Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 1

Το βότανο Cistanche έχει πολύ καλή νευροπροστατευτική δράση

2.6. Αντι-αποπτωτικές επιδράσεις των κυτοκινινών που προσδιορίζονται με μετρήσεις δραστηριότητας κασπάσης-3/7

Όπως φαίνεται από τους προσδιορισμούς χρώσης PI που περιγράφονται παραπάνω, το SAL προκάλεσε αυξήσεις στα ποσοστά θανάτου των κυττάρων SH-SY5Y. Καθώς το SAL σχετίζεται τόσο με την απόπτωση όσο και με τη νέκρωση [51], διερευνήσαμε επίσης την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και 7 (casp-3/7) ως ειδικός δείκτης απόπτωσης (η φάση εκτέλεσης) [52] μετά την έκθεση των κυττάρων σε CK. Οι δραστηριότητες κασπάσης-3/7 που καταγράφηκαν μετά από θεραπεία με καθεμία από τις υπό δοκιμή ενώσεις κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με εκείνες που καταγράφηκαν μετά από θεραπεία με 50{{3{0}} uM SAL (ορίστηκε ως 100 τοις εκατό ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, ο πολύ γνωστός αναστολέας κασπάσης Ac-DEVD-CHO (που περιλαμβάνεται ως ειδικός έλεγχος που σχετίζεται με την απόπτωση) ανέστειλε έντονα τη δραστηριότητα της κασπάσης-3/7 σε υπομικρομοριακές συγκεντρώσεις (έως 36,3 ± 2,66 και 25.2). ± 2,69 τοις εκατό των επιπέδων σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με SAL στα 0,05 και 0,5 μΜ, αντίστοιχα). Παρόμοια επίπεδα αναστολής έχουν παρατηρηθεί προηγουμένως [53] σε διαφορετικά in vitro μοντέλα νευροεκφυλισμού που βασίζονται σε κύτταρα SH-SY5Y. Ο θετικός μάρτυρας NAC μείωσε επίσης σημαντικά τη δραστηριότητα κασπάσης-3/7, σε 88,7 ± 1,87 τοις εκατό και 78,5 ± 2,56 τοις εκατό των επαγόμενων από SAL επιπέδων στα 100 uM και 1000 uM, αντίστοιχα. Τα δοκιμασμένα CK είχαν ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων στις δραστηριότητες κασπάσης-3/7. Είναι ενδιαφέρον από τις ριβοσίδες CK, μόνο το cZR είχε σημαντικά αποτελέσματα στις δραστηριότητες στα 0,1 uM (μειώνοντάς τα στο 83,3 ± 4,33 τοις εκατό των επαγόμενων από το SAL επιπέδων, αντίστοιχα), ενώ το iPR στο 1 uM δεν είχε σημαντική μείωση του casp{-3 ,7. Τέλος, το K3G μείωσε τη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 με μέγιστη επίδραση στα 10 uM (σε 81,7 ± 4,31 τοις εκατό του επιπέδου που προκαλείται από SAL). Συνολικά, το SAL προκάλεσε 1.6-πλάσια αύξηση στη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 σε σύγκριση με υγιή κύτταρα ελέγχου (CTR, Εικόνα 4), σύμφωνα με αποτελέσματα προηγούμενης μελέτης, στην οποία παρόμοια Χρησιμοποιήθηκε συγκέντρωση SAL (400 uM) και η ίδια κυτταρική σειρά [54]. Το NAC είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 σε διάφορα μοντέλανευρωνικόθάνατος [55-58]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ παρέχουν την πρώτη επίδειξη της κασπάσης-3/7 τους σε ένα μοντέλο που προκαλείται από SAL βασισμένο σε κύτταρα SH-SY5Yνευρωνικόθάνατος. Ο θετικός έλεγχος μείωσε τη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 που προκλήθηκε από 500 uM SAL με παρόμοιο τρόπο με τα CKs, αλλά το cZR και το K3G ήταν αποτελεσματικά ακόμη και σε υπομικρομοριακές ή μικρομοριακές συγκεντρώσεις. Άλλες μελέτες με μοντέλα στρες που σχετίζονται με PD (αναστολέας πρωτεασώματος MG 132- ή H2O2-προκαλούμενη τοξικότητα στα κύτταρα SH-SY5Y [17] και στους ινοβλάστες [15]) και τη νόσο του Huntington (μοντέλο πείνας ορού σε Τα κύτταρα PC12 [19]) έχουν επίσης δείξει ότι τα CKs K και tZR μπορούν να έχουν αντι-αποπτωτικές (κασπάση-3) δραστηριότητες [17], και ότι τόσο το K όσο και το tZR μπορούν να έχουν αντιγηραντικές δραστηριότητες [17,19] . Επιπλέον, συσχετίσεις μεταξύ της μείωσης casp-3,7 ενεργοποίησης καινευροπροστατευτικόαναφέρθηκε δραστηριότητα για τα μοντέλα SAL και SAL [54,59,60].

