Ενεργή μετάβαση Φάσης Μνήμης Φόβου από την Επανενοποίηση στην Εξάλειψη μέσω Πρόληψης Επανενοποίησης με Μεσολάβηση ERK

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Η ανάκτηση τουφόβοςμνήμηπροκαλεί δύο αντίθετες διεργασίες μνήμης, δηλ. την επανενοποίηση και την εξαφάνιση. Η σύντομη ανάκτηση προκαλεί επανενοποίηση για διατήρηση ή ενίσχυση του φόβουμνήμη, ενώ η παρατεταμένη ανάκτηση σβήνει αυτή τη μνήμη. Αν και έχουν διερευνηθεί οι μηχανισμοί της επανενοποίησης και της εξάλειψης, παραμένει άγνωστο πώς οι φάσεις της μνήμης του φόβου μετατρέπονται από την επανενοποίηση στην εξαφάνιση κατά την ανάκτηση της μνήμης. Εδώ, δείχνουμε ότι μια διαδικασία μετάβασης μνήμης εξαρτώμενη από εξωκυτταρικό σήμα κινάσης (ERK) μετά την ανάκτηση ρυθμίζει τη μετάβαση των φάσεων μνήμης από την επανασύνδεση στην εξαφάνιση, αποτρέποντας την επαγωγή επανασύνδεσης σε μια εργασία ανασταλτικής αποφυγής (IA) σε αρσενικά ποντίκια. Πρώτον, η φάση της μεταβατικής μνήμης, η οποία ακυρώνει την επαγωγή της επανασύνδεσης, αλλά είναι ανεπαρκής για την απόκτηση της εξάλειψης, εντοπίστηκε μετά την επανενοποίηση, αλλά πριν από τις φάσεις εξαφάνισης. Δεύτερον, οι φάσεις επανενοποίησης, μετάβασης και εξαφάνισης μετάανάκτηση μνήμηςεμφάνισε διακριτές μοριακές και κυτταρικές υπογραφές μέσω πρωτεΐνης που ανταποκρίνεται σε cAMP-δεσμευτικό στοιχείο (CREB) και φωσφορυλίωσης ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και τον έσω προμετωπιαίο φλοιό (mPFC). Η φάση επανασύνδεσης έδειξε αυξημένη φωσφορυλίωση CREB, ενώ η φάση εξάλειψης εμφάνισε αρκετούς νευρικούς πληθυσμούς με διάφορους συνδυασμούς φωσφορυλίωσης CREB ή/και ERK, σε αυτές τις περιοχές του εγκεφάλου. Είναι ενδιαφέρον ότι οι τρεις φάσεις μνήμης, συμπεριλαμβανομένης της φάσης μετάβασης, έδειξαν παροδική ενεργοποίηση ERK αμέσως μετά την ανάκτηση. Το πιο σημαντικό, ο αποκλεισμός του ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο ή το mPFC στη φάση της μεταβατικής μνήμης ανέστειλε την επαγόμενη από την επανασύνδεση ενίσχυση της μνήμης IA. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η οδός σηματοδότησης ERK ρυθμίζει ενεργά τη μετάβαση της φάσης της μνήμης από την επανέδραση στην εξαφάνιση και αυτή η διαδικασία λειτουργεί ως διακόπτης που ακυρώνει την επανέδραση του φόβουμνήμη.

Λέξεις-κλειδιά: ERK; εξαφάνιση; μνήμη φόβου? επανενοποίηση· μετάβαση

1 Department of Bioscience, Faculty of Life Sciences, Tokyo University of Agriculture, Tokyo 156-8502, Japan, και

2 Graduate School of Agriculture and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

Δήλωση Σημασίας

Ανάκτηση μνήμης φόβουπροκαλεί δύο αντίθετες διαδικασίες μνήμης. επανασύνδεση και εξαφάνιση. Η επανενοποίηση διατηρεί/ενισχύειμνήμη φόβου, ενώ η εξαφάνιση αποδυναμώνει τη μνήμη του φόβου. Παραμένει άγνωστο πώς οι φάσεις της μνήμης αλλάζουν από την ενοποίηση στην εξαφάνιση κατά την ανάκτηση. Εδώ, εντοπίσαμε μια ενεργή διαδικασία μετάβασης μνήμης που λειτουργεί ως διακόπτης που αναστέλλει την επανενοποίηση. Αυτή η φάση μετάβασης μνήμης έδειξε μια παροδική αύξηση της φωσφορυλίωσης της εξωκυτταρικής κινάσης ρυθμιζόμενης με σήμα (ERK) στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και τον έσω προμετωπιαίο φλοιό (mPFC). Είναι ενδιαφέρον ότι η αναστολή του ERK σε αυτές τις περιοχές στη μεταβατική φάση απέτρεψε την ενίσχυση της μνήμης ανασταλτικής αποφυγής (IA) που προκαλείται από την επανασυγκράτηση. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η διαδικασία της μνήμης μετάβασης ρυθμίζει ενεργά τη μετάβαση των φάσεων της μνήμης φόβου της μνήμης φόβου, αποτρέποντας την επαγωγή επανασύνδεσης μέσω της ενεργοποίησης της οδού σηματοδότησης ERK.

Εισαγωγή

Μνήμηη ανάκτηση δεν είναι μια παθητική διαδικασία αλλά είναι μάλλον μια δυναμική διαδικασία που επιτρέπει τη συντήρηση, την ενίσχυση, την αποδυνάμωση ή την τροποποίηση/ενημέρωση μιας αρχικής μνήμης (Misanin et al., 1968· Schneider and Sherman, 1968· Lewis, 1979· Mactutus et al. ., 1979· Gordon, 1981· Nader et al., 2000· Nader and Hardt, 2009· Dudai, 2012· Fukushima et al., 2014). Είναι σημαντικό ότι μια ανακτημένη εξαρτημένη μνήμη φόβου με σύντομη επανέκθεση στο εξαρτημένο ερέθισμα (CS) καθίσταται ασταθής και απαιτεί επανασυγκέντρωση εξαρτώμενη από τη γονιδιακή έκφραση για τη διατήρηση ή την ενίσχυσή της (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002· Suzuki et al., 2004· Tronel et al., 2005· Fukushima et al., 2014). Αντίθετα, η συνεχής ή επαναλαμβανόμενη επανέκθεση στο CS προκαλεί εξαφάνιση της μνήμης, η οποία αποδυναμώνει τη μνήμη του φόβου (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers και Davis, 2002). Έτσι, η ανάκτηση της μνήμης φόβου προκαλεί δύο αντίθετες διεργασίες μνήμης, π.χ., επανασύνδεση και εξαφάνιση, αν και και οι δύο διαδικασίες προκαλούνται από την επανέκθεση σε ένα πανομοιότυπο CS, αλλά διαφέρουν ανάλογα με τη διάρκεια της επανέκθεσης στο CS.

