ΜΕΡΟΣ 1 Αντιοξειδωτικές και αντιπηκτικές επιδράσεις των φαινυλοπροπανοειδών γλυκοσιδών που απομονώνονται από τη σκουπόραμμα (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria και P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

a University of Ło'd´z, Τμήμα Γενικής Βιοχημείας, Σχολή Βιολογίας και Προστασίας του Περιβάλλοντος, 90-236 Ł´od´z, Πολωνία

β Τμήμα Βιοχημείας και Ποιότητας Καλλιεργειών, Ινστιτούτο Εδαφολογίας και Καλλιέργειας Φυτών, Κρατικό Ινστιτούτο Ερευνών, 24-100 Puławy, Πολωνία

Κέντρο Έρευνας και Διατήρησης της Βιοποικιλότητας, Τμήμα Περιβαλλοντικής Βιολογίας, Ινστιτούτο Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Jan Kochanowski, 25-406 Kielce, Πολωνία

Αφηρημένη

Ολοπαρασιτικά φυτά των Orobanchaceae, συμπεριλαμβανομένωνCistanche, Orobanche και Phelipanche spp, είναι γνωστά για τον πλούτο τους σε φαινυλοπροπανοειδείς γλυκοσίδες (PPGs). Πολλές ενώσεις PPG έχουν βρεθεί ότι διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα δράσεων, όπως αντιμικροβιακές, αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές και ενίσχυση της μνήμης. Για την καλύτερη διερεύνηση του δυναμικού βιοδραστικότητας των ευρωπαϊκών σκουπιδιών (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) και δέκα μεμονωμένων απομονωμένων συστατικών φαινυλοπροπανοειδών, ερευνήσαμε την αντιριζική τους δράση, την προστατευτική δράση έναντι της οξείδωσης στο πλάσμα in vitro σύστημα και επιρροή στις παραμέτρους πήξης. Τα εξετασθέντα εκχυλίσματα έδειξαν μια δραστηριότητα καθαρισμού 50-70 τοις εκατό της ισχύος του Trolox. Το εκχύλισμα OC, πλούσιο σεακτεοσίδη, είχε πάνω από 20 τοις εκατό καλύτερο αντιριζικό δυναμικό από το εκχύλισμα PR, το οποίο ήταν το μόνο που περιείχε PPG χωρίς ένα τμήμα κατεχόλης Β-δακτυλίου στη μονάδα ακυλίου. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι μόνο οκτώ PPG που δοκιμάστηκαν έδειξαν αντιοξειδωτικό δυναμικό σε ανθρώπινο πλάσμα που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με H2O2/Fe. Ωστόσο, τα τρία PPG που δοκιμάστηκαν διέθεταν αντιπηκτικό δυναμικό εκτός από αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Φαίνεται ότι η δομή των PPG, ειδικά η παρουσία ακυλικών και κατεχολικών τμημάτων, σχετίζεται κυρίως με τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες. Το αντιπηκτικό δυναμικό αυτών των ενώσεων σχετίζεται επίσης με τη χημική τους δομή. Επιλεγμένα PPG εμφανίζουν τη δυνατότητα για τη θεραπεία καρδιαγγειακών παθήσεων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες.

