Μέρος 2: Η επιγενετική ρύθμιση του κιρκάδιου γονιδίου Per1 συμβάλλει σε αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στη μνήμη του ιππόκαμπου

Επικοινωνία: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 1

Η πτώση του Per1 βλάπτει μακροπρόθεσμαμνήμησε νεαρά ποντίκια.Στη συνέχεια, για να ελεγχθεί εάν η ανοδική ρύθμιση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο είναι απαραίτητη για μακροχρόνιαμνήμησχηματισμό, εγχύαμε siRNA που στοχεύει Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο νεαρών ποντικών 48 ώρες πριν από 10-λεπτά προπόνηση OLM. Η έγχυση του Per1 siRNA παρήγαγε μια σημαντική μείωση της πρωτεΐνης PER1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο, όπως μετρήθηκε 2 ώρες μετά την τελική συνεδρία δοκιμής (Εικ. 4δ, Συμπληρωματικό Σχ. 5). Αυτή η σχετικά μέτρια μείωση της πρωτεΐνης PER1 (~30 τοις εκατό) παρήγαγε σοβαρά μειωμένημνήμησχηματισμός για OLM? ποντίκια στα οποία έγινε έγχυση Per1 siRNA δεν εμφάνισαν σημαντική αύξηση στο DI μεταξύ εκπαίδευσης και δοκιμής και εμφάνισαν σημαντικά λιγότερη προτίμηση για το κινούμενο αντικείμενο κατά τη διάρκεια της δοκιμής από τα ποντίκια ελέγχου (Εικ. 4e) χωρίς καμία επίδραση στη συνολική εξερεύνηση αντικειμένων κατά τη δοκιμή (Εικ. 4στ) και καμία διαφορά στην κίνηση κατά τη διάρκεια των συνεδριών εξοικείωσης πριν από την προπόνηση (Συμπληρωματικό Σχ. 8γ). Αυτό καταδεικνύει, για πρώτη φορά, ότι η τοπική διαταραχή ενός γονιδίου του πυρήνα του κιρκάδιου ρολογιού επιλεκτικά εντός του ιππόκαμπου μπορεί να βλάψειμνήμησχηματισμός.

Η υπερέκφραση Per1 βελτιώνεταιμνήμησε γερασμένα ποντίκια. Τελικά,για να προσδιοριστεί εάν η υπερέκφραση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο είναι επαρκής για τη βελτίωση της σχετιζόμενης με την ηλικίαμνήμηαπομειώσεις, ρυθμίσαμε τοπικά το Per1 χρησιμοποιώντας δύο συμπληρωματικές μεθόδους. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε έναν φακοϊό που εκφράζει άγριου τύπου Per1 με ετικέτα επιτόπου v5 (pLVX-v5Per1) (Εικ. 5a, Συμπληρωματικό Σχήμα 6a). Για να επιβεβαιώσουμε ότι αυτό το πλασμίδιο υπερεκφράζει Per1, επιμολύναμε κύτταρα HT22 με pLVX-v5Per1 ή pLVX-EV και μετρήσαμε την έκφραση Per1 mRNA. Τόσο στις 24 όσο και στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, το Per1 mRNA αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με pLVX-v5Per1 σε σχέση με κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο ελέγχου (Εικ. 5b). Η επιμόλυνση του pLVX-v5Per1 οδήγησε επίσης σε σημαντική αύξηση του mRNA για το Per2 (ένα μέλος της οικογένειας ρολογιού περιόδου που αλληλεπιδρά με το Per1) στις 24 ώρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 6β), αν και αυτή η αύξηση ήταν πολύ μικρότερη από την παρατηρούμενη αύξηση στο Per1 (στο 24 h, Per1: 466-πλάσια αύξηση έναντι EV, Per2: 1.6-πλάσια αύξηση έναντι EV). Ωστόσο, η υπερέκφραση Per1 δεν επηρέασε τη μεταγραφή του πλησιέστερου κατάντη γονιδίου Hes7 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6c).

Για να προσδιορίσετε εάν βελτιώνεται η υπερέκφραση Per1μνήμηαπόδοση σε γηρασμένα ποντίκια, το pLVX-v5Per1 εγχύθηκε στον ραχιαίο ιππόκαμπο 18-mo ποντικών 2 εβδομάδες πριν από τη συμπεριφορά. Τα ποντίκια pLVX-v5Per1 έδειξαν σημαντικά βελτιωμέναμνήμηγια OLM στη δοκιμή σε σχέση με τους ελέγχους pLVX-EV (κενός φορέας) (Εικ. 5γ). Μόνο τα ποντίκια pLVX-v5Per1 εμφάνισαν σημαντική αύξηση στην προτίμηση για το κινούμενο αντικείμενο σε ηρεμία σε σχέση με την προπόνηση χωρίς να παρατηρηθούν διαφορές ομάδας στη συνολική εξερεύνηση στη δοκιμή (Εικ. 5δ) ή στην κίνηση κατά τη διάρκεια της εξοικείωσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 8δ).

Μετά τη συμπεριφορά, ο ιστός του ιππόκαμπου από ένα υποσύνολο ζώων υποβλήθηκε σε επεξεργασία για προσδιορισμό αλληλουχίας RNA για να επιβεβαιωθεί η παρουσία των μεταγραφών pLVX-EV και pLVX-v5Per1 στις κατάλληλες ομάδες in vivo (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a, b, f, g).

Για να συμπληρώσουμε αυτήν την προσέγγιση, χρησιμοποιήσαμε επίσης το σύστημα CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 για να προωθήσουμε τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο. Αυτό το σύστημα αποτελείται από τρία φακοϊικά συστατικά: ένα καταλυτικάανενεργό Cas9 (dCas9) συγχωνευμένο με μεταγραφικό τομέα ενεργοποίησης VP64 με ετικέτα GFP (dCas9-VP64-GFP), ένα τροποποιημένο μονοοδηγό RNA (sgRNA) που στοχεύει Per1 με δύο απταμερή MS2 RNA που μπορεί να στρατολογήστε το τρίτο συστατικό, μια πρωτεΐνη σύντηξης MS2- διπλού μεταγραφικού ενεργοποιητή (MS2-p65-HSF1)(Εικ. 5ε). Τα ζώα ελέγχου έλαβαν ένα sgRNA ελέγχου που δεν είχε την αλληλουχία των 20 νουκλεοτιδίων που απαιτείται για τη στόχευση του συστήματος SAM στο Per1 (αναφέρεται ως ctrl sgRNA). Η συναρμολόγηση αυτών των συστατικών στον υποκινητή Per1 επιτρέπει στις τρεις περιοχές τελεστών (VP64, p65 και HSF1) να οδηγήσουν τη μεταγραφή Per1. Για να επιβεβαιωθεί, η αποτελεσματικότητα του Σχ. 5 Η υπερέκφραση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο βελτιώνει τις σχετιζόμενες με την ηλικία βλάβες στη θέση του αντικειμένουμνήμη. ένα σχηματικό κατασκεύασμα φακοϊού που χρησιμοποιείται για την υπερέκφραση v{{0}}με ετικέτα Per1 (pLVX-v5Per1) σε σύγκριση με τον έλεγχο κενού φορέα (pLVX-EV). b Το Per1 mRNA αυξήθηκε σημαντικά 24 και 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση του pLVX-v5Per1 σε κύτταρα HT22 σε σύγκριση με κύτταρα που επιμολύνθηκαν με EV (Αμφίδρομη ANOVA: Αλληλεπίδραση Ομάδας x Χρονικού Σημείου (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{4{0}}1),="" οι="" δοκιμές="" post="" hoc="" του="" sidak,="" ***p="">< {0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" γ="" 18-μήνα="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" εγχύσεις="" ιππόκαμπου="" plvx-v5per1="" έδειξαν="" σημαντικά="" καλύτερη="" μνήμη="" για="" το="" olm="" από="" ποντίκια="" στους="" οποίους="" χορηγήθηκε="" ιός="" ελέγχου="" plvx-ev="" (αμφίδρομη="" anova:="" αλληλεπίδραση="" ιού="" x="" συνεδρίας,="" (f(1,29)="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" οι="" δοκιμές="" post="" hoc="" του="" sidak,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" όλοι="" οι="" άνδρες).="" δ="" η="" συνολική="" εξερεύνηση="" ήταν="" παρόμοια="" και="" για="" τις="" δύο="" ομάδες="" στη="" δοκιμή="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" σχηματική="" απεικόνιση="" του="" συστήματος="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" που="" χρησιμοποιείται="" για="" την="" κίνηση="" της="" μεταγραφής="" per1.="" κορυφή:="" μεμονωμένα="" εξαρτήματα="" του="" sam.="" κάτω:="" στοιχεία="" συναρμολογημένα="" στον="" προωθητή="" per1,="" οδηγώντας="" τη="" μεταγραφή="" per1.="" f="" per1="" mrna="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" 48="" ώρες="" μετά="" τη="" διαμόλυνση="" των="" συστατικών="" crispr-sam="" σε="" κύτταρα="" ht22="" σε="" σύγκριση="" με="" κύτταρα="" που="" επιμολύνθηκαν="" με="" το="" sgrna="" ελέγχου="" (αμφίδρομη="" anova:="" αλληλεπίδραση="" ομάδας="" x="" χρονικού="" σημείου="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" οι="" δοκιμές="" post="" hoc="" του="" sidak,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-μήνα="" ποντίκια="" που="" έλαβαν="" εγχύσεις="" ιππόκαμπου="" του="" συστήματος="" crispr-sam="" με="" στόχευση="" sgrna="" per1="" έδειξαν="" σημαντικά="">μνήμηγια OLM σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου EV με sgRNA ελέγχου (Αμφίδρομη ANOVA: Αλληλεπίδραση ιού x συνεδρίας (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" post="" hoc="" τεστ="" του="" sidak,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" όλοι="" άνδρες).="" h="" η="" συνολική="" εξερεύνηση="" ήταν="" παρόμοια="" και="" για="" τις="" δύο="" ομάδες="" στη="" δοκιμή="" (t(30)="0.41," p="0.68)." τα="" δεδομένα="" παρουσιάζονται="" ως="" μέσος="" όρος="" ±="" sem="" στο="" σύστημα="" crispr-sam,="" επιμολύναμε="" κύτταρα="" ht22="" και="" με="" τα="" τρία="" πλασμίδια,="" συλλέξαμε="" τα="" κύτταρα="" 24="" ή="" 48="" ώρες="" αργότερα="" και="" μετρήσαμε="" την="" έκφραση="" per1="" mrna.="" έως="" 48="" ώρες="" μετά="" τη="" διαμόλυνση,="" το="" per1="" mrna="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" στην="" ομάδα="" που="" έλαβε="" per1="" sgrna="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" ελέγχους="" (εικ.="" 5στ),="" επιβεβαιώνοντας="" ότι="" το="" σύστημα="" crispr-sam="" οδηγεί="" αποτελεσματικά="" την="" έκφραση="" per1="" mrna.="" δεν="" παρατηρήσαμε="" καμία="" αλλαγή="" στην="" έκφραση="" ούτε="" για="" το="" per2="" mrna="" (συμπληρωματικό="" σχ.="" 6e)="" ούτε="" για="" το="" hes7="" mrna="" (συμπληρωματικό="" σχήμα="" 6f),="" υποδεικνύοντας="" ότι="" το="" σύστημα="" crispr-sam="" οδηγεί="" σε="" επιλεκτική="" υπερέκφραση="" του="" γονιδίου="" στόχου,="">