Το κοινό και κρίσιμο βιοχημικό χαρακτηριστικό της επανασύνδεσης και της εξαφάνισης είναι η απαίτηση για έκφραση γονιδίου που διαμεσολαβείται από την πρωτεΐνη που ανταποκρίνεται σε cAMP (CREB) (Mamiya et al., 2009). Είναι ενδιαφέρον ότι δείξαμε αντικρουόμενες μοριακές, ανατομικές και συμπεριφορικές υπογραφές μεταξύ των φάσεων επανασύνδεσης και εξάλειψης της συναφούς μνήμης φόβου (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Η παρεμπόδιση της πρωτεϊνοσύνθεσης κατά τη φάση της επανασύνδεσης διαταράσσει τον αρχικό φόβομνήμη, ενώ η παρεμπόδιση της πρωτεϊνοσύνθεσης κατά τη φάση της εξαφάνισης αποτυγχάνει να το κάνει αυτό, αν και η μνήμη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα ενεργοποιήθηκε ξανά. Η απαίτηση των περιοχών του εγκεφάλου που εμφανίζουν την ενεργοποίηση της διαμεσολαβούμενης από το CREB γονιδιακής έκφρασης διαφέρει μεταξύ της επανενοποίησης και της εξαφάνισης. Η επανασύνδεση εξαρτάται από την αμυγδαλή και τον ιππόκαμπο, ενώ η εξαφάνιση βασίζεται στην αμυγδαλή και στον έσω προμετωπιαίο φλοιό (mPFC). Ωστόσο, η χρονική πορεία της ενεργοποίησης του αμυγδαλοειδή CREB διαφέρει μεταξύ των φάσεων της μνήμης επανασύνδεσης και της εξάλειψης. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι οι φάσεις επανενοποίησης και εξαφάνισης δεν είναι ανεξάρτητες, αλλά μάλλον αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Είναι ενδιαφέρον ότι πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει ένα χρονικό παράθυρο (φάση μετάβασης) που δεν δείχνει ενεργοποίηση εξωκυττάριας κινάσης ρυθμιζόμενης από σήμα (ERK) στην αμυγδαλή μετά την επανασύνδεση, αλλά πριν από τις φάσεις εξαφάνισης μετά την ανάκτηση της ακουστικής μνήμης φόβου (Merlo et al., 2018 ). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν τους πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους οι φάσεις της μνήμης μετατρέπονται από την επανενοποίηση στην εξαφάνιση κατά την ανάκτηση της μνήμης φόβου. Με άλλα λόγια, είναι πιθανό η διαδικασία μετάβασης μνήμης να ρυθμίζει ενεργά αυτόν τον διακόπτη.

Σε μια εργασία ανασταλτικής αποφυγής (IA), τα ποντίκια δέχονται ένα ηλεκτρικό σοκ αφού εισέλθουν σε ένα σκοτεινό διαμέρισμα από ένα φωτεινό διαμέρισμα και σχηματίζονταιμνήμηγια να αποφύγετε το σκοτεινό διαμέρισμα. Προηγουμένως, με τη χρήση αυτής της εργασίας, δείξαμε ότι οι φάσεις επανενοποίησης και εξάλειψης μπορούν να διακριθούν τη στιγμή που ένα ποντίκι εισέρχεται σε ένα σκοτεινό διαμέρισμα από ένα φωτεινό διαμέρισμα κατά τη διάρκεια μιας συνεδρίας επανέκθεσης (Fukushima et al., 2014). Επομένως, αυτή η εργασία μάς επιτρέπει να χαρακτηρίσουμε τις προοπτικές μοριακές υπογραφές των φάσεων επανασύνδεσης και εξάλειψης, σε αντίθεση με το κλασικό υπόδειγμα προσαρμογής του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα, στο οποίο η επανενεργοποίηση της ρυθμισμένης μνήμης φόβου με την επανέκθεση στο CS ξεκινά τόσο την επανασύνδεση όσο και την εξαφάνιση. Η σύντομη (3 λεπτά) επανέκθεση στο ρυθμισμένο πλαίσιο προκαλεί επανασύνδεση, ενώ η μακρά (30 λεπτά) ή η επαναλαμβανόμενη επανέκθεση σε αυτό το πλαίσιο προκαλεί εξαφάνιση (Eisenberg et al., 2003; Pedreira and Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004· Lee et al., 2008· Mamiya et al., 2009). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η ανακτημένη μνήμη IA ενισχύεται μέσω της ενοποίησης της μνήμης σε αυτήν την εργασία (Fukushima et al., 2014).

Να κατανοήσουν τον μηχανισμό για τη μετάβαση από την επανένωση στην εξαφάνιση κατά την ανάκτηση του φόβουμνήμη, στοχεύσαμε να αναγνωρίσουμε και να χαρακτηρίσουμε τις μοριακές, κυτταρικές και συμπεριφορικές υπογραφές των φάσεων επανενοποίησης, μετάβασης και εξαφάνισης της μνήμης IA. Αναλύσαμε την ενεργοποίηση του CREB και του ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC στις φάσεις επανασύνδεσης, μετάβασης και εξαφάνισης και εξετάσαμε τους ρόλους της ενεργοποίησης του ERK σε αυτές τις διαδικασίες μνήμης.

Υλικά και μέθοδοι

Ποντίκια Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων (Japan Neuroscience Society και Tokyo University of Agriculture). Όλα τα πειράματα σε ζώα που πραγματοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου Γεωργίας του Τόκιο (έγκριση #280037). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκαν με αναισθησία Nembutal και καταβλήθηκε κάθε δυνατή προσπάθεια για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας. Αρσενικοί ποντικοί C57BL/6N ελήφθησαν από τον Charles River. Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε κλουβιά των πέντε ή έξι, διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών και επέτρεψαν πρόσβαση σε τροφή και νερό κατά βούληση. Τα ποντίκια ήταν τουλάχιστον οκτώ εβδομάδων όταν δοκιμάστηκαν. Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε κατά την ελαφριά φάση του κύκλου. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τυφλά ως προς την κατάσταση θεραπείας των ποντικών.

