμα, αξιολογούνται επίσης συχνά ως δείκτες αζωθαιμίας [36-38]. Οι αυξήσεις της Crp και της ουρίας του πλάσματος είναι σημάδια μειωμένου GFR και AKI. Στη μελέτη μας, η νεφρική λειτουργία ήταν σοβαρή μειονέκτημα από τη σισπλατίνη και αυτή η επίδραση βελτιώθηκε μερικώς απόκερσετίνη. P-κερσετίνηπαρουσίασε ελαφρώς πιο τολμηρή δραστηριότητα από τη φυσικήκερσετίνη, όπως υποδεικνύεται από ηπιότερη βλάβη και βελτιωμένο προφίλ ανάκτησης (Εικόνα 3). Οι αρουραίοι στην ομάδα της σισπλατίνης (CP) υποβλήθηκαν σε εμφανή AKI, καθώς παρουσίασαν προοδευτική και σημαντική αύξηση στα επίπεδα κρεατινίνης και ουρίας πλάσματος σε σύγκριση με εκείνα των μαρτύρων (Εικόνα 3α, β). Αυτές οι παράμετροι αυξήθηκαν επίσης στις ομάδες CP συν Q και CP συν PQ, αλλά σε σημαντικά μικρότερο βαθμό. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων CP συν Q και CP συν PQ δεν ήταν στατιστικά σημαντικές, ωστόσο, οι αρουραίοι που έλαβαν P-κερσετίνηπαρουσίασαν ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα κρεατινίνης και ουρίας από εκείνα που έλαβαν φυσική θεραπείακερσετίνη. Η κάθαρση κρεατινίνης (ClCr) είναι μια τυπική μέθοδος για τη μέτρηση του GFR ]39,40]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα Cr, η σισπλατίνη προκάλεσε μια βαθιά πτώση, η οποία μετριάστηκε εν μέρει απόκερσετίνη(Εικόνα 3γ). Σε αυτή την περίπτωση, ωστόσο, παρατηρήθηκε μια αξιοσημείωτη διαφορά μεταξύ της P-quercetin και της φυσικής κερκετίνης, με την πρώτη να είναι σημαντικά πιο αποτελεσματική στη βελτίωση και στην επιτάχυνση της ανάρρωσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα Clcr και Crpl συμπεριφέρονται με αντιστρόφως ανάλογο τρόπο, ο οποίος είναι εμφανής μόνο στη σταθερή κατάσταση. Κατά τη διάρκεια της ΑΚΙ, ωστόσο, η νεφρική λειτουργία αλλάζει συνεχώς και γρήγορα, με αποτέλεσμα μια ελαφρά αποσύνδεση αυτής της σχέσης.

Εικόνα 3. Εξέλιξη νεφρικών παραμέτρων.

α)Συγκέντρωση κρεατινίνης στο πλάσμα·β)Συγκέντρωση ουρίας στο πλάσμα·γ) Κάθαρση κρεατινίνης·δ) Πρωτεϊνουρία· και (ε)ΚΙΜ-1 απέκκριση στα ούρα.

Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM(n=3-5 ανά ομάδα). *Π<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP συν Q:κερσετίνη(50 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3, CP συν PQ:P-κερσετίνη(100mg/kg,ip.)για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5mg/kg,ip) την ημέρα 3.KIM-1:νεφρόβλάβημόριο 1.