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

CistancheΤο tubulosa έχει πολλά αποτελέσματα

1. Εισαγωγή

Το οξειδωτικό στρες είναι ευρέως γνωστό για τις αρνητικές του επιπτώσεις στην υγεία των ζωντανών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένης της επιταχυνόμενης γήρανσης και ορισμένων μορφών καρκίνου. Η εμφάνιση οξειδωτικού στρες σχετίζεται με διαταραγμένη ισορροπία μεταξύ των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών μηχανισμών (συμπεριλαμβανομένης της ενζυμικής (καταλάσης, υπεροξειδάσης γλουταθειόνης) και της μη ενζυματικής (γλουταθειόνης) άμυνας) στα κύτταρα του σώματος [1]. Η υπερπαραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS), συμπεριλαμβανομένων των οξειδωτικών ριζών και των ειδών με κλειστό κέλυφος, είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς πίσω από το σχηματισμό οξειδωτικού στρες. Ωστόσο, η βιολογική επίδραση που προκαλείται από το ROS εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη συγκέντρωση, τον χρόνο έκθεσης και την τοποθεσία. Υπό κανονικές συνθήκες (χαμηλή συγκέντρωση), οι ρίζες οξυγόνου/αζώτου μπορούν να παίξουν το ρόλο δευτερευόντων αγγελιαφόρων, αλλά στο υψηλότερο επίπεδο, μπορεί να αρχίσουν να αντιδρούν με βιολογικές δομές, όπως οι κυτταρικές μεμβράνες [2]. Μεταξύ όλων των ειδών ROS, μια ρίζα υδροξυλίου (HO.) προκαλεί μια από τις μεγαλύτερες βλάβες στα βιο-μακρομόρια: πρωτεΐνες, λιπίδια και DNA. Το οξειδωτικό στρες είναι γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε μια σειρά ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών. Οι διαταραχές του συστήματος αίματος έχουν συσχετιστεί και/ή προηγηθεί από αλλαγές σε διάφορες παραμέτρους της αιμόστασης και των βιοδεικτών του πλάσματος [1,3].

Από την άλλη πλευρά, πολλές φυσικές ουσίες, όπως οι πολυφαινόλες και τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, έχουν αναγνωριστεί ως ισχυρά αντιοξειδωτικά ικανά να αποτρέψουν το σχηματισμό και/ή να μειώσουν τα δραστικά είδη οξυγόνου. Ενώσεις με τέτοιες ιδιότητες βρίσκονται σε πολλά προϊόντα διατροφής και φαρμακευτικά παρασκευάσματα φυτικής προέλευσης. Μια διατροφή εμπλουτισμένη με φρέσκα λαχανικά και φρούτα και αντιοξειδωτικές θεραπείες βασισμένες σε φυσικά αντιοξειδωτικά, συνιστώνται ευρέως, καθώς μπορούν να μειώσουν το επίπεδο του οξειδωτικού στρες και να αποτρέψουν διάφορες παθοφυσιολογικές διεργασίες [4,5]. Οι φυτικές πολυφαινόλες είναι μια ποικιλόμορφη ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών, μεταξύ των οποίων σημαντική θέση κατέχουν τα φαινολικά οξέα, καθώς είναι ευρέως διαδεδομένα και παρουσιάζουν ποικίλες βιολογικές επιδράσεις, όπως αντιμικροβιακές, αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις. Οι φαινυλοπροπανοειδείς γλυκοσίδες (PPGs) είναι εστερικοί συγγενείς του υδροξυκινναμωμικού οξέος και αποτελούν την κύρια/μόνη κατηγορία δευτερογενών μεταβολιτών που υπάρχουν στα ολοπαρασιτικά φυτά Orobanchaceae, συμπεριλαμβανομένωνCistanche, Orobanche και Phelipanche spp. Αρκετά είδη αυτής της οικογένειας είναι σοβαρά παράσιτα των καλλιεργειών που οι αγρότες θέλουν να απαλλαγούν από τα χωράφια (παράδειγμα Phelipanche ramosa), λίγα χρησιμοποιούνται στη φαρμακολογία, ενώ τα περισσότερα έχουν μικρή σημασία για τον άνθρωπο. HerbaCistancheχρησιμοποιείται εκτενώς στην ασιατική παραδοσιακή ιατρική για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας και ως παράγοντας ενίσχυσης του ανοσοποιητικού και μνήμης, αντιγήρανσης και αντικούρασης [6]. Οι φυτοχημικές αναλύσεις διαφόρων ερευνητικών ομάδων έχουν δείξει ότι οι φαινυλοπροπανοειδείς γλυκοσίδες, όπως το ακετονίδιο, η εχινακοσίδη και η πλευρά του podium, είναι ένα από τα κύρια δραστικά συστατικά του Herba Cistanche [7]. Μια πρόσφατη μελέτη αρκετών ειδών σκουπόκαμπου που βρέθηκαν στην Πολωνία από τους Jedrejek et al. [8] έχει δείξει ότι αυτό το φυτικό υλικό έχει παρόμοια ποιοτική σύσταση (κυριαρχία των PPG), επιπλέον, ισούται ή και υπερβαίνει τοCistanchespp. όσον αφορά την περιεκτικότητα σε δραστικές ουσίες [8].

