Μέρος 1: Η εκροή μαγνησίου από τα κύτταρα Drosophila Kenyon είναι κρίσιμης σημασίας για τη φυσιολογική και βελτιωμένη με δίαιτα μακροπρόθεσμη μνήμη

για περισσότερες πληροφορίες:Ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1Centre for Neural Circuits and Behaviour, The University of Oxford, Tinsley Building, Oxford, United Kingdom; 2 Τμήμα Κυτταρικής Ρύθμισης, Ερευνητικό Ινστιτούτο Μικροβιακών Ασθενειών, Πανεπιστήμιο της Οσάκα, Σουίτα, Ιαπωνία

Περίληψη Τα συμπληρώματα μαγνησίου (Mg2 plus ) μπορούν να ενισχύσουνμνήμησε νεαρούς και ηλικιωμένους αρουραίους.Μνήμη-η ικανότητα ενίσχυσης αποδόθηκε σε μεγάλο βαθμό στις αυξήσεις της συναπτικής πυκνότητας του ιππόκαμπου και στην αυξημένη έκφραση της υπομονάδας NR2B του υποδοχέα γλουταμινικού τύπου NMDA. Εδώ δείχνουμε ότι η σίτιση με Mg2 συν ενισχύει επίσης μακροπρόθεσμαμνήμηστη Δροσόφιλα. Normal και Mg2 plus - ενισχυμένη μύγαμνήμηεμφανίζεται ανεξάρτητο από τους υποδοχείς NMDA στο σώμα του μανιταριού και αντί αυτού απαιτεί έκφραση ενός διατηρημένου μεταφορέα τύπου CNNM Mg2 συν εκροής που κωδικοποιείται από το μη εκτεταμένο γονίδιο (uex). Το UEX περιέχει έναν υποτιθέμενο κυκλικό τομέα ομολογίας δέσμευσης νουκλεοτιδίων και η μετάλλαξή του διαχωρίζει έναν ζωτικό ρόλο για το uex από μια λειτουργία σεμνήμη. Επιπλέον, ο εντοπισμός UEX στα κύτταρα Kenyon σώματος μανιταριού (KCs) αλλάζειμνήμη-ελαττωματικές μύγες που φιλοξενούν μεταλλάξεις σε γονίδια που σχετίζονται με το cAMP. Η λειτουργική απεικόνιση υποδηλώνει ότι απαιτείται εκροή εξαρτώμενη από το UEX για αργή ρυθμική διατήρηση του KC Mg2 plus. Προτείνουμε ότι η ρυθμισμένη νευρωνική εκροή Mg2 συν είναι κρίσιμη για φυσιολογική και ενισχυμένη Mg2 συνμνήμη.

Κάντε κλικ στοCistanche vitamin shop και Cistanche για μνήμη

Εισαγωγή

Το μαγνήσιο (Mg2 plus ) παίζει κρίσιμο ρόλο στον κυτταρικό μεταβολισμό και θεωρείται απαραίτητος συμπαράγοντας για περισσότερα από 350 ένζυμα (Romani και Scarpa, 2000· Vink and Nechifor, 2011). Ως αποτέλεσμα, οι μεταβολές του Mg2 συν ομοιόσταση σχετίζονται με ένα ευρύ φάσμα κλινικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που επηρεάζουν το νευρικό σύστημα, όπως το γλαύκωμα (DeToma et al., 2014), η νόσος του Πάρκινσον (Hermosura et al., 2005; Hermosura και Garruto, 2007· Lin et al., 2014· Shindo et al., 2016), νόσος Alzheimer (Andra´si et al., 2000· Andra´si et al., 2005· Cilliler et al., 2007· Durlach et al. ., 1997· Glick, 1990· Lemke, 1995· Chui et al., 2011· Vural et al., 2010), άγχος (Sartori et al., 2012), κατάθλιψη (Whittle et al., 2011· Murck, 20). Murck, 2013, Rasmussen et al., 1990, Ghafari et al., 2015) και διανοητική αναπηρία (Arjona et al., 2014).