Δοκιμή ΙΑ Η συσκευή IA (OHARA Pharmaceutical) αποτελούταν από ένα κουτί με ξεχωριστά φωτεινά και σκοτεινά διαμερίσματα (και τα δύο 15,5 12,5 11,5 cm). Το διαμέρισμα φωτισμού φωτίστηκε από ένα φως φθορισμού (2500 lux· Fukushima et al., 2008, 2014· Zhang et al., 2011· Ishikawa et al., 2016). Πριν από την έναρξη της εκπαίδευσης ΙΑ, τα ποντίκια χειρίζονταν μεμονωμένα για 2 λεπτά κάθε μέρα για μία εβδομάδα. Κατά τη διάρκεια των προπονήσεων, κάθε ποντίκι αφέθηκε να συνηθίσει στο φωτεινό διαμέρισμα για 30 δευτερόλεπτα και η πόρτα της γκιλοτίνας ανυψώθηκε για να επιτρέψει την πρόσβαση στο σκοτεινό διαμέρισμα. Η καθυστέρηση εισόδου στο σκοτεινό διαμέρισμα θεωρήθηκε ως μέτρο απόκτησης. Μόλις το ποντίκι μπήκε στο σκοτεινό διαμέρισμα, η πόρτα της γκιλοτίνας έκλεισε. Μετά από 5 δευτερόλεπτα, χορηγήθηκε ένα σοκ (0,2 mA) για συνολική περίοδο 2 δευτερολέπτων (προπόνηση). Στις 24 ώρες μετά την προπόνηση, το ποντίκι τοποθετήθηκε ξανά στο φωτεινό διαμέρισμα μέχρι να εισέλθει στο σκοτεινό διαμέρισμα (μέσος όρος 459 6 15,49 δευτερόλεπτα). Αμέσως μετά την είσοδο του ποντικιού στο σκοτεινό διαμέρισμα, η πόρτα της γκιλοτίνας έκλεισε και το ποντίκι έμεινε στο σκοτεινό διαμέρισμα για ποικίλο χρονικό διάστημα (0, 1 ή 10 λεπτά) χωρίς πόδι (επανενεργοποίηση). Η μνήμη αξιολογήθηκε 48 ώρες αργότερα [δοκιμή μακροχρόνιας μνήμης μετά την ενεργοποίηση (PR-LTM)] ως η καθυστέρηση διασταύρωσης για το ποντίκι να εισέλθει στο σκοτεινό διαμέρισμα όταν αντικατασταθεί στο φωτεινό διαμέρισμα, όπως στην επανενεργοποίηση.

Για το πρώτο πείραμα, εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης μετά την επανενεργοποίηση (επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 0, 1 ή 10 λεπτό· Εικ. 1). Ο αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης ανισομυκίνη (ANI, Wako) διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα (pH ρυθμίστηκε στο 7.{12}}-7,4 με NaOH). Τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και 24 ώρες αργότερα, έλαβαν όχημα (VEH) ή ANI (150 mg/kg, ip) αμέσως μετά την εκ νέου έκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 0, 1 ή 10 λεπτά χωρίς ποδοπατήματα (επανενεργοποίηση). Σε αυτή τη δόση, το ANI αναστέλλει το 0,90 τοις εκατό της πρωτεϊνικής σύνθεσης στον εγκέφαλο κατά τις πρώτες 2 ώρες (Flood et al., 1973). Στις 48 ώρες μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης, μεμονωμένα ποντίκια τοποθετήθηκαν για άλλη μια φορά στο διαμέρισμα φωτός και αξιολογήθηκε η καθυστέρηση διασταύρωσης.

Για το δεύτερο πείραμα [φωσφορυλιωμένο CREB (pCREB) και φωσφορυλιωμένο ERK (pERK) ανοσοϊστοχημεία. σύκα. 2–5], εξετάσαμε τις περιοχές του εγκεφάλου που ενεργοποιήθηκαν μετά από επανέκθεση στο φως (μέχρι να εισέλθουν τα ποντίκια στο σκοτεινό διαμέρισμα, επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 0 λεπτά) ή στο σκοτεινό διαμέρισμα (επανα- έκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 1 ή 10 λεπτό). Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τέσσερα Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10 Φεβρουαρίου 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289ομάδες. Στις 24 ώρες μετά την προπόνηση, μεμονωμένα ποντίκια εκτέθηκαν ξανά στο φωτεινό διαμέρισμα και στη συνέχεια παρέμειναν στο σκοτεινό διαμέρισμα μετά την είσοδό τους από το σκοτεινό διαμέρισμα [επανενεργοποίηση: 0 λεπτά στο σκοτεινό διαμέρισμα, ομάδα επανασυγκράτησης (Recon). 1 λεπτό, ομάδα μετάβασης (Tran); 10 λεπτά, ομάδα εξαφάνισης (Εξ.)]. Μια άλλη ομάδα ποντικών δεν επέστρεψε στο φωτεινό/σκοτεινό διαμέρισμα [ομάδα μη επανενεργοποιημένης (NR)]. Τα ποντίκια στη συνέχεια αναισθητοποιήθηκαν με Nembutal (750 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) στα 5, 15 ή 30 λεπτά μετά την επανενεργοποίηση.

Για το τρίτο πείραμα (μικροέγχυση του U0126, Εικ. 6,7), εξετάσαμε τα αποτελέσματα της αναστολής ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο ή το mPFC σεμνήμηεπανενοποίηση/ενίσχυση, μετάβαση και εξαφάνιση. Ο αναστολέας ΜΕΚ U0126 (Sigma-Aldrich) διαλύθηκε σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό που περιείχε τρεις σταγόνες Tween 80 (Sigma) σε 2,5 ml διμεθυλοσουλφοξειδίου 7,5 τοις εκατό (Wako) και ρυθμίστηκε σε pH 7,4 με NaOH. Τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω, και 24 ώρες αργότερα, τοποθετήθηκαν ξανά στο διαμέρισμα φωτός (επανενεργοποίηση). Στα ποντίκια έγινε μικροέγχυση U0126 (1 mg) ή VEH στις διάφορες περιοχές του εγκεφάλου αμέσως μετά (Εικ. 6A, C, E-H, 7A-C) ή σε 30 λεπτά μετά (Εικ. 6Β, Δ) επανενεργοποίηση. Στις 48 ώρες μετά την επανενεργοποίηση, μεμονωμένα ποντίκια τοποθετήθηκαν για άλλη μια φορά στο φωτεινό διαμέρισμα και αξιολογήθηκε η καθυστέρηση διασταύρωσης (PR LTM). Έγιναν μικροεγχύσεις στον ιππόκαμπο και mPFC (0,5 ml) με ρυθμό 0,25 ml/min. Οι μικροεγχύσεις στην αμυγδαλή (0,2 ml) έγιναν με ρυθμό 0,1 ml/min. Ο σωληνίσκος της ένεσης αφέθηκε στη θέση του για 2 λεπτά μετά την μικροέγχυση και τα ποντίκια στη συνέχεια επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους. Ο αναστολέας ΜΕΚ SL327 (Santa Cruz Biotechnology) διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και αραιώθηκε με φυσιολογικό ορό. Τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και 24 ώρες αργότερα, μεμονωμένα ποντίκια τοποθετήθηκαν πίσω στο φωτεινό διαμέρισμα (επανενεργοποίηση). Στα ποντίκια έγινε συστηματική ένεση SL327 (10 ή 20 mg/kg) ή VEH αμέσως μετά την επανενεργοποίηση (Εικ. 7D–F). Στις 48 ώρες μετά την επανενεργοποίηση, μεμονωμένα ποντίκια τοποθετήθηκαν για άλλη μια φορά στο φωτεινό διαμέρισμα και αξιολογήθηκε η καθυστέρηση διασταύρωσης (PR-LTM).

