Μέρος 2: Η εκροή μαγνησίου από τα κύτταρα Drosophila Kenyon είναι κρίσιμη για τη φυσιολογική και βελτιωμένη με δίαιτα μακροπρόθεσμη μνήμη

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ σε αυτήν στο Μέρος 1

Κάντε κλικ σε αυτήν στο Μέρος 3

Κάντε κλικ στοΣκόνη Cistanche tubulosa για μνήμη

Ένας ρόλος για το uex στα σώματα των μανιταριών

Για να εντοπίσουμε το uex στον εγκέφαλο, χρησιμοποιήσαμε αρχικά τις διαγονιδιακές μύγες VT23256-GAL4, στις οποίες το GAL4 καθοδηγείται από μια ακολουθία 853 bp από το πρώτο εσώνιο του uex (Kvon et al., 2014). Το UAS-EGFP που καθοδηγείται από VT αποκάλυψε περιορισμένη έκφραση σε ab KCs με ιδιαίτερα ισχυρή επισήμανση σε νευρώνες ab core (abc) (Εικόνα 3Α). Χρησιμοποιήσαμε επίσης το CRISPR για να εισαγάγουμε μια C-τερματική ετικέτα HA-επιτόπου στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης uex (Εικόνα 3 — συμπλήρωμα εικόνας 1Α). Αυτές οι μύγες ήταν βιώσιμες ως ομοζυγώτες υποδεικνύοντας ότι η προκύπτουσα πρωτεΐνη σύντηξης UEX::HA διατηρεί τη λειτουργία. Οι μύγες ανοσοχρώσης που φιλοξενούν αυτό το uex:: Ο τόπος HA με ένα αντίσωμα αντι-ΗΑ αποκάλυψε εμφανή επισήμανση όλων των κύριων τάξεων KC στο MB, επιπλέον της χαμηλότερης έκφρασης σε όλο τον εγκέφαλο (Εικόνα 3Β). Αυτό το προφίλ έκφρασης uex υποστηρίζεται επίσης από αναλύσεις αλληλουχίας ενός κυττάρου (Εικόνα 3 — συμπλήρωμα εικόνας 1Β, Croset et al., 2018; Davie et al., 2018). Δεδομένου του καθιερωμένου ρόλου των ab KCs στο οσφρητικό LTM (Pascual and Pre´at, 2001; Yu et al., 2006; Krashes et al., 2007; Krashes and Waddell, 2008), σκεφτήκαμε ότι ένας μνημονικός ρόλος για το UEX μπορεί να περιλαμβάνει έκφραση σε KCs.

Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε GAL4-κατευθυνόμενη έκφραση του RNAi για να ελέγξουμε εάν 24 ώρεςμνήμηαπαιτούμενη απόδοση uex στα MB. Μύγες που εκφράζουν uexRNAi (Perkins et al., 2015) σε όλα τα ab KCs (c739-GAL4; Yang et al., 1995; Perisse et al., 2013) ή μόνο σε abc KCs (NP7175- GAL4, Tanaka et al., 2008) έδειξε φυσιολογική άμεσημνήμηαλλά σημαντικά εξασθενημένη μνήμη 24 ωρών (Εικόνα 3Γ). Αντίθετα, η έκφραση uexRNAi στην επιφάνεια ab (abs, 0770-GAL4; Parisse et al., 2013) ή a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes et al., 2007) δεν άλλαξε σημαντικά την άμεση απόδοση ή την απόδοση LTM. Κανονικό 24ωρο ορεκτικόμνήμηΗ απόδοση είναι επομένως ιδιαίτερα ευαίσθητη στην έκφραση uex σε νευρώνες abc. Για να μειώσουμε την πιθανότητα το ελάττωμα μνήμης που σχετίζεται με το uexRNAi να προκύπτει από μια αναπτυξιακή συνέπεια, περιορίσαμε επίσης την έκφραση UAS-uexRNAi στην ενήλικη ζωή χρησιμοποιώντας χρονικό έλεγχο με τη μεσολάβηση GAL80ts (McGuire et al., 2003). Στους επιτρεπτούς 18°C, το GAL80ts συνδέεται με το GAL4 και καταστέλλει τη λειτουργία μεταγραφικού ενεργοποιητή του. Σε περιοριστικούς 30˚C, τα GAL80ts δεν μπορούν πλέον να συνδεθούν με το GAL4, το οποίο απελευθερώνει το GAL4 στην άμεση έκφραση του διαγονιδίου UAS-uexRNAi. Οι μύγες ανατράφηκαν μέσω της ανάπτυξης στους 18°C ​​και μετακινήθηκαν στους 30°C μετά το κλείσιμο. Ο περιορισμός της έκφρασης UAS-uexRNAi σε ab KCs σε ενήλικες μύγες χρησιμοποιώντας c739-GAL4 με GAL80ts παρήγαγε παρόμοιο ειδικό 24 ωρώνμνήμηελάττωμα σε σχέση με αυτό που παρατηρήθηκε όταν το UAS-uexRNAi εκφράστηκε χωρίς χρονικό έλεγχο (Εικόνα 3D–F). Αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα του knockdown UAS-uexRNAi χρησιμοποιώντας τον τόπο μας με ετικέτα uex::HA. Εγκέφαλοι από ετερόζυγες μύγες uex::HA που εκφράζουν uexRNAi στα ab και g KCs με MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-ΗΑ. Σύγκριση της έντασης της ανοσοσήμανσης σε εγκεφάλους από uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi πετάει με αυτό από το uex::HA; Το MB247-GAL4/ plus fies έδειξε ότι η έκφραση uexRNAi μείωσε σημαντικά το σήμα αντι-ΗΑ στα ab και g KCs (Εικόνα 3G και H). Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει την αποτελεσματικότητα του διαγονιδίου uexRNAi και τη χρησιμότητα του τόπου uex::HA που επεξεργάστηκε το CRISPR/Cas9.