Η πρωτεϊνουρία μετράται επίσης συχνά στο πλαίσιο της νεφρικής παθολογίας. Ανάλογα με το υποκείμενο πρότυπο βλάβης, η πρωτεϊνουρία μπορεί να έχει σπειραματική προέλευση (δηλ. αυξημένη διαπερατότητα του φραγμού σπειραματικής διήθησης) ή, όπως στην περίπτωση της σισπλατίνηςνεφροτοξικότητα[13], μπορεί να προκύψει από ελαττωματική σωληναριακή επαναρρόφηση λόγω τραυματισμού του σωλήνα. Μια μη σημαντική αύξηση της πρωτεϊνουρίας ανιχνεύθηκε στις ομάδες CP και CP-Q (αν και λιγότερο έντονη στην τελευταία) την ημέρα 7, η οποία επέστρεψε στο φυσιολογικό την ημέρα 9. Ομοίως, η απέκκριση στα ούρα ενός βιοδείκτη σωληναριακής βλάβης (δηλ.νεφρόβλάβημόριο 1; Το KIM-1)[41,42] αυξήθηκε σημαντικά από τη σισπλατίνη και αυτή η αύξηση μετριάστηκε και από τις δύο μορφέςκερσετίνη, αν και Π-κερσετίνηήταν και πάλι ελαφρώς πιο αποτελεσματική.

Η ιστολογική μελέτη του νεφρικού ιστού ήταν σύμφωνη με τα βιοχημικά ευρήματα. Δείγματα από αρουραίους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη αποκάλυψαν μαζική σωληναριακή νέκρωση στην άνω λωρίδα του έξω μυελού, συνοδευόμενη από κάποια στοργή του φλοιού καικερσετίνημειωμένη βλάβη του φλοιού (Εικόνες 4 και 5). Οι αρουραίοι που έλαβαν μόνο τον νεφροτοξικό παράγοντα ανέπτυξαν σωληναριακή διαστολή και απόφραξη (που φαίνεται ως συσσωρευμένο υαλώδες υλικό) και σωληναριακή νέκρωση με αποεπιθηλιοποίηση και απολέπιση των κυττάρων. Και τα δυοκερσετίνηΟι θεραπείες μείωσαν παρομοίως τη φλοιώδη βλάβη που προκαλείται από τη σισπλατίνη αλλά δεν είχαν καμία επίδραση στη μυελική βλάβη (Εικόνες 4 και 5).

Εικόνα 4. Αντιπροσωπευτικές εικόνες δειγμάτων νεφρού που χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη.

Μαύρα βέλη: σωληναριακή νέκρωση και αφαίρεση κυττάρων. μπλε βέλη: σωληνοειδείς διαστολές. πράσινα βέλη: ενδοσωληνώδεις εναποθέσεις υαλώδους υλικού. CP: σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3.

CP συν Q:κερσετίνη(50 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3, CP συν PQ:P-κερσετίνη(100 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκά) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) την ημέρα 3.

Εικόνα 5. Ποσοτικοποίηση νεφρικής βλάβης.

Οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SEM(n =5 εικόνες×3 αρουραίοι ανά ομάδα). * Π<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip.) την ημέρα 3· CP συν Q:κερσετίνη(50 mg/kg, ip για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3, CP συν PQ:P-κερσετίνη(100 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3.AU: αυθαίρετες μονάδες.

3. Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα μικκυλιακό σκεύασμα τουκερσετίνημε Pluronic F127 (P-κερσετίνη), έχοντας ενισχυμένες βιοφαρμακευτικές ιδιότητες, αύξησε τη βιοδιαθεσιμότητα αυτού του αντιοξειδωτικού φλαβονοειδούς και διατήρησε (ή και ελαφρώς βελτίωσε) τις συνολικές νεφροπροστατευτικές του ιδιότητες σε σύγκριση με το φυσικόκερσετίνη.