Στη συνέχεια, σε 18-σε ποντίκια χορηγήθηκαν ενδο-ιππόκαμπες εγχύσεις των φακοϊών CRISPR-SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 6δ) και εκπαιδεύτηκαν σε OLM 2 εβδομάδες αργότερα. Όπως παρατηρήθηκε με την υπερέκφραση pLVX-v5Per1, η υπερέκφραση Per1 με τη μεσολάβηση CRISPR-SAM βελτιώθηκε σημαντικάμνήμηαπόδοση σε ποντίκια με έγχυση Per1 sgRNA σε σχέση με ζώα ελέγχου (Εικ. 5g) χωρίς να επηρεάζεται η συνολική εξερεύνηση (Εικ. 5h) ή η κίνηση κατά τη διάρκεια της εξοικείωσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 8e). Μόνο τα ποντίκια που έλαβαν το Per1 sgRNA έδειξαν σημαντική αύξηση στην προτίμηση για το κινούμενο αντικείμενο σε ηρεμία σε σχέση με την προπόνηση, υποδεικνύοντας άθικτομνήμηγια τις θέσεις των αντικειμένων (Εικ. 5ζ). Μετά τη συμπεριφορά, ο ιστός του ιππόκαμπου από ένα υποσύνολο ζώων υποβλήθηκε σε επεξεργασία για προσδιορισμό αλληλουχίας RNA για να επιβεβαιωθεί η παρουσία των μεταγραφών CRISPR στις κατάλληλες ομάδες in vivo (Συμπληρωματικό Σχήμα 7c–g). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο είναι επαρκής για τη βελτίωση των βλαβών που σχετίζονται με την ηλικία στη μακροπρόθεσμη μνήμη εντοπισμού αντικειμένων. Το Per1 είναι, επομένως, ένα βασικό γονίδιο που είναι κρίσιμο για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης, ρυθμίζεται από το HDAC3 και είναι εξασθενημένο στον γερασμένο εγκέφαλο.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διαγραφή ή η διακοπή της κατασταλτικής αποακετυλάσης ιστόνης HDAC3 μπορεί να βελτιώσει τις βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία και στις δύο μακροπρόθεσμεςμνήμηκαι συναπτική πλαστικότητα. Περαιτέρω, η διαγραφή του HDAC3 αποκαθιστά την επαγόμενη από την εμπειρία έκφραση του κιρκάδιου γονιδίου Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο. Καθώς η έκφραση του ιππόκαμπου PER1 είναι κρίσιμη για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης (Εικ. 4) και η υπερέκφραση του Per1 στον ιππόκαμπο βελτιώνει τις βλάβες μνήμης που σχετίζονται με την ηλικία (Εικ. 5), το PER1 είναι ένας πιθανός μηχανισμός μέσω του οποίου βελτιώνεται η διαγραφή του HDAC3μνήμηκαι συναπτική πλαστικότητα σε γηρασμένα ποντίκια. Ευρύτερα, η διαταραχή του Per1 που σχετίζεται με την ηλικία μπορεί να συνδέσει βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία τόσο στη μακροπρόθεσμη μνήμη όσο και στον κιρκάδιο ρυθμισμό, ανάλογα με τη δομή.

Ένα βασικό εύρημα από την τρέχουσα μελέτη ήταν ότι οι σχετιζόμενες με την ηλικία βλάβες στο LTP του ιππόκαμπου θα μπορούσαν να βελτιωθούν με διαγραφή ή διαταραχή του HDAC3. Αυτό είναι σύμφωνο με την πρόσφατη εργασία από το εργαστήριο Sajikumar που καταδεικνύει ότι ο φαρμακολογικός αποκλεισμός του HDAC3 μπορεί επίσης να βελτιώσει τις βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία στο συνειρμικό LTP34 του ιππόκαμπου. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι φέτες από παλιά ζώα HDAC3ox/ox και HDAC3(Y298H) απέτυχαν να φτάσουν στο ίδιο επίπεδο ενίσχυσης με φέτες από νεαρά ζώα HDAC3ox/ox ή HDAC3(Y298H) (Εικ. 2γ, στ), υποδηλώνοντας ότι Οι γερασμένοι εγκέφαλοι μπορεί να έχουν χαμηλότερο ανώτατο όριο πλαστικότητας από τους νέους εγκεφάλους. Μια πιθανή εξήγηση για αυτή τη διαφορά στην ενίσχυση είναι ότι η απώλεια συναπτικών επαφών στο CA122 που σχετίζεται με την ηλικία θα μπορούσε να μειώσει το ανώτατο όριο πλαστικότητας στον γηρασμένο ιππόκαμπο, καθώς οι λιγότερες διαθέσιμες συνάψεις θα κορέσουν πιο γρήγορα από τις σχετικά άφθονες συνάψεις στο νεαρό DH. Εάν συμβαίνει αυτό, η ενίσχυση του πρωτοκόλλου διέγερσης ή η παροχή σε απόσταση περιόδων διέγερσης35 δεν θα πρέπει να ενισχύσει περαιτέρω την LTP στον γηρασμένο ιππόκαμπο, καθώς δεν υπάρχουν διαθέσιμες πρόσθετες συνάψεις. Θα χρειαστεί περαιτέρω εργασία για τον προσδιορισμό του μηχανισμού που βρίσκεται στη βάση αυτής της διαφοράς.

Τα αποτελέσματα της αλληλουχίας RNA μας έδειξαν ότι μόνο ένα μικρό υποσύνολο γονιδίων ταιριάζει στα κριτήρια αποκατάστασης στον γερασμένο εγκέφαλο με διαγραφή HDAC3 (Εικ. 3e). Έτσι, αντί να ανακεφαλαιώσουμε το προφίλ γονιδιακής έκφρασης του νεαρού εγκεφάλου, η διαγραφή του HDAC3 στον γερασμένο εγκέφαλο αποκατέστησε την έκφραση που προκαλείται από την εμπειρία μερικών βασικών γονιδίων που είναι κρίσιμα για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης, συμπεριλαμβανομένου του Per1. Το Per1 φαίνεται να ρυθμίζεται άμεσα από το HDAC3, καθώς η εστιακή διαγραφή του HDAC3 αποκατέστησε την έκφραση Per1 που προκαλείται από την εμπειρία και το HDAC3 αφαιρείται φυσικά από τον υποκινητή Per1 ως απόκριση στην εκπαίδευση OLM. Επιπλέον, η έκφραση Per1 είναι απαραίτητη γιαμνήμη, καθώς η μείωση της πρωτεΐνης PER1 στο DH με τη μεσολάβηση siRNA βλάπτει μακροπρόθεσμαμνήμησχηματισμός σε νεαρά ποντίκια και η υπερέκφραση βελτιώθηκεμνήμηγια OLM σε γηρασμένα ποντίκια. Σημειωτέον, και τα δύο φακοϊικά συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για την υπερέκφραση Per1 επιμόλυναν μόνο έναν μικρό αριθμό κυττάρων στην περιοχή CA1b του ραχιαίου ιππόκαμπου (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a, d), καθιστώντας απαραίτητη την επιβεβαίωση της παρουσίας αυτών των κατασκευών με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA (βλ. μεθόδους ). Όπως έχει δείξει προηγούμενη εργασία ότι αυτή η ακριβής περιοχή του ραχιαίου ιππόκαμπου είναι κρίσιμη για το OLM36, αυτό δείχνει ότι ακόμη και μια μικρή εστιακή αλλαγή του Per1 σε μια δομή σχετική με τη μνήμη μπορεί να επηρεάσει το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης. Αυτό επεκτείνει την προηγούμενη έρευνα που δείχνει ότι η μη ειδική διαγραφή του Per1 σε όλο τον εγκέφαλο μπορεί να βλάψει το σχηματισμό μνήμης σε νεαρά ποντίκια6,28,29. Η μη φυσιολογική{12}}διαμεσολαβούμενη από HDAC καταστολή του Per1 στον γερασμένο εγκέφαλο είναι επομένως ένα βασικό συμβάν που θα μπορούσε να οδηγήσει σε βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία τόσο στον σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης όσο και στον κιρκάδιο ρυθμισμό. Αν και αυτή η μελέτη καταδεικνύει ξεκάθαρα ότι το Per1 είναι ένα σημαντικό γονίδιο μέσω του οποίου το HDAC3 ρυθμίζει τη μακροπρόθεσμη μνήμη στον γερασμένο εγκέφαλο, άλλα γονίδια πιθανότατα συμβάλλουν στις επιδράσεις ενίσχυσης της μνήμης της διαγραφής HDAC3. Άλλα γονίδια που προτείνονται για τη μεσολάβηση των επιδράσεων του HDAC3 στη συναπτική πλαστικότητα και τη μνήμη περιλαμβάνουν τα NF-κB34, FMRP37 και Nr4a226. Στην τρέχουσα μελέτη, εντοπίσαμε άλλα τρία γονίδια (Εικ. 3f:Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) που, όπως και το Per1, παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση στον γερασμένο εγκέφαλο που βελτιώνεται με τη διαγραφή HDAC3. Ο τρόπος με τον οποίο αυτά τα διαφορετικά γονίδια συμβάλλουν μοναδικά στα αποτελέσματα ενίσχυσης της μνήμης της διαγραφής HDAC3 δεν είναι επί του παρόντος ασαφές. Σημειωτέον, όλα αυτά τα γονίδια διασυνδέονται με το μονοπάτι CBP/CREB, το οποίο είναι κρίσιμο για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης38,39 και είναι τόσο πάνω όσο και κατάντη του PER16,28. Καθώς το PER1 είναι ανάντη της φωσφορυλίωσης CREB6, είναι πιθανό η μεσολαβούμενη από HDAC3-καταστολή του Per1 να μειώνει τη φωσφορυλίωση CREB, βλάπτοντας τελικά τη μεταγραφή των γονιδίων που διαμεσολαβούνται από το CREB όπως τα Fmrp40,41 και τα μέλη της οικογένειας του γονιδίου Nr4a226r και Nr4a26r. Η κατανόηση της πολύπλοκης δυναμικής μεταξύ των HDAC3, PER1 και αυτών των άλλων μοριακών παικτών θα είναι ένας σημαντικός στόχος μελλοντικής έρευνας.

