Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* και Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Μεταπτυχιακό Ινστιτούτο Νευροαναγεννητικής Ιατρικής, Κολλέγιο Ιατρικής Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Ταϊπέι, Ταϊπέι 11031, Ταϊβάν

2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taiwan

4 Κέντρο Ερευνών Κλινικής Ιατρικής, Εθνικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Cheng Kung, Κολλέγιο Ιατρικής, Εθνικό Πανεπιστήμιο Cheng Kung, Tainan 70403, Ταϊβάν

5 Τμήμα και Μεταπτυχιακό Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Επιστημών, Κολλέγιο Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Chang Gung, Taoyuan 33302, Ταϊβάν

6 Κέντρο Ερευνών Νευροεπιστημών, Νοσοκομείο Chang Gung Memorial, Linkou 33302, Ταϊβάν

7 Επικεφαλής επαφής

*Αλληλογραφία: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Η φαινοτυπική παραλλαγή είναι θεμελιώδης προϋπόθεση για την εξέλιξη των κυττάρων και των οργανισμών μέσω φυσικής επιλογής. Ενώ ο ρόλος της έκφρασης στοχαστικού γονιδίου στη φαινοτυπική ποικιλομορφία γενετικά πανομοιότυπων κυττάρων είναι καλά μελετημένος, δεν είναι γνωστά πολλά σχετικά με τη σχέση μεταξύ έκφρασης στοχαστικού γονιδίου και ατομικής διαφοροποίησης συμπεριφοράς στα ζώα. Αποδεικνύουμε ότι ένα συγκεκριμένο miRNA (miR-466f-3p) ρυθμίζεται προς τα πάνω στον ιππόκαμπο ενός τμήματος μεμονωμένων αμιγών ποντικών σε μια εργασία υδάτινου λαβύρινθου Morris. Σημαντικά, το miR- 466f-3p ρυθμίζει θετικά τη μορφολογία, τη λειτουργία και τη χωρική μάθηση των νευρώνων καιμνήμηικανότητα των ποντικών. Μηχανιστικά, το miR-466f-3p καταστέλλει τη μετάφραση του MEF2A, ενός αρνητικού ρυθμιστή της μάθησης/μνήμη. Τέλος, δείχνουμε ότι η ποικίλη ανοδική ρύθμιση του miR-466f-3 του ιππόκαμπου προκύπτει από τυχαιοποιημένη φωσφορυλίωση της δέσμευσης στοιχείων απόκρισης κυκλικής AMP (cAMP) του ιππόκαμπου (CREB) σε άτομα. Αυτό το εύρημα της διαμόρφωσης της χωρικής μάθησης καιμνήμημέσω ενός τυχαιοποιημένου άξονα σηματοδότησης ιππόκαμπου κατά τη νευρωνική διέγερση αντιπροσωπεύει μια επίδειξη του τρόπου με τον οποίο η παραλλαγή στην έκφραση του γονιδίου των ιστών οδηγεί σε ποικίλη συμπεριφορά των ζώων.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η φαινοτυπική διακύμανση μεταξύ των ατόμων προσδίδει ένα εξελικτικό πλεονέκτημα δεδομένου ότι παρέχει την ποικιλομορφία του πληθυσμού στην οποία δρα η φυσική επιλογή (Pavlicev et al., 2011). Το γενετικό υπόβαθρο και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες συμβάλλουν στη δημιουργία μιας τέτοιας φυσικής διαφοροποίησης (Bendesky and Bargmann, 2011). Πειραματικά, ποντίκια που έχουν εξομοιωθεί με την φυλή έχουν χρησιμοποιηθεί συχνά για τη μελέτη της μοριακής και κυτταρικής βάσης των μέσων φαινοτύπων και συμπεριφορών, ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι επιπτώσεις των γενετικών διαφορών μεταξύ των ατόμων που δοκιμάστηκαν (Casellas, 2011). Ωστόσο, διακύμανση της αφθονίας μεταγραφής ιστού έχει δειχθεί μεταξύ μεμονωμένων ισογονικών ποντικών. Τα γονίδια που παρουσιάζουν εξαιρετικά μεταβλητά επίπεδα έκφρασης σχετίζονται συχνά με τη λειτουργία του ανοσοποιητικού, τις αντιδράσεις στο στρες και την ορμονική ρύθμιση, δηλαδή με διαδικασίες ευαίσθητες σε περιβαλλοντικά στοιχεία (Vedell et al., 2011). Μερικές από αυτές τις μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι διαφορές στη γονιδιακή έκφραση ή την κυτταρική σηματοδότηση, με ή χωρίς την επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων όπως το γλείψιμο της μητέρας, η παροχή θρεπτικών συστατικών στη μήτρα ή η ανθεκτικότητα που προκαλείται από το στρες έναντι της ευαισθησίας (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011· Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές σε φαινοτύπους και συμπεριφορές (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Χωρική μάθηση καιμνήμηο σχηματισμός που ελέγχεται από τον εγκέφαλο μπορεί να χωριστεί σε δύο συστήματα: (1) εγωκεντρική πλοήγηση που χρησιμοποιεί αυτοκίνηση και εσωτερικά σημάδια και (2) αλλοκεντρική πλοήγηση που περιλαμβάνει κυρίως τον ιππόκαμπο και τις κοντινές δομές του εγκεφάλου που διεγείρονται από απομακρυσμένα σημάδια έξω από τους οργανισμούς (Ekstrom et al., 2014). Η ικανότητα της χωρικής μάθησης καιμνήμηεπιτρέπει στα περισσότερα είδη ζώων να προσαρμόζουν προοδευτικά τις συμπεριφορές τους ώστε να προσαρμόζονται σε χωρικά και χρονικά μεταβλητά περιβάλλοντα, κάτι που είναι κρίσιμο για την επιβίωσή τους. Αυτό μπορεί να εκτιμηθεί σε πειραματόζωα με την εφαρμογή παραδειγμάτων συμπεριφοράς όπως ο υδάτινος λαβύρινθος Morris (MWM) (Vorhees and Williams, 2014). Συγκεκριμένα, γενετικά πανομοιότυπα τρωκτικά έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν φαινοτυπικές διακυμάνσεις στη χωρική μάθηση καιμνήμη(Tsai et al., 2002), αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί αυτής της παραλλαγής συμπεριφοράς παρέμειναν άγνωστοι.