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση του αντιριζικού και αντιοξειδωτικού δυναμικού, καθώς και της επίδρασης στις παραμέτρους αιμόστασης των τριών εκχυλισμάτων σκουπόραμπου (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA, και P. ramosa – PR) πλούσιων σε διάφορα φαινύλια. -

προστανοειδή, καθώς και τα μεμονωμένα PPG συστατικά τους. Η ικανότητα κατά των ριζών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) και 2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH ) δοκιμές. Το οξειδωτικό στρες στο σύστημα δοκιμής πλάσματος προκλήθηκε χρησιμοποιώντας μια ρίζα υδροξυλίου (H2O2/Fe), στη συνέχεια υπεροξείδωση λιπιδίων (δοκιμασία αντιδρώντων με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS)) και μετρήθηκαν το επίπεδο των πρωτεϊνικών ομάδων καρβονυλίου και θειόλης. Μεταξύ των καθορισμένων παραμέτρων της αιμόστασης ήταν: ενεργοποιημένος χρόνος μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT), χρόνος προθρομβίνης (PT) και χρόνος θρομβίνης (TT).

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Χημικά

2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλική ρίζα (DPPH), 2,2'-αζινοδις-3-αιθυλβενζθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ (ABTS), υπερθειικό κάλιο, {{9 }}υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλοχρωμάνιο-2-καρβοξυλικό οξύ (Trolox), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA), μυρμηκικό οξύ (βαθμός LC-MS), και H2O2 αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., ΗΠΑ). Μεθανόλη (βαθμίδωση HPLC) και ακετονιτρίλιο (βαθμός LC-MS) αποκτήθηκαν από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία). δέκα φαινυλ-

προπανικές ενώσεις που δοκιμάστηκαν σε αυτήν την εργασία, συμπεριλαμβανομένου του 2'-O-ακετυλακτεοζίτη (97 τοις εκατό ), του 2'-Ο-ακετυλοπολιουμοζίτη (98 τοις εκατό ), του 3-Ο-μεθυλοπολυμοζίτη (96 τοις εκατό ), του ακετονιδίου (99 τοις εκατό ), του αρένα στο εσωτερικό (97 τοις εκατό), η κρενατοσίδη (98 τοις εκατό), η τενιποσίδη (99 τοις εκατό), η πολυουμοζίδη (99 τοις εκατό), η τουμπουλοσίδη Α (96 τοις εκατό) και η βιδεμαννιοσίδη D (96 τοις εκατό) είχαν απομονωθεί προηγουμένως από εμάς από φυτικό υλικό που δεν είχε δοθεί παρακάτω [ 8]. Η καθαρότητα των ενώσεων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση UHPLC-PDA-MS. Το υπερκαθαρό νερό παρασκευάστηκε στο σπίτι χρησιμοποιώντας ένα σύστημα καθαρισμού νερού Milli-Q (Millipore Co.). Άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας και παρασχέθηκαν από εγχώριους εμπορικούς προμηθευτές.

2.2. Φυτική ύλη

Ανθοφόρα φυτά τριών ειδών σκουφοκράμβης, συμπεριλαμβανομένων των Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel και P. Ramos (L.) Pomel αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή. Renata Piwowarczyk (Πανεπιστήμιο Jan Kochanowski, Kielce, Πολωνία) και συλλέχθηκε από μια φυσική πηγή στην Πολωνία.

Δείγματα κουπονιών (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), ξηρόθερμο λιβάδι, παρασιτίζουν Galium boreale, Μάιος 2014, P. Arenaria – Zwierzyniec (50.385-02 ◦μω) αγρανάπαυση, παρασίτωση Artemisia campestris, Ιούνιος 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), field, παρασιτοποιημένο Solanum Lycopersicum, Σεπτέμβριος 2014) κατατίθενται στο Herbarium του Πανεπιστημίου Jan Kochanowski στο Kielce (KTC). Το φυτικό υλικό λυοφιλοποιήθηκε και αλέστηκε λεπτά πριν την εκχύλιση.