Κερσετίνηέχει θεωρηθεί ως ένας πολλά υποσχόμενος υποψήφιος για προστασία από νεφρική βλάβη που προκαλείται από μια σειρά φαρμάκων και τοξινών, συμπεριλαμβανομένης της σισπλατίνης [25,26], της μεθοτρεξάτης [43,44], της σιπροφλοξασίνης [45], του NaF [46], του HgCl [47 l και του καδμίου [48]. Αν και αυτές οι μελέτες έδειξαν προκλινική αποτελεσματικότητα,κερσετίνηδεν έχει δοκιμαστεί σε παρόμοια κλινικά σενάρια λόγω εμποδίων στη σύνθεση και χαμηλής βιοδιαθεσιμότητας, εκτός από κλινική μελέτη στην οποίακερσετίνηπαρείχε κάποια προστασία από το CIN [27]. Και οι δύο περιορισμοί είναι συνέπειες της πολύ κακής υδατοδιαλυτότητας (μόνο 0.01 mg/mL, στους 25 βαθμούς [49]) τουκερσετίνηκαι της χαμηλής σταθερότητάς του (η οποία επηρεάζεται από τη θερμοκρασία, το pH, την υδροξυλίωση, την ενζυματική δραστηριότητα και τα μεταλλικά ιόντα)[28,29,50]. Χορηγείται από το στόμακερσετίνηαντιμετωπίζει εκτεταμένη υποβάθμιση κατά τη διέλευση του στομάχου λόγω του πολύ χαμηλού γαστρικού pH (δηλ. 1,5)[50]. Στο λεπτό έντερο, χημικά προστατευμένο από υψηλότερο pH(7,5), το υπόλοιποκερσετίνηαπορροφάται ελάχιστα. Ως εκ τούτου, προκειμένου να αυξηθεί η βιοδιαθεσιμότητα και η βιολογική της αποτελεσματικότητα, έχουν αναπτυχθεί νέα σκευάσματα κερκετίνης με στόχο τη βελτίωση της υδροδιαλυτότητάς της καθώς και την προστασία των ενεργών τμημάτων της από την αποικοδόμηση, συμπεριλαμβανομένων των λιποσωμάτων, των νανοσωματιδίων, των νανογαλακτωμάτων και των μικκυλίων [28].

Η μικκυλιακή μας σύνθεση με Pluronic F127 αυξάνεταικερσετίνηδιαλυτότητα δεκαπλάσια και, σε μελέτες in vitro, έχει δείξει καλύτερη συμπεριφορά διάλυσης σε προσομοιωμένα γαστρικά και εντερικά υγρά, καθώς επιτυγχάνει σημαντική μείωση του μεγέθους των σωματιδίων και πιο ομοιογενή διασποράκερσετίνηστην πολυμερή μήτρα I3l. Αυτή η σύνθεση παρέχει μια σημαντικά αυξημένη ποσότητακερσετίνηστην κυκλοφορία του αίματος, με αποτέλεσμα μια 3-πλάσια βιοδιαθεσιμότητα που, περιέργως, μεταφράζεται μόνο σε ελαφρώς υψηλότερο νεφροπροστατευτικό αποτέλεσμα. Συμφωνώντας, δεν παρατηρήσαμε επιπλέον νεφροπροστατευτική δράση όταν χρησιμοποιήσαμε υψηλότερη δόση (δηλ. 100 mg/kg) φυσικούκερσετίνησε προηγούμενα πειράματα (αδημοσίευτες παρατηρήσεις μας)[25,26]. Σε αυτές τις μελέτες, η ερμηνεία μας ήταν ότι, πιθανώς, υψηλότερες δόσεις ipκερσετίνη(i.e., >50 mg/kg) δεν μεταφράστηκε σε αυξημένη βιοδιαθεσιμότητα λόγω της μειωμένης διαλυτότητας, η οποία οδήγησε σε μη σημαντικά αυξημένη καθαρή απορρόφηση. Αυτό συνέπεσε με κίτρινες αποθέσεις μη απορροφημένωνκερσετίνηπου βρέθηκε στην περιτοναϊκή κοιλότητα κατά τη θυσία. Επιπλέον, τα σημερινά μας αποτελέσματα δείχνουν ότι ακόμη υψηλότερες συγκεντρώσεις κερκετίνης στο πλάσμα (όπως αυτές που λαμβάνονται με την P-quercetin) μεταφράζονται σε ελαφρώς υψηλότερο αποτέλεσμα. ΕπειδήκερσετίνηΗ κατανομή έχει εξηγηθεί σε απλοποιημένη μορφή από ένα μοντέλο πρώτης τάξης, δύο διαμερισμάτων [51], η πρόσβαση στα κύτταρα-στόχους από το κύριο διαμέρισμα (δηλ. την κυκλοφορία του αίματος) δεν φαίνεται να είναι ο περιορισμός. Έτσι, ο λόγος για τον οποίο το μέγιστο νεφροπροστατευτικό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται σχεδόν με τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις στο πλάσμα που αποδίδει η φυσική κερκετίνη παραμένει αδιευκρίνιστος.