Ίσως παραδόξως, η αύξηση του Mg2 του εγκεφάλου μέσω της διατροφής μπορεί να ενισχύσει την πλαστικότητα των νευρώνων καιμνήμηαπόδοση νεαρών και ηλικιωμένων τρωκτικών, μετρημένη σε μια ποικιλία εργασιών συμπεριφοράς (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Επιπλέον, το αυξημένο Mg2 συν μείωσε τα γνωστικά ελλείμματα σε ένα μοντέλο ποντικού της νόσου του Alzheimer (Li et al., 2013) και ενίσχυσε την εξαφάνιση των αναμνήσεων φόβου (Abumaria et al., 2011). Αυτά τα φαινομενικά ευεργετικά αποτελέσματα έχουν οδηγήσει στην πρόταση ότι το διαιτητικό Mg2 plus μπορεί να έχει θεραπευτική αξία για ασθενείς με ποικιλίαμνήμη-σχετικά προβλήματα (Billard, 2011).

Παρά τον μεγάλο αριθμό πιθανών θέσεων Mg2 συν δράση στον εγκέφαλο, τομνήμη-Η ιδιότητα ενίσχυσης στα τρωκτικά έχει αποδοθεί σε μεγάλο βαθμό στις αυξήσεις της συναπτικής πυκνότητας του ιππόκαμπου και στη δραστηριότητα των υποδοχέων γλουταμινικού N-μεθυλ-D-ασπαρτικού (NMDARs). Το εξωκυτταρικό Mg2 plus μπλοκάρει τον πόρο του καναλιού του NMDAR και έτσι αναστέλλει τη διέλευση άλλων ιόντων (Mayer et al., 1984, πέψη Η παροιμιώδης ρήση «είσαι ό,τι τρως» συνοψίζει τέλεια την ιδέα ότι η διατροφή μας μπορεί να επηρεάσει τόσο την ψυχική μας όσο και σωματική υγεία. Γνωρίζουμε ότι οι τροφές που είναι καλές για την καρδιά, όπως οι ξηροί καρποί, τα λιπαρά ψάρια και τα μούρα, είναι επίσης καλές για τον εγκέφαλο. Γνωρίζουμε επίσης ότι οι βιταμίνες και τα μέταλλα είναι απαραίτητα για τη γενική καλή υγεία. Υπάρχουν όμως αποδείξεις ότι η αύξηση της πρόσληψης συγκεκριμένων βιταμινών ή μετάλλων θα μπορούσε να βοηθήσει στην ενίσχυση της εγκεφαλικής σας δύναμης;

Αν και μπορεί να ακούγεται σχεδόν πολύ καλό για να είναι αληθινό, υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι αυτό ισχύει για τουλάχιστον ένα ορυκτό, το μαγνήσιο. Μελέτες σε τρωκτικά έχουν δείξει ότι η προσθήκη συμπληρωμάτων μαγνησίου στα τρόφιμα βελτιώνει το πόσο καλά τα ζώα εκτελούν εργασίες μνήμης. Τόσο τα νεαρά όσο και τα ηλικιωμένα ζώα επωφελούνται από πρόσθετο μαγνήσιο. Ακόμη και τα ηλικιωμένα τρωκτικά με πάθηση παρόμοια με τη νόσο του Αλτσχάιμερ παρουσιάζουν λιγότεραμνήμηαπώλεια όταν χορηγούνται συμπληρώματα μαγνησίου. Τι γίνεται όμως με άλλα είδη;

Οι Wu et al. τώρα δείχνουν ότι τα συμπληρώματα μαγνησίου ενισχύουν επίσης την απόδοση της μνήμης στις μύγες των φρούτων. Μια ομάδα μυγών τράφηκε με τυπικό καλαμποκάλευρο για αρκετές ημέρες, ενώ η άλλη ομάδα έλαβε καλαμποκάλευρο συμπληρωμένο με μαγνήσιο. Στη συνέχεια και οι δύο ομάδες εκπαιδεύτηκαν να συσχετίσουν μια μυρωδιά με μια ανταμοιβή φαγητού. Οι μύγες που είχαν λάβει το επιπλέον μαγνήσιο έδειξαν καλύτεραμνήμηγια την οσμή όταν ελέγχεται 24 ώρες μετά την προπόνηση.