Στην τρέχουσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε δύο συμπληρωματικές μεθόδους για την υπερέκφραση του Per1 στον γερασμένο εγκέφαλο: υπερέκφραση ενός πλήρους μήκους κατασκευάσματος Per1 cDNA χρησιμοποιώντας pLVX-v5Per1 και μεταγραφική ενεργοποίηση του ενδογενούς Per1 χρησιμοποιώντας το σύστημα CRISPR-SAM. Αν και η υπερέκφραση με τη μεσολάβηση pLVX οδήγησε σε μεγάλη αύξηση στο Per1 mRNA (Εικ. 5β), αυτό συνοδεύτηκε από αύξηση στο Per2, άλλο μέλος της οικογένειας της Περιόδου (Συμπληρωματικό Σχήμα 6β). Η έκφραση του κατάντη γονιδίου Hes7, ωστόσο, παρέμεινε αμετάβλητη από το pLVX-v5Per1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6c). Το σύστημα CRISPR-SAM, από την άλλη πλευρά, παρήγαγε μια πιο ανεπαίσθητη αύξηση στο Per1 mRNA που απέφυγε τις εκτός στόχου βελτιώσεις της έκφρασης Per2 ή Hes7 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6e–f). Καθώς και οι δύο προσεγγίσεις βελτιώθηκαν παρόμοια μακροπρόθεσμαμνήμησε γηρασμένα ποντίκια, είναι απίθανο η αύξηση εκτός στόχου στο Per2 που παρατηρήθηκε με το pLVX-v5Per1 να ήταν η αιτία της παρατηρούμενης βελτίωσης στη μακροπρόθεσμη μνήμη.

Κιρκαδικές επιδράσεις σε μακροπρόθεσμεςμνήμηπαραδοσιακά πιστεύεται ότι προέρχονται από δυσρύθμιση εντός του SCN, η οποία στη συνέχεια οδηγεί σε αλλαγές στις περιφερειακές δομές που εμπλέκονται στο σχηματισμό της μνήμης, όπως ο ραχιαίος ιππόκαμπος. Λίγα είναι γνωστά για το ρόλο των μεμονωμένων γονιδίων του κιρκάδιου ρολογιού στο DH, παρά τη σαφή σύνδεση μεταξύ της κιρκαδικής ρυθμικότητας και του σχηματισμού μακροπρόθεσμης μνήμης. Η μνήμη είναι στενά συνδεδεμένη με την ώρα της ημέρας, καθώς οι καταρράκτες γονιδίων που σχετίζονται με την πλαστικότητα εμφανίζουν κιρκαδικές ταλαντώσεις3,6 καιμνήμημπορεί να αποκτηθεί πιο εύκολα σε ορισμένες περιόδους του κιρκάδιου κύκλου. Για παράδειγμα, η ρύθμιση του φόβου περιβάλλοντος αποκτάται πιο έντονα κατά τη διάρκεια της ημέρας, όταν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης MAPK κορυφώνονται3. Επιπλέον, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η γήρανση συνοδεύεται από μια κατάρρευση των κιρκάδιων ρυθμών, πιθανώς λόγω αλλαγών στο κεντρικό κιρκάδιο ρολόι, τον υπερχιασματικό πυρήνα (SCN) (για ανασκόπηση1). Πώς αυτή η διαταραχή στο κιρκάδιο ρολόι σχετίζεται με τις βλάβες που σχετίζονται με την ηλικίαμνήμηείναι ανοιχτό ερώτημα. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το HDAC3 περιορίζει το Per1 που προκαλείται από την εμπειρία στον γερασμένο ιππόκαμπο, συμβάλλοντας πιθανώς στις παρατηρούμενες βλάβες στη μακροπρόθεσμη μνήμη. Η επιγενετική καταστολή του Per1 μπορεί επομένως να αντιπροσωπεύει μια σημαντική διασύνδεση μεταξύ των βλαβών που σχετίζονται με την ηλικία τόσο στον κιρκάδιο ρυθμισμό όσο και στον σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης.

Από τα βασικά κανονικά γονίδια του κιρκάδιου ρολογιού, το Per1 είναι μοναδικά έτοιμο να επηρεάσει δραματικά τον ιππόκαμπο μακροπρόθεσμαμνήμη. Το Per1 φαίνεται να εμπλέκεται κυρίως στις οδούς εξόδου του SCN και παίζει βασικό ρόλο στα περιφερειακά ρολόγια κατάντη του SCN, όπως ο ιππόκαμπος42. Περαιτέρω, πρόσφατη εργασία προτείνει ότι το Per1 μπορεί να «πύλη» σχηματισμό χωρικής μνήμης καθ' όλη τη διάρκεια του κύκλου ημέρας/νύχτας ελέγχοντας τη φωσφορυλίωση CREB6,28,29. Πράγματι, ανοδική ρύθμιση του mRNA Per1 του ιππόκαμπου έχει παρατηρηθεί μετά από μάθηση περιβάλλοντος ή χωρικής μάθησης σε τουλάχιστον τρεις άλλες μελέτες RNA-seq, συμπεριλαμβανομένης της εργασίας σε αρουραίους, υποδεικνύοντας ότι το Per1 συνήθως ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά την εκμάθηση σε όλα τα είδη20,43,44. Μαζί με τα αποτελέσματα της τρέχουσας μελέτης, αυτή η εργασία δείχνει ότι η έκφραση PER1 είναι κρίσιμης σημασίας για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης του ιππόκαμπου. Οι μειώσεις στο PER1 που συμβαίνουν τη νύχτα29 ή με τη γήρανση θα μπορούσαν να βλάψουν τον ιππόκαμπομνήμη. Μέχρι σήμερα,

έρευνα που εμπλέκει την Per1 σεμνήμηΟ σχηματισμός βασίζεται αποκλειστικά σε παγκόσμια νοκ-άουτ που διαταράσσουν την έκφραση Per1 στον πυρήνα του κιρκάδιου ρολογιού και σε άλλες περιοχές, εκτός από δομές που σχετίζονται με τη μνήμη, όπως ο ιππόκαμπος6,28,29,45,46, καθιστώντας αδύνατο να προσδιοριστεί εάν το ιππόκαμπο PER1 απαιτείται ειδικά για σχηματισμός μνήμης. Πράγματι, η συνολική διαγραφή Per1 επηρεάζει τον κιρκάδιο ρυθμό σε ορισμένες αναφορές42. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η μείωση της έκφρασης PER1 απευθείας στον ραχιαίο ιππόκαμπο μπορεί να βλάψειμνήμησε νεαρά ποντίκια, ενώ η τοπική υπερέκφραση του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη σε γηρασμένα ποντίκια. Καθώς η επιλεκτική διαγραφή HDAC3 (που ρυθμίζει το Per1) στον ραχιαίο ιππόκαμπο δεν είχε καμία επίδραση στα πρότυπα κιρκάδιας δραστηριότητας στην τρέχουσα μελέτη (Συμπληρωματικό Σχήμα 4), και ακόμη και οι ηλεκτρολυτικές βλάβες του ραχιαίου ιππόκαμπου είναι ανεπαρκείς για να επηρεάσουν τον κιρκάδιο ρυθμό47, φαίνεται απίθανο. Ο χειρισμός του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο επηρεάζει τη λειτουργία του κεντρικού κιρκάδιου ρολογιού. Παρ' όλα αυτά, είναι πιθανό οι αυξήσεις στο Per1 που προκαλούνται από την εμπειρία ή η υπερέκφραση του Per1 που προκαλείται από τον ιό να μπορεί να επηρεάσει την κιρκαδική ταλάντωση άλλων μοριακών παικτών, όπως άλλα γονίδια ρολογιού, εντός των νευρώνων του ιππόκαμπου, ακόμη και χωρίς να επηρεάζονται τα μοτίβα κιρκαδικής δραστηριότητας. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο το Per1 λειτουργεί για να αλλάξει το σχηματισμό μνήμης, συμπεριλαμβανομένου του εντοπισμού αυτών των πιθανών συνεργατών που αλληλεπιδρούν, θα είναι ο στόχος της μελλοντικής εργασίας.

