Μέρος 1: Ολιγοσακχαρίτης ανθρώπινου γάλακτος 2/-φουκοσυλλακτόζη προκαλεί νευροπροστασία από εγκεφαλικό επεισόδιο ενδοεγκεφαλικής αιμορραγίας
Mar 22, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 και Seong-Jin Yu1,*
1Center for Neuropsychiatric Research, National Health Research Institute, Zhunan 35053, Taiwan;
pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);
baee@nhri.edu.tw (E.-KB)
2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Κορέα; yhsong@aptech.biz (YS);
jongwon.yoon91@gmail.com (JY)
Αλληλογραφία: b7508@nhri.edu.tw; Τηλ.: συν 886-37206166 (εσωτ. 36710)
Αφηρημένη:
Η ενδοεγκεφαλική αιμορραγία (ICH) εμφανίζεται όταν τα αιμοφόρα αγγεία του εγκεφάλου ρήξουν, προκαλώντας φλεγμονή και κυτταρικό θάνατο. 2-Η φουκοσυλλακτόζη (2FL), ένας ολιγοσακχαρίτης ανθρώπινου γάλακτος, έχει ισχυρά αντιαποπτωτικά και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει την προστατευτική επίδραση του 2FL σε κυτταρικά και τρωκτικά μοντέλα ICH. Αιμίνη προστέθηκε σε ένα πρωτεύον φλοιό αρουραίουνευρωνικόκαι συγκαλλιέργεια μικρογλοίας BV2 για προσομοίωση ICH in vitro. Οι ανοσοαντιδραστικότητα IBA1 και MAP2 χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της φλεγμονής καινευρωνικόεπιβίωση. Η αιμίνη αύξησε σημαντικά το IBA1, ενώ μείωσε την ανοσοαντιδραστικότητα του MAP2. Το 2FL ανταγωνίστηκε σημαντικά και τις δύο αποκρίσεις. Η προστατευτική δράση του 2FL εξετάστηκε στη συνέχεια σε ένα μοντέλο ICH αρουραίου. Η ενδοεγκεφαλική χορήγηση κολλαγενάσης τύπου VII μείωσε την κινητική δραστηριότητα ανοιχτού πεδίου. Η πρώιμη μετά τη θεραπεία με 2FL βελτίωσε σημαντικά την κινητική δραστηριότητα. Οι ιστοί του εγκεφάλου συλλέχθηκαν για ανοσοϊστοχημεία και ανάλυση qRT-PCR. Το 2FL μείωσε την ανοσοαντιδραστικότητα των IBA1 και CD4 στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα. Το 2FL μείωσε την έκφραση των δεικτών στρες ER (PERK και CHOP), ενώ ρύθμισε προς τα πάνω τους δείκτες μακροφάγων M2 (CD206 και TGF) στον τραυματισμένο εγκέφαλο. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το 2FL διαθέτει ανευροπροστατευτικόεπίδραση κατά της ICH μέσω της αναστολής τηςνευροφλεγμονήκαι στρες ER. Το 2FL μπορεί να έχει κλινικές επιπτώσεις για τη θεραπεία της ICH.
Λέξεις-κλειδιά: 2-φουκοσυλλακτόζη; ενδοεγκεφαλική αιμορραγία εγκεφαλικό επεισόδιο? φλεγμονή? ενδοπλασματικό δίκτυο
επιδράσεις του εκχυλίσματος κιστάνι: θεραπεία νευρο-ασθένειες
1. Εισαγωγή
Η ενδοεγκεφαλική αιμορραγία (ICH) είναι μείζονανευρολογικόςδιαταραχή που σχετίζεται με υψηλό κίνδυνο θανάτου σε ενήλικες [1,2]. Η ICH αποτελεί το 10-15 τοις εκατό όλων των περιπτώσεων οξέων εγκεφαλικών επεισοδίων [3]. Μερικές επιδημιολογικές μελέτες έχουν υποστηρίξει τις ανισότητες μεταξύ των φύλων σε ασθενείς με ICH [4] ή εγκεφαλοαγγειακές παθήσεις [5]. Μια μικρή μερίδα ασθενών με ICH αναπτύσσει αιμορραγικό κενό σύνδρομο [6]. Η τρέχουσα θεραπεία για την ICH επικεντρώνεται στον έλεγχο της αιμορραγίας, στην αφαίρεση του θρόμβου αίματος και στην ανακούφιση της ενδοκρανιακής πίεσης που προκαλείται από αιμορραγία. Δεν υπάρχει αποτελεσματική φαρμακολογική θεραπεία για την ICH.