Ο σχηματισμός νέων αναμνήσεων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί γονιδιακή μεταγραφή που εξαρτάται από τη δραστηριότητα, σύνθεση νέας πρωτεΐνης και

Εικόνα 1. Συσχέτιση μεταξύ της διακύμανσης της χωρικής μάθησης καιμνήμηικανότητα και miR-466f-3p επαγωγή

(Α) Έργο MWM ποντικών άγριου τύπου αμιγούς C57BL/6J. Αριστερό πλαίσιο: Επιδόσεις MWM ποντικών GLN (κουκκίδες) και ποντικών PLN (τετράγωνα). Από ένα σύνολο 289 ποντικών που δοκιμάστηκαν, 180 κατηγοριοποιήθηκαν ως GLNκαι109asPLN.Δεξί πλαίσιο:probetestoftheMWMtask(n=47και30κάθεομάδα).Οι μετρήσεις σε ένα από τα τέσσερα τεταρτημόρια και η περιοχή της πλατφόρμας συγκρίνονται στο ιστόγραμμα. P, θέση της πλατφόρμας που λείπει. T, ζώνη στόχος χωρίς P; R, δεξιά ζώνη. O, αντίθετη ζώνη. L, αριστερή ζώνη. (Β) Ανάλυση RT-qPCR της έκφρασης miRNA. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης έξι miRNAs που βρίσκονται εντός του συμπλέγματος miR-466-669 και του miR-132-3p, ως θετικού ελέγχου εμπλουτισμένου με εγκέφαλο, αναλύθηκαν και κανονικοποιήθηκαν με εσωτερικό μάρτυρα U6 snRNA από ιππόκαμπο ποντικού GLN και PLN (n=9–18 ανά ομάδα). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3σελ.