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 201). Μετά την αναισθησία, όλα τα ποντίκια εγχύθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν, σταθεροποιήθηκαν όλη τη νύχτα, μεταφέρθηκαν σε 30 τοις εκατό σακχαρόζη και αποθηκεύτηκαν στους 4 βαθμούς. Τα στεφανιαία τμήματα (30 mm) κόπηκαν σε κρυοστάτη.

Για τη χρώση pCREB και pERK, οι ελεύθερες επιπλέουσες τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 τοις εκατό H2O2 και επωάστηκαν όλη τη νύχτα με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-φωσφο-CREB (σερίνη 133; S133) (1:1000; #{{10 }}, Millipore) και/ή μονοκλωνικό αντίσωμα αντιφωσφο-ERK1/2 (T202/Y204) κουνελιού (1:300; #4370; Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης) σε διάλυμα αποκλεισμού (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικά συν 1 τοις εκατό αλβουμίνη ορού κατσίκας, 1 mg/ml αλβουμίνη ορού βοοειδών και 0,05 τοις εκατό Triton X-100). Οι τομές πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό και επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου αντι-κουνελιού IgG γαϊδουριού (1:500, Jackson ImmunoResearch) για pCREB ή συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου αντι-κουνελιού IgG κατσίκας για pERK για 1 ώρα. Τα σήματα pCREB ενισχύθηκαν με τυραμίδιο βιοτίνης και οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στρεπταβιδίνη συζευγμένη με Alexa Fluor (Invitrogen). Τα σήματα pERK ενισχύθηκαν με TSA-FCM (Invitrogen). Τα τμήματα τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες και γλιστρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μέσο στήριξης (Millipore).

Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Οι δομές ορίστηκαν ανατομικά σύμφωνα με τον άτλαντα των Franklin και Paxinos (1997). Όλοι οι ανοσοαντιδραστικοί νευρώνες μετρήθηκαν από έναν πειραματιστή τυφλό ως προς την κατάσταση της θεραπείας

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός φάσεων μνήμης μετά την ανάκτηση στην εργασία ΙΑ

Η εργασία ΙΑ μάς επιτρέπει να διακρίνουμε τις φάσεις επανασύνδεσης και εξαφάνισης τη στιγμή που ένα ποντίκι εισέρχεται σε ένα σκοτεινό διαμέρισμα από ένα φωτεινό διαμέρισμα (Fukushima et al., 2014). Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό που διέπει τη μετάβαση των φάσεων της μνήμης από την επανασύνδεση στην εξάλειψη, χαρακτηρίσαμε τις φάσεις μνήμης ΙΑ μετά την ανάκτηση μνήμης, εξετάζοντας τα αποτελέσματα της αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης που απαιτείται για την επανέδραση και την εξαφάνιση της μνήμης ΙΑ (Fukushima et al., 2014). Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν αρχικά στο φωτεινό διαμέρισμα. Στα 5 δευτερόλεπτα μετά την είσοδό τους στο σκοτεινό διαμέρισμα, δόθηκε ένα σύντομο ηλεκτρικό σοκ (προπόνηση). Τα ποντίκια εκτέθηκαν ξανά στο φωτεινό διαμέρισμα 24 ώρες μετά την εκπαίδευση (συνεδρία επανενεργοποίησης· Εικ. 1Α) και αξιολογήθηκε η καθυστέρηση διασταύρωσής τους να εισέλθουν στο σκοτεινό διαμέρισμα (Εικ. 1Β). Τα ποντίκια επέστρεψαν στα κλουβιά του σπιτιού τους αμέσως μετά την είσοδό τους στο σκοτεινό διαμέρισμα από το φωτεινό διαμέρισμα (0-λεπτή επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα, φάση επανενοποίησης) ή παρέμειναν στο σκοτεινό διαμέρισμα για 1, 3 ή 10 λεπτά χωρίς να δεχθείτε ποδοπατήματα (φάση εξάλειψης, Εικ. 1C–E). Αμέσως μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης, τα ποντίκια έλαβαν συστηματική ένεση VEH ή τον αναστολέα πρωτεϊνοσύνθεσης ANI. Στις 48 ώρες αργότερα, η καθυστέρηση διασταύρωσης αξιολογήθηκε PR-LTM.

Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη μας (Fukushima et al., 2014), η επανέκθεση στο διαμέρισμα φωτός (0 min group) προκάλεσε επανενοποίηση και ενίσχυση της μνήμης IA. Μια αμφίδρομη ANOVA αποκάλυψε σημαντικά αποτελέσματα του χρόνου (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), φάρμακο (F(1) ,24)=23.197, p, 0.0001) και χρονική αλληλεπίδραση φαρμάκου (F(1,24)=25.022, p, 0.0001· Σχ. 1Β). Η Post hoc δοκιμή Bonferroni και το ζευγαρωμένο t-test αποκάλυψαν ότι οι ομάδες VEH και ANI, εμφάνισαν σημαντικά αυξημένη ή μειωμένη, αντίστοιχα, καθυστέρηση διασταύρωσης στο PR-LTM σε σύγκριση με την περίοδο επανενεργοποίησης (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003· Εικ. 1Β). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ανάκτηση μνήμης ΙΑ στο διαμέρισμα φωτός ενίσχυσε τη μνήμη, ενώ η αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης διέκοψε την ανακτηθείσα μνήμη, επιβεβαιώνοντας την προηγούμενη παρατήρηση ότι η ανάκτηση μνήμης ΙΑ ενισχύει τη μνήμη μέσω της επανασύνθεσης με τρόπο που εξαρτάται από την πρωτεϊνική σύνθεση.

Αντίθετα, η επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα προκάλεσε μακροπρόθεσμη εξαφάνιση [αμφίδρομη ANOVA, χρόνος (Εικ. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Εικ. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), φάρμακο (Εικ. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Εικ. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), χρονική αλληλεπίδραση φαρμάκων (Εικ. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Εικ. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως (Fukushima et al., 2014). Οι ομάδες VEH που παρέμειναν στο σκοτεινό διαμέρισμα για 3 ή 10 λεπτά εμφάνισαν σημαντικά μειωμένο λανθάνοντα χρόνο διασταύρωσης στο PR-LTM σε σύγκριση με τη συνεδρία επανενεργοποίησης, ενώ οι ομάδες ANI εμφάνισαν συγκρίσιμο λανθάνοντα χρόνο διασταύρωσης στο PR-LTM σε σύγκριση με την περίοδο επανενεργοποίησης και Ομάδες VEH (post hoc δοκιμή Bonferroni, ps , 0,05; ζευγαρωμένη δοκιμή t, Εικ. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, σ. 0.05· Εικ. 1D, VEH, t(9)=10.211, p, 0.0001, ANI, t(9)=1}.02, σ. 0.05 ). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 3 ή 10 λεπτά έσβησε τη μνήμη IA και ότι η αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης εμπόδισε τη μακροπρόθεσμη εξαφάνιση. Έτσι, η ανάκτηση μνήμης ΙΑ στο σκοτεινό διαμέρισμα σβήνει τη μνήμη ΙΑ με τρόπο που εξαρτάται από τη γονιδιακή έκφραση.