Εικόνα 4. Δραστηριότητα κασπάσης-3/7 στο μοντέλο PD που προκαλείται από SAL. Τριπλότυπα σε τουλάχιστον τέσσερις ανεξάρτητες ημέρες. * P σε σύγκριση με το όχημα με 500 uM SAL, # P σε σύγκριση με το όχημα χωρίς 500 uM SAL.

2.7. Προσδιορισμός της νευροπροστατευτικής δραστηριότητας κυτοκινίνης στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλουταμικό

Καθώς τα κύτταρα SH-SY5Y δεν εκφράζουν όλες τις υπομονάδες υποδοχέα NMDA [61], ο πιο πιθανός μηχανισμός τοξικότητας γλουταμικού (Glu) είναι η απόφραξη του αντιμεταφορέα κυστίνης/γλουταμινικού Xc με μαζική επαγωγή οξειδωτικού στρες [62]. Προηγούμενοι συγγραφείς έχουν ήδη αποδείξει μια συσχέτιση μεταξύ του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλουταμικό και της νεκρόπτωσης στα κύτταρα SH-SY5Y [63] και τη σημασία της ενεργοποίησης της κασπάσης-3 στην τοξικότητα που προκαλείται από το γλουταμικό προς αυτά [62,64]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει επίσης την εμφάνιση κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από σίδηρο (φερρόπτωση) μετά από δηλητηρίαση με γλουταμικό [62,65,66] και έχουν δείξει την εμφάνιση τριών τύπων κυτταρικού θανάτου (νέκρωση, απόπτωση και φερρόπτωση) μετά από αποκλεισμό του Xc - αντιμεταφορικό σύστημα. Προκειμένου να ολοκληρωθεί μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση τουνευροπροστατευτικόδυνατότητες των ελεγμένωνκυτοκινίνες, το σύστημα προσδιορισμού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλουταμικό συμπεριλήφθηκε σε ένα αναλυτικό πάνελ με το γνωστόνευροπροστατευτικόΧηλικός παράγοντας σιδήρου δεφεροξαμίνη (DFO) και αναστολέας νεκρόπτωσης νεκροστατίνη-1 (NEC-1) [67] ως θετικοί μάρτυρες. Εδώ, τα κύτταρα SH-SY5Y διαφοροποιήθηκαν για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 160 mM Glu ή σε συν-επεξεργασία αυτού με διάφορακυτοκινίνησυγκεντρώσεις ({{0}}.1–10 uM) για 24 ώρες και χρώση με PI. Σε αυτό το μοντέλο, η επίδραση του Glu στον κυτταρικό θάνατο ήταν 100 τοις εκατό σήμα PI, επομένως αξιολογήθηκε η μείωση του κυτταρικού θανάτου από τις υπό δοκιμή ενώσεις. Το Glu προκάλεσε σχεδόν 4-πλάσια αύξηση στον κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 τοις εκατό). Έλεγχος θετικών μαρτύρων καικυτοκινίνεςαποκάλυψε ότι και οι δύο θετικοί μάρτυρες NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 τοις εκατό) και DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 τοις εκατό) μείωσαν τον κυτταρικό θάνατο που προκλήθηκε από το γλουταμικό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, από τον πίνακα τουκυτοκινίνες, μόνο τρειςκυτοκινίνεςμπόρεσαν να προστατέψουννευρώνας-όπως τα κύτταρα SH-SY5Y με παρόμοιο τρόπο με τους θετικούς μάρτυρες. Οι πιο δραστήριοικυτοκινίνεςήταν τρανς-ζεατίνη (tZ) (0.1 uM, 79.5 ± 2.91 τοις εκατό, 1 uM, 81.3 ± 2.77 τοις εκατό) και cis-zeatin (CZ) (0.1 uM, 82.1 ± 3.29 ποσοστό ; 1 uM, {{2{0}}.2 ± 2,89 τοις εκατό ) και κινετίνη (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 τοις εκατό ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 τοις εκατό). Για να επιβεβαιωθεί η πολλά υποσχόμενη δραστηριότητά τους, χρησιμοποιήθηκε ένας ορθογώνιος προσδιορισμός για να αποσαφηνιστούν λεπτομερέστερα οι βιολογικές επιδράσεις των CKs σε αυτό το μοντέλο: Μια δοκιμασία απελευθέρωσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) [68], η οποία έδειξε επίσης μια δραματική (4-πλάση) αύξηση της τοξικότητας μετά από θεραπεία με Glu. Είναι ενδιαφέρον ότι ο προσδιορισμός της απελευθέρωσης LDH μας επέτρεψε να διαφοροποιήσουμε τις δραστηριότητες των CK και των θετικών μαρτύρων (NEC-1 και DFO). Τα CKs είχαν μέτρια αλλά σημαντική προστατευτική δράση (το tZ μείωσε τα ποσοστά θνησιμότητας σε 91,9 ± 1,40 τοις εκατό στα 0,1 uM· η cZ τα μείωσε σε 92,3 ± 1,15 τοις εκατό στα 0,1 uM και 91,7 τοις εκατό ± 1,56 τοις εκατό στο 1 uM, το K. 1,06 τοις εκατό σε 1 uM). Οι θετικοί έλεγχοι NEC-1 και DFO είχαν ισχυρότερα προστατευτικά αποτελέσματα αλλά ήταν αποτελεσματικοί σε πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις (μειώνοντας τα ποσοστά σε 76,9 ± 2,94 τοις εκατό και 81,6 ± 3,74 τοις εκατό στα 50 και 10 uM, αντίστοιχα) (Εικόνα 5Β). Η ανάλυση LDH επικύρωσε τις ενδείξεις που ελήφθησαν με χρώση PI και τα παρατηρούμενα αποτελέσματα των θετικών μαρτύρων ήταν σύμφωνα με τα δημοσιευμένα δεδομένα [69,70]. Τα ευρήματα σχετικά με τις επιδράσεις του Κ στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλυκόζη σε κύτταρα HT22 [18] και οι παρατηρήσεις μας για τις επιδράσεις των αντιπροσωπευτικών CKs όπως τα tZ, cZ και K δείχνουν ότι τα CK είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. 71]. Τέλος, τα tZ και cZ προτιμήθηκαν επειδή ήταν αποτελεσματικά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις και επιλέχθηκαν, μαζί με το K, για περαιτέρω μελέτες των επιπτώσεών τους στα επίπεδα οξειδωτικού στρες και ενεργοποίησης κασπάσης-3,7.