λεπτομερώς συντονισμένη συγκεκριμένη νευρωνική δικτύωση ωςμνήμηεγγράμματα για τη δημιουργία νέων νευρωνικών συνδέσεων και παρατεταμένης πλαστικότητας (Asok et al., 2019). Τα εγγράμματα του ιππόκαμπου, τα οποία είναι αραιοί πληθυσμοί νευρώνων στην οδοντωτή έλικα (DG), αντιπροσωπεύουν σύνολα νευρώνων που εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα μετάμνήμησχηματισμός. Ενώ οι νευρώνες DG engram εμφανίζουν ένα εξαιρετικά διακριτό μοτίβο γονιδιακής έκφρασης (Rao-Ruiz et al., 2019), οι ειδικοί για το έγγραμμα μοριακοί μηχανισμοί που υποκρύπτονταιμνήμηενοποίηση παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Διάφοροι παράγοντες και μονοπάτια σηματοδότησης είναι γνωστό ότι είτε θετικά είτε αρνητικά ρυθμίζουν τη μάθηση καιμνήμηέχουν εντοπιστεί διαδικασίες (Abraham et al., 2019; Humeau and Choquet, 2019). Μεταξύ αυτών, η ενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης που δεσμεύει το στοιχείο απόκρισης κυκλικής AMP (cAMP) (CREB) διεγείρει τη γονιδιακή μεταγραφή ως απόκριση σε αυξήσεις που εξαρτώνται από τη δραστηριότητα του ενδοκυτταρικού Ca2 συν στους νευρώνες (Kandel, 2012). Από την άλλη πλευρά, το camp/PKApathway καταστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα του παράγοντα ενίσχυσης μυοκυττάρων 2 (MEF2) εμποδίζοντας την πυρηνική εξαγωγή του συν-κατασταλτή του, HDAC5, και την πυρηνική εισαγωγή του συνενεργοποιητή NFAT (Belfield et al., 2006). Επιπλέον, σε αντίθεση με το CREB, το MEF2A περιορίζει τη δραστηριότηταμνήμησχηματισμός (Cole et al., 2012). Εκτός από τους πρωτεϊνικούς παράγοντες, τα microRNA (miRNAs) εμπλέκονται επίσης στη ρύθμιση των νευρωνικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της μάθησης και της μνήμης (McNeill και Van Vactor, 2012). Τα miRNA είναι μικρά (22 nt) μη κωδικοποιητικά RNA που κατά κύριο λόγο ενεργούν μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης μέσω ζευγών βάσεων ειδικής για αλληλουχία με τις θέσεις αναγνώρισής τους στις 30 αμετάφραστες περιοχές (30 UTRs) των ειδικών mRNAs ga2ard17,D. Τα miRNA συμμετέχουν σε μια σειρά από μονοπάτια σηματοδότησης σε μεταμιτωτικούς νευρώνες και μεσολαβούν σε εξαρτώμενες από τη δραστηριότητα κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της δενδριτικής ανάπτυξης και διακλάδωσης, του σχηματισμού συνάψεων και της ωρίμανσης. Ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων, παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο σε μακροχρόνιες μορφές συναπτικής πλαστικότητας που αποτελούν τη βάσημνήμησχηματισμός, ανάκτηση και ενοποίηση (Chen and Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Στη συνέχεια, παρουσιάζουμε στοιχεία για μια αιτιολογική σχέση μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου του στοχαστικού ιστού και της ατομικής διαφοροποίησης της συμπεριφοράς στα ζώα. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι η στοχαστική ενεργοποίηση ενός άξονα ιππόκαμπου CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A ρυθμίζει την ατομική παραλλαγή της χωρικής μάθησης καιμνήμηικανότητα σε αμιγή ποντίκια.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ατομική παραλλαγή της χωρικής μάθησης καιμνήμηη ικανότητα συσχετίζεται με την επαγωγή miR-466f-3p από ένα συγκεκριμένο σύμπλεγμα miRNA