Αυτό έχει πρακτικές επιπτώσεις για την περαιτέρω ανάπτυξη τουκερσετίνηως προφυλακτικό νεφροπροστάτη. Πρώτον, αυτά τα αποτελέσματα ανοίγουν τη δυνατότητα να μελετηθεί εάν τα σχήματα χαμηλότερης δόσης θα είναι εξίσου αποτελεσματικά, ως άφθονη περίσσεια βιοδιαθεσιμότητας του P-κερσετίνημπορεί να θυσιαστεί χωρίς να χάσει κανένα θεραπευτικό αποτέλεσμα, αλλά θα μεγιστοποιήσει το προφίλ ασφάλειας. Δεύτερον, η ευκαιρία είναι πλέον ανοιχτή για χορήγηση από το στόμα, η οποία ωστόσο πρέπει να δοκιμαστεί για τη νέα σύνθεση. Η απορρόφηση από την περιτοναϊκή κοιλότητα αποφεύγει τους φραγμούς που συναντώνται μέσω της στοματικής οδού. Υποτίθεται ότι η υψηλότερη διαλυτότητα στον αυλό του εντέρου μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένηκερσετίνηβιοδιαθεσιμότητα εντός του θεραπευτικού παραθύρου. Τρίτον, η ενδοφλέβια οδός μπορεί τώρα να είναι μια ρεαλιστική εναλλακτική λύση με ελαχιστοποιημένη τοξικότητα, η οποία θα αποφύγει τους φραγμούς απορρόφησης. Μέχρι τώρα, πειραματικά ενέσιμα σκευάσματα τουκερσετίνηχρησιμοποίησε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ως διαλύτη [51].

Η σισπλατίνη είναι γνωστό ότι συσσωρεύεται και καταστρέφει τα εγγύς και άπω σωληνάρια και προκαλεί απόπτωση και νέκρωση των επιθηλιακών κυττάρων των σωληναρίων, ανάλογα με τη συγκέντρωση [16]. Το εγγύς τμήμα S3 επηρεάζεται περισσότερο, αν και τα S1 και S2 καταστρέφονται επίσης όλο και περισσότερο από υψηλότερες δόσεις. Σε συμφωνία με τις γνωστές αντιαποπτωτικές του ιδιότητες στα κύτταρα των σωληναρίων [52,53],κερσετίνημειωμένη αποεπιθηλιοποίηση του φλοιού. Το ίδιο αποτέλεσμα που παρατηρείται και με τα δύο σκευάσματα ενισχύει την ιδέα ότι τοκερσετίνηκινητική κατανομής στονεφράείναι κορεσμένα στη μελέτη μας. Επιπλέον, εντός τουνεφρά, κερσετίνηδείχνει διαφορετική συμπεριφορά κατά μήκος του νεφρώνα. Στην πραγματικότητα,κερσετίνηδεν είχε καμία επίδραση στον έξω μυελό, όπου βρίσκεται το τμήμα S3 των εγγύς σωληναρίων.Κερσετίνηφαίνεται να συσσωρεύεται στα S1, S2 ή στα περιφερικά σωληνάρια, τα οποία βρίσκονται κοντά στον φλοιό. Επειδή είναι άγνωστο πώς (δηλαδή, ποιοι μεταφορείς ή μονοπάτια διάχυσης) και από πού (δηλαδή, η αυλή ή η βασεοπλάγια πλευρά)κερσετίνηπρόσβαση στα σωληνοειδή κύτταρα, απαιτείται περισσότερη έρευνα για να εξηγηθούν αυτά τα διαφορικά αποτελέσματα.

