Μέρος 2: Αντι-ινωτική επίδραση της 6-βρωμο-ινδιρουβίνης-3 ′ -οξίμης (6-BIO) μέσω της ρύθμισης της πρωτεΐνης ενεργοποίησης-1 (AP-1) και των παραγόντων μεταγραφής πρωτεΐνης-1 (SP-1) στα νεφρικά κύτταρα

Για το Μέρος 1, κάντε κλικ στο κουμπίΕδώ.

3.3. Το 6-BIO εξασθενεί τους δείκτες ίνωσης και τις οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με την ίνωση στα κύτταρα του εγγύς σωληναρίου (HK-2) και των διάμεσων ινοβλαστών (NRK49F)

Στη συνέχεια, επιβεβαιώσαμε την επίδραση του 6-BIO στα εγγύς σωληνοειδή κύτταρα και στα διάμεσα κύτταρα ινοβλαστών. Παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση και το χρόνο μείωση της έκφρασης του GSK3β mRNA κατά 6-BIO σε κύτταρα HK-2 και NRK49F (Σχ. S2A και B), καθώς και την έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ECM και το EMT και οι οποίες εμπλέκονται σενεφρόςκύτταροΊνωσημειώθηκε επίσης (Σχ. Σ2Ε). Επιπλέον, η ενισχυμένη έκφραση του GSK3β, κατά την έκθεση σε TGFβ αυτών των κυττάρων, μειώθηκε επίσης από την 6-BIO θεραπεία (Σχ. S2C και D). Το σχήμα 3 δείχνει την πρωτεϊνική έκφραση τουνεφρόςΊνωσηδείκτες σε κύτταρα HK-2 και NRK49F που υποβάλλονται σε θεραπεία με TGFβ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η έκφραση των πρωτεϊνών PAI-1 και CTGF αυξήθηκε σημαντικά ως απόκριση στη θεραπεία με 5 και 10 ng/mL TGFβ σε κύτταρα HK-2 και NRK49F, αντίστοιχα. Ωστόσο, η έκφρασή τους μειώθηκε αξιοσημείωτα μετά τη θεραπεία με 6-BIO (Εικ. 3Β).ΣΜΑΔκαι οι οδοί σηματοδότησης MAPK ρυθμίστηκαν από τη θεραπεία με TGFβ, η οποία αντιστράφηκε από τη θεραπεία 6-BIO (Εικ. 4). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής AP-1 και SP-1 που εμπλέκονται στη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση TGFβ σε κύτταρα HK-2 και NRK49F. Το σχήμα 4D δείχνει ότι η TGFβ−μεσολαβούμενη αύξηση των P-C-JUN και P-C-FOS μειώθηκε ως απόκριση στη θεραπεία με αναστολέα 6-BIO και JNK SP600125 και κατά τη διάρκεια της κυρίαρχης-αρνητικής μετάγγισης C-JUN. Το σχήμα 4Ε δείχνει τη μεταβολή της έντασης της πρωτεΐνης σε σχέση με τον έλεγχο. Επιπλέον, η αύξηση του επιπέδου SP-1 με τη μεσολάβηση του TGFβ εξασθένησε σημαντικά ως απόκριση στη θεραπεία με 6-BIO και SP-1 siRNA (Εικ. 4F). Το σχήμα 4G δείχνει τη μεταβολή της έντασης της πρωτεΐνης σε σχέση με τον έλεγχο. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι το TGFβ/ΣΜΑΔκαι η σηματοδότηση MAPK καθώς και οι παράγοντες μεταγραφής, AP-1 και SP-1, ρυθμίζονται από το 6-BIO.