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε εάν η έκφραση σε συγκεκριμένα KC ενός διαγονιδίου UAS-uex θα μπορούσε να αποκαταστήσει 24 ώρεςμνήμηικανότητα να πετάει uexMI01943.Μνήμηαπόδοση των μυγών uexMI{{10}}1943 μύγες που εκφράζουν UAS-uex σε ab και g KCs (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) ή μόνο τις ab KCs (c{{5 }}GAL4) βελτιώθηκε σημαντικά σε σχέση με αυτές των μυγών uexMI01943 και δεν διακρίθηκε στατιστικά από αυτό των μαρτύρων με άθικτη θέση uex (Εικόνα 4Α). Αντίθετα, η έκφραση UAS-uex σε a0 b0 , abc ή abs KC δεν αποκαταστάθηκεμνήμηαπόδοση σε μύγες uexMI01943 και η υπερέκφραση uex σε ab KC μυγών άγριου τύπου δεν αύξησε τη μνήμη 24 ωρών (Εικόνα 4Α και Β). Κανονικά 24 ώρεςμνήμηΗ απόδοση θα μπορούσε επίσης να αποκατασταθεί στις μύγες uexMI01943 εάν η έκφραση UAS-uex περιοριζόταν στους νευρώνες c739-GAL4 (όλοι οι ab KCs) στην ενήλικη ζωή χρησιμοποιώντας χρονικό έλεγχο με τη μεσολάβηση GAL80ts (Εικόνα 4Γ και Δ). Μαζί, αυτά τα πειράματα RNAi απώλειας λειτουργίας και αποκατάστασης αποδεικνύουν ότι το UEX παίζει σημαντικό ρόλο στους ενήλικες

Εικόνα 3. Η καταστροφή της έκφρασης uex σε κύτταρα ab Kenyon (KCs) βλάπτει το LTM. (Α) Ένα θραύσμα προαγωγέα uex-GAL4 κατευθύνει την έκφραση GFP σε abc KCs. Anti-GFP ανοσοχρωματισμένο uex-GAL4 (VT23256); Γραμμή UAS-EGFP. (Β) Αντι-ΗΑ ανοσοχρώση των εγκεφάλων που φιλοξενούν τον τόπο CRISPR/Cas9-επεξεργασμένος uex::HA

παρουσιάζει έντονη επισήμανση του UEX σε όλες τις κύριες υποδιαιρέσεις του σώματος μανιταριού (MB). Ράβδοι ζυγαριάς 20 mm. (Γ) RNAi knockdown του uex σε όλα τα ab (c739- GAL4) ή απλώς abc (NP7175-GAL4) KC ειδικά μειωμένα 24 ώρεςμνήμη. abs ({{0}}GAL4) ή μια0 b0 (c305a-GAL4) έκφραση KC δεν είχε αποτέλεσμα (σ<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 για άμεση και n=8–14 για 24 ώρεςμνήμη). (Δ) Παρατηρήθηκε ελαττωματικό LTM εάν η έκφραση uexRNAi περιοριζόταν σε ab KC ενήλικων μυγών χρησιμοποιώντας χρονικό έλεγχο με τη μεσολάβηση GAL80ts. (E) Η απόδοση του LTM δεν επηρεάστηκε εάν το uexRNAi διατηρήθηκε κατασταλμένο καθ' όλη τη διάρκεια και (F) Η απόδοση του LTM αποκαταστάθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα εάν η έκφραση του uexRNAi εκ νέου κατεστάλη για 3 ημέρες (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Συμπλήρωμα εικόνας 1. Σχέδιο κατασκευής για τη γραμμή uex::HA και τα διαγράμματα έκφρασης uex tSNE.

ab KCs. Η εύρεση ότι το abc RNAi knockdown του uex παράγει αμνήμηελάττωμα (Εικόνα 3C) αλλά η έκφραση UAS-uex στο abc δεν διασώζει το μεταλλαγμένο ελάττωμα uexMI01943 (Εικόνα 4Α) υποδηλώνει ότι η λειτουργία UEX στα abc KCs είναι απαραίτητη για την ορεκτική LTM, ενώ τόσο τα abc όσο και τα abs KC πρέπει να έχουν λειτουργικό UEX για υποστήριξη LTM. Επιπλέον, η ικανότητα του UAS-uex να επαναφέρει τις επιδόσεις στις μύγες uexMI0194 παρέχει περαιτέρω υποστήριξη ότι η uex είναι υπεύθυνη γιαμνήμηαπομείωση στις μύγες uexMI01943.

Η έκφραση uex στο MB υποστηρίζει Mg2 συν -βελτιωμένημνήμη

Στη συνέχεια ερευνήσαμε εάν το Mg2 συν σίτιση (4 ημέρες με 80 mM MgCl2) θα μπορούσε να βελτιωθείμνήμηαπόδοση σε μύγες με μειωμένη λειτουργία uex. Οι μύγες που φέρουν το αλληλόμορφο uexMI01943 (Εικόνα 4F) ή εκείνες που εκφράζουν UAS-uexRNAi στα ab KCs με c739-GAL4 (Εικόνα 4Ε) δεν εμφάνισαν ενισχυμένημνήμηόταν τρέφονται με 80 mM MgCl2, σε σύγκριση με μύγες που τρέφονται με 1 mM MgCl2. Επιπλέον, η βελτιωμένη μνήμη Mg2 plus ανακτήθηκε σε μεταλλαγμένες μύγες uexMI01943 όταν η έκφραση uex αποκαταστάθηκε στα ab KCs (Εικόνα 4F). Όλες οι μύγες ελέγχου (c739-GAL4, UAS-uexRNAi και UAS-uex) με μη διαταραγμένη έκφραση uex παρουσίασαν σημαντικά βελτιωμένημνήμηόταν τροφοδοτούνται με 80 mM σε σύγκριση με 1 mM MgCl2. Υπερέκφραση UAS-uex σε ab KCs με c739-GAL4 σε μύγες με γενετικό υπόβαθρο άγριου τύπου ούτε ενισχυμένο κανονικό 24ωρομνήμη(Εικόνα 4Β), ή σε μύγες που τρέφονται για 4 ημέρες με 40 ή 80 mM MgCl2 (Εικόνα 4G). Δοκιμάσαμε επίσης εάν 4 ημέρες με συμπλήρωμα MgCl2 80 mM ενίσχυσαν την απόδοση της μνήμης 24 ωρών μετά από αποτρεπτική προπόνηση σε απόσταση. Και πάλι, τομνήμηΟι μεταλλαγμένες μύγες άγριου τύπου, αλλά όχι uexMI01943 εμφάνισαν βελτίωση (Εικόνα 4 — Σχήμα συμπλήρωμα 1). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί δείχνουν ότι το βέλτιστομνήμηΗ ενίσχυση με τροφοδοσία Mg2 συν απαιτεί και μπορεί να υποστηριχθεί πλήρως από τη λειτουργία UEX στα ab KCs.