Για τον εντοπισμό miRNA που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μάθησης καιμνήμησχηματισμό, χρησιμοποιήσαμε την εργασία MWM για να διακρίνουμε ποντίκια άγριου τύπου C57BL/6J με καλή ή κακή ικανότητα μάθησης και μνήμης (Εικόνα 1Α). Ορίσαμε τα ποντίκια που ολοκλήρωσαν την εργασία εντός 30 δευτερολέπτων στην τελευταία (6η) συνεδρία ως «καλοί μαθητές» (GLN), ενώ τα ποντίκια που δεν μπορούσαν να βρουν την πλατφόρμα εντός 30 δευτερολέπτων στην τελευταία συνεδρία θεωρήθηκαν «κακοί μαθητές» (PLN). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α (αριστερό πλαίσιο), το 62 τοις εκατό των ποντικών ανήκε στην ομάδα GLN (180 από 289 ποντίκια), παρουσιάζοντας αξιοσημείωτη μείωση στον λανθάνοντα χρόνο διαφυγής από 98,1 δευτ. (1η συνεδρία) σε 21,8 δευτ. (6η συνεδρία). Αντίθετα, η καθυστέρηση διαφυγής του υπόλοιπου 38 τοις εκατό των ποντικών, της ομάδας PLN (109 από 289 ποντίκια), μειώθηκε μόνο μετρίως μεταξύ της πρώτης και της έκτης συνεδρίας (από 111,8 δευτ. στην 1η συνεδρία σε 82,1 δευτ. στην 6η συνεδρία). . Το τεστ ανιχνευτή, που δείχνει ότι τα ποντίκια είχαν πράγματι μάθει την εργασία στις έξι συνεδρίες, έδειξε επίσης ότι τα ποντίκια GLN παρέμειναν περισσότερο στην περιοχή της πλατφόρμας από τα ποντίκια PLN (Εικόνα 1Α, αριστερό ζεύγος ράβδων στο δεξιό πλαίσιο).

Στη συνέχεια, αναλύσαμε RNA από τον ιππόκαμπο ποντικών GLN και PLN με υβριδισμό μικροσυστοιχιών miRNA (n=4 κάθε ομάδα). Γενικά, παρατηρήσαμε σχετικά μικρές διαφορές στα προφίλ έκφρασης των miRNA του ιππόκαμπου από ποντίκια GLN και PLN. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι τα κορυφαία 10 miRNA για τα οποία τα επίπεδα έκφρασης ήταν υψηλότερα σε ποντίκια GLN από ποντίκια PLN (δεδομένα δεν εμφανίζονται) προέρχονταν όλα από το ίδιο ειδικό για τρωκτικό σύμπλεγμα miRNA, miR-466-669, που βρίσκεται στο εσώνιο 10 του το γονίδιο mSfmbt2 (βλ. παρακάτω). Με βάση την ανάλυση ανάστροφης μεταγραφής-ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-qPCR) των επιπέδων έκφρασης επιλεγμένων miRNAs στο σύμπλεγμα, επιλέξαμε το miR-466f-3p για περαιτέρω διερεύνηση (Εικόνα 1Β). Η μέση έκφραση αυτού του miRNA ήταν 1.{12}}φορά μεγαλύτερη στον ιππόκαμπο των ποντικών GLN σε σχέση με τα ποντίκια PLN. Συγκεκριμένα, τα μέσα επίπεδα miR-466f-3p του ιππόκαμπου ήταν παρόμοια μεταξύ της ομάδας PLN, της ομάδας ελέγχου στο σπίτι (HC) και της ομάδας ελέγχου κολύμβησης (Εικόνα 1C), αποκλείοντας έτσι τις επιπτώσεις που σχετίζονται με την άσκηση κατά τη διάρκεια κολύμβηση και περαιτέρω υποστήριξη της ιδέας ότι το miR-466f-3p προκλήθηκε κατά τη διάρκεια της χωρικής μάθησης καιμνήμησχηματισμός.

Στο Σχήμα 1Γ, τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-466f-3p του ιππόκαμπου πάνω από το 42 τοις εκατό των ποντικών GLN ήταν τουλάχιστον 1.5-φορές υψηλότερα από το μέσο επίπεδο έκφρασης Ποντίκια ελέγχου HC, ενώ τα επίπεδα στο 15 τοις εκατό των ποντικών PLN ήταν τα μισά από αυτά των ποντικών HC. Περίπου το 25 τοις εκατό των ποντικών GLN και το 55 τοις εκατό των ποντικών PLN είχαν παρόμοια επίπεδα miR-466f{{10}}p (0.8- έως 1.2- διπλώνει σε σχέση με HC). Το διάγραμμα διασποράς συσχέτισης Pearson που δείχνει μια θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων miR-466f{-3p και της ποσοστιαίας διάρκειας στην πλατφόρμα κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανιχνευτή παρουσιάζεται στο Σχήμα 1Δ. Πραγματοποιήσαμε επίσης miR-466f-3p και U6 μικρού πυρηνικού RNA (snRNA) in situ υβριδισμό (ISH) των τμημάτων του εγκεφάλου σε ποντικούς GLN και PLN (Εικόνα 1Ε). Η στατιστική ανάλυση των σημάτων miR{- 466f{-3p μέσω ISH επιβεβαίωσε ότι η επαγωγή του miR-466f{- 3p ήταν πράγματι μεγαλύτερη στο DG των ποντικών GLN σε σχέση με αυτό του