3.4. Το 6-BIO εξασθενεί την πυρηνική έκφραση των πρωτεϊνών P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 σε εγγύς σωληνωτά και διάμεσα κύτταρα ινοβλαστών

Τα σχήματα 5Α και Β δείχνουν τον εντοπισμό των PAI-1 και CTGF με P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1. Η κόκκινη χρώση των P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 έδειξε την υπερέκφρασή τους στον πυρήνα μετά από θεραπεία με TGFβ. Ομοίως, η πράσινη χρώση των PAI-1 και CTGF έδειξε την υπερέκφρασή τους στο κυτοσόλιο. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 μειώθηκαν από τη θεραπεία 6-BIO. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 6-BIO επηρεάζει άμεσα τα AP-1 και SP-1, τους παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν την έκφραση PAI-1 και CTGF.

3.5. Το 6-BIO εξασθενεί τη δραστηριότητα του προαγωγού PAI-1, CTGF, AP-1 και SP-1 σε εγγύς σωληνοειδή και διάμεσα κύτταρα ινοβλαστών

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν το 6-BIO αναστέλλει τις δραστηριότητες υποκινητή των γονιδίων PAI-1, CTGF, AP-1 και SP-1. Η προωθητική δράση των PAI-1 και CTGF αυξήθηκε ως απόκριση στον TGFβ, αλλά μειώθηκε από τη θεραπεία 6-BIO (Εικ. 6Α και Β). Επιπλέον, η μείωση ήταν αξιοσημείωτη όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία μόνο με 6-BIO από ό, τι παρουσία του TGFβ. Τα AP-1 και SP-1 συνδέονται με τους προωθητές των PAI-1 και CTGF. Τα σχήματα 6C και 6D δείχνουν τη δραστηριότητα του προωθητή των AP-1 και SP-1. Η δραστικότητα της AP-1 και της SP-1 λουσιφεράσης αυξήθηκε με τη θεραπεία με TGFβ και μειώθηκε κατά 6-BIO με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το σχήμα 6Ε δείχνει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα στα εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης. Έτσι, επιβεβαιώσαμε ότι η πυρηνική έκφραση των P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 αυξήθηκε ως απόκριση στη θεραπεία με TGFβ και κατεστάλη από την επεξεργασία 6-BIO. Το σχήμα 6F δείχνει τη μεταβολή της έντασης της πρωτεΐνης σε σχέση με τον έλεγχο. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το 6-BIO δρα στη θέση δέσμευσης του παράγοντα μεταγραφής του υποκινητή για να αποδυναμώσει τη δέσμευση των AP-1 και SP-1. Πραγματοποιήσαμε in vitro δοκιμή δέσμευσης υποκινητή παρουσία 6-BIO για να επιβεβαιώσουμε το ίδιο. Η δέσμευση των πυρηνικών πρωτεϊνών και των P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 αποδυναμώθηκε με την προσθήκη του 6-BIO με εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (συμπληρωματικό Σχήμα 3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το 6-BIO αναστέλλει τις δραστηριότητες προώθησης PAI-1 και CTGF καθώς και τις λειτουργίες AP-1 και SP-1. Έτσι, μπορεί να έχει θεραπευτικές δυνατότητες σενεφρόςΊνωση.