Η μέτρια διατήρηση του ιστού του φλοιού μπορεί να εξηγήσει μόνο εν μέρει την επίδραση τουκερσετίνηστη νεφρική λειτουργία (δηλαδή, GFR). Μπορεί να προκύψει πρόσθετη προστασία από τις αγγειακές επιδράσεις τουκερσετίνη. Η λειτουργία του ενδοθηλίου συμμετέχει στη ρύθμιση της νεφρικής ροής αίματος (RBF) και του GFR ρυθμίζοντας τον συσταλτικό τόνο του προσαγωγού και του απαγωγού αρτηριδίου [54-57]. Η σισπλατίνη προκαλεί ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και αυτό πιστεύεται ότι συμβάλλει ουσιαστικά στην πτώση του GFR, μαζί με τη αγγειοσυστολή του νεφρικού προσαγωγού που προκαλείται από τους μηχανισμούς σωληναριακής ανάδρασης (ενεργοποιούνται από σωληναριακή βλάβη) και από φλεγμονώδεις κυτοκίνες [13,58]. Πράγματι, η αναστροφή της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας είναι ένα ευρέως αναγνωρισμένο αποτέλεσμα τηςκερσετίνη(και των φλαβονοειδών γενικά)[59-61l, που μπορεί να εξηγήσει γιατίκερσετίνηβελτιώνει το RBF (και συνεπώς το GFR), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [25]. Επιπλέον, αυτά τα ενδοθηλιακά-αγγειακά αποτελέσματα μπορεί επίσης να βοηθήσουν στην εξήγηση της ελαφρώς υψηλότερης αποτελεσματικότητας του P-κερσετίνηστη βελτίωση της νεφρικής λειτουργίας και στην αποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας. Πιθανώς δεν είναι παράλογο να υποθέσουμε ότι μια υψηλότερη βιοδιαθεσιμότητα μπορεί να έχει πιο τολμηρή επίδραση στην ενδοθηλιακή λεκάνη σε άμεση επαφή με το αίμα.

Μερικές από τις επιδράσεις που παρατηρήθηκαν μετά τη χορήγηση τουκερσετίνημπορεί να ασκηθεί από τους μεταβολίτες του.Κερσετίνημεταβολίζεται στον εντερικό βλεννογόνο και στο ήπαρ με αντιδράσεις γλυκουρονίωσης, θείωσης και μεθυλίωσης [62], με τους πιο άφθονους μεταβολίτες να είναι οι μεταβολίτες του γλυκουρονιδίου στην κυκλοφορία του αίματος [63]. ΕΙΔΙΚΑ,κερσετίνηΤο -3-bO-glucuronide (Q3GA), ένας κύριος μεταβολίτης του πλάσματος, έχει αποδειχθεί ότι ασκεί αντιφλεγμονώδη και αγγειακά αποτελέσματα, τόσο άμεσα όσο και μετά τον μεταβολισμό πίσω στη μορφή αγλυκόνης [64]. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για την κατανόηση των συγκεκριμένων μεταβολιτών που είναι υπεύθυνοι για τη νευροπροστασία και τη διαφορική παραγωγή και μετασχηματισμό τους από διαφορετικές θέσεις χορήγησης στους τελικούς στόχους τους.

Συμπερασματικά, αυτή η αρχική μελέτη δείχνει τις θεραπευτικές δυνατότητες του P-κερσετίνηως βελτιωμένο σκεύασμα με ενισχυμένες βιοφαρμακευτικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες, χρήσιμο για περαιτέρω ανάπτυξη και προοπτική κλινική χρήση στην προφύλαξη απόνεφροτοξικότητα.