Το UEX είναι ένας λειτουργικά διατηρημένος μεταφορέας μαγνησίου

Δεδομένης της ισχυρής διατήρησης της αλληλουχίας του UEX με CNNM2/4 θηλαστικών, δοκιμάσαμε εάν το CNNM2 θα μπορούσε να υποκαταστήσει λειτουργικά το UEX και να αποκαταστήσει το ελάττωμα LTM των μυγών uexMI01943. Αρκετές σημειακές μεταλλάξεις στο CNNM2 έχουν εντοπιστεί σε ανθρώπους ασθενείς με υπομαγνησιαιμία, η οποία σχετίζεται με δυσπλασία του εγκεφάλου και διανοητική αναπηρία (Arjona et al., 2014). Η εισαγωγή των ισοδύναμων μεταλλάξεων στο CNNM2 του ποντικού (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W και CNNM2E122K) έδειξε ότι αυτές οι βλάβες που προέρχονται από τον ασθενή επηρεάζουν τη μεταφορά μαγνησίου (Arjona et al., 201). Κατασκευάσαμε μύγες που φέρουν διαγονίδια άγριου τύπου και αυτής της μεταλλαγμένης παραλλαγής UAS-CNNM2 (Εικόνα 5Α). Η χρώση για μια συσχετισμένη C-τερματική ετικέτα HA αποκάλυψε σαφή έκφραση όλων των παραλλαγών UAS-CNNM2::HA σε νευρώνες κοιλιακούς όταν οδηγήθηκαν με c739-GAL4 (Εικόνα 5—Σχήμα συμπλήρωμα 1). Ωστόσο, μόνο έκφραση άγριου τύπου CNNM2, και όχι σημειακές μεταλλαγμένες μορφές, σε ab KCs του uexMI01943

οι μεταλλαγμένες μύγες αποκαταστάθηκαν 24 ώρεςμνήμηαπόδοση (Εικόνα 5Β).

Δοκιμάσαμε επίσης εάν το UEX μπορεί να μεσολαβήσει στην εξώθηση Mg2 συν. Το UEX που εκφράζεται σε κύτταρα HEK293 που εντοπίζονται στη μεμβράνη πλάσματος και κύτταρα φορτωμένα με Mg2 plus και ο δείκτης Mg2 plus Magnesium Green έδειξε ταχεία εκροή Mg2 συν (Εικόνα 5—Σχήμα συμπλήρωμα 2 και Βίντεο 1), σε σύγκριση με κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με κενό φορέα. Η εξώθηση Mg2 plus που προκλήθηκε από το UEX ήταν αισθητά λιγότερο αποτελεσματική από ό,τι σε κύτταρα που εκφράζουν Ανθρώπινο CNNM4 (Εικόνα 5-σχήμα συμπλήρωμα 2), το οποίο είναι γνωστό ότι έχει παρόμοια αποτελεσματικότητα με το CNNM2 (Hirata et al., 2014). Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε εάν η έκφραση UEX και CNNM4 είναι ισοδύναμη. Παρόλα αυτά, η επίδειξη συμπληρωματικής συμπλήρωσης μεταξύ ειδών και δραστηριότητας εκροής Mg2 συν ορίζει το UEX ως λειτουργικό ομόλογο του CNNM2/4 θηλαστικού.

Εικόνα 4. Διάσωση του ελαττώματος LTM στις μύγες uexMI01943. Αποκατάσταση έκφρασης UAS-uex σε ab και g (MB247-GAL4) ή ab Kenyon κύτταρα (KCs) που διασώθηκαν 24 ώρεςμνήμηαπόδοση του uexMI01943 πετά, ενώ η έκφραση σε abc, abs ή0 b0 KCs όχι (σελ<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">μνήμηαπόδοση σε μύγες άγριου τύπου (ANOVA, n=8–12). (Γ) Το ελαττωματικό LTM διασώθηκε εάν η έκφραση UAS-uex περιοριζόταν σε ab KC ενήλικων μυγών χρησιμοποιώντας χρονικό έλεγχο με τη μεσολάβηση GAL80ts (σελ<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

για 24 ώρεςμνήμη) αλλά το (D) παρέμενε ελαττωματικό εάν δεν απελευθερωνόταν η έκφραση UAS-uex. (ΜΙ)ΜνήμηΗ ενίσχυση με διατροφικό Mg2 plus υποστηρίζεται από το UEX σε ab KCs. Η μνήμη των μυγών που εκφράζουν UAS-uexRNAi στα ab KCs δεν μπορεί να ενισχυθεί με τροφοδοσία Mg2 συν (t-test, n=8). (ΣΤ) Η μνήμη των μεταλλαγμένων μυγών uexMI01943 δεν μπορεί να ενισχυθεί με τροφοδοσία Mg2 συν, αλλά η ενίσχυση αποκαταστάθηκε εκφράζοντας το UAS-uex σε ab KCs (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Μνήμηβελτιώθηκε εάν οι μύγες τροφοδοτούνταν με 80 mM MgCl2, αλλά όχι με υποβέλτιστα 40 mM MgCl2 (σ.<0.05, anova,="" n="">

Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου περιλαμβάνει τα ακόλουθα συμπληρώματα εικόνας για το σχήμα 4:

Σχήμα συμπλήρωμα 1. Mg2 συν τροφοδοσία ενισχυμένο LTM μετά από αποτρεπτική προπόνηση σε απόσταση σε μεταλλαγμένες μύγες άγριου τύπου αλλά όχι uexMI01943.

Απαιτείται άθικτος τομέας CNBH γιαμνήμη

Δεδομένου του καθιερωμένου ρόλου για τη σηματοδότηση cAMP στομνήμη-σχετική πλαστικότητα σε ασπόνδυλα και θηλαστικά (Kandel, 2012), δοκιμάσαμε τη σημασία του τομέα CNBH στο UEX. Κατασκευάσαμε μύγες που φέρουν ένα σημειακώς μεταλλαγμένο διαγονίδιο CNBH UAS-uexR622K (Εικόνα 6Α). Η ισοδύναμη υποκατάσταση αμινοξέος R622K καταργεί τη δέσμευση cAMP στη ρυθμιστική υπομονάδα της εξαρτώμενης από cAMP πρωτεϊνικής κινάσης, PKA (Bubis et al., 1988). Η έκφραση UAS-uexR622K σε νευρώνες ab με c739-GAL4 δεν αποκατέστησε την απόδοση μνήμης 24 ωρών ούτε άλλαξε την άμεσημνήμηαπόδοση, μεταλλαγμένων μυγών uexMI01943 (Εικόνα 6Β).