Οι Wu et al. δείχνουν ότι το μαγνήσιο βελτιώνεταιμνήμηστις μύγες μέσω διαφορετικού μηχανισμού από αυτόν που αναφέρθηκε προηγουμένως για τα τρωκτικά. Στα τρωκτικά, το μαγνήσιο αύξησε τα επίπεδα μιας πρωτεΐνης υποδοχέα για μια χημική ουσία του εγκεφάλου που ονομάζεται γλουταμινικό. Στις φρουτόμυγες, αντίθετα, τομνήμηη ώθηση εξαρτιόταν από μια πρωτεΐνη που μεταφέρει το μαγνήσιο από τους νευρώνες. Οι μεταλλαγμένες μύγες που δεν είχαν αυτόν τον μεταφορέα εμφάνισαν βλάβες στη μνήμη. Σε αντίθεση με τις κανονικές μύγες, εκείνες χωρίς τον μεταφορέα δεν παρουσίασαν βελτίωση της μνήμης μετά την κατανάλωση τροφής εμπλουτισμένης σε μαγνήσιο. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο μεταφορέας μπορεί να βοηθήσει στη ρύθμιση των επιπέδων μαγνησίου μέσα στα εγκεφαλικά κύτταρα ως απόκριση στη νευρική δραστηριότητα.

Οι άνθρωποι παράγουν τέσσερις παραλλαγές αυτού του μεταφορέα μαγνησίου, καθεμία από τις οποίες κωδικοποιείται από ένα διαφορετικό γονίδιο. Ένας από αυτούς τους μεταφορείς έχει ήδη εμπλακεί στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Τα ευρήματα των Wu et al. προτείνουν ότι οι μεταφορείς μπορεί επίσης να δράσουν στον εγκέφαλο των ενηλίκων για να επηρεάσουν τη γνωστική λειτουργία. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να ελεγχθεί εάν η στόχευση του μεταφορέα μαγνησίου θα μπορούσε τελικά να υποσχεθεί για τη θεραπείαμνήμηαπομειώσεις.

Bekkers and Stevens, 1993; Jahr και Stevens, 1990; Nowak et al., 1984). Είναι σημαντικό ότι απαιτείται προηγούμενη νευρωνική εκπόλωση, η οποία οδηγείται από άλλους υποδοχείς πομπών, για να απελευθερωθεί το μπλοκ Mg2 plus στο NMDAR και να επιτραπεί η εισροή Ca2 συν το γλουταμινικό. Το NMDAR, επομένως, παίζει σημαντικό ρόλο στην πλαστικότητα των νευρώνων ως πιθανός ανιχνευτής συμπτώσεων Hebbian. Η οξεία αύξηση της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης Mg2 συν ([Mg2 συν ]e) εντός του φυσιολογικού εύρους (0,8–1,2 mM) μπορεί να ανταγωνιστεί την επαγωγή της εξαρτώμενης από το NMDAR μακροπρόθεσμης ενίσχυσης (Dunwiddie and Lynch, 1979· Malenka et al., 1992· Malenka και Nicoll, 1993· Slutsky et al., 2004). Αντίθετα, η αύξηση του [Mg2 συν]e για αρκετές ώρες σε καλλιέργειες νευρώνων οδηγεί σε ενίσχυση των ρευμάτων που προκαλούνται από NMDAR και διευκόλυνση της έκφρασης του LTP (Slutsky et al., 2004). Τα ενισχυτικά αποτελέσματα του αυξημένου [Mg2 συν]e παρατηρήθηκαν επίσης in vivo στον εγκέφαλο αρουραίων που τρέφονταν με Mg2 συν -L-θρεονικό (Slutsky et al., 2010). Τα νευρωνικά κυκλώματα του ιππόκαμπου υφίστανται ομοιοστατική πλαστικότητα (Turrigiano, 2008) για να προσαρμόσουν την αυξημένη [Mg2 συν]e ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση των NMDAR που περιέχουν υπομονάδα NR2B (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010). Η υψηλότερη πυκνότητα των συνάψεων του ιππόκαμπου με NR2B που περιέχουν NMDAR πιστεύεται ότι αντισταθμίζει τη χρόνια αύξηση του [Mg2 συν ]e ενισχύοντας τα ρεύματα NMDAR κατά τη διάρκεια της ριπής πυροδότησης. Προς υποστήριξη αυτού του μοντέλου, τα ποντίκια που έχουν κατασκευαστεί γενετικά για να υπερεκφράζουν NR2B παρουσιάζουν ενισχυμένο LTP ιππόκαμπου και συμπεριφοράμνήμη(Tang et al., 1999).