Η φλεγμονή παίζει κρίσιμο ρόλο στην επαγόμενη από ICHνευροεκφυλισμός. Μετά την έναρξη της ICH, τα κύτταρα του αίματος εισέρχονται στο παρέγχυμα του εγκεφάλου, ενεργοποιούν τη μικρογλοία και ξεκινούν την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών [7,8]. Η αιμίνη, ένα υποπροϊόν της αιμοσφαιρίνης, προκαλείνευρωνικόθάνατο και προκαλεί απόπτωση και φλεγμονή [9,10]. Αρκετές μελέτες έχουν υποστηρίξει την αποτελεσματικότητα της αντιφλεγμονώδους θεραπείας σε ζωικά μοντέλα ICH [11,12]. Πρόσφατα αποδείξαμε ότι η πρώιμη μετά τη θεραπεία με έναν ανταγωνιστή CXCR4 CX807 ανέστειλε τη φλεγμονή και βελτίωσε τη συμπεριφορική λειτουργία σε πειραματικούς αρουραίους ICH [13]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αντιφλεγμονώδης θεραπεία μπορεί να μειώσει την εγκεφαλική βλάβη
μετά ICH.
Το ανθρώπινο μητρικό γάλα περιέχει θρεπτικά συστατικά και αρκετά κρίσιμα βιοενεργά συστατικά [14], π.χ. ολιγοσακχαρίτες ανθρώπινου γάλακτος (HMOs) [15]. Η 2'-φουκοσυλλακτόζη (2FL) είναι ένας κύριος ολιγοσακχαρίτης στο ανθρώπινο γάλα. Η στοματική χορήγηση 2FL βελτιώθηκεμνήμηκαι μάθηση σε αρουραίους [16,17]. Επιπλέον, το 2FL κατέστειλε την επαγόμενη από λιποπολυσακχαρίτες έκφραση και φλεγμονή CD14 στα ανθρώπινα εντεροκύτταρα [18]. Πρόσφατα αναφέραμε ότι ο 2FL μετριάστηκενευροφλεγμονήσε εγκεφαλικό ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο [19]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το 2FL είναι ένας ισχυρός αντιφλεγμονώδης παράγοντας και μπορεί, επομένως, να είναι χρήσιμος για τη θεραπεία της ICH.
Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει τις νευροπροστατευτικές δράσεις του 2FL σε κυτταρικά και ζωικά μοντέλα ICH. Η αιμίνη χρησιμοποιήθηκε για την προσομοίωση της ICH σε κυτταρική καλλιέργεια [20]. Δείξαμε ότι το 2FL ανταγωνίστηκε την προκαλούμενη από αιμίνη ενεργοποίηση μικρογλοίας. Η κολλαγενάση τύπου VII χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία εστιακής ICH σε ενήλικες αρουραίους [13]. Βρήκαμε ότι το 2FL μετριάζει σημαντικά την επαγόμενη από ICH ενεργοποίηση μικρογλοίας, τη διήθηση των λεμφοκυττάρων CD4 συν και το στρες ER στον τραυματισμένο εγκέφαλο και βελτίωσε τη συμπεριφορική λειτουργία. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το 2FL έχει ανευροπροστατευτικόεπίδραση κατά της ICH.