Χρησιμοποιήσαμε επίσης το CRISPR για να προσπαθήσουμε να εισαγάγουμε τη μετάλλαξη R622K στο CNBH του εγγενούς τόπου uex (Bassett et al., 2013; Gratz et al., 2013; Yu et al., 2013). Απροσδόκητα, αυτή η προσέγγιση δεν εισήγαγε την υποκατάσταση R622K, αλλά αντικατέστησε το T626 στο CNBH με το NRR. Τυχαία, οι ομόζυγες μύγες για αυτό το αλληλόμορφο uexT626NRR ήταν βιώσιμες ως ενήλικες, σε αντίθεση με εκείνες που ήταν ομόζυγες για το uexD, γεγονός που υποδηλώνει ότι το UEX που κωδικοποιείται από το uexT626NRR διατηρεί τη λειτουργία του. Ωστόσο, οι μύγες ομόζυγες για uexT626NRR ή ετερόζυγες μύγες uexT626NRR/uexMI01943 εμφάνισαν ισχυρό 24ωρομνήμηελάττωμα (Εικόνα 6Γ). Αμεσοςμνήμηήταν επίσης μειωμένη σε ομόζυγες μύγες uexT626NRR, σε αντίθεση με τις μύγες που φέρουν όλους τους άλλους συνδυασμούς αλληλόμορφων uex. Επιπλέον, τομνήμητων μυγών uexT626NRR δεν μπόρεσαν να βελτιωθούν με Mg2 συν τροφοδοσία (Εικόνα 6Δ). Η μετάλλαξη uexT626NRR, επομένως, αποσυνδέει το ουσιαστικό

Σχήμα 5. Το uex κωδικοποιεί έναν εξελικτικά διατηρημένο μεταφορέα Mg2 plus. (Α) Μοντέλο δομής πρωτεΐνης CNNM2 που δείχνει κλινικά σχετικές σημειακές μεταλλάξεις.

Προσαρμογή και τροποποίηση από Arjona et al., 2014. (Β) Η υπερέκφραση άγριου τύπου, αλλά όχι μεταλλαγμένου, CNNM2 σε κύτταρα ab Kenyon σώζει τομνήμηελάττωμα μεταλλαγμένων μυγών uexMI01943 (σελ<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου περιλαμβάνει τα ακόλουθα συμπληρώματα εικόνας για το σχήμα 5:

Συμπλήρωμα Εικόνας 1. Διαγονιδιακή έκφραση μεταλλαγμένων παραλλαγών του CNNM2.

Σχήμα συμπλήρωμα 2. Mg2 συν εκροή εξαρτώμενη από UEX σε κύτταρα HEK293.

ρόλος για uex από μια συνάρτηση στομνήμηκαι προτείνει ότι η ρυθμιζόμενη από κυκλικά νουκλεοτίδια δραστηριότητα είναι κρίσιμη για το UEX για να υποστηρίξει το φυσιολογικό και το Mg2 plus - ενισχυμένομνήμη. Αν και επιβεβαιώσαμε χρησιμοποιώντας western blotting ότι μια πρωτεΐνη πλήρους μήκους εκφράζεται σε μύγες uexT622NRR (Εικόνα 6Ε), το αντίσωμά μας δεν μας επέτρεψε να επαληθεύσουμε ότι η πρωτεΐνη UEXT626NRR εντοπίζεται κατάλληλα στον εγκέφαλο. Απαιτείται επομένως περαιτέρω εργασία για να χαρακτηριστεί ο κυτταρικός εντοπισμός, η δέσμευση cAMP και η λειτουργία μεταφοράς Mg2 συν της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από αυτό το παθολογικό αλληλόμορφο uexT626NRR.

Ο χρόνιος χειρισμός cAMP μεταβάλλει τον εντοπισμό UEX στα KC

Δοκιμάσαμε εάν το cAMP θα μπορούσε να αλλάξει απότομα τη δραστηριότητα του UEX εφαρμόζοντας φορσκολίνη σε κύτταρα HEK293 που εκφράζουν UEX. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε εμφανής αλλαγή στην εξαρτώμενη από το UEX δυναμική εκροής Mg2 συν εκροή (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Επομένως, εξετάσαμε εάν η έκφραση KC του UEX:: ΗΑ μεταβλήθηκε σε μύγες με χρόνιες αλλοιώσεις του

Ο μεταβολισμός του cAMP, εισάγοντας μεταλλάξεις σχετικές με τη μάθηση στην αδενυλική κυκλάση που έχει κωδικοποιηθεί από rutabaga και διεγείρεται από την αδενυλική κυκλάση ή την ειδική για cAMP φωσφοδιεστεράση που κωδικοποιείται από το dunce. Αντι-ΗΑ ανοσοχρώση εγκεφάλου από rut2080; uex::HA και dnc1; Οι μύγες uex::HA αποκάλυψαν μια εντυπωσιακή αλλαγή στον εντοπισμό UEX (Εικόνα 7Α και Β και βίντεο 2–4). Ενώ το UEX::HA ανιχνεύεται συνήθως στους λοβούς όλων των KC σε ένα περίπου ισοδύναμο επίπεδο σε μύγες άγριου τύπου, η επισήμανση ήταν χαμηλότερη στον λοβό MB g και πιο έντονη στα abc KC στο μεταλλαγμένο υπόβαθρο rut2080 και dnc1 (Εικόνα 7C) , αν και η συνολική έκφραση MB του UEX::HA είναι παρόμοια μεταξύ μυγών άγριου τύπου και μεταλλαγμένων μυγών (Εικόνα 7D). Επιπλέον, οι αναλύσεις στυπώματος Western της πρωτεΐνης που εξήχθη από τα κεφάλια αυτών των μυγών δεν αποκάλυψαν σημαντική διαφορά στα συνολικά επίπεδα έκφρασης UEX::HA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα είναι επομένως συνεπή με το cAMP που ρυθμίζει τη λειτουργία UEX και ίσως τον κυτταρικό εντοπισμό του σε KCs.