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το γονίδιο του πυρήνα του κιρκάδιου ρολογιού Per1 παίζει βασικό ρόλο στην τοπικήμνήμηδομές για την αλλαγή του σχηματισμού μνήμης, ρόλος που είναι ανεξάρτητος από τη λειτουργία του στο SCN. Γενικότερα, αυτό αμφισβητεί την παραδοσιακή υπόθεση ότι οι κιρκαδικές αλλαγέςμνήμηΟ σχηματισμός οδηγείται από αλλαγές στον πυρήνα του κιρκάδιου ρολογιού και αντ' αυτού υποστηρίζει την υπόθεση ότι τα γονίδια του κιρκάδιου ρολογιού παίζουν πιο αυτόνομο ρόλο στα κύτταρα του ιππόκαμπου, πιθανώς κλείνοντας το σχηματισμό μνήμης με βάση την ώρα της ημέρας6.

Μέθοδοι

Ποντίκια. Τα νεαρά ενήλικα ποντίκια ήταν μεταξύ 2 και 4 μηνών τη στιγμή της δοκιμής και τα ηλικιωμένα ποντίκια ήταν μεταξύ 18 και 20 μηνών. Όλα τα ποντίκια ήταν C57BL/6J ή διατηρήθηκαν σε φόντο C57BL/6 (ποντίκια HDAC3 plus / plus και HDAC3flox/flox). Τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και τα φώτα διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών. Όλες οι δοκιμές συμπεριφοράς πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του κύκλου φωτός. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας των ΗΠΑ για τη φροντίδα και τη χρήση των ζώων και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Irvine.

Χειρουργική επέμβαση. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο (προκλήθηκε, 4 τοις εκατό, διατηρήθηκε 1,5-2,0 τοις εκατό ) και τοποθετήθηκαν στο στερεοταξικό. Οι βελόνες ένεσης χαμηλώθηκαν στον ραχιαίο ιππόκαμπο με ρυθμό 0,2 mm/15 s (AP, -2.0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, - 1,5 mm σε σχέση με το Bregma ). Δύο λεπτά μετά την επίτευξη του στοχευόμενου βάθους, 1,0 ul ιού ή siRNA εγχύθηκε αμφίπλευρα στο DH με ρυθμό 6 ul/h. Για τις εγχύσεις φακοϊών CRISPR-SAM, ένα κοκτέιλ από τους τρεις ιούς εγχύθηκε σε τελικό όγκο 1,5 μL ανά ημισφαίριο με τον ίδιο ρυθμό. Οι βελόνες ένεσης παρέμειναν στη θέση τους για δύο λεπτά μετά την ένεση για να επιτραπεί η διάχυση του ιού. Στη συνέχεια, οι εγχυτήρες ανυψώθηκαν 0,1 mm και αφέθηκαν να καθίσουν για άλλο ένα λεπτό πριν αφαιρεθούν με ρυθμό 0,1 mm ανά 15 δευτερόλεπτα. Οι ιογενείς εγχύσεις πραγματοποιήθηκαν 2 εβδομάδες πριν από την ανάλυση συμπεριφοράς, ενώ το siRNA knockdown πραγματοποιήθηκε 2 ημέρες πριν από την προπόνηση13. Για όλα τα πειράματα έγχυσης, τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία στις διαφορετικές συνθήκες ένεσης (με εξαίρεση τα ποντίκια HDAC3 plus / plus και HDAC3flox/flox, στα οποία έγινε ένεση AAV-CaMKII-Cre). Για όλα τα πειράματα συμπεριφοράς, τα ζώα σε κάθε ιογενή κατάσταση κατανεμήθηκαν τυχαία σε ομάδες κλωβού/εκπαιδευμένες και όλες οι συνθήκες (αντικείμενα, κουτιά, κ.λπ.) αντισταθμίστηκαν μεταξύ των ομάδων.

Παραγωγή AAV. AAV2.1-Το CaMKII-Cre αγοράστηκε από την Penn Vector Core (τίτλος: 1,81 × 1013 GC/ml). Για το AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, ενισχύσαμε τον άγριου τύπου HDAC3 από cDNA του ιππόκαμπου και κλωνοποιήσαμε το προϊόν σε ένα τροποποιημένο pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) υπό τον έλεγχο του προαγωγέα CMV και του εσωνίου -σφαιρίνης. Η ετικέτα 3×-FLAG, το στοιχείο IRES και η hrGFP αφαιρέθηκαν από τον φορέα και αντικαταστάθηκαν με μια ετικέτα V5, επιτρέποντας μια C-τερματική σύντηξη με HDAC3 (πλασμίδιο MW91). Για να δημιουργήσουμε τη σημειακή μετάλλαξη, αλλάξαμε τα νουκλεοτίδια ώστε να κωδικοποιούν ένα υπόλειμμα ιστιδίνης στη θέση της τυροσίνης στο αμινοξύ 298 (πλασμίδιο MW92). Για τον έλεγχο κενού φορέα, η κωδικοποιητική αλληλουχία HDAC3 δεν υπήρχε, αλλά όλα τα άλλα στοιχεία παραμένουν (πλασμίδιο MW87). Το AAV κατασκευάστηκε από τον Penn Vector Core και οι τελικοί τίτλοι προσδιορίστηκαν με qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml, AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Παραγωγή φακοϊού. Για το σύστημα CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), πλασμίδια φακοϊών αγοράστηκαν από την Addgene για το dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) και το MS2- Κατασκευάσματα P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) (τίτλοι μεγαλύτεροι ή ίσοι με 8× 106 TU/ml). Για το Per1 sgRNA, κλωνοποιήσαμε και εισαγάγαμε μια αντιπληροφοριακή αλληλουχία-οδηγό που αντιστοιχεί στο στοιχείο CRE στον προαγωγέα Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) στη ραχοκοκαλιά κλωνοποίησης Addgene sgRNA (MS2) (#61427). Το sgRNA ελέγχου ήταν πανομοιότυπο, εκτός από το ότι καμία αλληλουχία-οδηγός δεν κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο. Οι φακοϊοί τόσο για το Per1 sgRNA (τίτλος: 6,8 × 107 IFU/ml) όσο και για το sgRNA ελέγχου (3,5 × 107 IFU/ml) παρήχθησαν από το USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

Για το κατασκεύασμα υπερέκφρασης pLVX-V5Per1, ενισχύσαμε τον άγριο τύπο Per1 πλήρους μήκους από το πλασμίδιο Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) και κλωνοποιήσαμε το προϊόν σε ένα τροποποιημένο pLVX-EF{10}}I ραχοκοκαλιά (Takara, #631987). Τα στοιχεία IRES και mCherry αφαιρέθηκαν και αντικαταστάθηκαν με μια ετικέτα V5, επιτρέποντας μια Ν-τερματική σύντηξη στο PER1 (πλασμίδιο MW206). Για τον έλεγχο κενού φορέα (EV), η κωδικοποιητική αλληλουχία PER1 δεν ήταν παρούσα αλλά παρέμειναν όλα τα άλλα στοιχεία (Plasmid MW93). Οι φακοϊοί για το pLVX-v5Per1 (τίτλος: 1,3 × 108 IFU/ml) και το pLVX-EV (τίτλος: 1,5 × 108 IFU/ml) παρήχθησαν από το εργαστήριο Lentiviral School of Pharmacy USC. Όλα τα φακοϊικά κατασκευάσματα εκφράστηκαν υπό τον προαγωγέα EF1.

Επαλήθευση κυτταρικής καλλιέργειας του pLVX-v5Per1 και του CRISPR-SAM. Για να επαληθευτεί ότι το pLVX-v5Per1 παράγει υπερέκφραση του Per1 mRNA, κύτταρα HT22 ποντικού (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) διαμολύνθηκαν με pLVX-v5Per1 ή pLVX-EV (Εικ. 5a) χρησιμοποιώντας Lipofectaine LTX (Invi). Ομοίως, για να επαληθευτεί ότι το σύστημα CRISPR-SAM μπορεί να οδηγήσει αποτελεσματικά τη μεταγραφή Per1, τα κύτταρα HT22 επιμολύνθηκαν με dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast ένα δώρο από το πλασμίδιο Feng Zhang Addgene #61425), το MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Το Blast ήταν δώρο από τον Feng Zhang, το πλασμίδιο Addgene #61426) και Το Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) ή το μη στοχευόμενο sgRNA ελέγχου (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo ραχοκοκαλιά ήταν δώρο από τον Feng Zhang, πλασμίδιο Addgene #61427) χρησιμοποιώντας Lipofectamine LTX (Invitrogen). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ή 48 ώρες, λύθηκαν και το mRNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Το qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Per1, Per2 και Hes7 και τον ανιχνευτή που αναφέρονται στον Πίνακα S4.

siRNA. Για το πείραμα εξουδετέρωσης Per1, τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA του Accell SMARTpool (siRNA, Dharmacon, GE) που στοχεύουν το Per1 αραιώθηκαν σε μια τελική συνολική συγκέντρωση 10 μΜ σε ddH20 και εγχύθηκαν στο DH (1,0 ul/πλευρά). Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε το μη στοχευόμενο siRNA του Accell (συνολική συγκέντρωση, 10 μΜ) και εγχύθηκε με τον ίδιο τρόπο. Για τα πειράματα siRNA, τα ποντίκια χειρίστηκαν και εξοικειώθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε την επόμενη ημέρα της τελευταίας ημέρας εξοικείωσης. Τα ποντίκια έλαβαν μια ολόκληρη ημέρα ανάρρωσης μετά τη χειρουργική επέμβαση και εκπαιδεύτηκαν την επόμενη ημέρα (~48 ώρες μετά τη χειρουργική επέμβαση) για να διασφαλιστεί το μέγιστο knock-down στόχου. Για να εξασφαλιστεί το knockdown, τα ποντίκια θυσιάστηκαν ~ 1 ώρα μετά τη δοκιμή και οι γροθιές από τον ραχιαίο ιππόκαμπο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με στυπώματα western για να εξασφαλιστεί η καταστροφή της πρωτεΐνης PER1.