επιδράσεις του εκχυλίσματος κιστάνι
2. Αποτελέσματα
2.1. 2FL Μειωμένη νευροεκφύλιση που προκαλείται από αιμίνη σε πρωτογενείς φλοιώδεις νευρώνες και BV2 Microglia Coculture
Η προστατευτική δράση του 2FL εξετάστηκε για πρώτη φορά σε ένα κυτταρικό μοντέλο εγκεφαλικής αιμορραγίας. Πρωτογενής φλοιώδηςνευρωνικόκαι οι συνκαλλιέργειες μικρογλοίας BV2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αιμίνη (10 μΜ) για 48 ώρες (βλ. χρονοδιάγραμμα στο Σχήμα 1Ε). Ο Χέμιν εξασθενημένοςνευρωνικόδείκτη MAP2 (Εικόνα 1Α), ενώ αύξησε τον δείκτη μικρογλοίας IBA1 (Εικόνα 1Β). Αυτές οι αποκρίσεις ανταγωνίστηκαν και οι δύο με 2FL (1 υΜ, Σχήμα 1Α, Β). Οι ανοσοαντιδραστικότητα των MAP2 και IBA1 αναλύθηκαν περαιτέρω με μέτρηση της πυκνότητας εικονοστοιχείων συγκεκριμένων δεικτών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1C,D, η αιμίνη μείωσε σημαντικά την ανοσοαντιδραστικότητα του MAP2 (Map2-ir) και αύξησε το IBA1-ir (p < 0).00="" 1,="" μονόδρομη="" anova,="" n="6" σε="" κάθε="" ομάδα).="" αυτές="" οι="" αποκρίσεις="" ανταγωνίστηκαν="" σημαντικά="" με="" 2fl="" (map2:="" p=""><0,001, f2,14="115.863·" iba1:="" p=""><0,001, f2,15="134.644," μονόδρομη="">
F
Εικόνα 1. Τονευροπροστατευτικόεπίδραση του 2FL σε έναν πρωτογενή φλοιόνευρώναςκαι συγκαλλιέργεια μικρογλοίας BV2. (Α) Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες καταδεικνύουν ότι η αιμίνη μείωσε την ανοσοαντιδραστικότητα ΜΑΡ2 (-ir). Η συγχορήγηση με 2FL ανταγωνίστηκε την απώλεια του MAP-ir που προκαλείται από την αιμίνη. (Β) Η αιμίνη αύξησε το IBA1-ir. Η συγχορήγηση με 2FL μείωσε το IBA1-ir. (C,D) Η πυκνότητα εικονοστοιχείων του MAP2-ir ή του IBA{{10}}ir αναλύθηκε με χρήση λογισμικού NIS Elements AR 5.11. (Γ) 2FL ανταγωνίστηκε σημαντικά την απώλεια MAP2-ir που προκαλείται από την αιμίνη. (Δ) Οι 2FL εξασθενούσαν σημαντικά την επαγόμενη από την αιμίνη δραστηριότητα IBA1. (Ε) Χρονοδιάγραμμα πειράματος. * p < 0,05.="" γραμμή="" κλίμακας="100">
όφελος από το εκχύλισμα κιστάνι
2.2. Μετά τη θεραπεία με 2FL Βελτιωμένη κινητική δραστηριότητα σε αρουραίους ICH
Η προστατευτική επίδραση του 2FL εξετάστηκε στη συνέχεια σε ένα ζωικό μοντέλο ICH. Συνολικά σε 14 ενήλικες αρσενικούς αρουραίους χορηγήθηκε στερεοτακτικά χαμηλή δόση (0,5 μονάδες/uL × 1 uL) κολλαγενάσης τύπου VII για να προκληθεί εγκεφαλική αιμορραγία στο δεξιό ραβδωτό σώμα. 2FL (400 mg/kg/ημέρα, ip, n=7) ή όχημα (φυσιολογικό ορό, ip, n=7) χορηγήθηκε καθημερινά για 5 ημέρες, ξεκινώντας 1 ημέρα μετά το εγκεφαλικό επεισόδιο (παρακαλούμε δείτε το χρονοδιάγραμμα στο Εικόνα 2G). Στη συνέχεια, 2 ώρες μετά την τελευταία ένεση 2FL ή φορέα την ημέρα 5, τα ζώα τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε θαλάμους δραστηριότητας υπέρυθρης ακτινοβολίας για 30 λεπτά. Η κινητική συμπεριφορά σε ανοιχτό πεδίο εξετάστηκε για 30 λεπτά. Βρήκαμε ότι 2FL αυξήθηκε σημαντικά η κατακόρυφη δραστηριότητα (VACTV, Εικόνα 2Α), η συνολική απόσταση που διανύθηκε (TOTDIST, Εικόνα 2B), ο κατακόρυφος χρόνος (VTIME, Εικόνα 2C), η οριζόντια δραστηριότητα (HACTV, Εικόνα 2D), ο χρόνος κίνησης (MOVTME, Εικόνα 2E ), και τον αριθμό κίνησης (MOVNO, Εικόνα 2F). Λεπτομερή στατιστικά στοιχεία (αμφίδρομη ANOVA συν post hoc δοκιμές Newman–Keuls (NK)) παρατίθενται στον Πίνακα 1.
Εικόνα 2. Η μετά τη θεραπεία με 2FL βελτιώνει τις νευρικές λειτουργίες σε αρουραίους ICH. Οι ενήλικοι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με κολλαγενάση τύπου VII στο D0 (G, χρονοδιάγραμμα). 2FL ή όχημα χορηγήθηκε συστηματικά καθημερινά για 5 ημέρες. Η κινητική συμπεριφορά εξετάστηκε στο D5. 2FL σημαντικά βελτιωμένη (Α) κατακόρυφη δραστηριότητα, (Β) συνολική απόσταση που διανύθηκε, (C) κατακόρυφος χρόνος, (D) οριζόντια δραστηριότητα, (Ε) χρόνος κίνησης και (F) κίνηση
αριθμός. n {{0}} σε κάθε ομάδα. * p < 0.05,="" αμφίδρομη="" anova;="" #="" p="">< 0,05,="" post="" hoc="" δοκιμή="">
Πίνακας 1. Σημαντικές διαφορές στις κινητικές συμπεριφορές μεταξύ ICH συν veh και ICH συν 2FL.
2.3. Πρώιμη μετα-θεραπεία με 2FL μειωμένη μικρογλοιακή ενεργοποίηση στην περιοχή με περιβλάβες
Οκτώ αρουραίοι ICH (2FL, n=4· Veh, n=4) υποβλήθηκαν σε ευθανασία και εγχύθηκαν για ανοσοϊστοχημεία IBA1 μετά τη δοκιμασία συμπεριφοράς την ημέρα 5. Το τυπικό IBA1-ir φαίνεται στο Σχήμα 3 Το IBA1-ir ενισχύθηκε στην περιοχή με περιβλήματα στο ραβδωτό σώμα (Εικόνα 3Β), σε σύγκριση με τις αντίστοιχες θέσεις στο ετερόπλευρο μη αλλοιωμένο ραβδωτό σώμα (Εικόνα 3Α) σε αρουραίους με εγκεφαλικό που έλαβαν veh. Σε υψηλή μεγέθυνση, αποκλιμακωμένα ή αμεβοειδή μικρογλοιακά κύτταρα βρέθηκαν στην τραυματισμένη περιοχή (Εικόνα 3Β, ένθετο), ενώ ηρεμία μικρογλοία που παρουσίαζε διακλαδισμένη μορφολογία βρέθηκαν στο μη αλλοιωμένο ραβδωτό σώμα (Εικόνα 3Α, ένθετο). Η θεραπεία με 2FL μείωσε το IBA1- και αποκατέστησε μερικώς τη μορφολογική διακλάδωση της μικρογλοίας (Εικόνα 3C, ένθετο). Το IBA{19}}ir ποσοτικοποιήθηκε και υπολογίστηκε ο μέσος όρος σε τρεις διαδοχικές τομές εγκεφάλου με οπτικοποιημένη πρόσθια κοιλότητα σε όλα τα ζώα. 2FL σημαντικά μειωμένο IBA1- ή στον εγκέφαλο ICH (Εικόνα 3D, p < 0.001,="" f2,12="50.357," μονόδρομη="">
Σχήμα 3. Η πρώιμη μετά τη θεραπεία 2FL μείωσε τη μικρογλοιακή ενεργοποίηση στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα. Τα ζώα έλαβαν όχημα ή 2FL μετά την ένεση κολλαγενάσης από τις ημέρες 1 έως 5. Τα ζώα θυσιάστηκαν την ημέρα 5. Βρέθηκε ενισχυμένη ανοσοαντιδραστικότητα IBA1 με αποκλιμακωμένη μορφολογία στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα (Β έναντι Α). Η θεραπεία με 2FL μείωσε την ανοσοαντιδραστικότητα IBA (C έναντι B). (Δ) 2FL μείωσε σημαντικά την ανοσοαντιδραστικότητα IBA1 στον τραυματισμένο εγκέφαλο. * p < 0.05,="" μονόδρομη="" anova="" συν="" δοκιμή="">
2.4. 2FL Μετριασμένη CD4 συν Λεμφοκυτταρική διήθηση στους τραυματισμένους εγκεφάλους
Η χορήγηση κολλαγενάσης ενίσχυσε τη διήθηση CD4 συν λεμφοκυττάρων στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα (Εικόνα 4Β). Σχεδόν δεν βρέθηκαν κύτταρα CD4 στο μη αλλοιωμένο ραβδωτό σώμα (Εικόνα 4Α). Η διήθηση των κυττάρων CD4 στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα μετριάστηκε με τη θεραπεία 2FL (Εικόνα 4C έναντι Εικόνας 4Β, p < 0.001,="" f2,6="173.485," μονόδρομη="" anova,="" εικόνα="">
Εικόνα 4. Μετά τη θεραπεία με 2FL μείωσε τη διήθηση CD4 συν λεμφοκυττάρων στον τραυματισμένο εγκέφαλο. Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες καταδεικνύουν την ανοσοαντιδραστικότητα του CD4 στο (Α) το μη αλλοιωμένο ραβδωτό σώμα και (Β) το τραυματισμένο ραβδωτό σώμα από έναν αρουραίο που δέχεται όχημα σε χαμηλή (βαθμονόμηση=50 um) και υψηλή μεγέθυνση (εισαγωγή, βαθμονόμηση=10 um), καθώς και (C) το τραυματισμένο ραβδωτό σώμα από έναν αρουραίο που έλαβε 2FL. (D) 2FL σημαντικά μειωμένο CD{{1{{0}}στον εγκέφαλο που έχει υποστεί βλάβη (* p < 0,001,="">
τρόπο ANOVA).
2.5. Το 2FL άλλαξε διαφορικά την έκφραση των φλεγμονωδών δεικτών M1 και M2 σε εγκεφάλους ICH
Οι ραβδωτικοί ιστοί συλλέχθηκαν από οκτώ αρουραίους (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) την ημέρα 5. Η έκφραση των φλεγμονωδών δεικτών M1/M2 εξετάστηκε με qRT-PCR. Το ICH αύξησε σημαντικά την έκφραση του δείκτη M1 CD86 (Εικόνα 5Α, p=0.005) και των δεικτών M2 CD206 και TGF (Εικόνα 5B, C, p=0.005). Το 2FL δεν άλλαξε την έκφραση του CD86 (Εικόνα 5A, p=0.356, αμφίδρομη ANOVA). Ωστόσο, ρύθμισε σημαντικά την έκφραση του CD206 (Εικόνα 5Β) και του TGF στην πληγείσα πλευρά (ρ < 0,05,="" δοκιμή="">
όφελος από το εκχύλισμα κιστάνι
2.6. Το 2FL άλλαξε την έκφραση του στρες ER και των αποπτωτικών δεικτών σε εγκεφάλους ICH
Η έκφραση του στρες ER και των αποπτωτικών δεικτών εξετάστηκε σε οκτώ αρουραίους (veh, n=4; 2FL, n=4). Το 2FL μείωσε σημαντικά την έκφραση των PERK (Εικόνα 6Α, p=0.016), IRE1 (Εικόνα 6Β, p=0.018), CHOP (Εικόνα 6C, p=0.032) και SigmaR1 (Εικόνα 6D, p=0.017) στο τραυματισμένο ραβδωτό σώμα. Το 2FL δεν άλλαξε την έκφραση του BIP (Εικόνα 6Ε, p=0.841) και του ATF6 (Εικόνα 6F, p=0.403). Επιπλέον, η έκφραση της κασπάσης3 μειώθηκε σημαντικά κατά 2FL (Εικόνα 6G, p=0.029, t-test).
Εικόνα 5. Το 2FL ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση των δεικτών M2 σε εγκεφάλους ICH. Το ICH αύξησε σημαντικά την έκφραση του (A) M1 δείκτη CD86 και των δεικτών M2 (B) CD206 και (C) TGF (# p=0).005, αμφίδρομη ANOVA). (Α) Ο 2FL ρύθμισε σημαντικά προς τα πάνω την έκφραση του (B) CD206 και (C) TGF, αλλά όχι του (A) CD86, στο ραβδωτό σώμα με βλάβη (* p < 0,05,="" δοκιμή="">
Εικόνα 6. Το 2FL κατέστειλε την έκφραση του στρες ER και των αποπτωτικών δεικτών. Η έκφραση των (Α) PERK, (Β) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 και (G) κασπάσης3 αναστέλλεται σημαντικά κατά 2FL σε αιμορραγικούς εγκεφάλους. Η έκφραση του (Ε) BIP και (F) ATF6 δεν μεταβλήθηκε από 2FL. * p < 0.05.="" er,="" ενδοπλασματικό="" δίκτυο;="" perk,="" πρωτεϊνική="" κινάση="" r-like="" er="" κινάση;="" ire1,="" ένζυμο="" που="" απαιτεί="" ινοσιτόλη="" 1;="" chop,="" ccaat="" ενισχυτής-δεσμευτική="" πρωτεΐνη="" ομόλογη="" πρωτεΐνη.="" sigmar1,="" υποδοχέας="" sigma="" 1;="" atf6,="" ενεργοποιώντας="" τον="" μεταγραφικό="" παράγοντα="">