Το UEX απαιτείται για τη διατήρηση ενός κυμαινόμενου [Mg2 συν ]i στα ab KCs

Αν και το MagFRET μπορεί να αναφέρει [Mg2 συν ], δεν ανταποκρίνεται αρκετά γρήγορα για να καταγράψει σήματα που προκαλούνται από ερεθίσματα. Ως εκ τούτου, κατασκευάσαμε μύγες που φιλοξενούν διαγονίδια UAS για δύο νεότερους γενετικά κωδικοποιημένους αισθητήρες Mg2 plus, τον MagIC (non-FRET based; Koldenkova et al., 2015) και τον MARIO (με βάση FRET; Maeshima et al., 2018). Δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε την έκφραση UAS-MARIO στον εγκέφαλο της μύγας και επομένως μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε μόνο το UAS-MagIC. Το MagIC αναφέρθηκε ότι ανταποκρίνεται πιο έντονα στο Mg2 plus αλλά και σε μικρότερο βαθμό στο Ca2 plus (Koldenkova et al., 2015). Επομένως, πρώτα επαληθεύσαμε την ειδικότητα των αποκρίσεων MagIC σε ένα παρασκεύασμα εγκεφάλου με διαπερατό από κύτταρα ex vivo μύγα. Αφαιρέθηκαν εγκέφαλοι από μύγες που εκφράζουν UAS-MagIC σε ab KCs με c739-GAL4 (Εικόνα 8Α), επωάστηκαν σε ένα πιάτο με φυσιολογικό ορό (Barnstedt et al., 2016) και οι αλλαγές στον φθορισμό παρακολουθήθηκαν πριν και μετά την εφαρμογή μπάνιου - χημικών ουσιών. Ενώ η εφαρμογή MgCl2 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απόκριση MagIC, η χηλίνωση του Mg2 συν με EDTA προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση (Εικόνα 8Β και Βίντεο 5 και 6). Συγκριτικά, το CaCl2 κατέγραψε μόνο μια ελαφρά αύξηση στις υψηλότερες συγκεντρώσεις ενώ ο περισσότερο Ca2 συν-επιλεκτικός χηλικός παράγοντας EGTA είχε μικρή επίδραση (Εικόνα 8Β). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το UAS-MagIC μπορεί να παρακολουθεί το [Mg2 συν ]i στα ab KCs στον εγκέφαλο της μύγας.

Η αυξανόμενη ενδοκυτταρική cAMP έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί ροή Mg2 συν από κύτταρα θηλαστικών (Romani και Scarpa, 2000· Vormann and Gu¨nther, 1987· Jakob et al., 1989· Romani και Scarpa, 1990b· Romani και Scarpa, V, 1990 και Scarpa, Vormann και Gu¨nther, 1987· Jakob et al., 1990b· Romani και Scarpa, V. Gu¨nther, 1987· Gu¨nther et al., 1990· Howarth et al., 1994). Δεδομένου ότι τα πειράματά μας έδειξαν επίσης ότι το cAMP μπορεί να ρυθμίζει το UEX, δοκιμάσαμε στη συνέχεια εάν η διέγερση της σύνθεσης cAMP με φορσκολίνη (FSK) θα μπορούσε να αλλάξει τα σήματα MagIC στην κοιλιακή χώρα

Εικόνα 6. Η περιοχή ομολογίας κυκλικής δέσμευσης νουκλεοτιδίων (CNBH) του UEX απαιτείται για τη μνήμη. (Α) Σχηματική που δείχνει λεπτομέρειες αλληλουχίας της περιοχής CNBH στο UEX και τις αλλαγές αμινοξέων που έγιναν στο uexR622K και uexT626NRR. (Β) Η έκφραση ενός διαγονιδίου UAS-uexR622K σε κύτταρα ab Kenyon δεν έσωσε το ελάττωμα LTM των μεταλλαγμένων μυγών uexMI01943 (σελ<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Η εικόνα 6 συνεχίζεται

(Δ) Το διαιτητικό Mg2 plus δεν ενίσχυσε τη μνήμη των ομόζυγων μυγών uexT626NRR/uexT626NRR (σ<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. Για αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήσαμε και πάλι ένα ex vivo παρασκεύασμα εγκεφάλου αλλά αυτή τη φορά τα κύτταρα δεν ήταν διαπερατά. Το 30 mM FSK έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί μια κορυφαία αύξηση του cAMP στα KCs που προσεγγίζει αυτή που παρατηρήθηκε μετά την ορεκτική προετοιμασία (Louis et al., 2018). Εφαρμογή 30 mM FSK στο c739-GAL4; Οι εγκέφαλοι UAS-MagIC προκάλεσαν μια σταθερή δυναμική στον φθορισμό MagIC. Μετά από μια απότομη αρχική άνοδο, οι αποκρίσεις μειώθηκαν αργά προς τη γραμμή βάσης πριν αυξηθούν και πάλι αργά σε ένα σημείο στο οποίο το σήμα άρχισε να κυμαίνεται. (Εικόνα 8Γ και Δ και Βίντεο 7). Οι βασικές υπογραφές αυτής της απόκρισης καταγράφηκαν μόνο στο Mg2 συν ευαίσθητο σήμα Αφροδίτης (Εικόνα 8D). Αντίθετα, ο φθορισμός του mCherry δεν κυμάνθηκε αλλά μειώθηκε σταθερά καθ' όλη τη διάρκεια της εγγραφής (πιθανόν αποτέλεσμα φωτολεύκανσης), δείχνοντας ότι η διακύμανση στο σήμα της Αφροδίτης δεν είναι τεχνούργημα κίνησης (Εικόνα 8Ε). Είναι σημαντικό ότι οι αποκρίσεις MagIC που προκλήθηκαν από το FSK ήταν μεγαλύτερες από αυτές που ακολούθησαν την εφαρμογή φυσιολογικού ορού (Εικόνα 8—Σχήμα συμπλήρωμα 1Α). Ωστόσο, μια κυμαινόμενη απόκριση αναπτύχθηκε επίσης μετά από εφαρμογές φυσιολογικού ορού (Εικόνα 8—Σχήμα συμπλήρωμα 1Β) που υποδηλώνει ότι το ρυθμικό σήμα MagIC μπορεί να είναι μια γενική απόκριση σε μια αύξηση στο [Mg2 συν ]i που ακολουθεί την κυτταρική διαταραχή.

Το Drosophila MB έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι παρουσιάζει αργή ({0}}.004 Hz) ταλάντωση Ca2 συν σε ex vivo εγκεφάλους, ενώ μια πολύ πιο γρήγορη ταλάντωση 20 Hz προκαλείται από οσμές στην ακρίδα MB (Laurent and Naraghi, 1994; Rosay et al., 2001). Αν και ο αρχικός μας χαρακτηρισμός του MagIC στον εγκέφαλο της μύγας έδειξε μια προτιμησιακή απόκριση στο Mg2 plus (Εικόνα 8Β), παρόλα αυτά δοκιμάσαμε ρητά εάν η FSK προκάλεσε διακύμανση του [Ca2 συν ]i των ab KCs, χρησιμοποιώντας έκφραση του UAS-GCaMP6f (Chen et al., 2013). Το FSK προκάλεσε μια καθυστερημένη αύξηση στην απόκριση GCaMP αλλά δεν παρατηρήθηκε σαφής ταλαντωτική δραστηριότητα (Εικόνα 8-σχήμα συμπλήρωμα 1C–E).