Θέση αντικειμένου και αναγνώριση αντικειμένουμνήμηκαθήκοντα. Για εργασίες μνήμης εντοπισμού αντικειμένων και αναγνώρισης αντικειμένων, τα ποντίκια χειρίστηκαν για 2 λεπτά/ημέρα για 4 ημέρες και στη συνέχεια εξοικειώθηκαν στο περιβάλλον για 5 λεπτά/ημέρα για έξι συνεχόμενες ημέρες απουσία αντικειμένων. Κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης, τα ποντίκια εκτέθηκαν σε δύο πανομοιότυπα αντικείμενα (ποτήρια ζέσεως 100 ml, δοχεία μπαχαρικών ή γυάλινες θήκες κεριών) και αφέθηκαν να εξερευνήσουν για 10 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής κατακράτησης (24 ώρες αργότερα για μακροχρόνιαμνήμηή 60 μέτρα αργότερα για βραχυπρόθεσμη μνήμη), τα ποντίκια αφέθηκαν να εξερευνήσουν για 5 λεπτά. Για τη θέση του αντικειμένουμνήμη, ένα από τα δύο γνωστά αντικείμενα μετακινήθηκε σε νέα τοποθεσία. Για αναγνώριση αντικειμένωνμνήμη, οι θέσεις των αντικειμένων παρέμειναν σταθερές, αλλά ένα από τα αντικείμενα αντικαταστάθηκε με ένα νέο στοιχείο. Η εξοικείωση με τη μνήμη αναγνώρισης αντικειμένων ξεκίνησε τουλάχιστον μία εβδομάδα μετά την ολοκλήρωση της δοκιμής OLM και χρησιμοποιήθηκαν νέο πλαίσιο και άγνωστα αντικείμενα48. Η εξερεύνηση βαθμολογήθηκε όταν το κεφάλι του ποντικιού προσανατολίστηκε προς το αντικείμενο και έφτασε σε απόσταση 1 cm ή όταν η μύτη άγγιξε το αντικείμενο. Ο συνολικός χρόνος εξερεύνησης καταγράφηκε (t) και η προτίμηση για το νέο αντικείμενο εκφράστηκε ως δείκτης διάκρισης (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 τοις εκατό ). Για τις προπονητικές συνεδρίες, το αντικείμενο που ορίστηκε να μετακινηθεί κατά τη δοκιμή χρησιμοποιήθηκε ως το νέο αντικείμενο για να επιτραπεί η άμεση σύγκριση της εκπαίδευσης και της δοκιμής DI. Τα ποντίκια που εξερεύνησαν και τα δύο αντικείμενα για λιγότερο από 2 δευτερόλεπτα κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή 3 δευτερόλεπτα κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης αφαιρέθηκαν από περαιτέρω ανάλυση. Τα ποντίκια που έδειξαν προτίμηση σε ένα αντικείμενο κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης (DI > ±20) αφαιρέθηκαν επίσης. Οι συνεδρίες εξοικείωσης αναλύθηκαν (για τον προσδιορισμό της διανυθείσας απόστασης και της ταχύτητας) χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης συμπεριφοράς ANY-λαβύρινθο (Stoelting Co). Όλη η εξοικείωση, η εκπαίδευση, οι δοκιμές και η βαθμολόγηση πραγματοποιήθηκαν από πειραματιστές τυφλούς στις πειραματικές ομάδες.

Πλαίσιο φόβος σε κατάσταση. Για την προετοιμασία του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα, τα ποντίκια χειρίστηκαν για πρώτη φορά για 5 ημέρες. Κατά τη διάρκεια της απόκτησης, τα ποντίκια εκτέθηκαν στο πλαίσιο για 2 λεπτά και 28 δευτερόλεπτα και ακολούθησε ένα σοκ 2 δευτερολέπτων (0,75 mA), ένα πρωτόκολλο που συνήθως παράγει ισχυρή μακροπρόθεσμη μνήμη12,20. Τα ποντίκια παρέμειναν στο πλαίσιο για επιπλέον 30 δευτερόλεπτα πριν αφαιρεθούν. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 60 μέτρα μετά την προπόνηση μαζί με ελέγχους στο σπίτι που χειρίστηκαν αλλά δεν εκπαιδεύτηκαν. Η συμπεριφορά κατάψυξης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ethovision 11 (Noldus)12.

Υπερυψωμένο συν-λαβύρινθο. Ο συν-λαβύρινθος διεξήχθη από έναν πειραματιστή τυφλό στις πειραματικές ομάδες. Μία εβδομάδα μετά την ολοκλήρωση του ORM, ένα υποσύνολο ποντικών δοκιμάστηκε στο συν-λαβύρινθο. Δύο βραχίονες του λαβύρινθου ήταν ανοιχτοί (30 × 5 cm) και δύο βραχίονες ήταν εγκλεισμένοι (30 × 5 × 15 cm), συνδεδεμένοι με μια κεντρική πλατφόρμα (5 × 5 cm). Ο λαβύρινθος ήταν υψωμένος 40 cm πάνω από το πάτωμα. Τα ποντίκια δοκιμάστηκαν για 5 λεπτά στη συσκευή, η οποία συνίστατο στην τοποθέτηση κάθε ποντικιού στην κεντρική πλατφόρμα που βλέπει έναν από τους ανοιχτούς βραχίονες. Μεταξύ των υποκειμένων, ο λαβύρινθος καθαρίστηκε με 70 τοις εκατό αιθανόλη. Το ποσοστό του χρόνου που δαπανήθηκε σε κλειστές και ανοιχτές αγκάλες βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ANY-maze.

Ανάλυση κιρκάδιου ρυθμού. Νεαρά ({{0}}) και ηλικιωμένα (18-μήνα) HDAC3 plus / plus και HDAC3ox/ox ποντίκια εκτράφηκαν και στεγάστηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών (LD). Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση AAV-CaMKII-Cre (που περιγράφεται παραπάνω), οι ποντικοί μεταφέρθηκαν σε ένα απομονωμένο δωμάτιο 12 ωρών LD για 7 ημέρες. Στη συνέχεια, τα ποντίκια μεταφέρθηκαν σε ένα προστατευμένο από το φως δωμάτιο ανάλυσης δραστηριότητας, όπου η κινητική δραστηριότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανιχνευτές κίνησης οπτικής δέσμης (Philips Respironics). Η δραστηριότητα παρακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια 2 εβδομάδων μεταφοράς του κύκλου LD στο προστατευμένο από το φως δωμάτιο προτού τα ποντίκια περάσουν στο σταθερό σκοτάδι (DD) για επιπλέον 3 εβδομάδες. Η παρακολούθηση της δραστηριότητας συνεχίστηκε σε όλη τη φάση DD για να προσδιοριστεί εάν η διαγραφή HDAC3 στο DH επηρέασε τους ενδογενείς κιρκάδιους ρυθμούς. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το Minimitter VitalView 5.0 και το λογισμικό Clocklab (Actimetrics) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της έναρξης της ελεύθερης δραστηριότητας. Οι τιμές Tau υπολογίστηκαν με τη λήψη της κλίσης αυτής της έναρξης και τον υπολογισμό της προσαρμογής των ελαχίστων τετραγώνων με το λογισμικό Clocklab49,50.

Ανοσοϊστοχημεία. Μετά την ολοκλήρωση της συμπεριφοράς, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας και οι εγκέφαλοί τους αφαιρέθηκαν και καταψύχθηκαν σε παγωμένο ισοπεντάνιο. Φέτες είκοσι μικρομέτρων συλλέχθηκαν σε όλη την ραχιαία πανεπιστημιούπολη του ισχίου, τοποθετήθηκαν με απόψυξη σε διαφάνειες και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς . Οι διαφάνειες στερεώθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (10-λεπτά), διαπερατή σε 0.01 τοις εκατό Triton X{10}} σε 0,1 M PBS (5-λεπτά) , και μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα με 8 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας (Jackson). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύχτα (4 βαθμοί) σε αντίσωμα κουνελιού σε HDAC3 (1:250, Abcam, κλώνος Y415, ab32369) ή V5 (1:1000, Abcam, ab9116) ή αντίσωμα κοτόπουλου στο GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Την επόμενη ημέρα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με κατσικίσιο αντι-κουνελάκι Alexa 488 (HDAC3 και V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) ή Alexa 488 με κατσικίσιο αντι-κοτόπουλο (GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) στο σκοτάδι. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν με PBST και επωάστηκαν για 50 m σε NeuroTrace 530/615 (1:50· ThermoFisher, #N21482), μια φθορίζουσα κηλίδα nissl. Για την απόσβεση του μη ειδικού αυτοφθορισμού51, οι φέτες στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS με 0,01 τοις εκατό Triton, ξεπλύθηκαν με νερό και επωάστηκαν για 10- λεπτά σε 10 mM CuS04 σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM. Οι φέτες ξεπλύθηκαν και πάλι σε νερό, πλύθηκαν σε PBS και καλύφθηκαν με μέσο στερέωσης VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν με ένα Olympus Scanner VS110 με αποχρωματικό αντικειμενικό φακό 20x (αριθμητικό διάφραγμα 0,75) με λογισμικό σαρωτή VS110. Όλες οι ομάδες θεραπείας αντιπροσωπεύτηκαν σε κάθε διαφάνεια και όλες οι εικόνες σε μια διαφάνεια καταγράφηκαν με τον ίδιο χρόνο έκθεσης υπό συνθήκες μη κορεσμού. Η ένταση της ανοσοεπισήμανσης προσδιορίστηκε ποσοτικά με το ImageJ δειγματίζοντας την οπτική πυκνότητα του στρώματος κυττάρου στο CA1 και αφαιρώντας ένα δείγμα φθορισμού φόντου στην ίδια εικόνα. Για όλα τα πειράματα AAV, ζώα που απέτυχαν να εκφράσουν τον ιό στην περιοχή CA1 του ραχιαίου ιππόκαμπου αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις. Η απεικόνιση και ο ποσοτικός προσδιορισμός πραγματοποιήθηκαν από πειραματιστές τυφλούς στις πειραματικές συνθήκες.