κιστανάκικριτικέςσχετικά με τις επιπτώσεις τουνευροπροστασία

2.8. Επιδράσεις των κυτοκινινών στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τη γλυκόζη σε κύτταρα SH-SY5Y

Σε αντίθεση με το προηγούμενο μοντέλο, το Glu μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες στα κύτταρα SH-SY5Y με διαφορετικές οδούς. Το ένα βασίζεται στην απόφραξη του αντιμεταφορέα κυστίνης/γλουταμινικού (Xc-), που οδηγεί σε εξάντληση της γλουταθειόνης (GSH) και αρνητικές επιδράσεις στη δραστηριότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) [62]. Ο κυτταρικός θάνατος με τη μεσολάβηση Glu περιλαμβάνει επίσης πιθανώς σχηματισμό ROS (ιδιαίτερα ρίζα υπεροξειδίου) που οδηγείται από Rac-NADPH-οξειδάση σε κύτταρα SH-SY5Y [72]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η κύρια αιτία κυτταρικού θανάτου στο μοντέλο που προκαλείται από Glu είναι το OS. Μέσα στο μοντέλο,νευρώναςΚύτταρα που μοιάζουν με Glu συν-επεξεργάστηκαν με Glu και δοκιμάστηκαν ενώσεις, χρωματίστηκαν με DHE και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, παρατηρήθηκε μια δραματική αύξηση του φθορισμού του κόκκινου DHE σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Glu, η οποία βελτιώθηκε από τις θετικές ουσίες ελέγχου και τις δοκιμασμένες CK. Με βάση την παρατήρηση με μικροσκόπιο, ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων υπεροξειδίου πραγματοποιήθηκε στα επαγόμενα από Glu κύτταρα με παρόμοιο τρόπο, με τη δοκιμασία DHE, με εκείνα σε κύτταρα που προκαλούνται από SAL. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με τα επίπεδα που προκλήθηκαν μόνο από Glu (ορίστηκε ως 100 τοις εκατό ), γεγονός που προκάλεσε μια δραματική, σχεδόν 3-πλάσια αύξηση στα επίπεδα υπεροξειδίου μέσα σε μόλις 4 ώρες τονευρώνας-όπως τα κύτταρα SH-SY5Y σε σχέση με τα επίπεδα σε υγιή κύτταρα ελέγχου (CTR: 33,79 ± 1,45 τοις εκατό). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, τα CKs όπως τα tZ, cZ και K μείωσαν σημαντικά το επίπεδο υπεροξειδίου σε κύτταρα με τοξίκωση με Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM και 10 uM K το μείωσε σε 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 και 83,8 ± 2,32 τοις εκατό των επιπέδων σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με Glu. Αυτά τα επίπεδα είναι συγκρίσιμα με εκείνα που λαμβάνονται με τον αναστολέα νεκρόπτωσης NEC{31}} (80,5 ± 3,19 τοις εκατό στα 5 μΜ και 80,4 ± 2,70 τοις εκατό στα 50 μΜ) και τον χηλικοποιητή σιδήρου DFO (80,2 ± 3,80 τοις εκατό στα 10 μΜ). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν με το μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλυκόζη, ιδιαίτερα τα αποτελέσματα των θετικών μαρτύρων, είναι σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [70,73]. Προηγούμενες ενδείξεις ότι τα CK έχουν αποτελέσματα μείωσης του OS σε επαγόμενα από Glu ή παρόμοια μοντέλα περιορίζονται σε μια απόδειξη ότι το K είναι ένας ισχυρός παράγοντας μείωσης του OS (περίπου 23 μΜ) στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από Glu με βάση τα κύτταρα HT22 [18. ]. Βρήκαμε ότι το K είχε επίδραση μείωσης του OS σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (1–10 uM) στα κύτταρα SH-SY5Y μας. Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί ευεργετικές μακροπρόθεσμες επιδράσεις του tZ στους ανθρώπινους ινοβλάστες, συμπεριλαμβανομένης της δραστηριότητας αποσύνθεσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου [15], υποδηλώνοντας ότι τα tZ και cZ μπορεί να έχουν έμμεσα αποτελέσματα μείωσης του OS σε μοντέλα κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από Glu. Επιπλέον, άλλες αναφορές επεσήμαναν τις συσχετίσεις μεταξύ της επίδρασης μείωσης του λειτουργικού συστήματος με τη μεσολάβηση CKs και της προστατευτικής δραστηριότητας [22,74-76]. Συνολικά, τα tZ, cZ και K έδειξαν εκπληκτικά ισχυρά αποτελέσματα μείωσης του λειτουργικού συστήματος, συγκρίσιμα με αυτά των θετικών μαρτύρων, παρά τις διαφορετικές δυνάμεις στο σύνολονευροπροστατευτικόαποτέλεσμα.