Οσφρητικόςμνήμηστο Drosophila περιλαμβάνει έναν ετεροσυναπτικό μηχανισμό που καθοδηγείται από την ενίσχυση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, ο οποίος έχει ως αποτέλεσμα την προσυναπτική κατάθλιψη των χολινεργικών συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων Kenyon που ενεργοποιούνται από την οσμή του σώματος (MB) και των νευρώνων εξόδου του σώματος μανιταριού (MBONs) (Schwaerzel et al. Aso et al., 2010· Aso et al., 2012· Claridge-Chang et al., 2009· Burke et al., 2012· Liu et al., 2012· Plac¸ais et al., 2013· Owald et al., 2013 ., 2015· Hige et al., 2015· Barnstedt et al., 2016· Parisse et al., 2016· Aso et al., 2014· Oswald and Waddell, 2015). Επιπλέον, οι οσφρητικές πληροφορίες μεταφέρονται στα KC με χολινεργική μετάδοση από νευρώνες οσφρητικής προβολής (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009). Αν και είναι κατανοητό ότι το γλουταμικό παραδίδεται στο δίκτυο MB μέσω μιας διαδρομής που δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί, δεν υπάρχει επί του παρόντος προφανής θέση για πλαστικότητα που εξαρτάται από το NMDAR στη γνωστή αρχιτεκτονική των στρωμάτων χολινεργικής εισόδου ή εξόδου (Barnstedt et al., 2016 ). Η μύγα, επομένως, παρέχει ένα πιθανό μοντέλο για τη διερεύνηση άλλων μηχανισμών μέσω των οποίων το διαιτητικό Mg2 plus μπορεί να ενισχυθείμνήμη.

Τα ενισχυτικά αποτελέσματα της ντοπαμίνης εξαρτώνται από τον υποδοχέα ντοπαμίνης τύπου Dop1R D{{1} (Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019), ο οποίος συνδέεται θετικά με την παραγωγή cAMP (Tomchik και Davis, 2009· Boto et al., 2014). Επιπλέον, πρώιμες μελέτες στη Drosophila προσδιόρισαν ότι η φωσφοδιεστεράση cAMP που κωδικοποιείται από dunce και rutabaga και η αδενυλική κυκλάση τύπου I συν διεγερμένη από Ca2, αντίστοιχα, είναι απαραίτητα για την όσφρησημνήμη(Dudai et al., 1976· Byers et al., 1981· Dudai and Zvi, 1984· Chen et al., 1986· Livingstone et al., 1984· Levin et al., 1992). Μελέτες σε κύτταρα θηλαστικών έχουν δείξει ότι οι ορμόνες ή οι παράγοντες που αυξάνουν το κυτταρικό επίπεδο cAMP συχνά προκαλούν σημαντική εξώθηση Mg2 συν εξαρτώμενη από Na συν στον εξωκυτταρικό χώρο (Romani and Scarpa, 1990b; Romani and Scarpa, 1990a; Romani and Scarpa, 2000; Vink και Nechifor, 2011· Vormann και Gu¨nther, 1987). Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η διέλαση Mg2 συν παίζει ρόλο στην επεξεργασία στη μνήμη.