Western blot. Για την επαλήθευση του knockdown PER1, τα ποντίκια Per1 siRNA και siRNA ελέγχου θυσιάστηκαν 2 ώρες μετά τη δοκιμή και οι εγκέφαλοι καταψύχθηκαν με φλας. Οι εγκέφαλοι κόπηκαν στεφανιαία και συλλέχθηκαν διατρήσεις DH 1 mm από φέτες 500 μm. Οι διατρήσεις ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα T-PER (Thermo Fisher) με αναστολέα πρωτεάσης Halt και φωσφατάσης (Thermo Fisher) χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή Dounce. Τα προϊόντα λύσης πρωτεϊνών προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη ανάλυση Bradford (BioRad) και 50 ug ολικής λύσης πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα γέλης NuPAGE Bis-Tris 7,5 τοις εκατό (Thermo Fisher). Τα πηκτώματα έτρεξαν για 50 λεπτά στα 200 βολτ και οι κηλίδες μεταφέρθηκαν όλη τη νύχτα στα 15 V στους 4 βαθμούς σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Novexi, LC2001). Την επόμενη μέρα, οι μεμβράνες επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα (5 τοις εκατό μη λιπαρό γάλα σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris με 0,01 τοις εκατό Tween 20), πλύθηκαν (0,1 τοις εκατό Tween 20 σε TBS) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε πρωτογενές αντίσωμα (1:500, κουνελιού anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) σε πρωτεύον ρυθμιστικό διάλυμα αντισωμάτων (3 τοις εκατό BSA σε TBS με 0,1 τοις εκατό Tween) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς . Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν σε συζευγμένο με HRP αντίσωμα ποντικού σε κουνέλι (1:10,000, Jackson Laboratories, ειδική για ελαφριά αλυσίδα, #211-032-171) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077). Χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλές εκθέσεις ταινιών για την επαλήθευση της γραμμικότητας. Οι κηλίδες πλύθηκαν και απογυμνώθηκαν για 10 m με Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), πλύθηκαν ξανά και στη συνέχεια εξετάστηκαν ξανά όλη τη νύχτα (4 βαθμοί) με αντίσωμα κουνελιού στο GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). Οι κηλίδες PER1 και GAPDH πλήρους μήκους φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 5. Οι σχετικές οπτικές πυκνότητες υπολογίστηκαν από σαρωμένη ταινία χρησιμοποιώντας ImageJ (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ) από έναν πειραματιστή τυφλό στις πειραματικές συνθήκες. Όλες οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης GAPDH.

qRT-PCR. Ο ιστός συλλέχθηκε από διατρήσεις DH (που περιγράφεται παραπάνω) και καταψύχθηκε στους -80 βαθμούς μέχρι την επεξεργασία. Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) και το cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA First Strand Transcriptor (Roche, 04379012001). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές προήλθαν από τη Roche Universal ProbeLibrary (Πίνακας S4) και χρησιμοποιήθηκαν για πολυπλεξία στη μηχανή Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Όλες οι τιμές κανονικοποιήθηκαν σε Gapdh. Οι αναλύσεις και οι στατιστικές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους ιδιόκτητους αλγόριθμους της Roche και το λογισμικό REST 2009 με βάση τη μέθοδο Pfafffl52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυσή μας. Οι βιβλιοθήκες cDNA για κάθε ομάδα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τον TruSeq RNA Sample Preparation Guide (Illumina). Διακόσια πενήντα νανογραμμάρια ολικού RNA από κάθε ποντίκι καθαρίστηκαν με πολυ-Τ ολιγο-προσαρτημένα μαγνητικά σφαιρίδια και κατακερματίστηκαν με θερμότητα. Στη συνέχεια συντέθηκε το cDNA της πρώτης και δεύτερης αλυσίδας και καθαρίστηκε. Αφού αμβλύνθηκαν τα άκρα, το άκρο 3' αδενυλιώθηκε για να αποτραπεί η συνένωση του εκμαγείου κατά τη σύνδεση του προσαρμογέα. Για κάθε ομάδα, ένα μοναδικό σετ προσαρμογέα προστέθηκε στα άκρα του cDNA και οι βιβλιοθήκες ενισχύθηκαν με PCR. Η ποιότητα της βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε από το Bioanalyzer και προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας qRT-PCR με μια τυπική καμπύλη που παρασκευάστηκε από μια εμπορική βιβλιοθήκη αλληλουχίας (Illumina). Τα δείγματα πολυπλεξήθηκαν, με κάθε ομάδα συμπεριφοράς να αντιπροσωπεύεται σε κάθε κελί ροής του προσδιοριστή αλληλουχίας. 10 nM από κάθε βιβλιοθήκη συγκεντρώθηκαν σε τέσσερις βιβλιοθήκες πολυπλεξίας και αλληλουχήθηκαν σε ένα όργανο Illumina HiSeq 2500 κατά τη διάρκεια μιας απλής ανάγνωσης αλληλουχίας 50 bp, που διεξήχθη από το Genomic High-Troughput Facility στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Irvine. Τα προκύπτοντα δεδομένα αλληλουχίας για κάθε βιβλιοθήκη υποβλήθηκαν σε μεταγενέστερη επεξεργασία για την παραγωγή αρχείων FastQ. Στη συνέχεια, τα δεδομένα αποπολυπλεξήθηκαν και φιλτράρθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Illumina CASAVA 1.8.2 καθώς και λογισμικό εσωτερικού χώρου. Οι αναγνώσεις κακής ποιότητας (αποτυχία στις τυπικές δοκιμές ποιότητας της Illumina) και οι αναγνώσεις ελέγχου που ευθυγραμμίστηκαν επιτυχώς με το γονιδίωμα ελέγχου PhiX αφαιρέθηκαν από τις αναλύσεις. Η ποιότητα των υπόλοιπων αλληλουχιών αξιολογήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας βαθμολογίες ποιότητας PHRED που παρήχθησαν σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια του βήματος κλήσης βάσης της σειράς ακολουθίας (Συμπληρωματικό Σχήμα 3α).

Ευθυγράμμιση με το γονιδίωμα αναφοράς και το μεταγραφικό. Οι αναγνώσεις από κάθε πείραμα ευθυγραμμίστηκαν χωριστά με το γονιδίωμα αναφοράς και το αντίστοιχο μεταγραφικό σώμα χρησιμοποιώντας ευθυγραμμιστές σύντομης ανάγνωσης ELAND v2e (Illumina) και Bowtie24. Στο μεταγράφημα συμπεριλήφθηκαν αναγνώσεις μοναδικά ευθυγραμμισμένες και από τα δύο εργαλεία σε γνωστά εξόνια ή συνδέσεις ματίσματος με όχι περισσότερες από δύο αναντιστοιχίες σε οποιοδήποτε τμήμα 25 bp της ανάγνωσης. Οι αναγνώσεις στοιχισμένες μοναδικά, αλλά με περισσότερες από δύο αναντιστοιχίες σε οποιοδήποτε τμήμα 25 bp της ανάγνωσης αφαιρέθηκαν από τις αναλύσεις. Ομοίως, οι αναγνώσεις που ταιριάζουν με πολλές θέσεις στο γονιδίωμα αναφοράς αφαιρέθηκαν από την ανάλυση. Το ποσοστό των αναγνώσεων που έχουν εκχωρηθεί στο γονιδίωμα αναφοράς και στο μεταγραφικό με χρήση αυτού του πρωτοκόλλου αναφέρεται για κάθε ομάδα αντιγράφων (Συμπληρωματικό Σχήμα 3β). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα κατά μέσο όρο περίπου 30 εκατομμύρια αναγνώσεις ανά δείγμα.

Για να επαληθεύσουμε την παρουσία των πλασμιδίων pLVX και CRISPR-SAM μετά από έγχυση φακοϊού, εκτελέσαμε αλληλουχία RNA σε δείγματα ιππόκαμπου από ένα υποσύνολο τριών ζώων ανά ομάδα που ακολουθεί τη συμπεριφορά. Καθώς ο αριθμός των κυττάρων που μολύνθηκαν με τους φακοϊούς in vivo ήταν πολύ μικρός για να ανιχνεύσει αξιόπιστα την παρουσία των κατάλληλων μεταγραφών χρησιμοποιώντας RT-qPCR (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a, d), χρησιμοποιήσαμε το RNA-seq ως πιο ευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση της παρουσίας από αυτές τις μεταγραφές. Δημιουργήθηκε μια ενημερωμένη έκδοση της συναρμολόγησης γονιδιώματος και του σχολιασμού του γονιδιώματος προσθέτοντας τις αλληλουχίες και τον σχολιασμό των πλασμιδικών κατασκευών στο αρχικό γονιδίωμα του ποντικού mm10 και στον σχολιασμό γονιδιώματος του ποντικού mm10, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το εργαλείο ευθυγράμμισης αναγνώσεων TopHat στο Tuxedo Suite54, οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα και μόνο οι επιτυχίες που ήταν μοναδικές για τις μεταγραφές του πλασμιδίου σε σύγκριση με το ενδογενές γονιδίωμα αναφοράς ποντικού θεωρήθηκαν "ταιριασμένες αναγνώσεις" με τις κατασκευές πλασμιδίου. Ο αριθμός αυτών των ταιριασμένων αναγνώσεων στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε για κάθε κατασκευή για κάθε δείγμα.

Γονιδιακή έκφραση και διαφορική ανάλυση. Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν απευθείας από τα αποτελέσματα ευθυγράμμισης ανάγνωσης για κάθε αντίγραφο. Οι τυπικές τιμές RPKM55, αναγνώσεις ανά κιλοβάση μοντέλου εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένες αναγνώσεις) εξήχθησαν για κάθε γονίδιο που καλύπτεται από τα δεδομένα αλληλούχισης και κάθε αντίγραφο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη.

Πραγματοποιήθηκαν διαφορικές μεταγραφικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας το Cyber ​​T56,57 σε κάθε ζεύγος ομάδων (κατ' οίκον κλωβός έναντι 60 m μετά την προπόνηση) για τον εντοπισμό γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω ή προς τα κάτω μετά το OLM. Εκτός από τα 18-μήνα ποντίκια HDAC3 plus / plus και HDAC3ox/ox που εκπαιδεύτηκαν για την τρέχουσα μελέτη, επεξεργάστηκαν πανομοιότυπα δεδομένα αλληλουχίας RNA από {{10}}μήνους ποντίκια άγριου τύπου C57 ( homecage και OLM-εκπαιδευμένοι με τον ίδιο τρόπο όπως η τρέχουσα μελέτη) από προηγούμενη μελέτη20 χρησιμοποιήθηκε για διαφορικές αναλύσεις. Ο αριθμός των ζώων (βιολογικά αντίγραφα) για κάθε ομάδα ήταν: Young HDAC plus / plus HC: 6, Young HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3 plus / plus HC: 6, Old HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3ox/ox HC: 8, Παλιό HDAC3ox/ox OLM: 8. Δεν χρησιμοποιήθηκαν τεχνικά αντίγραφα. Το κατώφλι p-value που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της διαφορικής έκφρασης είναι 0,05 για όλες τις ομάδες. Το False Discovery Rate (FDR) όπως μετρήθηκε με την τιμή q Benjamini & Hochberg (BH) χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές, με όριο FDR 0,15. Τα σύνολα των γονιδίων που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω μετά την εμπειρία (σε σύγκριση με τον κλωβό στο σπίτι) για αυτές τις 3 ομάδες (νεαρός άγριος τύπος, ηλικιωμένος HDAC plus / plus ή ηλικιωμένος HDAC3flox/ox) διασταυρώθηκαν για να προσδιοριστούν γονίδια κοινά σε δύο ή περισσότερες ομάδες. Ο εμπλουτισμός κάθε ομάδας για ειδική για τον ιστό έκφραση, όρους γονιδιακής οντολογίας58 και οδούς KEGG59,60 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το DAVID61, με βάση διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μετά τη συμπεριφορά. Η οπτικοποίηση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας "matplotlib" για python και "ggplot" για R.

Ανοσοκαθίζηση χρωματίνης. Το ChIP πραγματοποιήθηκε σε διατρήσεις DH με βάση το πρωτόκολλο από το κιτ Millipore ChIP11,12,62. Ο ιστός διασυνδέθηκε με 1 τοις εκατό φορμαλδεΰδη (Sigma), λύθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπερήχους και η χρωματίνη ανοσοκατακρημνίστηκε όλη τη νύχτα με 2 ul αντι-H4K8Ac (Millipore #17-10099) ή 4 ul αντι- HDAC3 (Millipore #{{{ 13}}) ή ισοδύναμη ποσότητα ορού κανονικού κουνελιού (αρνητικός έλεγχος H4K8Ac, Millipore) ή IgG αντι-ποντικού (αρνητικός έλεγχος HDAC3, Millipore). Μετά την πλύση, η χρωματίνη εκλούστηκε από τα σφαιρίδια και διασυνδέθηκε αντίστροφα παρουσία πρωτεϊνάσης Κ πριν από τον καθαρισμό της στήλης του DNA. Οι αλληλουχίες εκκινητών για τους προαγωγείς κάθε γονιδίου σχεδιάστηκαν από το πρόγραμμα Primer 3 (Πίνακας S4). Πέντε μΙ εισόδου, αντι-Η4Κ8Αο IgG/αντι-HDAC3 IgG, ή ανοσοϊζήματος αντι-κουνελιού/ποντικού IgG από κάθε ζώο εξετάστηκαν εις διπλούν. Για την κανονικοποίηση των δεδομένων ChIP-qPCR, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο εισαγωγής ποσοστού. Το δείγμα εισόδου προσαρμόστηκε στο 100 τοις εκατό και τα δείγματα IP και IgG υπολογίστηκαν ως ποσοστό αυτής της εισόδου χρησιμοποιώντας τον τύπο 100*AE^(προσαρμοσμένη είσοδος – Ct(IP)). Ο διπλωμένος εμπλουτισμός στη συνέχεια υπολογίστηκε ως αναλογία του ChIP προς τη μέση IgG. Μια τυπική καμπύλη στην πλάκα καθόρισε την αποτελεσματικότητα ενίσχυσης (AE).

Προετοιμασία φέτας και καταγραφή. Νεαρά (περίπου 3-μήνα) και ηλικιωμένα (18-μηνιαία) ποντίκια εγχύθηκαν στερεοταξικά με τον ιό. Για το πρώτο πείραμα, νεαρά και μεγάλα ποντίκια HDAC3 plus / plus και HDAC3ox/flox εγχύθηκαν με AAV-CaMKII- Cre διμερώς στο DH. Για το δεύτερο πείραμα, νεαρά και μεγάλα ποντίκια άγριου τύπου C57 εγχύθηκαν με AAV-HDAC3(Y298H) στο DH του ενός ημισφαιρίου και έλεγχο AAV-EV στο άλλο ημισφαίριο. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση (για να επιτραπεί η βέλτιστη έκφραση του ιού)2, εγκάρσιες φέτες ιππόκαμπου (320 μm) τοποθετήθηκαν σε θάλαμο καταγραφής διεπαφής με προθερμασμένο (31 ± 1 βαθμό) τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 και 10 mM D-γλυκόζη). Οι φέτες διαχέονταν συνεχώς με ρυθμό 1,75–2 ml ανά λεπτό, ενώ η επιφάνεια των φετών εκτέθηκε σε ζεστό, υγροποιημένο 95 τοις εκατό O2/5 τοις εκατό CO2. Οι καταγραφές ξεκίνησαν μετά από τουλάχιστον 2 ώρες επώασης.

Τα διεγερτικά μετασυναπτικά δυναμικά πεδίου (fEPSPs) καταγράφηκαν από την ακτινοβολία της στιβάδας CA1b χρησιμοποιώντας μια μονή γυάλινη πιπέτα (2–3MΩ) γεμάτη με 2 M NaCl. Οι παλμοί διέγερσης (0.05 Hz) παραδόθηκαν σε προβολές collateral-commissural Schaffer χρησιμοποιώντας ένα διπολικό ηλεκτρόδιο διέγερσης (στριμμένο σύρμα νιχρώμου, 65 μm) τοποθετημένο στο CA1c. Η ένταση του ρεύματος ρυθμίστηκε για να ληφθεί το 50 τοις εκατό της μέγιστης απόκρισης fEPSP. Αφού καθιερώθηκε μια σταθερή γραμμή βάσης, το LTP προκλήθηκε με ένα μόνο τρένο πέντε ριπών θήτα, στην οποία κάθε ριπή (τέσσερις παλμοί στα 100 Hz) χορηγήθηκε σε απόσταση 200 ms (δηλαδή, στη συχνότητα θήτα). Η ένταση διέγερσης δεν αυξήθηκε κατά τη διάρκεια του TBS. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και ψηφιοποιήθηκαν με NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Στατιστική ανάλυση. Διεξήχθησαν στατιστικές αναλύσεις όπως υποδεικνύεται στο υπόμνημα του κειμένου και των εικόνων χρησιμοποιώντας το Prism 6 (GraphPad). Οι αναλυτικές προσεγγίσεις μας βασίζονται σε προηγουμένως δημοσιευμένες εργασίες12,20,63,64. Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαθορισμό των μεγεθών του δείγματος, αλλά τα μεγέθη του δείγματός μας είναι παρόμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται γενικά στον τομέα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που αναφέρθηκαν στις προηγούμενες δημοσιεύσεις12,20,64,65. Η κατανομή των δεδομένων θεωρήθηκε ότι ήταν κανονική, με παρόμοια διακύμανση που παρατηρήθηκε μεταξύ των ομάδων, αλλά αυτό δεν δοκιμάστηκε επίσημα. Όταν ένα πείραμα είχε δύο ομάδες προς σύγκριση, χρησιμοποιήθηκαν τα τεστ t Student δύο ουρών. Όταν συγκρίθηκαν δύο παράγοντες, (όπως η ηλικία και ο γονότυπος ή η συνεδρία και η ομάδα), τα δεδομένα αναλύθηκαν με αμφίδρομες ANOVA ακολουθούμενες από πολλαπλές συγκρίσεις post hoc δοκιμές του Sidak. Όλες οι αναλύσεις είναι δύο ουρών, με τιμή 0,05 που απαιτείται για τη σημασία. Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλα τα σχήματα αντιπροσωπεύουν το SEM. Για όλα τα πειράματα, οι τιμές ± 2SD από τον μέσο όρο της ομάδας θεωρήθηκαν ακραίες τιμές και αφαιρέθηκαν από τις αναλύσεις.

Διαθεσιμότητα δεδομένων. Τα δεδομένα που υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος. Τα δεδομένα αλληλουχίας RNA έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus του NCBI και είναι προσβάσιμα μέσω του αριθμού πρόσβασης της σειράς GEO GSE94832.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Οι επιγενετικές αλλοιώσεις στον υπερχιασματικό πυρήνα και στον ιππόκαμπο συμβάλλουν στη γνωστική έκπτωση που σχετίζεται με την ηλικία. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Κιρκάδιοι ρυθμοί και σχηματισμός μνήμης. Nat. Σεβ. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Κιρκαδική ταλάντωση της δραστηριότητας MAPK και cAmp του ιππόκαμπου: επιπτώσεις για την επιμονή της μνήμης. Nat. Neurosci. 11, 1074– 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Κιρκαδική διαμόρφωση της μάθησης και της μνήμης σε ποντίκια με συνθήκες φόβου. Συμπεριφορά. Brain Res. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Το κιρκάδιο ρολόι και η παθολογία του εγκεφάλου της γήρανσης. Nat. Σεβ. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Ο Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 προστατεύει την κιρκαδική διαμόρφωση της σχετικής με τη μνήμη σηματοδότησης στον ιππόκαμπο ποντικού ρυθμίζοντας την πυρηνική μετατόπιση της κινάσης CREB pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Μια επιγενετική υπόθεση της γνωστικής δυσλειτουργίας που σχετίζεται με τη γήρανση. Μπροστινοί Γηράνοντες Νευροσκοί. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Η αλλοιωμένη ακετυλίωση ιστόνης σχετίζεται με εξασθένηση της μνήμης που εξαρτάται από την ηλικία σε ποντίκια. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Η αναστολή του H3K9me3 βελτιώνει τη μνήμη, προάγει το σχηματισμό της σπονδυλικής στήλης και αυξάνει τα επίπεδα BDNF στον ηλικιωμένο ιππόκαμπο. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Επιγενετικές συνεισφορές στη γνωστική γήρανση: αποσύνδεση του νου και της διάρκειας ζωής. Μάθετε Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, Μ. et αϊ. Ο εκλεκτικός αναστολέας HDAC3-ενισχύει την εξάλειψη της συμπεριφοράς αναζήτησης κοκαΐνης με επίμονο τρόπο. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Το πλαίσιο και ο ακουστικός φόβος ρυθμίζονται διαφορετικά από τη δραστηριότητα HDAC3 στους πλευρικούς και βασικούς υποπυρήνες της αμυγδαλής. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC et αϊ. Το HDAC3 είναι ένας κρίσιμος αρνητικός ρυθμιστής του σχηματισμού μακροπρόθεσμης μνήμης. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Η αναστολή της αποακετυλάσης ιστόνης μέσω του RGFP966 απελευθερώνει τα φρένα στην αισθητική πλαστικότητα του φλοιού και την ιδιαιτερότητα του σχηματισμού μνήμης. J. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, Α. et αϊ. Αποκάλυψη της κρυμμένης καταλυτικής δραστηριότητας των αποακετυλασών ιστόνης κατηγορίας IIa σπονδυλωτών. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Ζ. et αϊ. Η ανεξάρτητη από τη δεακετυλάση λειτουργία του HDAC3 στη μεταγραφή και το μεταβολισμό απαιτεί συνθλιπτικό πυρηνικό υποδοχέα. ΜοΙ. Cell 52, 769-782 (2013).

17. Alaghband, Υ. et αϊ. Διακεκριμένοι ρόλοι για την περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 στον ιππόκαμπο και στον έσω προμετωπιαίο φλοιό στο σχηματισμό και την εξαφάνιση της μνήμης. Neurobiol. Μαθαίνω. Μεμ. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, Α. et al. Η αποακετυλάση ιστόνης 3 συνδέεται με το MeCP2 για τη ρύθμιση του FOXO και της κοινωνικής συμπεριφοράς. Nat. Neurosci. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetylase 3 είναι απαραίτητη για τη σωστή ανάπτυξη του εγκεφάλου. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, Α. et al. Η ειδική για τον νευρώνα ρυθμιστική υπομονάδα χρωματίνης BAF53b είναι απαραίτητη για τη συναπτική πλαστικότητα και τη μνήμη. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Παράγοντες μεταγραφής στη μακροχρόνια μνήμη και συναπτική πλαστικότητα. Physiol. Rev. 89, 121– 145 (2009).

22. Barnes, CA Μακροπρόθεσμη ενίσχυση και γήρανση του εγκεφάλου. Philos. Μεταφρ. R. Soc. Lond. Β 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Η βάση δεδομένων UCSC Genome Browser: Ενημέρωση 2016. Nucleic Acids Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Υπερταχεία και αποδοτική ως προς τη μνήμη ευθυγράμμιση σύντομων αλληλουχιών DNA με το ανθρώπινο γονιδίωμα. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Οι αναλύσεις έκφρασης του ιππόκαμπου αποκαλύπτουν επιλεκτική συσχέτιση άμεσων-πρώιμων, νευροενεργειακών και μυελινογονικών οδών με γνωστική εξασθένηση σε ηλικιωμένους αρουραίους. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Διαφορικοί ρόλοι για Nr4a1 και Nr4a2 στη θέση αντικειμένου έναντι μακροπρόθεσμης μνήμης αναγνώρισης αντικειμένων. Μάθετε Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Επιδράσεις της στέρησης ύπνου και της γήρανσης στη μακροπρόθεσμη και απομακρυσμένη μνήμη σε ποντίκια. Μάθετε Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, Ο. et αϊ. Το PERIOD1 συντονίζει τους ιππόκαμπους ρυθμούς και την επεξεργασία της μνήμης με την ημέρα. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, Α. et αϊ. Η χρονική δυναμική της έκφρασης του γονιδίου του ρολογιού του ιππόκαμπου ποντικού υποστηρίζει την επεξεργασία της μνήμης. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Οι κιρκαδικές ταλαντώσεις εντός του ιππόκαμπου υποστηρίζουν το σχηματισμό μνήμης και την επιμονή. Εμπρός ΜοΙ. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Εμπειρία-εξαρτώμενη γονιδιακή έκφραση στον ιππόκαμπο αρουραίου μετά από χωρική μάθηση: σύγκριση των γονιδίων Arc, c-fos, και zif268 άμεσα πρώιμα. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Κουζαρίδης, Τ. Τροποποιήσεις της χρωματίνης και η λειτουργία τους. Cell 128, 693-705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Μεταγραφική ενεργοποίηση σε κλίμακα γονιδιώματος από ένα κατασκευασμένο σύμπλεγμα CRISPR-Cas9. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, Μ., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Η αναστολή αποακετυλάσης 3 ιστόνης αποκαθιστά τη συναπτική σήμανση και σύλληψη στη γήρανση μέσω της ενεργοποίησης του πυρηνικού παράγοντα κάπα Β. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Συναπτικά στοιχεία για την αποτελεσματικότητα της μάθησης σε απόσταση. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Το εστιακό νοκ-άουτ του ιππόκαμπου της CBP επηρεάζει συγκεκριμένες τροποποιήσεις ιστόνης, τη μακροπρόθεσμη ενίσχυση και τη μακροπρόθεσμη μνήμη. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Η αυξημένη μακροπρόθεσμη ενίσχυση στις συνάψεις κοκκιωδών κυττάρων έσω-διατρητικής διαδρομής-οδοντωτής που προκαλείται από εκλεκτική αναστολή της αποακετυλάσης ιστόνης 3 απαιτεί πρωτεΐνη εύθραυστης νοητικής καθυστέρησης X. Neurobiol. Μαθαίνω. Μεμ. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB και μνήμη. Annu. Σεβ. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Λειτουργικοί ρόλοι του CREB ως θετικού ρυθμιστή στη διαμόρφωση και ενίσχυση της μνήμης. Brain Res. Ταύρος. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την εύθραυστη πρωτεΐνη δέσμευσης RNA X ελέγχεται από τον πυρηνικό αναπνευστικό παράγοντα 2 και την οικογένεια παραγόντων μεταγραφής CREB. Nucleic Acids Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, Η. et αϊ. Οι ρόλοι του CREB στη ρύθμιση του FMRP από τους μεταβοτροπικούς υποδοχείς γλουταμινικού της ομάδας Ι στον φλοιό του κυκλώματος. ΜοΙ. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Αλλοιωμένοι ρυθμοί συμπεριφοράς και έκφραση γονιδίου ρολογιού σε ποντικούς με στοχευμένη μετάλλαξη στο γονίδιο Period1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Οι αλλαγές μεθυλίωσης του DNA στα γονίδια πλαστικότητας συνοδεύουν το σχηματισμό και τη διατήρηση της μνήμης. Nat. Neurosci. 19, 102– 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Επιγονιδιωματική αναδιοργάνωση εξαρτώμενη από την εμπειρία στον ιππόκαμπο. Μάθετε Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Ένα γονίδιο ρολογιού, περίοδος, παίζει βασικό ρόλο στο σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης στη Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Η ευαισθητοποίηση και η ανταμοιβή στην κοκαΐνη είναι υπό την επίδραση των κιρκάδιων γονιδίων και του ρυθμού. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Η ημερήσια ταλάντωση της MAP (ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη) κινάσης και οι δραστηριότητες της αδενυλυλοκυκλάσης στον ιππόκαμπο εξαρτάται από τον υπερχιασματικό πυρήνα. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Εξέταση θέσης αντικειμένου και μνήμης αναγνώρισης αντικειμένων σε ποντίκια. Curr. Πρωτοκ. Neurosci. 69, 1– 17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Το κιρκάδιο ρολόι στον κοιλιακό υποθάλαμο ελέγχει την κυκλική ενεργειακή δαπάνη. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in ποντίκια. Curr. Πρωτοκ. Mouse Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Μείωση αυτοφθορισμού που μοιάζει με λιποφουσκίνη σε ιστό με σήμανση με φθορισμό. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafffl, MW Ένα νέο μαθηματικό μοντέλο για σχετική ποσοτικοποίηση σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, ε45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Εργαλείο λογισμικού σχετικής έκφρασης (REST) ​​για ομαδική σύγκριση και στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων σχετικής έκφρασης σε πραγματικό χρόνο PCR. Nucleic Acids Res. 30, ε36 (2002).

54. Trapnell, C. et αϊ. Ανάλυση διαφορικής έκφρασης γονιδίου και μεταγραφής πειραμάτων RNA-seq με TopHat και Cuffinks. Nat. Πρωτοκ. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, Α., Williams, BA, McCue, Κ., Schaeffer, L. & Wold, Β. Χαρτογράφηση και ποσοτικοποίηση μεταγραφωμάτων θηλαστικών με RNA-Seq. Nat. Methods 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T web server: διαφορική ανάλυση δεδομένων υψηλής απόδοσης. Nucleic Acids Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD A Bayesian πλαίσιο για την ανάλυση δεδομένων έκφρασης μικροσυστοιχιών: κανονικοποιημένο t-test και στατιστικά συμπεράσματα γονιδιακών αλλαγών. Bioinformatics 17, 509–519 (2001).