4. Συζήτηση

Χρήση του μοντέλου αρουραίων του UUO και του TGFβ-επεξεργασμένου με TGFβνεφρόςεγγύς σωληνάρια που προέρχονται και διάμεσες κυτταρικές σειρές ινοβλαστών, αποδείξαμε ότι η θεραπεία 6-BIO μπορεί να εξασθενίσεινεφρόςβλάβη. Το μοντέλο UUO είναι ένα αντιπροσωπευτικό ζωικό μοντέλο αποφρακτικής νεφροπάθειας που χαρακτηρίζεται από προοδευτική σωληναριακή διάμεσηΊνωση[43]. Ιστοπαθολογική ανάλυσηνεφρόςοι ιστοί που ελήφθησαν από το μοντέλο UUO έδειξαν ότι η συσσώρευση ECM και η σωληναριακή ατροφία στον διάμεσο χώρο αποκαταστάθηκαν με τη θεραπεία 6-BIO. Επιπλέον, η χρήση θεραπείας με TGFβνεφρόςεγγύς σωληνάριο που προέρχονται από και διάμεσα κύτταρα ινοβλαστών, αποδείξαμε ότι η θεραπεία 6-BIO μπορεί να εξασθενήσεινεφρόςβλάβη. Στο μοντέλο UUO και στα επεξεργασμένα με TGFβ κύτταρα HK-2 και NRK49F, το 6-BIO ανέστειλε την έκφραση τουνεφρόςΊνωσηδείκτες καθώς και MAPK καιΣΜΑΔμονοπάτια σηματοδότησης. Επιπλέον, η θεραπεία με 6-BIO μείωσε την έκφραση των πρωτεϊνών P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 που επάγονται από UUO και TGFβ, καθώς και την πυρηνική έκφραση και τη δραστηριότητα του υποκινητή των AP-1 και SP-1 σε κύτταρα HK-2 και NRK49F που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία με TGF-β. Η αναστολή των μεταγραφικών παραγόντων AP-1 και SP-1 από τη θεραπεία με 6-BIO έχει συσχετιστεί με την αναστολή της συσσώρευσης ECM που οδηγεί σε επιδείνωση τηςνεφρόςΊνωση. Αυτό επιτυγχάνεται με την καταστολή του MAPK καιΣΜΑΔοδούς σηματοδότησης που οδηγούν σε μείωση της έκφρασης των PAI-1 και CTGF. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το 6-BIO μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας κατάνεφρόςασθένειες, καθώς και για την πρόληψηνεφρόςζημιές που προκλήθηκαν από UUO και TGFβ.

Κάντε κλικ στο οργανικό Cistanche για νεφρική νόσο

Το ημισυνθετικό διαπερατό από κύτταρα παράγωγο ινδιρουβίνης 6-BIO ανήκει σε μια οικογένεια δις-ινδόλης και εμφανίζεται φυσικά σε βρώσιμα γαστερόποδα μαλάκια και φυτά [12]. Η ινδιρουβίνη περιέχει έναν ενδομοριακό δεσμό υδρογόνου μεταξύ του διπλού δεσμού Ο 2-C και της ομάδας Ν1-Η και έναν άλλο διαμοριακό δεσμό υδρογόνου μεταξύ των μορίων. Το 6-BIO έχει μια χημικά τροποποιημένη δομή στην οποία η 6-θέση αντικαθίσταται με Br για να ξεπεραστεί το μειονέκτημα των φτωχών φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων λόγω της χαμηλής υδατοδιαλυτότητας της ινδιρουμπίνης [44]. Πολλές ινδιρουμπίνες, λόγω της ανταγωνιστικής σύνδεσης με το ΑΤΡ, δρουν ως διπλοί αναστολείς της εξαρτώμενης από την κυκλίνη κινάσης (CDK) και της κινάσης της συνθάσης του γλυκογόνου-3β (GSK-3β), παρουσιάζοντας περισσότερο από 16 φορές επιλεκτικότητα έναντι του CDK5 [12]. Επιπλέον, το 6-BIO παρουσιάζει σημαντικά επιλεκτική αναστολή του GSK-3β με τιμή IC50 0,005 μM [12]. Σύμφωνα με αναφορές από διάφορες ομάδες, το 6-BIO αναστέλλει πλήρως τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MCF-7 και αναστέλλει τη μετανάστευση κατά περίπου 75% σε συγκέντρωση 10 μM και αναστέλλει τη φωσφορυλίωση του PDK1. Αυτό έδειξε ότι το 6-BIO εισήχθη στον θύλακα δέσμευσης του PDK1 για να σχηματίσει τρεις δεσμούς υδρογόνου με υπολείμματα στην περιοχή των μεντεσέδων και ο θύλακας δέσμευσης φιλοξένησε εύκολα τα πρόσθετα άτομα Br στο 6-BIO [45]. Με αυτά τα χαρακτηριστικά, το 6-BIO μελετάται ως ένα νέο φάρμακο για τη ρύθμιση των κυτταρικών διεργασιών όπως η φλεγμονή που σχετίζεται με τη γήρανση, το οξειδωτικό στρες, η επιβίωση των κυττάρων, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση στον καρκίνο, τον διαβήτη και τις εκφυλιστικές ασθένειες [46,47]. Ωστόσο, οι μελέτες για τη γονιδιακή ρύθμιση και τους μοριακούς μηχανισμούς που σχετίζονται μενεφρόςκύτταροΊνωσησπανίζουν. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να διερευνήσουμε εάν το 6-BIO εξασθένησενεφρόςΊνωσηαναστέλλοντας τη γονιδιακή ρύθμιση των PAI-1 και CTGF σενεφρόςκύτταρα, μειώνοντας έτσι τη συσσώρευση ECM.