Εδώ αποδεικνύουμε ότι η Drosophila μακροπρόθεσμαμνήμη(LTM) μπορεί να ενισχυθεί με διαιτητικά συμπληρώματα Mg2 συν. Διαπιστώνουμε ότι το μη εκτεταμένο γονίδιο (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010), το οποίο κωδικοποιεί ένα λειτουργικό ορθολογικό μύγα των πρωτεϊνών Cyclin M2 Mg2 συν -εκροής (CNNM) θηλαστικών, είναι κρίσιμο για τηνμνήμη-ενισχυτική ιδιότητα του Mg2 plus . Η λειτουργία UEX σε MB KC απαιτείται για το LTM και η λειτουργική αποκατάσταση του uex αποκαλύπτει ότι το MB είναι η βασική τοποθεσία για τη βελτίωση της μνήμης που εξαρτάται από το Mg2 plus. Η χρόνια αλλαγή του μεταβολισμού του cAMP με την εισαγωγή μεταλλάξεων στα γονίδια dnc ή rut μεταβάλλει τον κυτταρικό εντοπισμό του UEX. Επιπλέον, η μετάλλαξη του συντηρημένου τομέα ομολογίας κυκλικής δέσμευσης νουκλεοτιδίων (CNBH) στο UEX αποσυνδέει έναν ουσιαστικό ρόλο για το uex από τη λειτουργία του στη μνήμη. Η εκροή Mg2 plus καθοδηγούμενη από το UEX απαιτείται για την αργή ρυθμική διατήρηση των επιπέδων KC Mg2 plus, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο για την επεξεργασία Mg2 plus ροής στη μνήμη.

Αποτελέσματα

Η σίτιση Mg2 plus ενισχύει το LTM των μυγών άγριου τύπου

Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η διατροφή των αρουραίων με τροφή που περιείχε υψηλή συγκέντρωση Mg2 συν - ενίσχυσε την ικανότητα μάθησης και μνήμης τους (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Επομένως, εξετάσαμε εάν υπάρχουν παρόμοια αποτελέσματα στις μύγες, ταΐζοντάς τες με τροφή που περιέχει υψηλή συγκέντρωση Mg2 συν πριν από την προπόνηση. Παραδόξως, οι μύγες άγριου τύπου που τράφηκαν για 4 ημέρες πριν από την προπόνηση με τροφή συμπληρωμένη με επιπλέον χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl2) επέδειξαν σημαντικά ενισχυμένη απόδοση μνήμης 24 ωρών. Η ενίσχυση της μνήμης εξαρτάται από τη συγκέντρωση και ήταν μέγιστη όταν το φαγητό συμπληρώθηκε με 80 mM MgCl2 (Εικόνα 1Α). Η απόδοση της άμεσης μνήμης δεν βελτιώθηκε εμφανώς (Εικόνα 1Β). Η ενισχυτική επίδραση του MgCl2 παρατηρήθηκε επίσης σε μύγες που τρέφονταν με θειικό μαγνήσιο (MgSO4) αλλά όχι με χλωριούχο ασβέστιο (CaCl2) (Εικόνα 1C). Επιπλέον, το τάισμα μυγών για 4 ημέρες με τροφή που περιείχε μεταξύ 5 και 80 mM χλωριούχο στρόντιο (SrCl2) οδήγησε σε υψηλά επίπεδα θνησιμότητας και οι μύγες που επέζησαν από τη διατροφή 5 mM SrCl2 δεν παρουσίασαν βελτιωμένη απόδοση μνήμης άμεσης ή 24 ωρών (δεδομένα δεν εμφανίζονται) . Τα αποτελέσματα ενίσχυσης της μνήμης μπορούν επομένως να αποδοθούν ειδικά στη διατροφική συμπλήρωση δισθενούς Mg2 συν.

Η ενισχυμένη μνήμη Mg2 plus είναι ανεξάρτητη από το NMDAR στα σώματα των μανιταριών

Δεδομένου ότι το μαγνήσιο-L-θρεονικό ενισχυμένη μνήμη σε αρουραίους συσχετίστηκε με μια ανοδική ρύθμιση των NMDARs που περιέχουν υπομονάδα NR2B του ιππόκαμπου (Slutsky et al., 2010), δοκιμάσαμε για αλλαγές στην έκφραση του υποδοχέα γλουταμικού σε μύγες που τρέφονταν με MgCl2. Οι αναλύσεις RT-qPCR δεν αποκάλυψαν σημαντική διαφορά στην αφθονία των mRNAs για τους υποτιθέμενους υποδοχείς NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA) ή τύπου kainate (GluRIIA) σε κεφάλια που ελήφθησαν από μύγες που ταΐστηκαν για 4 ημέρες με 80 mM MgCl2 έναντι αυτών που τροφοδοτούνται με 1 mM MgCl2 (Εικόνα 1D).