Είναι σημαντικό ότι η ομάδα VEH έδειξε συγκρίσιμο λανθάνοντα χρόνο διασταύρωσης στο PR-LTM σε σύγκριση με τη συνεδρία επανενεργοποίησης και με την ομάδα ANI όταν παρέμειναν στο σκοτεινό διαμέρισμα για 1 λεπτό [ANOVA δύο κατευθύνσεων, χρόνος (F(1,36) {{ 5}}.03, σ. 0.05), φάρμακο (F(1,36)=0.019, σελ. 0.05), χρονική αλληλεπίδραση φαρμάκων (F(1,36)=0.011, σελ. 0.05); post hoc δοκιμή Bonferroni, ps . 0,05; ζεύγη t-test, VEH, t(9)=0.091, p . 0.05, ANI, t(9)=0.328, p. 0,05; Εικ. 1Ε]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ομάδα VEH δεν έδειξε ούτε ενίσχυση ούτε εξαφάνιση της μνήμης IA και ότι η ομάδα ANI δεν παρουσίασε διακοπή της μνήμης IA. Επομένως, η επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 1 λεπτό απέκλεισε τόσο τη βελτίωση όσο και την επαγόμενη από το ANI διαταραχή της επανενεργοποιημένης μνήμης IA, αλλά όχι την σβησμένη μνήμη IA, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η 1-λεπτή επανέκθεση ακυρώνει την επαγωγή της επανενοποίησης , αλλά δεν επαρκεί για να σβήσει τη μνήμη IA.

Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επανέκθεση στο διαμέρισμα φωτός επάγει τη φάση επανασύνδεσης, ενώ η μεγαλύτερη επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα (3 ή 10 λεπτά) προκαλεί τη φάση εξάλειψης. Το πιο σημαντικό είναι ότι η παραμονή για 1 λεπτό στο σκοτεινό διαμέρισμα προκαλεί τη μεταβατική φάση από την επανασύνδεση στην εξαφάνιση, η οποία, αναστέλλει την επαναεδροποίηση της μνήμης του φόβου χωρίς να προκαλεί εξαφάνιση.

Μοριακές υπογραφές των φάσεων επανασύνδεσης, μετάβασης και εξαφάνισης στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC μετά από ανάκτηση μνήμης IA

Η ενοποίηση και η εξάλειψη της μνήμης του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα δείχνουν αυξήσεις στη φωσφορυλίωση CREB στο S133, έναν δείκτη ενεργοποίησης γονιδιακής έκφρασης που απαιτείται για την επανασυγκέντρωση και τη μακροπρόθεσμη εξάλειψη, αλλά δείχνει ξεχωριστή δυναμική της φωσφορυλίωσης CREB (Mamiya et al., 2009 ). Είναι ενδιαφέρον ότι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι δεν υπάρχει αύξηση στη φωσφορυλίωση του ERK, ενός ανοδικού ρυθμιστή του CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001), στη βασεοπλευρική περιοχή της αμυγδαλής κατά τη μετάβαση από την επανασυγκράτηση στην εξάλειψη μιας υπενθυμισμένης μνήμης φόβου, αν και αυτή η φωσφορυλίωση αυξάνεται στη βασεοπλάγια περιοχή όταν μια ενδεικτική μνήμη φόβου παγιώνεται και σβήνει (Merlo et al., 2014, 2018). Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι το ERK του ιππόκαμπου ενεργοποιείται μόνο όταν η μνήμη του φόβου του περιβάλλοντος έχει σβήσει, αλλά δεν παγιώνεται (Tronson et al., 2009). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι φάσεις επανασύνδεσης, μετάβασης και εξαφάνισης εμφανίζουν διακριτές μοριακές και κυτταρικές υπογραφές. Ως εκ τούτου, μετρήσαμε και συγκρίναμε τα επίπεδα του pCREB και του pERK στις φάσεις επανασύνδεσης, μετάβασης και εξάλειψης χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Πραγματοποιήσαμε παρόμοια πειραματικά προγράμματα όπως στο Σχήμα 1Β, Δ, Ε χρησιμοποιώντας τέσσερις πειραματικές ομάδες. Τα ποντίκια εκτέθηκαν ξανά στο φωτεινό διαμέρισμα στις 24 ώρες μετά την εκπαίδευση και μετά παρέμειναν στο σκοτεινό διαμέρισμα [Επανενεργοποίηση: 0 λεπτά στο σκοτεινό διαμέρισμα, ομάδα επανασυγκράτησης (Recon). 1 λεπτό, ομάδα μετάβασης (Tran); 10 λεπτά, ομάδα εξαφάνισης (Εξ.)]. Μια άλλη ομάδα ποντικών δεν επέστρεψε στο φωτεινό/σκοτεινό διαμέρισμα (μη επανενεργοποιημένη, ομάδα NR). Μετρήσαμε τους θετικούς για pCREB (pCREB1) νευρώνες, τους θετικούς για pERK (pERK1) νευρώνες και τους διπλά θετικούς (pCREB1/pERK1) νευρώνες στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC στα 30 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης.

Το CREB της αμυγδαλής (πλευρική περιοχή) ενεργοποιήθηκε στις φάσεις εξαφάνισης και επαναστερέωσης, ενώ το ERK ενεργοποιήθηκε μόνο στη φάση εξαφάνισης (Εικ. 2A–C). Μια μονόδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική επίδραση της ομάδας (Εικ. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Παρόμοια με τα προηγούμενα ευρήματα (Mamiya et al., 2009), το post hoc τεστ Newman-Keuls αποκάλυψε ότι οι ομάδες Recon και Ext έδειξαν σημαντικά περισσότερους νευρώνες pCREB1 από τις άλλες ομάδες (ρ, 0,05). Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι παρόμοια με τις παρατηρήσεις στα επίπεδα συμπεριφοράς (Εικ. 1), η έκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 1 λεπτό (μεταβατική φάση) ακυρώνει την "ενεργοποίηση" της φωσφορυλίωσης CREB που θα αυξανόταν στη φάση της επαναστερεοποίησης. Αντίθετα, σημαντικά περισσότεροι νευρώνες pERK1 παρατηρήθηκαν στην ομάδα Ext από ό,τι στις άλλες ομάδες, αν και υπήρχαν πολύ λιγότεροι νευρώνες pERK1 από τους νευρώνες pCREB1 στην ομάδα Ext (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207· Εικ. 2C).