Οφέλη της κερκετίνης στη νεφροτοξικότητα

4. Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα χημικά και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία) εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.

4.1.Παρασκευή της μυκηλιακής σύνθεσης (P-κερσετίνη)και το ΦυσικόΚερσετίνηΔιατύπωση

Κερσετίνηένυδρο άλας (ελάχιστη καθαρότητα 95 τοις εκατό) αποκτήθηκε από την Acros Organics (Μαδρίτη, Ισπανία) και το μπλοκ συμπολυμερές οξειδίου αιθυλενίου-προπυλενοξειδίου Pluronic F127 (μέσο μοριακό βάρος 12,6 kDa, υδρόφιλο-λιπόφιλο ισοζύγιο 22,Raffen 22,Raud παρέχεται από την Γερμανία). Για το μικκυλιακό σκεύασμα, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική καταβύθισης υπερκρίσιμου αντιδιαλύτη για την παραγωγήκερσετίνη/Σωματίδια Pluronic F127 (P-κερσετίνη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Το προκύπτον Pluronic-κερσετίνηΤο σκεύασμα είχε σχετική σύνθεση 50 τοις εκατό /50 τοις εκατό w/w Pluronic F127/κερσετίνη. Για το φυσικόκερσετίνηδιατύπωση,κερσετίνητέθηκε σε αναστολή σε 0.16 τοις εκατό Tween 20 σε αλατούχο διάλυμα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25,26].

4.2. Ζώα και Βιοηθική

Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Βιοηθικής του Πανεπιστημίου της Sala-manca και την Περιφερειακή Κυβέρνηση της Καστίλλης και Λεόν, Υπουργείο Γεωργίας και Κτηνοτροφίας (κωδικός: 0000037, 27 Ιουλίου 2015). Ο χειρισμός των ζώων έγινε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Οδηγίας 2010/63/UE του Συμβουλίου της Ευρωπαϊκής Κοινότητας και με την ισχύουσα ισπανική νομοθεσία για τη χρήση και τη φροντίδα σε πειραματόζωα (RD53/2013, 01 Φεβρουαρίου 2013). Οι αρσενικοί αρουραίοι Wis-tar (200-250 g) διατηρήθηκαν υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες εντός των εγκαταστάσεων του Πανεπιστημίου της Σαλαμάνκα Animal House, με δωρεάν πρόσβαση σε νερό και τυπική τροφή.

4.3. Μελέτη βιοδιαθεσιμότητας

Οι αρουραίοι χωρίστηκαν σε δύο πειραματικές ομάδες: O (n=5), στις οποίες τα ζώα έλαβαν μία δόσηκερσετίνη(50 mg/kg); και PQ(n=5), στα οποία τα ζώα έλαβαν μία μόνο ip ισομοριακή δόση P-κερσετίνη(100 mg/kg (δηλ. περιέχει 50 mg/kgκερσετίνη). Στη συνέχεια, λήφθηκαν δείγματα αίματος σε σωλήνες επικαλυμμένους με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) από μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς στις ακόλουθες στιγμές:0.25,0.5,1,2,8, 12 και 24 ώρες. Το πλάσμα ελήφθη με φυγοκέντρηση και 10 μL ασκορβικού οξέος 10 mM (για αποφυγήκερσετίνηαποικοδόμηση) προστέθηκε σε 100 μL πλάσματος και καταψύχθηκε σε -80 βαθμό μέχρι την ανάλυσή του.ΚερσετίνηΟι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν με μέθοδο υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) αντίστροφης φάσης με ανίχνευση UV. Χρησιμοποιήθηκε στήλη C18 μεγέθους σωματιδίου Prosper 3 um, με κινητή φάση αποτελούμενη από 28 τοις εκατό ακετονιτρίλιο και 72 τοις εκατό από υδατικό διάλυμα ορθοφωσφορικού οξέος 2 τοις εκατό, με ταχύτητα ροής 1 mL/min. Το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 371 nm. Πριν από την έγχυση στον εξοπλισμό χρωματογραφίας, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε διαδικασία γλυκουρονίωσης για τον ποσοτικό προσδιορισμό του συνολικούκερσετίνη. Για το σκοπό αυτό, 1000 μονάδες -γλυκουρονιδάσης από Helix pomatia σε 0,1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα οξικού (pH 5) προστέθηκαν σε 100 μL πλάσματος και αυτό το μείγμα επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 1 ώρα. . Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια διαδικασία εκχύλισης με 100 μL ενός μίγματος 0,5M80∶20 ακετονιτριλίου/οξικού (τρεις φορές). Μόλις το υπερκείμενο εξατμίστηκε σε ρεύμα αζώτου, το ξηρό υπόλειμμα διαλύθηκε ξανά στην κινητή φάση των 40 μL και 20 μL εγχύθηκαν στο σύστημα HPLC.