Τέλος, δοκιμάσαμε εάν οι παρατηρούμενες αποκρίσεις MagIC ήταν ευαίσθητες στην κατάσταση του γονιδίου uex. Δημιουργήσαμε μύγες uexMI01943 που περιείχαν επίσης c379-GAL4 και UAS-MagIC και συγκρίναμε τις αποκρίσεις MagIC που προκαλούνται από το FSK και το αλατούχο διάλυμα με αυτές των μυγών με τόπο uex άγριου τύπου. Οι μεταλλαγμένες μύγες uexMI01943 έδειξαν αυξημένη απόκριση FSK σε αυτήν των μυγών άγριου τύπου, ενώ οι αποκρίσεις που προκαλούνται από αλατούχο διάλυμα ήταν δυσδιάκριτες (Εικόνα 8F και G). Οι αποκρίσεις που προκλήθηκαν από το ανενεργό ανάλογο FSK, ddFSK, δεν ήταν επίσης ευαίσθητες στην κατάσταση του uex (Εικόνα 8—σχήμα συμπλήρωμα 1F). Συνεπώς, η μετάλλαξη του uex αυξάνει επιλεκτικά τις αποκρίσεις MagIC που προκαλούνται από FSK.

Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα ίχνη MagIC από μεταλλαγμένες μύγες uex δεν εμφάνιζαν κυμαινόμενο σήμα (Εικόνα 8Η και Εικόνα 8 — συμπλήρωμα εικόνας 1G). Για να ποσοτικοποιήσουμε αυτή τη διαφορά υπολογίσαμε τη μέση φασματική πυκνότητα ισχύος (PSD) των ιχνών από uexMI01943 και μύγες άγριου τύπου που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FSK ή φυσιολογικό ορό. Και στις δύο συνθήκες η μέση PSD μετατοπίστηκε σημαντικά προς τα αριστερά προς χαμηλότερες συχνότητες στους μεταλλάκτες uexMI01943 σε σύγκριση με τους μάρτυρες άγριου τύπου (Εικόνα 8I). Οι εγκέφαλοι μύγας άγριου τύπου είχαν σημαντικά μεγαλύτερη ταλαντωτική δραστηριότητα με επίκεντρο γύρω στα 0,015 Hz από εκείνους από μεταλλάκτες uexMI01943. Αυτά τα δεδομένα επομένως υποδηλώνουν ότι το UEX απαιτείται για την αργή ρυθμική διατήρηση του KC [Mg2 συν ]i. Είναι σημαντικό, η διαπίστωση ότι τα σήματα MagIC είναι αυξημένα και αλλοιωμένα σε μεταλλάξεις uex επιβεβαιώνει ότι οι παρατηρούμενες αποκρίσεις MagIC εξαρτώνται από το Mg2 συν. Επιπλέον, προτείνουν ότι το KC εξέφρασε τα όρια UEX Mg2 συν συσσώρευση, σύμφωνα με έναν ρόλο στην εξώθηση.

Συζήτηση

Παρατηρήσαμε μια ενίσχυση της οσφρητικής απόδοσης LTM όταν οι μύγες τρέφονταν για 4 ημέρες πριν από την προπόνηση με τροφή συμπληρωμένη με 80 mM [Mg2 συν]. Αυτό το αποτέλεσμα μοιάζει με αυτό που αναφέρθηκε σε αρουραίους, αν και απαιτήθηκαν μεγαλύτερες περίοδοι σίτισης για να αυξηθεί ο εγκέφαλος [Mg2 συν] σε επίπεδα ενίσχυσης της μνήμης (Slutsky et al., 2010). Μια διαφορά στον βέλτιστο χρόνο σίτισης μπορεί να αντανακλά το μέγεθος του ζώου και ίσως τη μεγαλύτερη βιοδιαθεσιμότητα του διατροφικού Mg2 συν στο Drosophila. Ενώ το Mg2 συν -L-threonate (MgT) ήταν ένα πιο αποτελεσματικό μέσο για την παροχή Mg2 plus από το χλωριούχο μαγνήσιο σε αρουραίους (Slutsky et al., 2010), παρατηρήσαμε παρόμοια βελτίωση της απόδοσης της μνήμης όταν οι μύγες τρέφονταν με χλωριούχο μαγνήσιο , θειικό μαγνήσιο ή MgT (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Σχήμα 7. Η έκφραση uex των κυττάρων Kenyon (KC) μεταβάλλεται σε μεταλλαγμένες μύγες rutabaga και dunce. (Α) Οι χρωματισμένοι εγκέφαλοι με αντι-ΗΑ αποκαλύπτουν ότι ο εντοπισμός της πρωτεΐνης UEX::ΗΑ αλλάζει στο rut2080. uex::HA και dnc1; Το uex::HA πετά, γίνεται πιο εμφανές στα abc KC (βέλη). Ράβδοι ζυγαριάς 20 mm. (Β) Μεγεθυσμένες εικόνες των σωμάτων μανιταριών (MBs) που υπογραμμίζουν την έκφραση abc KC σε μεταλλαγμένες μύγες rut2080 και dnc1, σε σύγκριση με μύγες άγριου τύπου uex::HA. Ράβδοι ζυγαριάς 20 mm. (Γ) Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού. Αριστερά, μικρογράφημα με γραμμή μέτρησης στην άκρη του λοβού και ορθογώνια ROI για τον λοβό g και μια περιοχή ελέγχου. Τα μεσαία, προφίλ σχετικής έντασης φθορισμού στο άκρο του λοβού δείχνουν σημαντικά υψηλότερο σήμα στις μεταλλαγμένες μύγες rut2080 και dnc1 στην κεντρική περιοχή που καταλαμβάνεται από τα KCs ab core (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Η αύξηση του [Mg2 συν ]e στον εγκέφαλο του αρουραίου οδηγεί σε αντισταθμιστική ανοδική ρύθμιση της έκφρασης της υπομονάδας NR2B του NMDAR και επομένως σε αύξηση της αναλογίας των NMDAR που περιέχουν μετασυναπτικό NR2B. Αυτή η κατηγορία NMDARs έχει μεγαλύτερο χρόνο ανοίγματος (Chen et al., 1999· Erreger et al., 2005) υποδηλώνοντας ότι αυτός ο διακόπτης στη σύνθεση υπομονάδας αντιπροσωπεύει έναν μηχανισμό ομοιοστατικής πλαστικότητας (Turrigiano, 2008) για να καλύψει το αυξημένο μπλοκ NMDAR που επιβάλλεται από αύξηση [Mg2 συν ]e. Επιπλέον, η υπερέκφραση του NR2B στον πρόσθιο εγκέφαλο του ποντικιού μπορεί να ενισχύσει τη συναπτική διευκόλυνση και τη μάθηση καιμνήμηαπόδοση (Tang et al., 1999), υποστηρίζοντας την αύξηση του NR2B που είναι ένας σημαντικός παράγοντας στο Mg2 συν ενισχυμένομνήμη. Ωστόσο, ακόμη και στην αρχική in vitro μελέτη της συναπτικής πλαστικότητας ενισχυμένης με Mg2 συν (Slutsky et al., 2004), σημειώθηκε ότι τα ρεύματα NMDAR ήταν ανεπαρκή για να εξηγήσουν πλήρως τις παρατηρούμενες αλλαγές.