2.3. Παρασκευή εκχυλισμάτων σκουπόκαμπων

Το φυτικό υλικό σε σκόνη (O. Caryophyllaceae (OC) - 2 g, P. Arenaria (PA) - 3 g και P. ramosa (PR) - 3 g) εκχυλίστηκε με 80 τοις εκατό MeOH στους 40 ◦C και 1500 psi (πίεση διαλύτη ) χρησιμοποιώντας ένα ASE 200 επιταχυνόμενο

εξαγωγέας διαλύτη (Dionex, Sunnyvale, CA, ΗΠΑ). Τα εκχυλίσματα εξατμίστηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν (Gamma 2–16 LSC freeze dryer, Christ, Germany). Η απόδοση εκχύλισης για OC, PA και PR ήταν 55 τοις εκατό, 37 τοις εκατό και 43 τοις εκατό κατά βάρος του φυτικού υλικού, αντίστοιχα. Λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε υδατάνθρακες (τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα ακατέργαστα εκχυλίσματα καθαρίστηκαν περαιτέρω με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) σε μικροστήλη Oasis HLB (500 mg· Waters, Milford, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα σάκχαρα απομακρύνθηκαν με 1 τοις εκατό MeOH, στη συνέχεια οι ενώσεις που μας ενδιαφέρουν εκλούστηκαν με 80 τοις εκατό MeOH. Μετά την απομάκρυνση του διαλύτη, τα εκχυλίσματα OC, PA και PR λυοφιλοποιήθηκαν (Gamma 2–16 LSC freeze dryer) και οι αποδόσεις καθαρισμού SPE ήταν 53 τοις εκατό (OC), 67 τοις εκατό (PA) και 51 τοις εκατό (PR) .

2.4. Φυτοχημικά χαρακτηριστικά των εκχυλισμάτων σκουφοκράμπας

Πραγματοποιήθηκαν ποιοτικές και ποσοτικές αναλύσεις των εκχυλισμάτων σκουπόραμπου χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ACQUITY UPLC (Waters) συνδεδεμένο με έναν ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου (PDA) και ένα διαδοχικό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας (TQD-MS/MS). Τα λυοφιλοποιημένα εκχυλίσματα OC, PA και PR διαλύθηκαν σε 5{3}} τοις εκατό μεθανόλη σε συγκέντρωση 0,50 mg/mL και στη συνέχεια

χρωματογραφήθηκε σε στήλη BEH C18 (100 χ 2,1 mm, 1,7 μm, Waters). Οι χρωματογραφικές συνθήκες ήταν οι εξής: θερμοκρασία φούρνου – 25 ◦C,

γραμμική βαθμίδα 10→25 τοις εκατό της κινητής φάσης Β (0.1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ στο ακετονιτρίλιο) στην κινητή φάση Α (0.1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε H2O) πάνω από 12 min, ρυθμός ροής – 0,4 mL/min, όγκος έγχυσης – 2 μL, εύρος UV – 190–490 nm (ανάλυση 3,6 nm). Η ανάλυση MS πραγματοποιήθηκε σε λειτουργία αρνητικών ιόντων με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI), χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες ρυθμίσεις: εύρος σάρωσης 100–1200 m/z. τριχοειδής τάση 2,8 kV; τάση κώνου 35 V;

θερμοκρασία πηγής 150 ◦C; θερμοκρασία αποδιάλυσης 450 ◦C; ερήμωση

ροή αερίου 900 L/h, και ροή αερίου κώνου 100 L/h. Η απόκτηση και η επεξεργασία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Waters MassLynx 4.1.

Οι κορυφές του φαινυλοπροπανοειδούς γλυκοσιδίου (PPG) ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση των ληφθέντων δεδομένων LC-MS με εκείνα των προηγουμένως απομονωμένων ενώσεων [8]. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των PPG στα εκχυλίσματα σκουφοκράμβης βασίστηκε στη μέθοδο UPLC-UV με ανίχνευση στα 330 nm και μια εξωτερική τυπική βαθμονόμηση χρησιμοποιώνταςακτεοσίδη(Sigma-Aldrich, 99 τοις εκατό, HPLC) ως

ομαδικό πρότυπο. Μια γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης ετοιμάστηκε σε έξι συγκεντρώσεις εντός της περιοχής 1–200 ug/mL και έδειξε καλή γραμμικότητα (R2

0.999). Τα ποσοτικά αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή SD τριών ενέσεων και εκφράστηκαν σε χιλιοστόγραμμαακτεοσίδηισοδύναμα (eq) ανά γραμμάριο εκχυλίσματος (mgακτεοσίδηeq/g).

2.5. Αντιριζική δράση in vitro

2.5.1. Δοκιμασία ριζικής σάρωσης ABTS

Η αντιριζική δοκιμή ABTS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Kontek et al. [9], με μικρές τροποποιήσεις ως εξής: 20 τοις εκατό MeOH χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή αντιδραστηρίων (7 mM ABTS και 4,9 mM κάλιο ανά

θειικό άλας); τα διαλύματα εκχυλισμάτων OC, PA και PR, σε τέσσερα επίπεδα συγκέντρωσης στην περιοχή από 100-400 ug/mL, και διαλύματα Trolox, σε έξι επίπεδα συγκέντρωσης στην περιοχή των 10 250 ug/mL, παρασκευάστηκαν με 50 τοις εκατό MeOH. Η αναλογία του δείγματος προς το διάλυμα εργασίας ABTS ήταν 1:25 (ν/ν). Η απορρόφηση στα 734 nm μετρήθηκε μετά από 30 λεπτά επώασης

στο σκοτάδι χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-vis (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ΗΠΑ).

Η αναστολή απορρόφησης (ποσοστό ) υπολογίστηκε ως εξής: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Υπολογίστηκαν τα ισοδύναμα Trolox (ΤΕ) των εκχυλισμάτων σκουπόραμπης

χρησιμοποιώντας τον τύπο TE=msample/mstandard, όπου m είναι η κλίση της ευθείας

καμπύλες γραμμής (αναστολή απορρόφησης έναντι συγκέντρωσης). Η τιμή TE του

το δείγμα περιγράφει την κανονικοποιημένη δραστηριότητά του έναντι του Trolox (TEstandard =

1.0). Οι τιμές IC50 για τα εκχυλίσματα OC, PA και PR και το Trolox ήταν

έφτασε πειραματικά, στη συνέχεια υπολογίστηκαν από την ευθεία γραμμή τους

καμπύλες (αναστολή απορρόφησης έναντι συγκέντρωσης) και εκφράζονται σε

ug/mL.

Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται

ως μέσος όρος ± τυπικές αποκλίσεις (SD).

2.5.2. Δοκιμασία καθαρισμού ριζών DPPH

Η αντιριζική δοκιμή DPPH διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Jedrejek et al. [8] και Brand-Williams et al. [10], με μικρές τροποποιήσεις ως εξής: τα διαλύματα εκχυλισμάτων OC, PA και PR, σε τέσσερα επίπεδα συγκέντρωσης στην περιοχή 50▽ 250 ug/mL, και διαλύματα Trolox, σε έξι επίπεδα συγκέντρωσης στην περιοχή των 10▽ 250 ug/mL, παρασκευάστηκαν με 50 τοις εκατό MeOH. Η αναλογία δείγματος προς DPPH ήταν 1:19 (ν/ν). Η απορρόφηση στα 517 nm μετρήθηκε μετά από 30 λεπτά επώασης στο σκοτάδι χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-vis (Evolution 260 Bio). Η αναστολή απορρόφησης (ποσοστό ) υπολογίστηκε ως εξής: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Οι τιμές Trolox Equivalent (TE) και IC50 των δειγμάτων δοκιμής υπολογίστηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως στη δοκιμή ABTS (Ενότητα 2.5.1). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD.

2.6. Στοκ διαλύματα ελεγμένων φυτικών ενώσεων και εκχυλισμάτων για πειράματα με ανθρώπινο πλάσμα

Παρασκευάστηκαν απόθεμα διαλύματα των εξεταζόμενων ενώσεων και φυτικών εκχυλισμάτων σε 50 τοις εκατό DMSO. Η τελική συγκέντρωση του DMSO στα δείγματα που δοκιμάστηκαν ήταν χαμηλότερη από 0,05 τοις εκατό και τα αποτελέσματά του προσδιορίστηκαν σε όλα τα πειράματα.

2.7. Απομόνωση ανθρώπινου πλάσματος

Ανθρώπινο αίμα ή πλάσμα ελήφθη από έξι τακτικούς δότες (άντρες και γυναίκες μη καπνιστές) σε τράπεζα αίματος (Λοτζ, Πολωνία) και ιατρικό κέντρο (Λοτζ, Πολωνία). Το αίμα συλλέχθηκε ως διάλυμα CPD (κιτρικό/φωσφορικό/δεξτρόζη· 9:1· ν/ν αίμα/CPD) ή διάλυμα CPDA (κιτρικό/φωσφορικό/δεξτρόζη/αδενίνη· 8,5:1· ν/ν· αίμα/CPDA). Οι δότες δεν είχαν λάβει φάρμακα ή εθιστικές ουσίες (συμπεριλαμβανομένου του καπνού, του αλκοόλ και των αντιοξειδωτικών συμπληρωμάτων) για τουλάχιστον δύο εβδομάδες πριν από τη δωρεά. Η ανάλυσή μας των δειγμάτων αίματος πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Διακήρυξης του Ελσίνκι για την Έρευνα στον άνθρωπο και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Έρευνας στον Ανθρώπινο Πειραματισμό του Πανεπιστημίου του Λοτζ. Το πλάσμα παρασκευάστηκε με φυγοκέντρηση φρέσκου ανθρώπινου αίματος στα 4500x g για 25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε μετρώντας την απορρόφηση των δειγμάτων που δοκιμάστηκαν στα 280 nm, σύμφωνα με τη διαδικασία των Whitaker και Granum [11].

2.8. Δείκτες οξειδωτικού στρες στο ανθρώπινο πλάσμα

2.8.1. Μέτρηση υπεροξείδωσης λιπιδίων

Η υπεροξείδωση των λιπιδίων του πλάσματος ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της συγκέντρωσης των δραστικών ουσιών του θειοβαρβιτουρικού οξέος (TBARS). Η συγκέντρωση TBARS υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον μοριακό συντελεστή εξάλειψης (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Η μέθοδος περιγράφεται λεπτομερέστερα σε άλλα [12,13]. 2.8.2. Μέτρηση ομάδας καρβονυλίου Το επίπεδο των καρβονυλικών ομάδων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον μοριακό συντελεστή εξαφάνισης (ε=22,000 M 1 cm 1) και εκφράστηκε ως nmol καρβονυλικές ομάδες/mg πρωτεΐνης πλάσματος, σύμφωνα με τον Bartosz [ 13] και Levine et al. [14]. 2.8.3. Προσδιορισμός ομάδας θειόλης Η περιεκτικότητα της ομάδας θειόλης στις πρωτεΐνες του πλάσματος μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Γερμανία) με απορρόφηση στα 412 nm με 5,5'-διθειόλη-δις-(2- νιτροβενζοϊκό οξύ). Η μέθοδος περιγράφεται με περισσότερες λεπτομέρειες αλλού [15-17].

2.9. Παράμετροι αιμόστασης

2.9.1. Η μέτρηση του χρόνου προθρομβίνης (PT)

Το PT προσδιορίστηκε πηκτομετρικά χρησιμοποιώντας οπτική πήξη

Τα γράμματα υποδεικνύουν τα αποτελέσματα της δοκιμής του Tukey (p < 0.05), τιμές με το ίδιο

γράμμα μέσα σε μια σειρά δεν διαφέρει σημαντικά.

2.9.2. Η μέτρηση του χρόνου θρομβίνης (TT)

Το ΤΤ προσδιορίστηκε πηκτομετρικά χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή οπτικής πήξης (μοντέλο Κ-3002, Kselmed, Grudziadz, Πολωνία), σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Malinowska et al. [18].

2.9.3. Η μέτρηση του χρόνου ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT)

Το APTT προσδιορίστηκε πηκτομετρικά χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή οπτικής πήξης K-3002 (Kselmed, Grudziadz, Πολωνία) σύμφωνα με τους Mali now ska et al. [18].

2.10. Ανάλυση δεδομένων Η δοκιμή Q-Dixon πραγματοποιήθηκε για την εξάλειψη αβέβαιων δεδομένων.

Τα δεδομένα δοκιμάστηκαν για κανονική κατανομή με το τεστ Shapiro-Wilk και ισότητα διακύμανσης με το τεστ Levene. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας ANOVA, ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey ή τη δοκιμή Kruskal-Wallis. Οι συγκρίσεις θεωρήθηκαν σημαντικές στο p < 0.05.="" οι="" τιμές="" παρουσιάζονται="" ως="" μέσοι="" όροι="" ±="">