Εικόνα 5. (Α) Ποσοστό θανάτου τωννευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y σε μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλουταμικό (Glu). (Β) Τοξικότητα που προκαλείται από γλυκόζη (απελευθέρωση LDH) τουνευρώνας-όπως τα κύτταρα SH-SY5Y. Τριπλασιάζεται σε τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες ημέρες.* P σε σύγκριση με το όχημα με 160 uM Glu, # P σε σύγκριση με το όχημα χωρίς 160 uM Glu.

Σχήμα 6. (Α) Οξειδωτικό στρες (OS) που προκαλείται από γλυκόζη και δράση μείωσης του OS των ενδεικνυόμενων ενώσεων στον άνθρωπονευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y που οπτικοποιήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού μετά από επισήμανση με διυδροαιθίδιο (DHE). Μπάρες=50 um. Οι εικόνες δείχνουννευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (Έλεγχος), 160 mM γλουταμικό (Glu) μόνο και μαζί με: 10 uM δεφεροξαμίνη (συν DFO), 50 uM νεκροστατίνη{{6} } (συν NEC-1), 0,1 uM tZ (συν tZ) και 0,1 uM cZ (συν cZ) για 4 ώρες, στη συνέχεια χρώση με DHE. (Β) Σχηματισμός ρίζας υπεροξειδίου που προκαλείται από γλυκόζη σενευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y μετά από 4 ώρες. Το γράφημα εμφανίζει τον ποσοτικό προσδιορισμό των κυττάρων που έχουν χρωματιστεί με DHE χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Infinite M200 Pro (Tecan, Αυστρία). Τριπλότυπα σε πέντε ανεξάρτητες ημέρες.

* P σε σύγκριση με το όχημα με 160 uM Glu, # P σε σύγκριση με το όχημα χωρίς 160 uM Glu.

2.9. Επιδράσεις των κυτοκινινών στη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από γλυκόζη

Το Glu έχει παρόμοιες τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα SH-SY5Y με προηγουμένως αναφερθείσες επιδράσεις στα κύτταρα HT22 που σχετίζονται με την απόφραξη του Xc-αντιμεταφορέα. Έτσι, μηχανισμοί μη αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου (φερρόπτωση, νεκρόπτωση, κ.λπ.) εμπλέκονται και στις δύο περιπτώσεις [62] αν και η έκφραση της κασπάσης-3 και σε κάποιο βαθμό, η υπομονάδα NMDA του NR1 μπορεί να εμφανίζεται πιο έντονα στην SH -Κύτταρα SY5Y [61]. Ως εκ τούτου, τα τελικά στάδια του κυτταρικού θανάτου στις δύο κυτταρικές σειρές μπορεί να διαφέρουν. Ένας συνεισφορικός ρόλος της δραστηριότητας της κασπάσης{11}} έχει παρατηρηθεί σε πολλές μελέτες στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου των κυττάρων SH-SY5Y που προκαλείται από γλυκά [62,77-79]. Σε αυτή τη δοκιμασία,νευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εδώ με 160 mM Glu, το οποίο οδηγεί σε αύξηση της δραστηριότητας κασπάσης-3/7. Σε προσπάθειες να διευκρινιστεί ο ρόλος της απόπτωσης στον επαγόμενο από Glu θάνατο των κυττάρων SH-SY5Y, ένας ειδικός αναστολέας κασπάσης-3/7, Ac-DEVD-CHO, εφαρμόστηκε και βρέθηκε να έχει ισχυρή ανασταλτική δράση: Στα 50 nM μείωσε τη δραστηριότητα κασπάσης-3,7 στο 23,70 ± 1,01 τοις εκατό του επιπέδου στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία

μόνο με Glu και στα 0,5 uM σχεδόν εντελώς απέκλεισε τη δραστηριότητα (μειώνοντάς την σε ένα κανονικοποιημένο επίπεδο μόλις 7,22 ± 1,05 τοις εκατό, συγκρίσιμο με το επίπεδο που παρατηρείται σε υγιή κύτταρα:

7,8 ± 0,39 τοις εκατό ), όπως φαίνεται στο Σχήμα 7. Η εφαρμογή θετικών μαρτύρων είχε ως αποτέλεσμα μια σταδιακή δοσοεξαρτώμενη μείωση της δραστηριότητας της κασπάσης-3,7. Είναι ενδιαφέρον ότι το NEC-1 είχε ένα ελαφρύ αποτέλεσμα με μέγιστο αποτέλεσμα στα 50 uM και το DFO είχε πιο ισχυρή ανασταλτική δραστηριότητα στο 10 uM (μειώνοντας τη δραστηριότητα σε 80,5 ± 1,85 και 75,8 ± 3 .00 τοις εκατό , αντίστοιχα). Από την άλλη πλευρά, μόνο ελαφρά, αλλά σημαντικά αποτελέσματα στο casp-3,7 επιτεύχθηκαν με tZ σε 1 uM (89,5 ± 2,50 τοις εκατό), cZ σε 0,1 uM (87,4 ± 1,62 τοις εκατό) και K σε 1 uM ( 91,0 ± 2,06 τοις εκατό). Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο θετικοί μάρτυρες είχαν ισχυρότερη δραστηριότητα μείωσης της δραστηριότητας κασπάσης-3/7 από τα CK που δοκιμάστηκαν, αλλά τα CK είχαν αποτελέσματα σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαμόρφωση της δραστηριότητας κασπάσης-3/7 παίζει βασικό ρόλο στηννευροπροστατευτικόδραστηριότητα παραγόντων όπως το DFO [58] στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από Glu [79,80]. Ωστόσο, όπως φαίνεται σε αυτήν την ενότητα, το NEC-1 είχε επίσηςνευροπροστατευτικόδραστηριότητα, υποδηλώνοντας ότι άλλοι τύποι κυτταρικού θανάτου μπορεί να εμπλέκονται στον επαγόμενο από Glu θάνατο κυττάρων SH-SY5Y που μοιάζουν με νευρώνες [63,67,81]. Ενδείξεις ότι μηχανισμοί ανεξάρτητοι από κασπάση εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από Glu έχουν επίσης ληφθεί σε αναλύσεις των επιδράσεων των NEC-1 [70], DFO [69] και K [18] σε κύτταρα HT22.

Εικόνα 7. Δραστηριότητα κασπάσης-3/7 στο Glu-μοντέλο οξειδωτικής βλάβης τουνευρώνας-όπως τα κύτταρα SH-SY5Y. Τριπλότυπα σε τουλάχιστον τέσσερις ανεξάρτητες ημέρες. * P σε σύγκριση με το όχημα με 160 uM Glu, # P σε σύγκριση με το όχημα χωρίς 160 uM Glu.

3. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, η μελέτη μας αποκάλυψε ότι τα CK και οι μεταβολίτες τους έχουννευροπροστατευτικόδραστηριότητες στο μοντέλο που προκαλείται από SALΝόσος Πάρκινσονκαι οξειδωτική βλάβη που προκαλείται από Glu σε ανθρώπινο διαφοροποιημένο SH-SY5Yνευρωνικόκύτταρα. Τα K3G, cZR και iPR βρέθηκαν να έχουν βιολογικά σημαντικάνευροπροστατευτικόδραστηριότητες. Επιπλέον, τα ενεργά CK ήταν αποτελεσματικά σε χαμηλότερες (υπομικρομοριακές και μικρομοριακές) συγκεντρώσεις από την ουσία θετικού ελέγχου NAC. Τα K3G, cZR και iPR είχαν επίσης θετικά αποτελέσματα στη βιωσιμότητα, την κυτταροτοξικότητα, το οξειδωτικό στρες και τη δραστηριότητα κασπάσης-3,7 (εκτός του iPR). Οι ορθογώνιες επιδείξεις υποδεικνύουν έντονα ότι η δραστηριότητα του αντιοξειδωτικού στρες παίζει βασικό ρόλο στις προστατευτικές επιδράσεις των CK στο μοντέλο κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από SAL. Μόνο τρεις μεταβολίτες στο δοκιμασμένο πάνελ των CKs (tZ, cZ και K) προστατεύονταινευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y στο μοντέλο οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από Glu με παρόμοιο τρόπο με τον χηλικοποιητή σιδήρου NEC1 και τον αναστολέα νεκρόπτωσης DFO. Για να επιβεβαιώσουμε την πολλά υποσχόμενη δραστηριότητά τους, δοκιμάσαμε τα αποτελέσματά τους σε ορθογώνιο προσδιορισμό απελευθέρωσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH). Τα CKs είχαν μέτρια αλλά σημαντική προστατευτική δράση. Αυτό ήταν ασθενέστερο από τις αντίστοιχες δραστηριότητες των ουσιών ελέγχου, αλλά παρά τις διαφορές στη διαμόρφωση τουνευρωνικόυγείας, και τα τρία CK που δοκιμάστηκαν προκάλεσαν ισχυρές μειώσεις στο σχηματισμό ριζών υπεροξειδίου, παρόμοια με τις ουσίες θετικού ελέγχου. Τα CK είχαν επίσης συγκρίσιμα αποτελέσματα στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από Glu στα κύτταρα SH-SY5Y με εκείνα των NEC1 και DFO, αλλά αυτές οι ενώσεις είχαν ισχυρότερα ανασταλτικά αποτελέσματα στη δραστηριότητα κασπάσης-3/7 από τα CKs. Καθώς ο κυτταρικός θάνατος που προκαλείται από γλυκόζη δεν βασίζεται σε μια εξαρτώμενη από την κασπάση οδό, όπως φαίνεται σε μελέτες των επιδράσεων των DFO και NEC-1 σε κύτταρα HT-22 [70], τα CKs μπορούν προφανώς να τροποποιήσουν και τις δύο κασπάση εξαρτώμενος και ανεξάρτητος κυτταρικός θάνατος με μείωση του οξειδωτικού στρες [18,82]. Σε συνεχιζόμενες μελέτες, ο λεπτομερής μηχανισμός δράσης των CK και/ή οι μιτοχονδριακές επιδράσεις τους σενευρωνικόή αστροκύτταρα θα διερευνηθούν.

κιστανάκιεμπειρίαγια τοΠ.Δκαιμνήμη

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

ΚυτοκινίνηΤα πρότυπα ελήφθησαν από την OlChemIm (Olomouc, Δημοκρατία της Τσεχίας). Calcein AM (διάλυμα 1 mg/mL) και κιτ απελευθέρωσης LDH και κιτ ανάπτυξης Neurite αγοράστηκαν από την ThermoFisher. Ιωδιούχο προπίδιο, διυδροαιθίδιο, συστατικά ρυθμιστικού διαλύματος δοκιμασίας κασπάσης- 3/7, μέσο DMEM/F12 1:1, ορός εμβρύου βοοειδών, θρυψίνη, ATRA, υδροβρωμική σαλσολινόλη, άλας μονονάτριου γλουταμικού, δεφεροξαμίνη, Ν-ακετυλοκυστεΐνη , Ac-DEVD-CHO, και DMSO για κυτταρικές καλλιέργειες αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich (Merck). Το υπόστρωμα Ac-DEVD-AMC προμηθεύτηκε από την Enzo Life Science.

4.2. Δοκιμασίες δραστηριότητας καθαρισμού ριζών ORAC

Η ικανότητα των ενώσεων να δεσμεύουν ελεύθερες ρίζες in vitro προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ικανότητας απορρόφησης ριζών οξυγόνου (ORAC). Εν συντομία, φλουορεσκεΐνη (100 uL, 500 mM) και 25 uL του διαλύματος της δοκιμασμένης ένωσης προστέθηκαν σε μια μικροπλάκα 96-πηγαδιού προεπωασμένη στους 37oC. Στη συνέχεια, 25 uL των 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Κυτταρική καλλιέργεια SH-SY5Y

Η κυτταρική σειρά ανθρώπινου νευροβλαστώματος SH-SY5Y που αγοράστηκε από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ΗΠΑ) αναπτύχθηκε στο τροποποιημένο Eagle's Medium και Ham's F12 Nutrient Mixture της Dulbecco (DMEM: F-12, 1:1) ), συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη στους 37 oC σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2. Τα κύτταρα πέρασαν έως και 20 φορές και τα μέσα άλλαζαν δύο ή τρεις φορές την εβδομάδα. Η κυτταρική πυκνότητα ορίστηκε όπως αρμόζει για την προγραμματισμένη ανάλυση (5000, 7000, 10.000 ή 20.000 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε 96-πλάκες πολλαπλών κοιλοτήτων σε 100 uL συνολικούς όγκους μέσου για κάθε πείραμα. Την ημέρα μετά τη σπορά, προστέθηκε στα κύτταρα ATRA σε 1 τοις εκατό μέσο FBS DMEM/F12 σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ και η επώαση συνεχίστηκε για άλλες 48 ώρες για να προκληθεί διαφοροποίηση, να επιτραπεί ο σχηματισμός μακρύτερων νευριτών και να μειωθεί πολλαπλασιασμός.

