Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' and Olivianoir

«Université de Paris, PARCC, Inserm, Παρίσι, Γαλλία. και Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Παρίσι, Γαλλία

Η ισχυρή προγνωστική αξία της πρωτεϊνουρίας σε χρόνιες σπειραματοπάθειες είναι σταθερά εδραιωμένη καθώς και ο παθογόνος ρόλος της αγγειοτενσίνης ll που προάγει την εξέλιξη της σπειραματικής νόσου με αλλοιωμένο φραγμό σπειραματικής διήθησης, τραυματισμό των ποδοκυττάρων και ουλές σπειραμάτων. Εδώ βρήκαμε ότι η χρόνια υπέρταση που προκαλείται από την αγγειοτενσίνη ανέστειλε τη ροή αυτοφαγίας στα σπειράματα ποντικού. Η διαγραφή του Atg5 (ένα γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται αυτοφαγία) ειδικά στο ποδοκύτταρο είχε ως αποτέλεσμα επιταχυνόμενη επαγόμενη από την αγγειοτενσίνη Ι ποδοκυτταροπάθεια, τονισμένη λευκωματουρία και σπειραματοσκλήρωση. Αυτό δείχνει ότι η αυτοφαγία είναι ένας βασικός προστατευτικός μηχανισμός στο ποδοκύτταρο σε αυτή την κατάσταση. Η επαγόμενη από την αγγειοτενσίνη δράση καλπαΐνης στα ποδοκύτταρα αναστέλλει τη ροή αυτοφαγίας. Ποδοκύτταρα από ποντίκια με διαγονιδιακή έκφραση του ενδογενούς αναστολέα καλπαΐνης καλπαστατίνη εμφάνισαν υψηλότερη αυτοφαγία των ποδοκυττάρων κατά την έναρξη που ήταν ανθεκτική στην αναστολή που εξαρτάται από την αγγειοτενσίνη Il. Επίσης, η παρατεταμένη αυτοφαγία με την καλπαστατίνη περιόρισε την καταστροφή των ποδοκυττάρων και τη λευκωματουρία. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η υπέρταση έχει παθογόνες επιδράσεις στη δομή και τη λειτουργία του σπειράματος, εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης των καλπαινών που οδηγεί σε αποκλεισμό της αυτοφαγίας των ποδοκυττάρων. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν έναν αρχικό μηχανισμό με τον οποίο η υπέρταση με τη μεσολάβηση της αγγειοτενσίνης Il αναστέλλει την αυτοφαγία μέσω της επαγόμενης από το ασβέστιο πρόσληψης καλπαΐνης με παθογόνες συνέπειες σε περίπτωση ανισορροπίας από τη δράση της καλπαστατίνης. Έτσι, η πρόληψη μιας μείωσης της αυτοφαγίας που προκαλείται από την καλπαΐνη μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα θεραπευτική στρατηγική για νεφροπάθειες που σχετίζονται με υψηλή δραστηριότητα του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης.

Cistanchedeserticola προλαμβάνεινεφρόνόσος

Μεταφραστική δήλωση

Δεδομένου του κρίσιμου ρόλου της αυτοφαγίας στην ανάπτυξη τουνεφρόασθένειες, η φαρμακολογική ρύθμιση της αυτοφαγίας μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την πρόληψη και τη θεραπεία αρκετών νεφρικών παθήσεων. Παράλληλα, η υπερενεργοποίηση της δραστηριότητας της καλπαΐνης στα ποδοκύτταρα βρέθηκε να έχει επιζήμια αποτελέσματα στη λειτουργία των ποδοκυττάρων, ενώ οι επιβλαβείς μηχανισμοί δράσης της δεν εντοπίστηκαν. Εδώ, παρέχουμε στοιχεία ότι η καλπαΐνη συνδέει τη βλαβερή δράση της αγγειοτενσίνης Il με τον επιζήμιο αποκλεισμό της αυτοφαγίας στα ποδοκύτταρα και προτείνουμε ότι η αναστολή της καλπαΐνης θα μπορούσε να είναι ένας πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός στόχος για ασθένειες των ποδοκυττάρων, εν μέρει μέσω της διατήρησης της αυτοφαγίας των ποδοκυττάρων.

Η υπέρταση είναι δεύτερη μετά τον διαβήτη ως κύρια αιτία προοδευτικής νόσουχρόνιοςνεφρόνόσος-και ακόμη και η μέτρια αύξηση της αρτηριακής πίεσης είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Ένας αυξανόμενος αριθμός πειραματικών μελετών έχει τονίσει τη σημασία των ποδοκυττάρων στην ανάπτυξη τουνεφρόβλάβη. Η προοδευτική απώλεια των ποδοκυττάρων και οι μικροαγγειακές αλλοιώσεις εμφανίζονται νωρίς με τη λειτουργική μείωση των νεφρών στην πειραματική υπερτασική νεφροπάθεια. Σε ασθενείς, η απέκκριση βιώσιμων ποδοκυττάρων μέσω ούρων αποδείχθηκε ευαίσθητος και ειδικός δείκτης για την προεκλαμψία και οι ασθενείς με νεφροσκλήρωση είχαν σημαντικά χαμηλότερη πυκνότητα σπειραματικών ποδοκυττάρων από τους δότες νεφρού. Επιπλέον, ο παθογόνος ρόλος της αγγειοτενσίνης II (Άγγελος) που προάγει την εξέλιξη της σπειραματικής νόσου είναι καλά τεκμηριωμένος, όχι μόνο σε υπερτασικές καταστάσεις αλλά και σε αρκετές σπειραματικές ασθένειες.

Η σπειραματική υπέρταση έχει ως αποτέλεσμα τέντωμα σπειραματικών τριχοειδών, ενδοθηλιακή βλάβη και αυξημένη σπειραματική πρωτεϊνική διήθηση που προκαλεί σπειραματική κατάρρευση και σπειραματοσκλήρωση. Ασκεί επίσης μια άμεση δράση στις σπειραματικές δομές, προκαλώντας σηματοδοτικές ρυθμιστικές αποκρίσεις με στόχο την αντιστάθμιση. Ένα ενεργοποιημένο συστηματικό και τοπικό σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης (RAAS) προάγει τη μεσαγγειακή υπερπλασία και τη σύνθεση παραγόντων αγγειακής διαπερατότητας. Ταυτόχρονα, τα ποδοκύτταρα εμφανίζουν σηματοδότηση ασβεστίου και τροποποιούν το σχήμα τους στον υποδοχέα AnglI τύπου 1 (AT1)-28Αυτοί οι προσαρμοστικοί μηχανισμοί εξαρτώνται από τη διέγερση.24-28 γίνονται δυσπροσαρμοστικοί μακροπρόθεσμα, οδηγώντας τελικά σε σπειραματοσκλήρωση. Το AT1 μεσολαβεί σε εμφανή συμμετοχή RAAS για την αρτηριακή πίεση και την ομοιόσταση αλατιού και νερού. Οι αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης και οι αναστολείς AT1 χρησιμοποιούνται κλινικά για τη θεραπεία της υπέρτασης και της καρδιακής ανεπάρκειας σε ασθενείς. Είναι ενδιαφέρον ότι και οι δύο αναστολείς παρουσιάζουν επίσης προστατευτική δράση στονεφρόλειτουργία.

Η αυτοφαγία αποδείχθηκε ότι είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης, ιδιαίτερα στα μεταμιτωτικά και ιδιαίτερα στα ποδοκύτταρα.1- Η αυτοφαγία είναι ένα σύστημα αποικοδόμησης που σχετίζεται με το cll9 για μακρόβιες κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και δυσλειτουργικά οργανίδια55 και περιλαμβάνει δέσμευση πρωτεϊνών και οργάνων. σε αυτοφαγοσώματα. Ο σχηματισμός αυτοφαγοσωμάτων εξαρτάται από την επαγωγή πολλών γονιδίων συμπεριλαμβανομένων των Mapllc3a/b, Berlin 1 και Atgs. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η απορρύθμιση της αυτοφαγικής οδού εμπλέκεται στην παθογένεση τουνεφρόγήρανση και αρκετάνεφρόασθένειες όπως η οξεία νεφρική βλάβη, η πολυκυστική νεφρική νόσος, η γήρανση και η διαβητική νεφροπάθεια.

Η ρύθμιση της αυτοφαγίας στα ποδοκύτταρα, φυσιολογική και κυρίως σε παθολογικό πλαίσιο, δεν είναι καλά γνωστή. Πρόσφατα αποδείξαμε ότι η αυτοφαγία των ποδοκυττάρων είναι ανεξάρτητη από τον μηχανιστικό στόχο της ρύθμισης της ραπαμυκίνης (mTOR) σε φυσιολογικές συνθήκες, καθιστώντας αυτόν τον κυτταρικό τύπο εξαίρεση. Η ενεργοποίηση AT1 διεγείρει την πρωτεϊνοσύνθεση και τον κύκλο εργασιών πρωτεΐνης στα κύτταρα. Έτσι, σκεφτήκαμε ότι η ενεργοποίηση του RAAS μπορεί επίσης να επηρεάσει τη διέγερση του κύκλου εργασιών των πρωτεϊνών και την πρωτεόσταση.

Στην παρούσα μελέτη, επικεντρωθήκαμε στον ρόλο της σηματοδότησης AnglI στη ρύθμιση της αυτοφαγίας των ποδοκυττάρων. Προσδιορίσαμε τις ενεργοποιημένες με ασβέστιο πρωτεάσες καλπαΐνες που μεσολαβούν σε μια χρόνια ανασταλτική επίδραση του AnglI στην αυτοφαγία των ποδοκυττάρων. Περαιτέρω, διαπιστώσαμε ότι ο ενδογενής αναστολέας καλπαΐνης καλπαστατίνη ήταν σε θέση να αποτρέψει την εξαρτώμενη από το AngI αναστολή αυτοφαγίας και τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων κατά τη διάρκεια της υπέρτασης.

Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν έναν αρχικό μηχανισμό με τον οποίο η υπέρταση με τη μεσολάβηση AnglI αναστέλλει την αυτοφαγία μέσω της επαγόμενης από το ασβέστιο πρόσληψης καλπαΐνης με παθογόνες συνέπειες σε περίπτωση ανισορροπίας από τη δράση της καλπαστατίνης.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Των ζώων

Τα διαγονιδιακά ποντίκια καλπαστατίνης (CST18) παρασχέθηκαν ευγενικά από τον Δρ. Ε. Letavernier. Ποντίκια με ειδική για τα ποδοκύτταρα διαταραχή του Atg5) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως γονίδιο (Nphs2.cre Atg5'o διασταυρώνοντας ποντίκια Nphs2.cre με Ag5lxlomice5 στο υπόβαθρο C57BL6/J. Ποντίκια Nphs2.cre Atg5'oxlox και συγγενείς αρσενικοί έλεγχοι , ηλικίας 10 έως 12 εβδομάδων, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το υπερτασικό μοντέλο προκλήθηκε με έγχυση του AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) σε δόση 1 ug/kg/min για 4 έως 6 εβδομάδες μέσω οσμωτικές μίνι αντλίες (Alzet Corp, μοντέλο 2006). Εμφυτεύτηκαν αντλίες στην πλάτη μεταξύ των ωμοπλάτων και των γοφών. Τα ποντίκια έλαβαν συμπλήρωμα αλατιού (3 τοις εκατό NaCl) στα τρόφιμα. Τα ποντίκια Atgsloxilox (άγριου τύπου [WT]) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες σε Όλες οι μελέτες. Για το άλας οξικής δεοξυκορτικοστερόνης (DOCA) με το μοντέλο μείωσης του νεφρώνα, ενήλικα αρσενικά ποντίκια υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη αριστερή νεφρεκτομή. Δύο εβδομάδες μετά τη νεφρεκτομή, έλαβαν σφαιρίδια DOCA με εμφυτευμένο sc. Ένα δεύτερο σφαιρίδιο εμφυτεύθηκε 3 εβδομάδες μετά το πρώτο εμφύτευμα έλαβαν 0,9 τοις εκατό NaCl στο πόσιμο νερό κατά βούληση και θανατώθηκαν μετά από 6 εβδομάδες χορήγησης DOC.6 Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις γαλλικές κτηνιατρικές οδηγίες και εκείνες που διατυπώθηκαν από την Ευρωπαϊκή Κοινότητα για χρήση σε πειραματόζωα (L358-86/609EEC) και εγκρίθηκαν από το Γαλλικό Υπουργείο Έρευνας και την τοπική επιτροπή πανεπιστημιακής δεοντολογίας της έρευνας (APAFIS-7646 και -22373).

Πρωτογενές πείραμα καλλιέργειας ποδοκυττάρων

Διαφοροποιημένα πρωτογενή ποδοκύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως./Συνοπτικά, ο πρόσφατα απομονωμένος νεφρικός φλοιός αναμίχθηκε και υποβλήθηκε σε πέψη από την κολλαγενάση Ι (Gibco, {{0}}) στο Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2 }}). Στη συνέχεια, οι ιστοί διήλθαν μέσω φίλτρων κυττάρων 70 μm και 40 μm (BD Falcon, 352340 και 352350). Τα σπειράματα, τα οποία προσκολλώνται στο φίλτρο κυττάρων 40 um, αφαιρέθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS; Life Technologies, 10010023) συν 0,5 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (Eurobio, HALALB07-65) που εγχύθηκε υπό πίεση και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές στο PBS. Πρόσφατα απομονωμένα σπειράματα τοποθετήθηκαν σε 6-πηγαδάκια στο Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco,61870036) συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου μοσχαριού και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Life Technologies, 15140122222222200000) και μεγαλώνουν. Ο εμπλουτισμός των ποδοκυττάρων επαληθεύτηκε με ανάλυση στυπώματος Western όπως προηγουμένως (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Τα ποδοκύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία βαφιλομυκίνης Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, Β1793) για 4 ώρες. Για πειράματα ανοσοφθορισμού, πρωτογενή ποδοκύτταρα επιστρώθηκαν σε ετικέτες 4 πιάτων (Dutcher, 055071). Τα ποδοκύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό για 10 λεπτά και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοφθορισμό.

Δοκιμασία δραστικότητας καλπαΐνης

Η ενδοκυτταρική δράση καλπαΐνης προσδιορίστηκε στα πρωτογενή ποδοκύτταρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Συνολικά 100,000 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 24-πιάτα ιστοκαλλιέργειας φρεατίων στο Roswell Park Memorial Institute 1640 συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου μόσχου και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. Μετά την υποδεικνυόμενη περίοδο καλλιέργειας, το μέσο αντικαταστάθηκε με διττανθρακικό διάλυμα Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7,4) που περιέχει 4 mM CaCl2, με ή χωρίς 10 uM αναστολέα καλπαΐνης-1 και επωάστηκε για 10 λεπτά πριν από την προσθήκη υποστρώματος καλπαΐνης 50 mM N-ηλεκτρυλο-Leu-Leu-Val-Tyr-7-αμινο-4-μεθυκουμαρίνης (Sigma-Aldrich, S6510). Μετά από μια 90-λεπτή περίοδο επώασης, η δραστηριότητα του πόνου cal προσδιορίστηκε ως η διαφορά μεταξύ του φθορισμού (μετρημένος σε διέγερση 360 nm και εκπομπή 430 nm) με και χωρίς αναστολέα καλπαΐνης-1.

Western blot

Τα πρωτογενή ποδοκύτταρα ξύστηκαν με 80 ul ρυθμιστικού προσδιορισμού ραδιοανοσοκαθίζησης που περιέχει φωσφατάση και αναστολέα πρωτεάσης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Merck Biochemistry, 71285). Είκοσι μικρογραμμάρια πρωτεϊνών ηλεκτροφορήθηκαν σε προκατασκευασμένη γέλη Criterion XT (12 τοις εκατό Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Thermo Fischer Scientific, 88518). Μετά τον αποκλεισμό σε 5 τοις εκατό γάλα σε Tris Buffer Saline 0,1 τοις εκατό Tween (TBS-T), οι μεμβράνες επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντι-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), κουνέλι πολύκλωνο αντι-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), ινδικό χοιρίδιο πολυκλωνικό anti-Sequestosome 1(SQSTM1)/P62(1:10,000, PROGEN,GP62), πολυκλωνικός τομέας αντικαλπαΐνης 1 κουνελιού IV(1:1000, Abcam, Abcam, Abcam,). ), πολυκλωνικό αντικαλπαΐνη 2 αμινοτελικού άκρου κουνελιού του τομέα I(1:1000, Abcam, ab39165), μονοκλωνικό IgG1 ποντικού anti-calpain 4(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), κουνέλι αντι-ποδοκίνη (1:1000, Abcam, ab50339), αντι-νεφρίνη ινδικού χοιριδίου (1:500, PROGEN, GP-N2) και μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-τουμπουλίνης αρουραίου (1:5000, Abcam, ab6160). Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα συνδεδεμένο με υπεροξειδάση χρένου (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074,7076,7077). Η ανίχνευση συγκεκριμένων σημάτων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ χημειοφωταύγειας ECL (Bio-Rad, 170-5070) σε συσκευή LAS 4000 (Fuji). Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκε η πυκνομετρική ανάλυση με λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health).

Μετρήσεις αρτηριακής πίεσης και φυσιολογικές εκτιμήσεις

Η συστολική αρτηριακή πίεση των ποντικών καταγράφηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο tail-cuff (Visitech Systems Inc., BP-2000). Ελήφθησαν δέκα μετρήσεις από κάθε ποντίκι και στη συνέχεια προσδιορίστηκε μια μέση τιμή. Η συστολική αρτηριακή πίεση μετρήθηκε στην έναρξη (ηλικία 12 εβδομάδων) και στη συνέχεια εβδομαδιαία μέχρι το τέλος της περιόδου θεραπείας. Όλα τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε μεταβολικά κλουβιά με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό για μια συλλογή ούρων 6-ωρών. Οι συγκεντρώσεις κρεατινίνης ούρων και ουρίας στο πλάσμα αναλύθηκαν φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική μέθοδο (Olympus, AU400). Η απέκκριση λευκωματίνης στα ούρα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια ειδική ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό της λευκωματίνης στα ούρα ποντικού (Crystal Chem, 80630).

Ιστολογία

Τα νεφρά συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη ρυθμισμένη με PBS 4 τοις εκατό. Τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη (3-um πάχος) χρωματίστηκαν με τρίχρωμο Masson για την αξιολόγηση της μορφολογίας των νεφρών. Οι ανωμαλίες στους νεφρούς βαθμολογήθηκαν με βάση την παρουσία και τη σοβαρότητα των ανωμαλιών των συστατικών, συμπεριλαμβανομένης της σπειραματοσκλήρωσης, της μεσαγγειακής επέκτασης, της σωληναριακής ατροφίας ή εκμαγείων και της ίνωσης. Η αναλογία των σκληρωτικών σπειραμάτων αξιολογήθηκε με τυφλή εξέταση τουλάχιστον 50 σπειραμάτων ανά τομή νεφρού.

Χρώση ανοσοφθορισμού τμημάτων νεφρού και πρωτογενών ποδοκυττάρων

Σταθερά πρωτογενή ποδοκύτταρα αποκλείστηκαν σε αλβουμίνη βόειου ορού TBS-T 3 τοις εκατό και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς με πρωτογενή αντισώματα ινδικού χοιριδίου anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) και αντι-πράσινο κουνελιού φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Μετά τις εκπλύσεις TBS-T, συζευγμένα με φθοροφόρο δευτερογενή αντισώματα αντισώματος γαϊδουριού αντι-ινδικού χοιριδίου IgG AF594-συζευγμένο αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) και συζευγμένο αντίσωμα IgG AF αντι-κουνελιού γαϊδουριού488- Εφαρμόστηκε το Invitrogen, Α21206). Οι εικόνες λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μικροσκόπιο Zeiss 2, μια κάμερα AxioCam HRc και το λογισμικό Axiovision 4.3.

Για νεφρούς ενσωματωμένους σε παραφίνη (FFPE) σταθεροποιημένους με φορμαλίνη, τα τμήματα (3 um) αποπαραφινώθηκαν και ενυδατώθηκαν και η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε σε θερμαινόμενο ρυθμιστικό κιτρικού (ρΗ 6). Οι τομές στη συνέχεια διαπερατήθηκαν με Triton 0.1 τοις εκατό (Euromedex) και αποκλείστηκαν σε αλβουμίνη βόειου ορού TBS-T3 τοις εκατό πριν από την ολονύκτια επώαση αντισωμάτων στους 4 βαθμούς. Χρησιμοποιήσαμε αντινεφρίνη κατσίκας (1:100, PROGEN, GP-N2), ινδικό χοιρίδιο anti-SQSTM1/P62(1:1000,PROGEN, GP-62C), αντι-GFP κουνελιού (1:1000, Abcam, ab290), αντίσωμα αντι-Ποδοκαλυξίνης κατσίκας (PODXL;1:1000, Bio-Techne,AF{-1556) και αντίσωμα κατά του όγκου του κουνελιού 1(WT1;1:100, Abcam, ab192). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν τα Alexa 488- και Alexa 568-συζευγμένα αντισώματα από το Invitrogen. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με μπλε χρησιμοποιώντας Hoechst. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μέσο στήριξης (Dako, S3023). Οι φωτομικρογραφίες λήφθηκαν με φωτομικροσκόπιο Zeiss Axiophot και λογισμικό Axiovision. Οι ημιαυτόματες ποσοτικοποιήσεις στα Φίτζι χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικοποιήσεις θετικών σε νεφρίνη και PODXL συν εμβαδών ανά σπειραματική τομή σε τουλάχιστον 30 σπειράματα ανά ποντίκι. Ο αριθμός των ποδοκυττάρων μετρήθηκε ως ο αριθμός των WT1 συν πυρήνων ανά σπειραματική τομή σε τουλάχιστον 30 σπειράματα ανά ποντικό.

Διαδικασία ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης

Μικρά κομμάτια του νεφρικού φλοιού (1 mm) στερεώθηκαν σε 3 τοις εκατό γλουταραλδεΰδης EM βαθμού (Electron Microscopy Sciences) για 1 έως 30 ημέρες και πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν εκ των υστέρων σε 1 τοις εκατό τε-τροξείδιο του οσμίου 0.1 Μ (Electron Microscopy Science) σε 0,1 Μ PBS (ρΗ 7,4) και πλύθηκαν με νερό. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε ποιότητες αλκοόλης και 100 τοις εκατό προπυλενοξείδιο (Electron Microscopy Science). Διήθηση ρητίνης διεξήχθη ως εξής: αναμίξτε Epikote 812 και οξείδιο του προπυλενίου σε αναλογία 1:1 για 30 λεπτά ακολουθούμενη από μίγμα Epikote 812 και οξείδιο προπυλενίου σε αναλογία 1:2 για ολονύκτια θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα ενσωματώθηκαν σε κάψουλες ζελατίνης 4 mm σε 100 τοις εκατό Epikote 812 και πολυμερίστηκαν σε φούρνο θερμαινόμενο στους 60 βαθμούς Κελσίου. Οι υπερλεπτές τομές κόπηκαν με υπερμικρότομο UFC7 (Leica Microsystems GmbH) και αποτέθηκαν σε Gilder Grids 200 mesh (Electropy). Αντιχρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο 7 τοις εκατό (LFG Distribution) και κιτρικό μόλυβδο Reynold (LFG). Τα δείγματα εξετάστηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEM1011 (JEOL) με την κάμερα CCD Orius SC1000 (Gatan), που λειτουργεί με το λογισμικό Digi-talMicrograph (Gatan) για απόκτηση.

Ποσοτική συστοιχία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Τα πρόσφατα απομονωμένα σπειράματα καταψύχθηκαν σε αντιδραστήριο QIAzol Lysis (Qiagen) σε βαθμό -80. Η εξαγωγή ολικού RNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που βασίζεται στη φαινόλη υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα cDNA συντέθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ RT²First Strand (Qiagen, 330401) και πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη συστοιχία RT²Profiler PCR （ Qiagen, CLAM36771C) με RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Οι ποσοτικές πλάκες PCR εκτελέστηκαν σε κυκλοποιητή Applied Bio-systems StepOnePlus. Κάθε συστοιχία περιέχει ποιοτικό έλεγχο για την αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής και τη μόλυνση του γονιδιωματικού DNA. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-△△CT με τη βοήθεια του GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) και εκφράζεται ως η αλλαγή της πτυχής Log2 στη γονιδιακή έκφραση.

Σε πυριτική πρωτεομική ανάλυση

Η πρόβλεψη in silico της θέσης διάσπασης της καλπαΐνης έγινε με DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD(http://ccd.biocuckoo.org) και CaMPDB (http:// calpain.org/) διαδικτυακά εργαλεία. Η αλληλουχία αμινοξέων πρωτεΐνης ποντικού ελήφθη από την Uniprot (https://www.uniprot.org). Τα αποτελέσματα επαναλαμβάνονται στους Συμπληρωματικούς Πίνακες S1 και S2.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα γραφήματα αντιπροσωπεύουν μεμονωμένες τιμές και μέσο όρο ± SEM. Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism, έκδοση 9. Η σύγκριση μεταξύ 2 ομάδων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα παραμετρικό Student t-test όταν τα δείγματα πέρασαν τις δοκιμές κανονικότητας Anderson-Darling και D'Agostino και τη δοκιμή F για ισότητα διακύμανσης. Διαφορετικά, χρησιμοποιήθηκε μια μη παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney. Η σύγκριση μεταξύ πολλαπλών ομάδων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης 1-τρόπου ή 2-τρόπου ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης με διόρθωση Sidak. Οι αξίες του Π<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Εικόνα 1| Η υπέρταση που προκαλείται από την αγγειοτενσίνη Ι (Άγγελος) και η δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι (HSD) αναστέλλει τη σπειραματική αυτοφαγία. (μετα Χριστον)

Ανοσοφθορισμός Podocalyxin (PODXL; κόκκινο) και P62 (πράσινο) σε σπειράματα (a,a') από ποντίκια άγριου τύπου (WT), (b,B) από ποντίκια WT μετά από 6 εβδομάδες Angel plus HSD, και (c) από ποντίκια Nphs2.cre Atgsl/ox που δείχνουν τη συσσώρευση του P62 στα ποδοκύτταρα κατά τη διάρκεια της υπέρτασης και σε ποντίκια με έλλειψη ATG5-ειδικών για τα ποδοκύτταρα. Οι αιχμές βέλους υποδεικνύουν P62 συν κουκκίδες στο WT στο (a'). Οι πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με Hoechst (μπλε). Τα υποτμήματα του σχήματος με πρώτο υποδεικνύουν μεγαλύτερη μεγέθυνση. Μπάρες =50 μm. (d) Η σχετική ποσοτικοποίηση του P62 plus εκφράζεται ως το ποσοστό της σπειραματικής περιοχής.n =4 ποντίκια WT και n=5 WT με ποντίκια Angel plus HSD και Nphs2.cre Atgsoxlo. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μεμονωμένα διαγράμματα και μέσος όρος ± SEM. Δοκιμή Mann-Whitney:*P= 0.0159.

Η υπέρταση που προκαλείται από τη δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε αλάτι ανέστειλε την αυτοφαγία των ποδοκυττάρων

Τα ποδοκύτταρα παρουσιάζουν υψηλό επίπεδο αυτοφαγίας in vivo, όπως φαίνεται από την ισχυρή έκφραση GFP σε διαγονιδιακά ποντίκια με σύντηξη GFP σε LC3 (ποντίκια GFP-LC3), βασικό δείκτη αυτοφαγίας (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A). Η αυτοφαγία είναι μια δυναμική διαδικασία με συνεχή σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων και αποικοδόμηση αυτοφαγολυσοσωμάτων. Ο αποκλεισμός της αυτοφαγοσωμικής αποικοδόμησης με χλωροκίνη είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση GFP συν κουκκίδων, υποδεικνύοντας υψηλή αυτοφαγική ροή στα ποδοκύτταρα (Συμπληρωματικά Σχήματα S2A και B). Η επιβεβαίωση ότι το GFP συν οι κουκκίδες ήταν αυτοφαγοσώματα αποδείχθηκε με διπλό ανοσοφθορισμό για το GFP και το SQSTM1/P62, μια πρωτεΐνη συνοδού που αποικοδομείται από αυτοφαγία (Συμπληρωματικό Σχήμα S2C και D). Και πάλι, η θεραπεία με χλωροκίνη προκάλεσε τη συσσώρευση GFP συν P62 συν κουκκίδες, επιδεικνύοντας σημαντική αυτοφαγική ροή στα ποδοκύτταρα. Τέλος, η υψηλή αυτοφαγική ροή διατηρήθηκε in vitro όπως φαίνεται από την έκφραση GFP και P62 σε πρωτογενή ποδοκύτταρα που απομονώθηκαν από ποντίκια GFP-LC3 και ισχυρή συσσώρευση κουκκίδων GFP plus και P62 plus υπό θεραπεία με bafilomycin Al, έναν άλλο αναστολέα της αυτοφαγοσωματικής αποδόμησης (Συμπληρωματικό Σχήμα S2E- Η).

Η ικανότητα της υπέρτασης να ρυθμίζει τις αυτοφαγικές αποκρίσεις των ποδοκυττάρων στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε ποντίκια στα οποία έγινε έγχυση AngII με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι (HSD) για 6 εβδομάδες και σε μη υπερτασικούς μάρτυρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, το AnglI συν HSD προκάλεσε συσσώρευση P62 στα σπειράματα με ισχυρή συσσώρευση στα ποδοκύτταρα, υποδηλώνοντας έτσι ότι το Angl συν HSD ήταν υπεύθυνο για τον αποκλεισμό της αυτοφαγίας των ποδοκυττάρων (Σχήμα εδάφους). Είναι ενδιαφέρον ότι η συσσώρευση P62 στα ποδοκύτταρα ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε ποντίκια με έλλειψη για αυτοφαγία ποδοκυττάρων (ποντίκια Nphs2.cre Atg5'olox). χρονική πορεία της νόσου (Συμπληρωματικό Σχήμα S3).

Η διαγραφή του Atg5 ειδικά στα ποδοκύτταρα έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη λευκωματουρία, απώλεια ποδοκυττάρων και σπειραματική βλάβη στο μοντέλο Angel plus HSD

Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν ο αποκλεισμός της αυτοφαγίας μόνο σε ποδοκύτταρα (ποντίκια Nphs2.cre Atg5laxlox) επηρεάζει τη σπειραματική βλάβη στο μοντέλο AnglI plus HSD. Αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι το Nphs2. Τα ποντίκια cre Atg5 είχαν φυσιολογική αρτηριακή πίεση, φυσιολογική νεφρική λειτουργία και καμία σπειραματική ιστολογική αλλοίωση μέχρι την ηλικία των 10 μηνών, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Συμπληρωματικό lox (WT) και Nphs2.cre Atgslox Εικόνα S4).2 Στη συνέχεια, οι ποντικοί Atg5'cl εγχύθηκαν με AngII με HSD για 6 εβδομάδες. Είναι σημαντικό ότι η συστολική αρτηριακή πίεση ήταν παρόμοια στις 2 ομάδες μετά την έγχυση AnglI κατά τη διάρκεια της μελέτης (Εικόνα 2α), αν και η μέθοδος ουράς-cuff που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της αρτηριακής πίεσης μπορεί να μην έχει την ικανότητα να επιλύει μικρές διαφορές αρτηριακής πίεσης. Η έγχυση Angl με HSD αύξησε σημαντικά την αναλογία λευκωματίνης ούρων προς κρεατινίνη σε ποντίκια WT και αυτό το αποτέλεσμα αυξήθηκε περαιτέρω σημαντικά στα ποντίκια (Εικόνα 2β). Τα υπερτασικά Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre ποντίκια Atgsoxlox εμφάνισαν επίσης σημαντικά αυξημένη σπειραματική σκλήρυνση σε σύγκριση με τα νεογνά WT (Εικόνα 2γ-ε). Σε συμφωνία με τη μετρούμενη πρωτεϊνουρία, οι πρωτεϊνικοί γύψοι και η σωληναριακή διαστολή ήταν σημαντικά πιο διαδεδομένες σε ποντίκια με ανεπάρκεια ποδοκυττάρων στο ATG5 (Εικόνα 2f-h).

Ο αριθμός των ποδοκυττάρων ανά σπειράμα μειώθηκε σημαντικά στο Nphs2.cre Atg5loxlox (Εικόνα 2i-k). Η βλάβη των ποδοκυττάρων σε ποντικούς Nphs2.cre Atgsoxlo με έγχυση AngII συν HSD ακόμη και εξελίχθηκε σε εστιακή και τμηματική σπειραματοσκλήρωση όπως φαίνεται από την έκφραση του βρεγματικού επιθηλίου (PEC ) δείκτης ενεργοποίησης CD44 σε σπειράματα (Εικόνα 2l και m). Η ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εντόπισε σημαντικές αλλαγές που σχετίζονται με ανεπάρκεια ATG5 κατά τη χρόνια έγχυση AngII με HSD, συμπεριλαμβανομένης της εξάλειψης της διαδικασίας του ποδιού σε…ποντίκια. Αντίθετα, λίγα υπερυπερτασικά Nphs2. Βρέθηκαν δομικά ελαττώματα cre Atg5'oxlx σε ποδοκύτταρα από ποντίκια WT ακόμη και μετά από 10 εβδομάδες έγχυσης AngII με HSD (Εικόνα 2n και o), υποδεικνύοντας ότι η αυτοφαγική δραστηριότητα των ποδοκυττάρων απαιτείται για την αντίστασή τους στη βλάβη που προκαλείται από τον Angel συν HSD. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι στο μοντέλο AnglIl plus HSD, η αναστολή της αυτοφαγίας επιδεινώνει τον τραυματισμό και την απώλεια των ποδοκυττάρων και προκαλεί επακόλουθη εστιακή και τμηματική σπειραματοσκλήρωση.

Σχήμα 2|Η διαγραφή του Atg5 ειδικά στα ποδοκύτταρα έχει ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση της λευκωματουρίας, του νεφρικού τραυματισμού και της απώλειας ποδοκυττάρων μετά από 6 εβδομάδες έγχυσης αγγειοτενσίνης Il(Angel) συν δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε αλάτι (HSD). (α) Συστολική αρτηριακή πίεση σε ποντικούς Atgslo/b και Nphs2.cre Ataslo κατά τη διάρκεια 36 ημερών με Angel συν HSD.n =9 ποντίκια ανά γονότυπο. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Αμφίδρομη ανάλυση διασποράς (ANOVA): ns. Σε (bm),n =10 ποντίκια ανά γονότυπο. Στο(b,g,h,k), οι τιμές παρουσιάζονται ως μεμονωμένα διαγράμματα και μέσος όρος± SEM.(β) Άγγελος συν HSD (συνέχεια

Εικόνα 3| Έκφραση και δραστηριότητα καλπαΐνης στα ποδοκύτταρα. (α) Ανάλυση Western blot της έκφρασης της καλπαΐνης-1.calpain-2 και της καλπαΐνης-4 σε πρωτογενή ποδοκύτταρα. Η έκφραση τουμπουλίνης χρησιμεύει ως ομαλοποίηση. (β) Η δραστικότητα καλπαΐνης μετρήθηκε σε πρωτογενή ποδοκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή ή δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή με αγγειοτενσίνη ll (Angel, 100 nM) για 24 ώρες με ή χωρίς καλπεπτίνη (10 μΜ), n =5 ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μεμονωμένα διαγράμματα και μέσος όρος ± SEM. Μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA): θεραπεία, p =0. Angll συν καλπεπτίνη έναντι Angll. (γ) Η δραστηριότητα της καλπαΐνης μετρήθηκε σε πρωτογενή ποδοκύτταρα από άγριου τύπου (WT) ή διαγονιδιακά ποντίκια καλπαστατίνης (CST') που υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή δεν έλαβαν θεραπεία με Angel (100 nM) για 24 ώρες. n {{18} } ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μεμονωμένα διαγράμματα και μέσος όρος ± SEM. Αμφίδρομη ANOVA συζευγμένη για τον γονότυπο θεραπείας. P= 0.0483. Τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Sidak:**P=0.0009 για WT Angll έναντι γραμμής βάσης,*P=0.0420 για CST'9 Angll έναντι γραμμής βάσης, *P=0.0424 για WT έναντι CST9 Angll.

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2