Αρκετές μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει το μοντέλο UUO για να αναφέρουν μια συσχέτιση μεταξύ συσσώρευσης ECM και χρόνιαςνεφρόςασθένεια που προκαλείται από σωληνοειδή διάμεσηΊνωση[43]. Επιπλέον, οι υπερεκφρασμένες PAI-1 και CTGF φέρεται να σχετίζονται με υψηλή συσσώρευση ECM κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της χρόνιαςνεφρόςαρρώστια. Έτσι, ο εντοπισμός ενός θεραπευτικού μορίου που αναστέλλει τη σηματοδότηση και τη μεταγραφή των γονιδίων που σχετίζονται με την ενισχυμένη συσσώρευση ECM είναι σημαντικός για την αποτελεσματική αναστολή τηςνεφρόςΊνωση. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε το 6-BIO, έναν από τους αναστολείς της κινάσης της συνθάσης του γλυκογόνου 3β (GSK-3β), σενεφρόςΊνωση.

Μελετήσαμε την επίδραση των πρωτεϊνών PAI-1 και CTGF στιςνεφρόςκύτταροΊνωσηκαι επιβεβαίωσε ότι η έκφρασή τους ρυθμίστηκε από κοινούς παράγοντες μεταγραφής, AP-1 και SP-1. Ο παράγοντας μεταγραφής, AP-1, είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια JUN (C-JUN, JUNB και JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 και Fra-2), ATF (παράγοντας μεταγραφής ενεργοποίησης) και JDP (πρωτεΐνη διμερισμού JUN) [48]. Ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ο θάνατος,