Με συνέπεια, σημαντικά περισσότεροι διπλοί θετικοί νευρώνες (pCREB1/pERK1) παρατηρήθηκαν στην ομάδα Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14· Εικ. 2D), ενώ παρατηρήθηκαν σημαντικά περισσότεροι νευρώνες pCREB1/ pERK– (pCREB single θετικοί) στις ομάδες Recon και Ext (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Εικ. 2Ε). Έτσι, η φάση επανασύνδεσης έδειξε μόνο έναν πληθυσμό νευρώνων pCREB1/pERK–. Αντίθετα, η φάση εξάλειψης έδειξε δύο πληθυσμούς νευρώνων pCREB1/pERK– και pCREB1/pERK1, υποδεικνύοντας ότι το ERK ενεργοποιείται μόνο σε ένα υποσύνολο νευρώνων pCREB1. Είναι σημαντικό ότι παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στη βασεοπλάγια περιοχή της αμυγδαλής (Εικ. 2G, F(3,29)=13.042, p, 0,0001· Εικ. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Εικ. 2I, F(3,29)=12.633, p, 0,0001· Εικ. 2J, F(3,29)=12 ,505, p , 0,0001).

Διφασική ενεργοποίηση του ERK στη φάση εξάλειψης Το ERK είναι ένας ανάντη ενεργοποιητής του CREB και ως εκ τούτου, απαιτείται ενεργοποίηση ERK για την εδραίωση και την επανέδραση της μνήμης φόβου (Schafe et al., 200{{31 }}· Duvarci et al., 2005). Ωστόσο, ασυνεπώς, δεν παρατηρήθηκε ενεργοποίηση ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο ή το mPFC στη φάση της επανασυγκράτησης όταν το pERK μετρήθηκε σε 30 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης (Εικ. 2-4). Επομένως, εξετάσαμε τις χρονικές πορείες της φωσφορυλίωσης ERK και CREB. Πραγματοποιήσαμε ένα παρόμοιο πείραμα όπως στα σχήματα 2-4, με τη διαφορά ότι τα επίπεδα pCREB και pERK μετρήθηκαν σε 5, 15 και 30 λεπτά μετά την περίοδο επανενεργοποίησης (επαναέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για {{ 66}}, 1, ή 10 λεπτά· Εικ. 5Α). Σε συμφωνία με τα δεδομένα που φαίνονται στα σχήματα 2-4, παρατηρήθηκαν σημαντικές αυξήσεις στους νευρώνες pCREB1 στα 30 λεπτά, αλλά όχι στα 5 λεπτά, μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης στο Recon (αμυγδαλή, mPFC και ιππόκαμπος) και Ext (αμυγδαλή και mPFC ) ομάδες, αλλά όχι η ομάδα Tran (Εικ. 5Ε, μονόδρομη ANOVA, αμυγδαλή, 5 λεπτά, F(3,23)=0.346, σελ. 0,05, 30 λεπτά, F(3,23)=15.272, p, 0,0001· mPFC, 5 λεπτά, F(3,23)=1.169, p. 0,05, 30 λεπτά, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001, ιππόκαμπος, 5 λεπτά, F(3,23)=0,154, p. 0,05, 30 λεπτά, F(3,23)=16.197, p, 0,0001; μη ζευγαρωμένη δοκιμή t, αμυγδαλή, επανασύνδεση, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, extinction, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002· mPFC, reconsolidation, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0.0001, extinction, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013· περιοχή CA1 του ιππόκαμπου, επανασύνδεση, 5 έναντι 30 λεπτών, t(12)=2.339, p=0.0374).

Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκαν σημαντικές αυξήσεις στους νευρώνες pERK1 στην αμυγδαλή, το mPFC και τον ιππόκαμπο των ομάδων Recon, Tran και Ext σε 5 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης σε σύγκριση με την ομάδα NR (Εικ. 5F, αμυγδαλή, F(3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011· ιππόκαμπος, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι το ERK ενεργοποιείται αμέσως μετά την επανενεργοποίηση σε όλες τις φάσεις της μνήμης. Ωστόσο, αυτές οι αυξήσεις στον αριθμό των νευρώνων pERK1 επέστρεψαν σε βασικά επίπεδα (συγκρίσιμα με την ομάδα NR) σε 15 λεπτά μετά την επανενεργοποίηση (Εικ. 5F, αμυγδαλή, F(3,20)=2.676, p 0,05· mPFC, F(3,23)=0, 683, σελ. 0,05· ιππόκαμπος, F(3,20)=0.74, σ. 0,05). Επιπλέον, σύμφωνα με τα ευρήματα που φαίνονται στα Σχήματα 2-4, σημαντικά περισσότεροι νευρώνες pERK1 παρατηρήθηκαν στην αμυγδαλή, το mPFC και τον ιππόκαμπο στα 30 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης μόνο στην ομάδα Ext (Εικ. 5F, αμυγδαλή, F( 3,23)=6.616, p=0.022· mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008· ιππόκαμπος, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Έτσι, οι φάσεις επανασύνδεσης και μετάβασης δείχνουν παροδική ενεργοποίηση του ERK μόνο στο πρώιμο χρονικό σημείο (5 λεπτά), ενώ η φάση εξάλειψης δείχνει διφασική ενεργοποίηση του ERK στα πρώιμα (5 λεπτά) και στα όψιμα (30 λεπτά) χρονικά σημεία μετά την επανενεργοποίηση συνεδρία. Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι οι μηχανισμοί για τη ρύθμιση της ενεργοποίησης του ERK διαφέρουν στις φάσεις επανασύνδεσης/μετάβασης και εξάλειψης. Συλλογικά, οι παρατηρήσεις μας απέδειξαν ότι οι φάσεις επανασύνδεσης, μετάβασης και εξαφάνισης εμφανίζουν ξεχωριστές μοριακές υπογραφές.

Οι ρόλοι της ενεργοποίησης του ERK στις φάσεις επανενοποίησης και εξάλειψης της μνήμης IA

Οι φάσεις επανασύνδεσης/μετάβασης και εξάλειψης έδειξαν μονοφασική και διφασική ενεργοποίηση ERK, αντίστοιχα. Στη συνέχεια ερευνήσαμε και συγκρίναμε τους ρόλους της πρώιμης (5 λεπτά) και της όψιμης (30 λεπτών) ενεργοποίησης του ERK στο mPFC στις φάσεις επανασύνδεσης και εξάλειψης, εξετάζοντας τα αποτελέσματα της αναστολής του ERK (Εικ. 6).