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε απευθείας εάν η ενισχυμένη μνήμη Mg2 συν απαιτούσε λειτουργία NMDAR, καταρρίπτοντας την έκφραση των γονιδίων Nmdar1 ή Nmdar2 χρησιμοποιώντας διαγονιδιακή παρεμβολή RNA που βασίζεται σε UAS

Εικόνα 1. Το διαιτητικό Mg2 συν το συμπλήρωμα ενισχύει τη μακροπρόθεσμη μνήμη του Drosophila. (Α) Οι μύγες άγριου τύπου εκπαιδεύτηκαν και δοκιμάστηκαν για 24ωρη ορεκτική μνήμη μετά από 1-5 ημέρες κατά βούληση διατροφής με τροφή συμπληρωμένη με Mg2 συν . Η μνήμη ενισχύθηκε σημαντικά σε μύγες που τρέφονταν για 4 ημέρες με 80 mM MgCl2, σε σύγκριση με εκείνες που τρέφονταν με 1 mM. 80 mM MgCl2 παρήγαγε οριακά υψηλότερη απόδοση από 50 mM ή 100 mM και έτσι θεωρήθηκε βέλτιστη (οι αστερίσκοι δηλώνουν p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου περιλαμβάνει τα ακόλουθα συμπληρώματα εικόνας για το σχήμα 1:

Συμπλήρωμα Εικόνας 1. Η καταστροφή του υποδοχέα γλουταμινικού N-μεθυλ-D-ασπαρτικού (NMDAR) σε σώματα μανιταριών δεν βλάπτει τη μνήμη Mg2 συν ενισχυμένη.

(RNAi) κατασκευές (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015). Από τις δύο ανεξάρτητες γραμμές UAS-Nmdar1R-NAi και τέσσερις UAS-Nmdar2RNAi που δοκιμάσαμε, μόνο μία γραμμή Nmdar1RNAi (BDSC 25941), όταν οδηγήθηκε σε όλους τους νευρώνες από το νευρωνικό Synaptobrevin (nSyb)-GAL4, παρουσίασε σημαντικά μειωμένη απόδοση μνήμης 24 ωρών, καθώς σε σύγκριση με αυτή των ετερόζυγων μυγών ελέγχου (Εικόνα 1—σχήμα συμπλήρωμα 1Α). Αντίθετα, η πιο επιλεκτική έκφραση αυτού του UAS-Nmdar1RNAi σε αβ KC που σχετίζονται με LTM χρησιμοποιώντας c739-GAL4 δεν μείωσε σημαντικά την απόδοση μνήμης 24 ωρών (Εικόνα 1—Σχήμα συμπλήρωμα 1Β). Επιπλέον, οι μύγες που εκφράζουν Nmdar1RNAi σε νευρώνες ab διατήρησαν ισχυρή μνήμη Mg2 συν ενισχυμένη με βελτιωμένη μνήμη (Εικόνα 1—Σχήμα συμπλήρωμα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενισχυμένη μνήμη Mg2 συν δεν αλλάζει την έκφραση των υποδοχέων γλουταμινικού ή απαιτεί λειτουργία NMDAR σε ab KCs.