4.4. Μελέτη Νεφροπροστασίας

Οι αρουραίοι χωρίστηκαν στις ακόλουθες πειραματικές ομάδες (Εικόνα 6): Τα ζώα ελέγχου (n=3) έλαβαν φορέα (NaCl0.9 τοις εκατό) ενδοπεριτοναϊκά (ip) για 9 ημέρες. Τα ζώα CP(n=5) έλαβαν μια εφάπαξ νεφροτοξική δόση σισπλατίνης (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3 του πειράματος. Τα ζώα CP συν Q(n=5) έλαβαν μια ημερήσια δόσηκερσετίνη(50 mg/kg, ip) για 9 ημέρες και μια εφάπαξ δόση σισπλατίνης (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3. και CP συν PQ (n=5) ζώα έλαβαν μια ημερήσια δόση P-κερσετίνη(100 mg/kg, ip (δηλ. περιέχει 50 mg/kgκερσετίνη)) για 9 ημέρες και μια δόση σισπλατίνης (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3.

Εικόνα 6. Σχήμα του μοντέλου νεφροτοξικότητας.

CP: σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) την ημέρα 3. CP συν Q:κερσετίνη(50 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) την ημέρα 3. CP συν PQ:P-κερσετίνη(100 mg/kg, ip.) για 9 ημέρες και σισπλατίνη (6,5 mg/kg, ip) την ημέρα 3.

Δείγματα αίματος (150 μL) συλλέχθηκαν τις ημέρες 0,3,5,7 και 9 σε ηπαρινισμένα τριχοειδή από μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς. Το πλάσμα διαχωρίστηκε με φυγοκέντρηση (11.000 rpm για 3 λεπτά) και διατηρήθηκε στους-80C. Τις ημέρες 7 και 9, συλλέχθηκαν ούρα 24 ωρών σε μεταβολικούς κλωβούς, καθαρίστηκαν με φυγοκέντρηση (2000× g για 9 λεπτά) και αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό . Στο τέλος του πειράματος (ημέρα 9), οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν και τουςνεφράτεμαχίστηκαν, ζυγίστηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 3,7 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για ιστολογικές μελέτες.

Η κρεατινίνη πλάσματος και ούρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ βασισμένο στη μέθοδο Jaffe [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Η ουρία πλάσματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ βασισμένο στη μέθοδο Jung [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Η κάθαρση κρεατινίνης (Clcr) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: Clcr=Crur × UF/ Crp); όπου το Crur αντιστοιχεί στη συγκέντρωση κρεατινίνης στα ούρα, το UF είναι η ροή των ούρων και η Crp είναι η συγκέντρωση της κρεατινίνης στο πλάσμα. Η πρωτεϊνουρία μετρήθηκε με τη δοκιμασία Bradford [67]. Το KIM-1 προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τον ΑρουραίοΝεφρόβλάβηmolecule 1(KIM-1)ELISA Kit (Cusabio, Houston. TX, USA). ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για ιστολογικές μελέτες, νεφρικά δείγματα ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και τομές ιστού 5 um χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Οι φωτογραφίες τραβήχτηκαν κάτω από μικροσκόπιο Olympus BX51 συνδεδεμένο με έγχρωμη ψηφιακή κάμερα Olympus DP70 (Olympus, Μαδρίτη, Ισπανία). Η ποσοτικοποίηση της ζημίας πραγματοποιήθηκε με τυφλό τρόπο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [68]. Εν ολίγοις, λήφθηκαν πέντε τυχαίες φωτογραφίες της περιοχής του φλοιού και πέντε φωτογραφίες της εξωτερικής μυελικής περιοχής (δηλαδή των περιοχών που έχουν υποστεί βλάβη από τη σισπλατίνη), χαρτογραφώντας ομοιόμορφα αυτές τις περιοχές. Κάθε εικόνα χωρίστηκε σε 10 πανομοιότυπες ενότητες (χρησιμοποιώντας λογισμικό Microsoft Office PowerPoint 2016), σε καθεμία από τις οποίες εκχωρήθηκε βαθμολογία 0 (καμία ζημιά), 1 (παρουσία ζημιάς σε λιγότερο από το 1/3 της περιοχής), 2 (παρουσία ζημιάς μεταξύ 1/3-2/3 της περιοχής) ή 3 (παρουσία ζημιάς σε περισσότερα από τα 2/3 της περιοχής). Η ζημιά αξιολογήθηκε λαμβάνοντας υπόψη την παρουσία σωληναριακής νέκρωσης και κυτταρικής απομάκρυνσης, διαστολής των σωληναρίων, κενοτοπίωσης, παρουσίας υαλικών εναποθέσεων και απώλειας του περιγράμματος της βούρτσας.

4.5.Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Τα ακραία σημεία προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Grubbs|69]. Η κανονική κατανομή των δεδομένων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ Shapiro-Wilk. Στη μελέτη βιοδιαθεσιμότητας, η σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων έγινε χρησιμοποιώντας το Student's t-test ή το Mann-Whitney U test. Η φαρμακοκινητική μελέτη διεξήχθη μέσω μιας ανεξάρτητης από το μοντέλο ανάλυσης των μέσων επιπέδων πλάσματος τουκερσετίνη. Οι εκτιμώμενες παράμετροι για την αξιολόγηση της σχετικής βιοδιαθεσιμότητας τουκερσετίνηήταν η περιοχή κάτω από τη μερική καμπύλη των επιπέδων πλάσματος (AUC) 24, η περιοχή κάτω από τη συνολική καμπύλη των επιπέδων στο πλάσμα (AUC)0~, η κλίση της τελικής φάσης, ο χρόνος ημιζωής αποβολής (ti/2) , και μέσος χρόνος παραμονής (MRT). Η εκτίμηση των φαρμακοκινητικών παραμέτρων πραγματοποιήθηκε με συνδυασμό της τραπεζοειδούς μεθόδου για την εκτίμηση της περιοχής κάτω από τη μερική καμπύλη και της μη γραμμικής παλινδρόμησης της τελικής φάσης της καμπύλης στάθμης πλάσματος. Για τη μελέτη νεφροπροστασίας, πραγματοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με τις δοκιμές Scheffe ή μια δοκιμή Kruskal-Wallis για συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Το Microsoft Office Excel και το PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία του έργου τέχνης και των εικονογραφήσεων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedΝεφροτοξικότητα. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Use καιΝεφροτοξικότηταστη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας.ΝεφρόInt.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, νεφρική δυσλειτουργία που σχετίζεται με το BADrug. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Blaskovich, MA; Δοκιμασίες για Πρόβλεψη Βασισμένες σε Cooper, MACell και ΒιοδείκτεςΝεφροτοξικότητα.

Σημείωση:τα παραπάνω δεν είναι πλήρης λίστα αναφοράς