διαφοροποίηση και αγγείωση. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η δραστηριότητα του AP-1 αυξάνεται στο ήπαρ και τους πνεύμονες με την ενεργοποίηση του κολλαγόνου τύπου VI και των ινοβλαστών [49,50]. Τα δύο κύρια συστατικά των AP-1, C-JUN και C-FOS ανταποκρίνονται σε μια ποικιλία ερεθισμάτων, όπως οι κυτοκίνες, οι αυξητικοί παράγοντες και το στρες [51]. Παρατηρήσαμε αυξημένη φωσφορυλίωση των C-JUN και C-FOS σε ένα μοντέλο αρουραίων UUO και κύτταρα HK-2 και NRK49F που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία με TGFβ (Εικ. 2D και 4D). Τα C-JUN και C-FOS σχηματίζουν ετεροδιμερή και συνδέονται με τη θέση δέσμευσης AP-1 στο DNA, ενεργώντας έτσι ως μεταγραφικοί παράγοντες για τη ρύθμιση της έκφρασης άλλων γονιδίων. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση των ERK1/2 και JNK ενεργοποιεί τα C-FOS και C-JUN, αντίστοιχα. Στη μελέτη μας, η φωσφορυλίωση των ERK1/2 και JNK, καθώς και των C-JUN και C-FOS στον πυρήνα, αυξήθηκε σημαντικά ως απάντηση στη θεραπεία με TGFβ. Ωστόσο, η θεραπεία 6-BIO αντέστρεψε σημαντικά αυτά τα αποτελέσματα. Η μελέτη μας έδειξε ότι το 6-BIO ανέστειλε αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση των ERK1/2 και JNK και μείωσε τη δραστηριότητα του μεταγραφικού παράγοντα AP-1, αναστέλλοντας έτσι τη φωσφορυλίωση των C-JUN και C-FOS που είναι οι κατάντη τελεστές του. Η αναστολή του SP-1 στα ηπατικά αστροκύτταρα ασκεί μιααντι-ινωτικάαποτέλεσμα [52]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι το SP-1 έπαιξε σημαντικό ρόλο στηνΊνωση[52,53]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε εάν το 6-BIO θα μπορούσε να αναστείλει τον παράγοντα μεταγραφής SP-1. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης SP-1 αυξήθηκε ως απόκριση στη θεραπεία με TGFβ καθώς και στο μοντέλο UUO, ενώ μειώθηκε μετά από θεραπεία με 6-BIO. Επιπλέον, η πυρηνική έκφραση του SP-1 που προκλήθηκε από το TGFβ κατεστάλη από την επεξεργασία 6-BIO. Ως αποτέλεσμα, οι δραστηριότητες προώθησης των PAI-1 και CTGF, οι οποίες έχουν θέσεις δέσμευσης AP-1 και SP-1, μειώθηκαν επίσης με τη θεραπεία με 6-BIO (Σχήμα 6). Ως εκ τούτου, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η μείωση της δραστηριότητας του υποκινητή του PAI-1 και του CTGF από τη θεραπεία με 6-BIO μείωσε την έκφραση των πρωτεϊνών PAI-1 και CTGF και μείωσε τη συσσώρευση ECM, μειώνοντας έτσι τη μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών PAI-1 και CTGF και μείωσε τη συσσώρευση ECM, μειώνοντας έτσινεφρόςκύτταροΊνωση.

5. Συμπέρασμα

Η θεραπεία με 6-BIO μείωσε την έκφραση PAI-1 και CTGF στο μοντέλο UUO και υποβλήθηκε σε θεραπεία με TGFβνεφρόςΚύτταρα. Επιπλέον, το 6-BIO ανέστειλε την επαγόμενη από TGFβ ενεργοποίηση τουΣΜΑΔκαι σηματοδότηση MAPK, ενώ παράλληλα αναστέλλουν τις δραστηριότητες των AP-1 και SP-1, δύο από τους διάφορους παράγοντες μεταγραφής που συνδέονται με τους προωθητές των γονιδίων PAI-1 και CTGF. Η αναστολή των AP-1 και SP-1 φαίνεται να είναι ένας από τους βασικούς μηχανισμούς με τους οποίους αναστέλλει το 6-BIOνεφρόςΊνωση. Έτσι, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το 6-BIO μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας κατάνεφρόςΑσθένειες.

Δήλωση συνεισφοράς συγγραφικού έργου CRediT

Jung Sun Park: Εννοιολόγηση, Μεθοδολογία, Επιμέλεια δεδομένων, Συγγραφή − αρχική προετοιμασία προσχεδίου, Συγγραφή − αναθεώρηση &επεξεργασία, Οπτικοποίηση, Απόκτηση χρηματοδότησης. Στο Ae Jung: Επιμέλεια δεδομένων, Συγγραφή − αναθεώρηση &επεξεργασία. Χονγκ Σανγκ Τσόι: Επιμέλεια δεδομένων, Συγγραφή − αναθεώρηση και επεξεργασία. Dong-Hyun Kim: Μεθοδολογία, Επιμέλεια δεδομένων. Hoon In Choi: Μεθοδολογία, Επιμέλεια δεδομένων. Eun Hui Bae: Συγγραφή − κριτική & επιμέλεια, Επίβλεψη. Seong Kwon Ma: Συγγραφή − κριτική &επεξεργασία,

6. Παραπομπές

Η πηγή είναι από Jung Sun Park et, al on Βιοϊατρική &φαρμακοθεραπεία 145 (2022) 112402