Η συγκέντρωση Mg2 plus στους νευρώνες ab είναι αυξημένη σε μύγες που τρέφονται με υψηλό Mg2 plus Χρησιμοποιήσαμε τον MagFRET, τον πρώτο γενετικά κωδικοποιημένο αισθητήρα φθορισμού Mg2 plus (Lindenburg et al., 2013), για να ελέγξουμε εάν η σίτιση Mg2 συν άλλαξε την ενδοκυτταρική συγκέντρωση Mg2 plus ([Mg2 συν ]i). Κατασκευάσαμε μύγες που φιλοξενούν ένα διαγονίδιο UAS-MagFRET-1 και το συνδυάσαμε με το c739-GAL4 για να εκφράσουμε το MagFRET- 1 σε ab KCs. Συγκρίναμε τα σήματα FRET σε σταθερούς εγκεφάλους από το c739. Το UAS-MagFRET-1 πετάει με τροφή 1 mM ή 80 mM MgCl2 για 4 ημέρες. Το σήμα MagFRET ήταν σημαντικά υψηλότερο και στις δύο παράπλευρες ασφάλειες α και β των ab KC μυγών που τρέφονταν με 80 mM, σε σχέση με αυτές που τροφοδοτήθηκαν με 1 mM (Εικόνα 1Ε). Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι η τροφοδοσία Mg αυξάνει το νευρωνικό [Mg2 συν ]i. Δεδομένης της συγγένειας του MagFRET-1 (Kd {= 148 mM) και της αύξησης κατά ~50 τοις εκατό στο σήμα FRET κατά τη δέσμευση Mg2 συν (Lindenburg et al., 2013), εκτιμούμε ότι η ενίσχυση κατά ~8 τοις εκατό το σήμα MagFRET που μετράται σε μύγες που τροφοδοτούνται με 80 mM MgCl2 αντιστοιχεί περίπου σε 50 mM αύξηση του ab KC [Mg2 συν ]i κατά μέσο όρο.

Ο μη εκτεταμένος κωδικοποιημένος μεταφορέας τύπου CNNM Mg2 plus έχει ρόλο στη μνήμη

Προσδιορίσαμε το μη εκτεταμένο (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) ως ένα ορεκτικό οσφρητικό LTM που μεταβάλλει τα γονίδια, ενισχυμένο με ανταμοιβή σακχαρόζης. Οι μύγες με την εισαγωγή uexMI01943 MiMIC (Venken et al., 2011) έδειξαν ισχυρό ελάττωμα στη μνήμη 24 ωρών, αλλά η απόδοσή τους αμέσως μετά την προπόνηση δεν διακρίθηκε από αυτή των μαρτύρων άγριου τύπου. Πιο λεπτομερής ανάλυση των μυγών uexMI01943 αποκάλυψε μια σταθερή εξασθένηση της μνήμης που αρχικά έγινε σημαντικά διαφορετική από εκείνη των μυγών άγριου τύπου 12 ώρες μετά την εκπαίδευση (Εικόνα 2Α). Κανένα ελάττωμα μνήμης δεν ήταν εμφανές στις ετερόζυγες μύγες uexMI01943/ plus, αποδεικνύοντας ότι αυτό το υποτιθέμενο αλληλόμορφο φύλο είναι υπολειπόμενο.

Το uex τράβηξε την προσοχή μας επειδή είναι ο ορθολόγος μιας μύγας των τεσσάρων ανθρώπινων γονιδίων CNNM που κωδικοποιούν μεταφορείς Mg2 συν (Ishii et al., 2016) και περιέχει επίσης έναν υποτιθέμενο τομέα CNBH που σχετίζεται δομικά με εκείνους σε κυκλικά νουκλεοτίδια κανάλια (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015). Η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας UEX των 834 αμινοξέων με το CNNM1-4 αποκαλύπτει ιδιαίτερα υψηλή διατήρηση αλληλουχίας με CNNM2 και CNNM4 στους τομείς DUF21, CBS και CNBH (Εικόνα 2—σχήμα συμπλήρωμα 1A–C). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι το UEX είχε τη δυνατότητα να συνδέσει τις επιδράσεις ενίσχυσης της μνήμης του διατροφικού Mg2 συν με την εξαρτώμενη από το cAMP νευρωνική πλαστικότητα.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 kb πιο μακριά. Επιβεβαιώσαμε αρχικά τη θέση MiMIC με αντίστροφη PCR (Attrill et al., 2016). Είναι σημαντικό ότι δεν εντοπίστηκε πρόσθετη εισαγωγή MiMIC σε αυτές τις μύγες. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν το uexMI01943 ήταν υπεύθυνο για το ελάττωμα της μνήμης αφαιρώντας με ακρίβεια το στοιχείο MiMIC με εκτομή με τη μεσολάβηση της τρανσποζάσης Minos (Arca` et al., 1997; Εικόνα 2 — σχήμα συμπλήρωμα 2Α και Β). Η αφαίρεση MiMIC στο uexMI01943.ex1 και στο uexMI01943.ex2 μύγες αποκατέστησε την κανονική απόδοση μνήμης 24 ωρών, αποδεικνύοντας ότι η εισαγωγή MiMIC απαιτείται για το uexMI01943μνήμηελάττωμα (Εικόνα 2Γ).

Τόσο η qRT-PCR του mRNA όσο και η ανάλυση western blot των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από κεφαλές μυγών απέτυχαν να αποκαλύψουν σημαντική διαφορά στην έκφραση uex/UEX στις μύγες uexMI01943. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε το CRISPR για να εισαγάγουμε ένα κωδικόνιο τερματισμού στο πέμπτο κωδικοποιητικό εξόνιο του τόπου uex (Εικόνα 2Β και Εικόνα 2 — συμπλήρωμα εικόνας 2C). Οι ομόζυγες μύγες για την προκύπτουσα μετάλλαξη uexD δεν ήταν βιώσιμες ως ενήλικες, πέθαιναν στο στάδιο της προνύμφης. Αντίθετα, οι ετερόζυγες μύγες uexMI01943/uexD ήταν βιώσιμες, αλλά ήταν ορεκτικές για 24 ώρεςμνήμηήταν σημαντικά μειωμένη (Εικόνα 2Δ). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το uex είναι ένα ουσιαστικό γονίδιο και ότι το uexMI01943 είναι ένα βιώσιμο υπομορφικό αλληλόμορφο του uex.

Δοκιμάσαμε και το αποτρεπτικόμνήμηαπόδοση μεταλλαγμένων μυγών uexMI01943. Οι ομόζυγες μύγες uexMI01943 εμφανίστηκαν αμέσωςμνήμηπου ήταν δυσδιάκριτο από αυτό των ετερόζυγων και άγριου τύπου ελέγχου (Εικόνα 2Ε). Ωστόσο, η 24ωρη μνήμη τους, που σχηματίστηκε είτε μετά από πέντε δοκιμές αποτρεπτικής προπόνησης σε απόσταση (Tully et al., 1994; Jacob and Waddell, 2020), είτε μετά από μία δοκιμή προπόνησης με διευκόλυνση νηστείας (Hirano et al., 2013), ήταν σημαντικά μειωμένη. (Εικόνα 2Ε). Αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν ότι οι μύγες uexMI01943 διακυβεύονται γενικότερα στην ικανότητά τους να σχηματίζουν LTM. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλες οι επόμενες αναλύσεις τουμνήμησε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήστε ορεκτικό ρυθμιστικό με ανταμοιβή ζάχαρης.

Εικόνα 2. Οι μεταλλαγμένες μύγες uexMI01943 έχουν ελαττωματικές μακροπρόθεσμεςμνήμη(LTM). (Α) Η διατήρηση της ορεκτικής μνήμης δοκιμάστηκε σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά την προπόνηση. Οι ομόζυγες μύγες για το uexMI01943 εμφάνισαν σημαντικό ελάττωμα στη μνήμη από 12 ώρες μετά την προπόνηση, σε σύγκριση με την απόδοση των ετερόζυγων μυγών uexMI01943/ plus και άγριου τύπου μύγες ελέγχου (σελ.<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">μνήμηελάττωμα του uexMI01943 (σελ<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

Η εικόνα 2 συνεχίστηκε

σε σύγκριση με την απόδοση των ετερόζυγων μυγών uexMI01943/ plus και άγριου τύπου μύγες ελέγχου (σελ.<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">μνήμηδεν επηρεάστηκε σε ομόζυγες μεταλλαγμένες μύγες uexMI01943.

Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου περιλαμβάνει τα ακόλουθα δεδομένα πηγής και συμπλήρωμα εικόνας για το σχήμα 2:

Πηγή δεδομένων 1. Πίνακας ελέγχου σακχάρου και οσφρητικής αισθητηριακής οξύτητας για όλα τα πειράματα συμπεριφοράς σε αυτό το χειρόγραφο.

Συμπλήρωμα Εικόνας 1. Διατήρηση του UEX με τα ορθόλογά του.

Συμπλήρωμα Εικόνας 2. Σχέδια κατασκευής για την εκτομή του uex Mino και τη δημιουργία του αλληλόμορφου uexD.