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τους μηχανισμούς για τη μετάβαση της μνήμης από τις φάσεις επανενοποίησης στις φάσεις εξαφάνισης μετά την ανάκτηση της μνήμης ΙΑ. Αρχικά χαρακτηρίσαμε τις συμπεριφορικές υπογραφές των φάσεων μνήμης IA μετά την ανάκτηση. Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη μας (Fukushima et al., 2014), η επανασύνδεση και η εξάλειψη που προκαλείται από την ανάκτηση μνήμης IA με επανέκθεση στο φως (0 λεπτά στο σκοτεινό διαμέρισμα) και στο σκοτάδι ( διαμερίσματα 3 ή 10 λεπτών, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι η μνήμη IA δεν ενισχύθηκε ούτε έσβησε και έδειξε αντίσταση στην αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης όταν τα ποντίκια εκτέθηκαν ξανά στο σκοτεινό διαμέρισμα για μόνο 1 λεπτό. Επομένως, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι μια 1-λεπτή επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα ακυρώνει την επαγωγή της επανασύνδεσης, αλλά είναι ανεπαρκής για να σβήσει τη μνήμη IA. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι το ERK ενεργοποιήθηκε στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC σε πρώιμο χρονικό σημείο (5 λεπτά) μετά από επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα για 0, 1 ή 10 λεπτά. Με συνέπεια, η αναστολή του ERK σε αυτές τις περιοχές του εγκεφάλου εμπόδισε την επανασυγκράτηση/ενίσχυση και την εξάλειψη της μνήμης IA. Το πιο σημαντικό, η αναστολή ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC μετά από 1-λεπτή επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα ανέστειλε την ενίσχυση της μνήμης IA με τη μεσολάβηση της ενοποίησης, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση ERK μετά από σύντομες (1 λεπτό) επανεκθέσεις στο σκοτεινό διαμέρισμα απαιτείται για την αναστολή της επανασύνδεσης της μνήμης IA. Αντίθετα, μια 1-λεπτή επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα ήταν ανεπαρκής για να σβήσει τη μνήμη IA, αν και η εκτεταμένη επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα (3 ή 10 λεπτά) έσβησε αυτή τη μνήμη. Επομένως, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι μια 1-λεπτή επανέκθεση στο σκοτεινό διαμέρισμα προκαλεί μια διαδικασία μετάβασης της μνήμης που ακυρώνει την επανενοποίηση/βελτίωση, αλλά δεν ξεκινά την εκμάθηση εξαφάνισης. Συλλογικά, προτείνουμε ότι η διαδικασία μετάβασης μνήμης συμβάλλει στη μετάβαση των φάσεων της μνήμης από την επανενοποίηση στην εξαφάνιση μέσω της αποτροπής της επανενοποίησης μέσω ERK.

Παρόμοια με τις τρέχουσες παρατηρήσεις μας, μια πρόσφατη μελέτη με χρήση ακουστικού φόβου έδειξε ότι οι μονές (1) ή οι παρατεταμένες (10) παρουσιάσεις CS επάγουν επανασυγκέντρωση και εξαφάνιση της μνήμης, αντίστοιχα, μέσω αύξησης των επιπέδων pERK στη βασεοπλάγια περιοχή της αμυγδαλής. Αντίθετα, οι ενδιάμεσες (4-7) παρουσιάσεις CS δεν αλλάζουν τα επίπεδα pERK στη βασεοπλάγια περιοχή της αμυγδαλής. Είναι σημαντικό ότι η αναστολή ERK στις ενδιάμεσες παρουσιάσεις CS δεν επηρέασε τη μνήμη φόβου. Αυτή η μελέτη πρότεινε ότι υπάρχει μια μετάβαση της φάσης της μνήμης από την ενοποίηση στην εξαφάνιση μετά την ανάκτηση μνήμης φόβου (Merlo et al., 2018). Στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε αυτό το εύρημα και προτείναμε ότι η φάση μετάβασης αλλάζει ενεργά τις φάσεις της μνήμης από την ενοποίηση στην εξαφάνιση μέσω της ενεργοποίησης της οδού μεταγωγής σήματος ERK. Σε αντίθεση με προηγούμενα ευρήματα (Merlo et al., 2018), βρήκαμε ότι η φάση μετάβασης περιλαμβάνει φωσφορυλίωση ERK στην αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο και το mPFC. Αυτές οι αποκλίσεις ίσως λόγω της διαφοράς χρονικών σημείων εξέτασης της φωσφορυλίωσης ERK. η προηγούμενη μελέτη μέτρησε τα επίπεδα pERK στα 12 λεπτά μετά την παρουσίαση του CS (Merlo et al., 2018), ενώ η μελέτη μας έδειξε ότι τα αυξημένα επίπεδα pERK επέστρεψαν στο βασικό επίπεδο περίπου σε αυτό το χρονικό σημείο (15 λεπτά μετά την επανέκθεση). Επιπρόσθετα, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η εργασία ΙΑ επιτρέπει την παρατήρηση της ενίσχυσης της μνήμης ΙΑ μέσω επανασύνδεσης, οδηγώντας έτσι στο συμπέρασμα ότι η αναστολή του ERK στη φάση μετάβασης αναστέλλει την ενίσχυση της μνήμης ΙΑ.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση ERK αυξάνεται στη βασεοπλάγια περιοχή της αμυγδαλής σε 20-60 λεπτά μετά την εκμάθηση εξαφάνισης της μνήμης του φόβου (Herry et al., 2006· Merlo et al., 2014, 2018), ενώ ο ιππόκαμπος δείχνει αυτή η ενεργοποίηση σε 1 ώρα μετά την εκμάθηση εξάλειψης της συναφούς μνήμης φόβου (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). Στην παρούσα μελέτη, λάβαμε παρόμοιες παρατηρήσεις ότι το pERK αυξάνεται στα 30 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης στη φάση της εξάλειψης. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση ERK είναι μια κοινή μοριακή υπογραφή της όψιμης φάσης εξαφάνισης (20-60 λεπτά).

Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η ενεργοποίηση ERK λαμβάνει χώρα διφασικά σε πρώιμα και όψιμα χρονικά σημεία (5 και 30 λεπτά) μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης στη φάση εξάλειψης, ενώ αυτή η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα μονοφασικά στο πρώιμο χρονικό σημείο της φάσης επανασύνδεσης (Εικ. 5) . Με συνέπεια, η αναστολή του ERK σε περιοχές του εγκεφάλου σε αυτά τα χρονικά σημεία των φάσεων επανασυγκράτησης και εξάλειψης εμπόδισε την επανασυγκράτηση/ενίσχυση και τη μακροπρόθεσμη εξάλειψη, αντίστοιχα (Εικ. 6Α, C-H). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι απαιτείται μονοφασική και διφασική ενεργοποίηση ERK για την ενίσχυση και την εξάλειψη της μνήμης IA με τη μεσολάβηση της ενοποίησης, αντίστοιχα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το ERK λειτουργεί ως ανοδικός ρυθμιστής της φωσφορυλίωσης CREB. Ως εκ τούτου, η παροδική ενεργοποίηση του ERK στην πρώιμη φάση της μνήμης μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να συμβάλει σε αυτή τη φωσφορυλίωση του CREB, η οποία ενεργοποιεί την έκφραση των γονιδίων που απαιτούνται για την επανενοποίηση και τη μακροπρόθεσμη εξαφάνιση.