4.4. Μικροσκοπία

Μικρογραφίες τουνευρώναςΚύτταρα τύπου SH-SY5Y λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, Γερμανία) με κατάλληλο φίλτρο διέγερσης για τη δοκιμασία ή διάταξη φωτεινού πεδίου με ψηφιακή κάμερα υψηλής απόδοσης DP73 (Olympus, Tokyo, Japan ). Δεδομένου ότι η αναλογία σήματος προς θόρυβο για τη χρώση ήταν μέτρια, η αντίθεση προσαρμόστηκε ελαφρώς στο λογισμικό ImageJ (Fiji) χωρίς να επηρεαστεί η παρατήρηση που προέκυψε. Οι πρωτότυπες εικόνες περιλαμβάνονται στο Συμπληρωματικό Υλικό.

4.5. Χρώση κυτταρικής μεμβράνης (κιτ ανάπτυξης νευριτών, Invitrogen™)

Νευρώνας-όπως κύτταρα SH-SY5Y (5000 κύτταρα ανά φρεάτιο) που ελήφθησαν με τη διαδικασία διαφοροποίησης 48 ωρών χρωματίστηκαν με κιτ ανάπτυξης Neurite (Invitrogen™) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επισημάνθηκαν με ένα διάλυμα της χρωστικής μεμβράνης που παρέχεται με το κιτ (ακολουθώντας το πρωτόκολλο για 96 πλακίδια πολλαπλών φρεατίων) σε PBS για 20 λεπτά στους 37 oC, πλύθηκαν ξανά με PBS και εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού ( με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 533 και 585 nm, αντίστοιχα).

4.6. Κυτταρική Θεραπεία

Μετά τη διαδικασία διαφοροποίησης, το μέσο διαφοροποίησης άλλαξε σε 1 τοις εκατό μέσο DMEM/F12 συμπληρωμένο με δοκιμαστικές ενώσεις σε συγκεντρώσεις 0.1, 1 και 10 uM (με 7000 κύτταρα ανά φρεάτιο για δοκιμές κυτταροτοξικότητας), ή μαζί με την τοξίνη SAL στα 500 uM (με 7000–10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο) ή 160 mM Glu (με 20.000 κύτταρα ανά φρεάτιο) για κατάλληλη διάρκεια για τον τύπο της ανάλυσης (βιωσιμότητα, κυτταρικός θάνατος κ.λπ.). Τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο που περιείχε 0,0,1 τοις εκατό DMSO.

4.7. Κυτταρική βιωσιμότητα και κυτταρικός θάνατος

Η βιωσιμότητα τωννευρώναςΚύτταρα τύπου SH-SY5Y που αναπτύσσονται σε 96-μικροπλάκες φρεατίων (με περίπου 7000 κύτταρα ανά φρεάτιο) μετά από 24 ώρες θεραπειών αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία Calcein AM με μικρή τροποποίηση [31]. Το διάλυμα Calcein AM σε PBS που χρησιμοποιήθηκε είχε συγκέντρωση 0,75 μΜ και ο χρόνος επώασης ορίστηκε στα 50 λεπτά. Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας Infinite M200 Pro (Tecan, Αυστρία), με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 495 και 517 nm, αντίστοιχα.

Κυτταρικός θάνατος τουνευρώνας-όπως κύτταρα (μοντέλο SAL: 10,000 κύτταρα ανά φρεάτιο· Μοντέλο Glu: 20,000 κύτταρα ανά φρεάτιο) προσδιορίστηκε με ανάλυση PI όπως αναφέρεται από τους Stone et al. 2003 με μικρή τροποποίηση [83]. Εν συντομία, το μέσο του προκληθέντος από SAL μοντέλου αναρροφήθηκε και άλλαξε σε διάλυμα PI 1 ug/mL σε PBS, αλλά τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επαγωγή Glu έχουν ασθενέστερη προσκόλληση, επομένως προστέθηκε διάλυμα PI 1 mg/mL σε PBS δώστε μια τελική συγκέντρωση 1 ug/mL. Και στις δύο περιπτώσεις, τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλα 15-25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια μετρήθηκε ο φθορισμός PI από έναν αναγνώστη Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Αυστρία) με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 535 και 617, αντίστοιχα. Ο προκύπτων φθορισμός PI που λήφθηκε μόνο με τοξίνες ορίστηκε ως 100 τοις εκατό κυτταρικός θάνατος.