Οι μελέτες μας για την απώλεια της λειτουργίας υπομονάδας NMDAR στα Drosophila KCs δεν βλάπτουν τα κανονικά ή ενισχυμένα με Mg2 συνμνήμη. Επιπλέον, δεν ανιχνεύσαμε μια προφανή αλλαγή στα επίπεδα της έκφρασης σε όλο τον εγκέφαλο των υπομονάδων υποδοχέα γλουταμικού σε μύγες που τρέφονται με Mg2 συν. Αν και η δραστηριότητα του NMDAR είχε προηγουμένως εμπλακεί στην οσφρητική Drosophilaμνήμη, τα αποτελέσματα αποδόθηκε κυρίως ότι λειτουργούν εκτός του ΜΒ (Xia et al., 2005; Wu et al., 2007). Επιπλέον, η υπερέκφραση Nmdar1 σε όλους τους νευρώνες, ή συγκεκριμένα σε όλα τα KC, δεν άλλαξε το STM ή το LTM. Η έκτοπη υπερέκφραση στα MB μιας έκδοσης NMDARN631Q, η οποία δεν μπορεί να αποκλειστεί από το Mg2 plus , επηρεάζει το LTM (Miyashita et al., 2012). Ωστόσο, αυτή η μετάλλαξη επιτρέπει την είσοδο του Ca2 συν με συνδέτη, χωρίς την ανάγκη συσχετισμένης νευρωνικής εκπόλωσης, η οποία μπορεί να διαταράξει τη λειτουργία του KC με απροσδόκητους τρόπους. Είναι ίσως πιο αξιοσημείωτο ότι η συναπτική κατάθλιψη που σχετίζεται με τη μάθηση στο ΜΒ μπορεί να προκληθεί από ντοπαμινεργικά σήματα διδασκαλίας που παραδίδονται σε χολινεργικές συνάψεις εξόδου από KC που ανταποκρίνονται στις οσμές σε συγκεκριμένα MBON (Claridge- Chang et al., 2009; Aso et al., 2012 Burke et al., 2012· Liu et al., 2012· Owald et al., 2015· Hige et al., 2015· Barnstedt et al., 2016· Parisse et al., 2016· Aso et al., 2014· Owald and Waddell, 2015· Handler et al., 2019). Είναι κατανοητό ότι τα KCs λαμβάνουν γλουταμικό, από μια πηγή που δεν έχει ακόμη εντοπιστεί, αλλά δεν υπάρχει επί του παρόντος εμφανής θέση στο δίκτυο MB για πλαστικότητα που εξαρτάται από το NMDAR. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η κανονική και ενισχυμένη με Mg2 συν - Drosophila LTM είναι ανεξάρτητη από τη σηματοδότηση NMDAR στα KC. Επιπλέον, οι μετρήσεις MagFRET μας δείχνουν ότι η τροφοδοσία Mg2 συν αυξάνει επίσης το [Mg2 συν ]i των ab KCs κατά περίπου

περίπου 50 mM.

Προσδιορίσαμε έναν ρόλο για το uex, τον ορθολόγο μιας μύγας της εξελικτικά συντηρημένης οικογένειας των μεταφορέων Mg2 τύπου CNNM συν εκροής (Ishii et al., 2016). Υπάρχουν τέσσερα διαφορετικά γονίδια CNNM σε ποντίκια και ανθρώπους, πέντε στο C. elegans και δύο στο zebrafish (Ishii et al., 2016· Arjona et al., 2013). Ο τόπος uex παράγει τέσσερα εναλλακτικά ματισμένα μεταγραφήματα mRNA, αλλά όλα κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη 834 aa. Ο ακριβής ρόλος των πρωτεϊνών CNNM στη μεταφορά Mg2 συν είναι κάπως αμφισβητούμενος (Funato et al., 2018a; Arjona and de Baaij, 2018; Funato et al., 2018b; Gime'nez-Mascarell et al., 2019). Ορισμένοι προτείνουν ότι οι πρωτεΐνες CNNM είναι άμεσοι μεταφορείς Mg2 plus, ενώ άλλοι υποστηρίζουν ότι λειτουργούν ως αισθητήρες ενδοκυτταρικού Mg2 συν συγκέντρωση [Mg2 συν ]i και/ή ρυθμιστές άλλων μεταφορέων Mg2 plus. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του Drosophila UEX ενισχύει την εκροή Mg2 συν στα κύτταρα HEK293 και ότι η ενδογενής UEX περιορίζει το [Mg2 συν ]i σε ab KCs στον εγκέφαλο της μύγας. Επομένως, εάν το UEX δεν είναι το ίδιο μεταφορέας Mg2 plus, πρέπει να είναι

ικανό να αλληλεπιδρά αποτελεσματικά με ανθρώπινους μεταφορείς εκροής Mg2 συν και να επηρεάζει την εξώθηση Mg2 συν στο Drosophila. Δεδομένου ότι η UEX είναι η μόνη πρωτεΐνη CNNM στη μύγα, μπορεί να εξυπηρετήσει όλους τους ρόλους των τεσσάρων μεμονωμένων CNNM θηλαστικών. Ωστόσο, η ικανότητα του ποντικιού CNNM2 να επαναφέρειμνήμηικανότητα για uex μεταλλαγμένες μύγες υποδηλώνει ότι ημνήμη-η σχετική συνάρτηση UEX μπορεί να αντικατασταθεί από αυτή του CNNM2.

Είναι ενδιαφέρον ότι καμία από τις σχετικές με τη νόσο παραλλαγές του CNNM2 δεν ήταν σε θέση να συμπληρώσει τομνήμηελάττωμα των μεταλλαγμένων μυγών uex. Η παραλλαγή CNNM2 T568I υποκαθιστά ένα μόνο αμινοξύ στη δεύτερη περιοχή CBS (Arjona et al., 2014). Οι ογκογόνες πρωτεϊνικές φωσφατάσες τυροσίνης της οικογένειας PRL (φωσφατάση του αναγεννούμενου ήπατος) συνδέονται με τις περιοχές CBS των CNNM2 και CNNM3 και μπορούν να αναστείλουν τη λειτουργία μεταφοράς Mg2 συν (Hardy et al., 2015; Gime'nez-Mascarell et al., 20). Zhang et al., 2017). Επομένως, θα έχει ενδιαφέρον να ελέγξουμε τον ρόλο των τομέων UEX CBS και εάν το fly PRL{10}} ρυθμίζει τη δραστηριότητα UEX.

Η ανάλυση RNA-seq αποκαλύπτει ότι το uex εκφράζεται έντονα στην πεπτική οδό και στο νευρικό σύστημα της προνύμφης και της ενήλικης μύγας, καθώς και στις ωοθήκες (Gelbart and Emmert, 2010; Croset et al., 2018; Davie et al., 2018) υποδηλώνοντας ότι πολλές μεταλλάξεις uex θα είναι πλειοτροπικές. Το αλληλόμορφο uexD μας, το οποίο διαγράφει 272 αμινοξέα (συμπεριλαμβανομένου μέρους του δεύτερου CBS και ολόκληρου του τομέα CNBH) από το C-άκρο UEX, οδηγεί σε αναπτυξιακή θνησιμότητα όταν είναι ομόζυγο, αποδεικνύοντας ότι το uex είναι απαραίτητο γονίδιο. Το CNNM4 των θηλαστικών εντοπίζεται στη βασοπλευρική μεμβράνη των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (Yamazaki et al., 2013). Εκεί πιστεύεται ότι λειτουργεί στη διακυτταρική μεταφορά Mg2 συν ανταλλάσσοντας το ενδοκυτταρικό Mg2 συν για εξωκυτταρικό Na συν μετά την είσοδο στην κορυφή μέσω των καναλιών TRPM7. Η θνησιμότητα στο Drosophila θα μπορούσε επομένως να προκύψει από την αδυναμία απορρόφησης επαρκούς Mg2 συν μέσω του εντέρου της προνύμφης. Ωστόσο, η νευρωνικά περιορισμένη έκφραση του uexRNAi με το elav-GAL4 έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη θνησιμότητα των προνυμφών (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδηλώνοντας ότι το UEX έχει έναν επιπλέον ρόλο στην πρώιμη ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, όπως το CNNM2 σε ανθρώπους και ζέβρα (Arjona et al., 2014· Accogli et al., 2019). Ίσως παραδόξως, οι μύγες που φέρουν ομόζυγους ή δια-ετερόζυγους συνδυασμούς αρκετών υπομορφικών αλληλόμορφων uex έχουν ελαττωματικά ορεκτικά και αποτρεπτικάμνήμηαπόδοση, ωστόσο φαίνονται κατά τα άλλα ανεπηρέαστα.

Η γενετική μηχανική του τόπου uex για την προσθήκη μιας C-τερματικής ετικέτας HA στην πρωτεΐνη UEX μας επέτρεψε να εντοπίσουμε την έκφρασή της στον εγκέφαλο. Η επισήμανση είναι ιδιαίτερα σημαντική σε όλες τις μεγάλες κατηγορίες KC. Ο περιορισμός του knockdown της έκφρασης uex σε όλα τα ab KC των ενήλικων μυγών ή ακόμα και μόνο στο υποσύνολο abc αναπαρήγαγε το ελάττωμα LTM. Η έκπτωση LTM ήταν εμφανής εάν η έκφραση uexRNAi σε νευρώνες κοιλιακούς

Εικόνα 8. Το UEX περιορίζει την αύξηση του [Mg2 συν ]i και υποστηρίζει μια αργή ταλάντωση στα κύτταρα ab Kenyon (KCs). (Α) Εγκέφαλος μύγας εκφυτεύματος που εκφράζει UAS-MagIC οδηγούμενο από c739-GAL4. Επάνω πίνακα, όψη αντίθεσης φάσης ευρέος πεδίου. μεσαία πάνελ, όψεις φθορισμού των καναλιών Venus και mCherry. κάτω πάνελ, ένα ομοεστιακό τμήμα στο επίπεδο του σώματος KC που δείχνει κανάλια Venus και mCherry. Ράβδοι ζυγαριάς 20 mm. (Β) Το MagIC ανταποκρίνεται επιλεκτικά σε αλλαγές στο [Mg2 συν ]i στα KC. Ίχνη αναλογίας MagIC μετά από εφαρμογή λουτρού 10, 20 ή 40 mM MgCl2 ή CaCl2. 5, 10 ή 20 mM EDTA ή EGTA. (Γ) Το αντιπροσωπευτικό ίχνος του Σχήματος 8 συνεχίστηκε στο επόμενο - Το Σχήμα 8 συνεχίστηκε

Ο λόγος MagIC μετά την εφαρμογή του FSK δείχνει ένα αρχικό κύμα που ακολουθείται από μια σταδιακή άνοδο και την ανάπτυξη μιας αργής ταλάντωσης. (Δ) Οι πρωτεύουσες αποκρίσεις προκύπτουν από αλλαγές στο Mg2 συν ευαίσθητο σήμα της Αφροδίτης. (Ε) Το σήμα mCherry παρουσιάζει μια σταθερή αποσύνθεση. (ΣΤ) Οι αποκρίσεις MagIC που προκαλούνται από FSK είναι μεγαλύτερες σε μεταλλαγμένες μύγες uex. Οι μέσες αποκρίσεις MagIC δείχνουν ότι το FSK προκάλεσε σημαντικά μεγαλύτερη αύξηση στο μεταλλαγμένο uexMI01943 από ό,τι σε μύγες άγριου τύπου. (ΣΟΛ). Οι μέσες αποκρίσεις MagIC που προκαλούνται από αλατούχο διάλυμα δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά στις μεταλλαγμένες μύγες uex. (Η) Τα μεμονωμένα ίχνη καναλιών Venus (πράσινη) και mCherry (κόκκινο) δείχνουν ότι η αργή ταλάντωση είναι εμφανής μόνο στο κανάλι Venus των μυγών άγριου τύπου, αλλά όχι μεταλλαγμένων uex. (I) Η ανάλυση φασματικής πυκνότητας ισχύος (PSD) της χρονοσειράς από 200 έως 900 s όλων των δεδομένων δείχνει ότι τα ίχνη από μύγες άγριου τύπου έχουν σημαντικά μεγαλύτερη ταλαντωτική δραστηριότητα, με κέντρο γύρω στα 0,015 Hz, από εκείνα από μεταλλαγμένες μύγες uex.

Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου περιλαμβάνει τα ακόλουθα συμπληρώματα εικόνας για το σχήμα 8:

Συμπλήρωμα εικόνας 1. Μεμονωμένα ίχνη για απεικόνιση MagIC και GCaMP.