Παρόμοια με τα προηγούμενα ευρήματά μας χρησιμοποιώντας τη ρύθμιση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα (Mamiya et al., 2009), το CREB ενεργοποιήθηκε στις φάσεις μνήμης επανασύνδεσης (αμυγδαλή/ιππόκαμπος/mPFC) και εξάλειψης (αμυγδαλή/mPFC), ενώ το ERK ενεργοποιήθηκε μόνο στη φάση εξάλειψης στα 30 λεπτά μετά τη συνεδρία επανενεργοποίησης. Κατά συνέπεια, μόνο ένας πληθυσμός νευρώνων pCREB1/pERK– παρατηρήθηκε στη φάση επανασυγκράτησης, ενώ διακριτοί πληθυσμοί νευρώνων παρατηρήθηκαν στη φάση εξαφάνισης: νευρώνες pCREB1/pERK– και pCREB1/pERK1 στην αμυγδαλή (Εικ. 2). Οι νευρώνες pCREB–/pERK1 στον ιππόκαμπο (Εικ. 3). και οι νευρώνες pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 και pCREB1/pERK1 στο mPFC (Εικ. 4). Αυτές οι παρατηρήσεις, ειδικά η αντίθετη παρατήρηση των νευρώνων pCREB–/pERK1 και pCREB1/pERK–, υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση των CREB και ERK ρυθμίζεται διαφορετικά σε κάθε περιοχή του εγκεφάλου όταν σβήνει η μνήμη και ότι η ενεργοποίηση όψιμης φάσης του ERK παίζει συγκεκριμένο και διακριτό ρόλοι για την εξάλειψη της μνήμης του φόβου σε σύγκριση με άλλες διαδικασίες μνήμης, όπως η εδραίωση και η επανένωση, όπως αναλύονται παρακάτω. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι οι νευρώνες pERK1 ήταν πιο άφθονοι στο mPFC σε σύγκριση με τον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή, καθώς το mPFC παρουσίασε υψηλότερη αναλογία νευρώνων pERK1 (φάση εξάλειψης) και νευρώνων pCREB1 (φάση επανασύνδεσης) σε σύγκριση με τον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή, γεγονός που υποδηλώνει ότι Η ενεργοποίηση του ERK στο mPFC παίζει πιο συγκεκριμένο ρόλο στην εξάλειψη της μνήμης.

Παραμένει ασαφές εάν οι ίδιοι ή διαφορετικοί πληθυσμοί νευρώνων ενεργοποιούνται στις φάσεις της μνήμης επανασύνδεσης, μετάβασης και εξαφάνισης. Μια προηγούμενη μελέτη εντόπισε την ενεργοποίηση των «νευρώνων του φόβου» και των «νευρώνων εξάλειψης» στην αμυγδαλή όταν επανενεργοποιηθεί ή σβήσει η μνήμη φόβου, αντίστοιχα (Herry et al., 2008). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό το ERK και το CREB να ενεργοποιούνται στους διαφορετικούς πληθυσμούς νευρώνων με διαφορετικά χρονικά προφίλ (δηλαδή, "νευρώνες επανενοποίησης" και νευρώνες εξαφάνισης). Όπως συζητήθηκε παραπάνω, οι νευρώνες pCREB1, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων pCREB1/pERK1, μπορεί να ρυθμίζουν την επανασυγκράτηση και τη μακροπρόθεσμη εξαφάνιση της μνήμης ΙΑ μέσω της ενεργοποίησης της γονιδιακής έκφρασης ως νευρώνων επαναστερεοποίησης και εξαφάνισης, αντίστοιχα. Αντίθετα, η ενεργοποίηση ERK σε νευρώνες pCREB–/pERK1 μπορεί να συμβάλει στην ακύρωση της μεταγραφικής ενεργοποίησης που προκαλείται από το CREB που θα απαιτούνταν για την επανασυγκράτηση, καθώς αυτή η ενεργοποίηση ERK παρατηρείται ειδικά στην όψιμη φάση εξαφάνισης. Το ERK έχει ενεργοποιηθεί στους νευρώνες επανασύνδεσης για να ακυρώσει την ενεργοποίηση της γονιδιακής έκφρασης στη φάση της εξαφάνισης. Είναι ενδιαφέρον ότι μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποίηση του ERK του ιππόκαμπου μπλοκάρει την επαγωγή του c-fos όταν σβήνει η μνήμη φόβου των συμφραζομένων (Guedea et al., 2011), αυξάνοντας την πιθανότητα αυτή η ενεργοποίηση ERK να ανταγωνίζεται την οδό σηματοδότησης CREB. Είναι σημαντικό να εντοπιστούν οι νευρωνικοί πληθυσμοί που ρυθμίζουν την επανασυγκράτηση, τη μετάβαση και την εξαφάνιση και να διερευνηθούν οι μοριακές υπογραφές και η λειτουργική σημασία αυτών των νευρώνων. Επιπλέον, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ νευρικών πληθυσμών που εντοπίστηκαν σε αυτή τη μελέτη παραμένουν άγνωστες. Είναι πιθανό ότι οι «νευρώνες εξαφάνισης (μετάβασης)» διαμορφώνουν τη λειτουργία των νευρώνων επανασυγκράτησης για να ακυρώσουν την πρόληψη της επανασυγκράτησης μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους (Eisenberg et al., 2003· Merlo et al., 2014). Επομένως, είναι επίσης σημαντικό να εξεταστούν αυτές οι αλληλεπιδράσεις μέσα και μεταξύ της αμυγδαλής, του mPFC και του ιππόκαμπου.

Προηγουμένως, δείξαμε ότι ο ιππόκαμπος δεν εμφανίζει καμία αλλαγή στη φωσφορυλίωση του CREB και στην έκφραση του τόξου μετά την εκμάθηση της εξάλειψης του συναφούς φόβου και, με συνέπεια, η αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης στον ιππόκαμπο στη φάση της εξαφάνισης αποτυγχάνει να εμποδίσει τη μακροπρόθεσμη εξαφάνιση (Mamiya et al. , 2009). Αυτές οι παρατηρήσεις έχουν αυξήσει την πιθανότητα ότι ο ιππόκαμπος δεν απαιτείται για μακροπρόθεσμη εξαφάνιση. Ωστόσο, δείξαμε ότι το ERK ενεργοποιείται στον ιππόκαμπο μετά την εκμάθηση εξαφάνισης της μνήμης IA και, με συνέπεια, ο αποκλεισμός της ενεργοποίησης του ERK στον ιππόκαμπο επηρεάζει τη μακροπρόθεσμη εξαφάνιση. Επομένως, οι τρέχουσες παρατηρήσεις μας υποδεικνύουν ουσιαστικούς ρόλους για τον ιππόκαμπο στην εξαφάνιση της μνήμης. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα ευρήματά μας, προτείνουμε ότι ο ιππόκαμπος απαιτείται για την εξαφάνιση της μνήμης, αλλά όχι για μια διαδικασία που μοιάζει με ενοποίηση για να σταθεροποιήσει μια «μνήμη εξαφάνισης» μέσω της ενεργοποίησης της γονιδιακής έκφρασης.