4.8. Μέτρηση οξειδωτικού στρες με τη δοκιμασία διυδροαιθιδίου (DHE).

Τα κύτταρα διαφοροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα για επαγωγή SAL (10,000 κύτταρα ανά φρεάτιο, 24 ώρες ή επαγωγή Glu (20,000 κύτταρα ανά φρεάτιο, 4 ώρες). στις επεξεργασίες, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 500 xg για 330 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια τα μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν (μετά την αναρρόφηση) με 10 μΜ διάλυμα DHE σε PBS. 96-πλάκες πολλαπλών φρεατίων με κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά στο δωμάτιο Η θερμοκρασία και στη συνέχεια ο φθορισμός DHE μετρήθηκε με έναν αναγνώστη μικροπλακών Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Αυστρία) με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 500 και 580 nm, αντίστοιχα. Ενδεικτικές μικροφωτογραφίες φθορισμού κυττάρων χρωματισμένων με DHE λήφθηκαν μετά από μέτρηση DHE με τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.

Το φυτό Cistanche έχει πολύ καλή νευροπροστατευτική δράση

4.9. Μέτρηση Caspase-3/7 Δραστηριότητα

Οι δοκιμασίες κασπάσης-3/7 ενός σταδίου πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με μια διαδικασία που δημοσιεύτηκε προηγουμένως [84]. Για καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε επαγωγή SAL και επαγωγή Glu, τα μείγματα αντίδρασης (κασπάση-3, ρυθμιστικό διάλυμα 7 και συστατικά με κύτταρα σε 96-πλάκες πολλαπλών κοιλοτήτων) επωάστηκαν για 2 ώρες και 3 ώρες στους 37 oC, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η δραστηριότητα κασπάσης{12}}/7 μετρήθηκε από έναν αναγνώστη μικροπλάκας Infinite M200 Pro (Tecan, Αυστρία) με μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής 346 και 438 nm, αντίστοιχα.

4.10. Στατιστική ανάλυση

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν σε τρεις έως πέντε (n {{0}}–5) ανεξάρτητες ημέρες. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM. Οι τιμές για όλες τις μετρούμενες μεταβλητές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM, οι οποίοι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), το οποίο χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη δημιουργία των ψηφίων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε από το πακέτο λογισμικού PAST (έκδ. 1.97) [85]. Για το πείραμα διαφοροποίησης χρησιμοποιήθηκε το Student t-test. Τα υπόλοιπα πειράματα αξιολογήθηκαν με τη μη παραμετρική δοκιμή Kruskal–Wallis με τη δοκιμασία Mann–Whitney post hoc με διαδοχική διόρθωση Bonferroni. Μια τιμή p < 0,05="" θεωρήθηκε="">

Συμπληρωματικό υλικό: Οι πρωτότυπες εικόνες είναι διαθέσιμες στο διαδίκτυο.

Συνεισφορές συγγραφέων: Οι συνεισφορές των συγγραφέων ήταν οι εξής: Έρευνα, μεθοδολογία, επικύρωση, ανάλυση δεδομένων, GG, CWD και JG. σύνταξη-προετοιμασία πρωτότυπου σχεδίου GG, CWD και MS. επιμέλεια δεδομένων, απόκτηση χρηματοδότησης, επίβλεψη, συγγραφή-αναθεώρηση και επεξεργασία, CWD, MS και PK Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση: Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε οικονομικά εν μέρει από επιχορηγήσεις από την Internal Grant Agency του Πανεπιστημίου Palacky στο Olomouc, Τσεχική Δημοκρατία (IGA{{0}}PrF_2020_021), την Τσεχική Υπηρεσία Επιχορηγήσεων ({{ 2}}S), και το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης—Project ENOCH (Αρ. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) και φοιτητική υποτροφία από το Palacky University's Endowment Fund.

Δήλωση του Συμβουλίου Θεσμικής Αναθεώρησης: Δεν ισχύει.

Δήλωση συγκατάθεσης μετά από ενημέρωση: Δεν ισχύει.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων: Τα δεδομένα περιέχονται στο άρθρο ή στο συμπληρωματικό υλικό.

Ευχαριστίες: Οι συγγραφείς ευχαριστούν τις Dita Jordovd, Jana Hrubešovd και Lucie Koplikovd για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια. Επιπλέον, οι συγγραφείς ευχαριστούν τη Sees-editing Ltd., το Ηνωμένο Βασίλειο για την αγγλική επιμέλεια του χειρογράφου.

Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Διαθεσιμότητα δειγμάτων: Δείγματα των ενώσεων δεν είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς.