Μέρος 1: Η εχινακοσίδη προστατεύει από MPP plus-επαγόμενη νευρωνική απόπτωση μέσω κανονισμού οδού ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

είδη (ROS) συμβάλλουν επίσης στην ανάπτυξή του [3]. Χαρακτηριστικά παρόμοια με το PD μπορούν να προκληθούν από διάφορες περιβαλλοντικές τοξίνες, όπως 1-μεθυλ-4-φαινυλ- 1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη (MPTP), κυανίδιο, διθειάνθρακας, και τολουόλιο. Το MPTP χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόκληση ζωικών μοντέλων PD και ο ενεργός μεταβολίτης του, το ιόν 1-μεθυλ-4- φαινυλοπυριδινίου (MPP?), χρησιμοποιείται σε κυτταρικά μοντέλα PD [4, 5]. MPP; αναστέλλει επιλεκτικά την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και οδηγεί σε υπερβολική παραγωγή ROS, προκαλώντας έτσι νευρωνικό θάνατο και ένα σύνδρομο που μοιάζει με PD [6]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι MPP? επάγει πολλαπλές οδούς σε ένα in vitro μοντέλο PD, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης φωσφορυλίωσης GSK3B (pY206) και της συσσώρευσης α-συνουκλεΐνης [5], ρύθμιση προς τα πάνω της οξυγενάσης της αίμης-1/νι-νικοτιναμίδης δινουκλεοτιδικής φωσφορικής οξειδάσης [7,ROS άξονας [7,ROS]. 8], αυξημένη έκφραση του ενεργού μεταγραφικού παράγοντα 3 (ATF3) και διακοπή ανάπτυξης μέσω της επαγόμενης από βλάβη DNA 153 (GADD153)/C/EBP-ομόλογης πρωτεΐνης (CHOP) [9]. Στην κλινική θεραπεία, η καταστολή των προϊόντων ROS είναι μια από τις πιο σημαντικές στρατηγικές για την επιβίωση των νευρώνων και τη θεραπεία της PD [1].

Εχινακοσίδη(ECH, Σχ. 1Α), ένα φυσικόφαινυλαιθανοειδέςπου βρίσκεται σε πολλά φαρμακευτικά φυτά, είναι ένα κύριο συστατικό τουφαινυλαιθανοειδέςγλυκοσίδεςαπομονωμένο από το παραδοσιακό κινέζικο βότανο,Cistancheσάλσα [10]. Είναι ενδιαφέρον ότι πρόσφατες μελέτες το έχουν δείξειECHέχει προστατευτικά αποτελέσματα σε ένα μοντέλο PD ποντικού που προκαλείται από MPTP [10, 11].ECHεπίσης εξασθενεί την απόπτωση των κυττάρων νευροβλαστώματος που προκαλείται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου-α ή την 6-υδροξυντοπαμίνη in vitro [12, 13]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίουςECHπροάγει την επιβίωση των νευρώνων στο επαγόμενο από ΜΡΡα κυτταρικό μοντέλο PD παραμένει ασαφές.

Το δείξαμεECHμείωσε σημαντικά τα προϊόντα ROS που προκαλούνται από MPP; σε κύτταρα SH-SY5Y.ECHανέστειλε επίσης την επαγόμενη από ΜΡΡα έκφραση των ATF3, CHOP και α-συνουκλεΐνης, καθώς και καταστέλλοντας την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών προ-απόπτωσης κασπάση-3 και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP).

Cistancheεχινακοσίδηέχεινευροπροστατευτικόυπάρχοντα

Υλικά και μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Το ελάχιστο απαραίτητο μέσο Dulbecco (DMEM), εμβρυϊκός βόειος ορός, 0.25 τοις εκατό θρυψίνη, 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη και το αντιδραστήριο TRIZol ήταν από τη Life Technologies (Grand Island, Νέα Υόρκη). Η βαφή χρωματίνης bisbenzimide (Hoechst 33342), πολυ-L-λυσίνη, MPP; Το ιωδίδιο και το MPTP ήταν από τη Sigma (St. Louis, MO). Το κιτ δοκιμασίας υπεροξείδωσης λιπιδίων της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) και η διχλωροφθοροσκεΐνη διοξική (DCFH-DA) ήταν από την Beyotime Biotech (Haimen, Κίνα). Το ECH καθαρότητας C98 τοις εκατό ήταν από την Push Biotechnology (Chengdu, Κίνα).

Ζώα και Θεραπείες

Η συντήρηση και οι θεραπείες των ζώων ήταν όπως περιγράφηκαν προηγουμένως [14]. Χρησιμοποιήσαμε αρσενικά ποντίκια C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Κίνα) βάρους 24–26 g σε ηλικία 10 εβδομάδων. Τα ζώα διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες (12:12 ώρες φως: κύκλος σκότους, 21 ± 2C, και σχετική υγρασία 40 τοις εκατό) και επέτρεψαν πρόσβαση σε τροφή και νερό κατά βούληση. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Νοσοκομείου Zhongshan, στο Πανεπιστήμιο Fudan, και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και τη Χρήση του

Ζώα Εργαστηρίου.

Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (10 ποντίκια/ομάδα): ομάδα Α, ομάδα ελέγχου φορέα, στους οποίους δόθηκε ίσος όγκος (500 lL) φυσιολογικού ορού (NS). ομάδα Β, ομάδα ελέγχου ECH, χορηγούμενη 20 mg/kg ECH. ομάδα C, ομάδα μοντέλου MPTP, προεπεξεργασμένη με ίσο όγκο NS. και ομάδα D, ομάδα κατεργασμένη με ECH, προκατεργασμένη με 20 mg/kgECH. ECHδιαλύθηκε σε NS και χορηγήθηκε με ενδογαστρική χορήγηση κάθε 24 ώρες για 15 διαδοχικές ημέρες. Το μοντέλο PD ποντικού για τις ομάδες C και D δημιουργήθηκε με πέντε διαδοχικές ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις 30 mg/kg MPTP κάθε 24 ώρες από την ημέρα 11 έως την ημέρα 15. Τα ποντίκια θανατώθηκαν από εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας ή διάχυση ναρκοποιηθούν από 10 τοις εκατό χλωροϋδρίτη (3. kg) ενδοπεριτοναϊκά 24 ώρες μετά την τελική θεραπεία.

Η αιμάτωση και η επεξεργασία των ιστών ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Μετά την ενδοκαρδιακή αιμάτωση, συλλέχθηκαν δείγματα εγκεφάλου και σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 24 ώρες στους 4 C, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και στεφανιαίες τομές που περιλάμβαναν ολόκληρο το SNc (στερεοταξικές συντεταγμένες προσθιοοπίσθια -3}}}}.64 έως {2{{2{. mm σε σχέση με το βρεγμα) κόπηκαν στα 5 lm.

Άλλα 5 ζώα από κάθε ομάδα θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση και ο κοιλιακός μεσεγκέφαλος λύθηκε ταχέως σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS 1 τοις εκατό σε πάγο. Τα επίπεδα πρωτεΐνης CHOP και ATF3 στο προϊόν λύσης αναλύθηκαν με στύπωμα western.

Cistancheεχινακοσίδηέχει ως αποτέλεσμα την αναζωογόνηση τουνεφρό

Καλλιέργεια κοιλιακού μεσεγκέφαλου αρουραίου (VM)

Ντοπαμινεργικοί Νευρώνες

Οι έγκυοι αρουραίοι Wistar αγοράστηκαν από την Shanghai Laboratory Animal Co., (Σαγκάη, Κίνα). Οι νευρώνες DA στο VM απομονώθηκαν την εμβρυϊκή ημέρα 14. Το VM αποκόπηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για την καθιέρωση πρωτογενών καλλιεργειών νευρώνων VM DA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15, 16]. Εν συντομία, τεμάχια ιστού συλλέχθηκαν σε παγωμένο εξισορροπημένο διάλυμα άλατος Hanks (HBSS) και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm στους 4 C για 5 λεπτά. Το ίζημα ιστού επωάστηκε σε 750 l 0,1 τοις εκατό τρυψίνης-HBSS για 15 λεπτά στους 37 C με 5 τοις εκατό CO2. Ο ορός εμβρύου μόσχου (FCS, 750 lL) χρησιμοποιήθηκε για την αδρανοποίηση της θρυψίνης και οι ιστοί διαχωρίστηκαν με ήπια λειοτρίβηση

χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα Παστέρ. Τα κυτταρικά εναιωρήματα φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 4 λεπτά στους 4 C και επαναιωρήθηκαν σε μέσο διαφοροποίησης (τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco/F12, 33 mmol/L D-γλυκόζη, 1 τοις εκατό L-γλουταμίνη και 1 τοις εκατό συμπληρωμένο με 2 τοις εκατό FCS, Β27). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού καλυμμένες με πολυ-D-λυσίνη (Sigma) 24-πηγαδιών σε 5 9 104 κύτταρα/φρεάτιο σε 500 l διαφορικού μέσου στους 37 C με 5 τοις εκατό CO2 για 10 ημέρες για να αναπτυχθούν σε

ώριμους νευρώνες DA. Οι νευρώνες VM DA χαρακτηρίστηκαν από ανοσοφθορισμό με αντίσωμα αντι-β-τουμπουλίνης ισοτύπου III και αντίσωμα υδροξυλάσης τυροσίνης (TH) (Εικ. S1). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mmol/L MPPa, 40 LG/mL ECH, έναν συνδυασμό MPPβ. και ECH, ή PBS μόνο ως έλεγχος. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με αντιδραστήριο CCK-8 μετά από 96 ώρες θεραπείας.

και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (n {{0}}; **P \0.01 έναντι ελέγχου, #P \ 0,05, ##P \0,01 έναντι MPP ? θεραπευτική αγωγή). C Μικροσκοπικές εικόνες φωτός μορφολογικών αλλαγών που προκαλούνται από MPP; ή MPP; και ECH. α, έλεγχος PBS. β, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP;; d, 1 mmol/L MPP; και 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP; και 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP; και 40 lg/mL ECH (ράβδος κλίμακας, 200 lm).

Το Cistanche echinacoside έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της απόπτωσης

Κυτταρική καλλιέργεια SH-SY5Y

Τα κύτταρα SH-SY5Y ήταν από το Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 U/mL πενικιλίνη και 100 U/mL στρεπτομυκίνες. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστήρα 37 C εφοδιασμένο με 5 τοις εκατό CO2. MPP; διαλύθηκε σε αποστειρωμένο νερό και χρησιμοποιήθηκε αμέσως. Το ECH διαλύθηκε σε PBS. Για τη διερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης και των επιπέδων πρωτεΐνης που σχετίζονται με το ROS, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια τροφοδοτήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε ΜΡΡα, ECH, ένα συνδυασμό ΜΡΡβ. και ECH, ή PBS μόνο ως έλεγχος. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS 1 τοις εκατό (1 τοις εκατό SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6,5) για ανάλυση western blot και το συνολικό RNA απομονώθηκε απευθείας με Αντιδραστήριο TRIZol.

Για την ανάλυση της κατανομής ATF3 και CHOP μετά τη θεραπεία, χρησιμοποιήθηκαν κιτ αντιδραστηρίων πυρηνικής και κυτταροπλασματικής εκχύλισης (Thermo Fisher, Waltham, ΜΑ) για την εξαγωγή κυτταροπλασματικών και πυρηνικών κλασμάτων από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φάρμακο και κύτταρα ελέγχου.

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Τα κύτταρα SH-SY5Y σπάρθηκαν σε τρυβλία 96-φρεατίων και επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα τροφοδοτούνταν κάθε 24 ώρες με ένα φρέσκο ​​πλήρες μέσο που περιείχε διαφορετικά φάρμακα και διατηρήθηκαν για 3 ημέρες. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ μετρητή κυττάρων CCK8 (Dojindo, Ιαπωνία). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα από τον έλεγχο PBS και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Για να αναλυθεί η βιωσιμότητα σε κύτταρα ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) και ελέγχου (GFP shRNA), τα κύτταρα προστέθηκαν σε τρυβλία 96-και καλλιεργήθηκαν για 14-16 ώρες. Πλασμίδια shRNA ATF3 ή GFP shRNA επιμολύνθηκαν σε κύτταρα SH-SY5Y χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mmol/L MPP? ή ίσο όγκο PBS μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης και στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 ημέρες. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρούνταν κάθε μέρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD.

ShRNA Constructs and Oligo Primers

Οι κατασκευές shRNA pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) και GFP ελέγχου ήταν από την GeneChem Co. (Σαγκάη, Κίνα). Η αλληλουχία στόχου ATF3 ήταν 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 από μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [17, 18]. Για την ανίχνευση της γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από το MPPa, επιλέχθηκαν γονίδια που σχετίζονται με το στρες ROS και σχετιζόμενα με PD για qRT-PCR και το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όλοι οι εκκινητές συντέθηκαν από τη Sangon Biotech Co. (Σαγκάη, Κίνα) και οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα 1.

PCR σε πραγματικό χρόνο

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε με αντιδραστήριο TRIZol σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάστροφη μεταγραφή και η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA First Strand RevertAid (Thermo Scientic, Waltham, MA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κιτ SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για qRT-PCR: 20-1L συστήματα αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν με ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Οι παράμετροι PCR περιελάμβαναν τα ακόλουθα βήματα: 95C για 3 λεπτά, 1 κύκλος. 95 C για 5 s και 60 C για 40 s, 40 κύκλους. Τα τελικά στοιχεία δεν ήταν

ηθικοποιούνται σε GAPDH και παρουσιάζονται ως αναλογία προς τον έλεγχο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Western Blotting

Η ανάλυση Western blot πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τα κύρια αντισώματα ήταν αντι-διασπασμένη κασπάση 3 και ρ53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), αντι-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), αντι-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Κίνα) και αντι- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA και αντι-ιστόνη 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Τα δευτερογενή αντισώματα επισημασμένα με υπεροξειδάση χρένου προέρχονταν από τα Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). Οι μεμβράνες PVDF ήταν από την EMD Millipore (Billerica, MA) και το υπόστρωμα ECL ήταν από την CWBio (Suzhou, Κίνα). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης με βάση τα επίπεδα του γκρι από την εικόνα αναλύθηκαν με το λογισμικό Tanon GIS (Tanon Biotech, Shanghai, Κίνα) και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η αναλογία της πρωτεΐνης στόχου προς το GAPDH.

Cistancheεχινακοσίδηέχει ως αποτέλεσμα την προστασία του ήπατος