ποντίκια PLN, ενώ δεν βρέθηκε διαφορά όταν συγκρίθηκαν τα σήματα U6 snRNA (δεξιό ιστόγραμμα, Εικόνα 1Ε). Αν και τα σήματα miR-466-3p δεν ήταν ίσα μεταξύ των μεμονωμένων κοκκωδών κυττάρων στο DG, εξακολουθούσαν να αυξάνονται σημαντικά και πανταχού παρόντα στον ιππόκαμπο των ποντικών GLN σε σύγκριση με τα ποντίκια PLN. Ως εκ τούτου, η επαγωγή miR-466f-3p δεν συνέβη μόνο σε ένα μικρό τμήμα κυττάρων, π.χ. στους νευρώνες του εγγράμματος. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανοδική ρύθμιση του miR{-466f-3p κατά τη διάρκεια της εργασίας MWM συνδέεται στενά με καλύτερη χωρική μάθηση καιμνήμηικανότητα σε ένα σημαντικό ποσοστό ποντικών GLN.

Αναλύσαμε επίσης τα μέσα επίπεδα έκφρασης πολλών miRNA που είναι ειδικά για τον εγκέφαλο με RT-qPCR. Μεταξύ αυτών, το miR-132-3p ρυθμίστηκε προς τα πάνω στον ιππόκαμπο του ποντικιού μετά την εργασία MWM, αλλά δεν παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων GLN και PLN (ζεύγος ράβδων VII, Εικόνα 1Β). Τα επίπεδα έκφρασης των miR-335-5p και miR-22 ήταν παρόμοια μεταξύ των ομάδων GLN, PLN και HC (Εικόνα S1A). Έτσι, σε αντίθεση με το miR-466f-3p, η έκφραση του ιππόκαμπου αυτών των miRNA κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης MWM δεν συσχετίζεται με τη χωρική μάθηση καιμνήμηικανότητα των ποντικών.

Η ανοδική ρύθμιση του miR-466f-3p προάγει την ανάπτυξη νευριτών και τον σχηματισμό δενδριτικής σπονδυλικής στήλης

Για να επιβεβαιώσουμε ότι το miR-466f-3p εκφραζόταν πράγματι σε νευρώνες, πραγματοποιήσαμε το miRNA ISH σε συνδυασμό με χρώση ανοσοφθορισμού (IF) του NeuN και του MAP2 στους πρωτογενείς νευρώνες του ιππόκαμπου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρόμοια με άλλα miRNAs (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), το miR-466f-3p εκφράστηκε κυρίως στην περιοχή του νευρωνικού σώματος, με ορισμένα πρόσθετα σήματα στους δενδρίτες (Εικόνα S2A). Για να κατανοήσετε τη μοριακή και την κυτταρική βάση της συσχέτισης του ρυθμισμένου miR-466f-3p με τη μάθηση καιμνήμησχηματισμό, πρώτα υπερεκφράσαμε παροδικά miR-466f{-3p μαζί με ένα πολυπεπτίδιο σύντηξης dsRed υπό τον έλεγχο του προαγωγέα ουβικιτίνης από το pFUGW-miR-466f-3p- dsRed πλασμίδιο στους πρωτεύοντες νευρώνες του ιππόκαμπου DIV10 (Εικόνα S2B). Μέσω του miRNA ISH, επιβεβαιώσαμε ότι το σήμα miR-466f-3p είναι ισχυρότερο στην ομάδα υπερέκφρασης miR{-466f{-3p σε σχέση με τον έλεγχο φορέα ή το μεταλλαγμένο miR{{ 12}}f-3p ομάδα (βέλη, Εικόνα S2B). Παράλληλα, δημιουργήσαμε επίσης μια πλατφόρμα για να εξετάσουμε την επίδραση της απώλειας λειτουργίας miR{-466f-3p από την αναστολή miR-466f-3p χρησιμοποιώντας το σφουγγάρι miR που βρίσκεται στο τα 30 UTR του mRNA του EGFP που εκφράζονται από το πλασμίδιο pFUGW-miR-σπόγγος-EGFP (Εικόνα S2C). Ο ανταποκριτής EGFP στο πλασμίδιο σφουγγαριού χρησίμευσε τόσο ως δείκτης της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης όσο και ως αισθητήρας της κυτταρικής δραστηριότητας miRNA (Kluiver et al., 2012). Σε ένα σημαντικό τμήμα των επιμολυσμένων κυττάρων HEK293T, το σήμα EGFP μειώθηκε κατά τη συνέκφραση με άγριου τύπου miR{-466f{-3p, αλλά όχι με μεταλλαγμένο miR-466f{{32 }}p, λόγω αναστολής της μετάφρασης mRNA του EGFP με δέσμευση του miR-466f-3p στο σπόγγο miR- στο 30 UTR (συγκρίνετε τις αριστερές τέσσερις εικόνες και δύο προγράμματα του, Εικόνα S2C) . Αντίθετα, δεν παρατηρήσαμε μειωμένο σήμα EGFP κατά τη συνέκφραση του σπόγγου ελέγχου που κωδικοποιεί οκτώ αντίγραφα μιας κωδικοποιημένης αλληλουχίας από το πλασμίδιο pFUGW-SCR- sponge-EGFP είτε με miR-466f-3p ή το μεταλλαγμένο του (συγκρίνετε τις σωστές τέσσερις εικόνες και δύο ιστογράμματα).

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, η έκτοπη έκφραση του miR-466f-3p είχε ως αποτέλεσμα μορφολογικές αλλαγές των νευρώνων, με πιο αξιοσημείωτη αύξηση της ανάπτυξης νευρίτη σε σχέση με τους νευρώνες ελέγχου που διαμολύνθηκαν με τον φορέα pFUGW- που εκφράζει dsRed dsRed ή μεταλλαγμένο miR-466f-3p-εκφράζοντας πλασμίδιο pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Τα δεδομένα ποσοτικού προσδιορισμού έδειξαν ότι ο μέσος αριθμός δενδριτικών διακλαδώσεων ανά νευρώνα δεν ήταν σημαντικά διαφορετικός μεταξύ της ομάδας υπερέκφρασης miR-466f-3p-υπερέκφρασης (bar II) και του φορέα ή του μεταλλαγμένου ελέγχου (γραμμές I και III) (δεξιά άνω ιστόγραμμα, Εικόνα 2Α). Ωστόσο, το μέσο συνολικό μήκος δενδρίτη και το μέσο μήκος των πρωτογενών δενδριτών αυξήθηκαν κατά την υπερέκφραση miR-466f-3p (συγκρίνετε τη γραμμή II με τις ράβδους I και III, δεξιά κάτω ιστόγραμμα του Σχήματος 2Α). Παράλληλα, αναστέλλαμε το ενδογενές miR-466f-3p χρησιμοποιώντας το σπόγγο miR. Όπως φαίνεται, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό δενδριτικών κλάδων μεταξύ των ομάδων αναστολής miR{{-466f{-3p και ελέγχου (συγκρίνετε τη γραμμή IV με τις ράβδους I και V, επάνω δεξιό ιστόγραμμα, Εικόνα 2Α) , αλλά η ομάδα miR-466f-3p-αναστολής εμφάνισε μια αξιοσημείωτη μείωση στο μέσο συνολικό μήκος δενδρίτη καθώς και στο μέσο μήκος των πρωτογενών και δευτερευόντων δενδριτών σε σχέση με άλλες ομάδες (συγκρίνετε τη γραμμή IV με τις ράβδους I και V, δεξιά κάτω ιστόγραμμα της Εικόνας 2Α). Επιπλέον, η χρώση IF έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR{- 466f-3p, αλλά όχι η αναστολή, αύξησε επίσης την πυκνότητα των δενδριτικών σπονδύλων (Εικόνα 2Β, άνω πάνελ και κάτω αριστερό ιστόγραμμα). Πραγματοποιήσαμε επίσης συν-χρώση για την πρωτεΐνη μετασυναπτικής πυκνότητας 95 (PSD-95) και μετρήσαμε την πυκνότητα των εντοπισμένων δενδριτικών σπονδύλων για να καθορίσουμε ακριβείς αριθμούς διεγερτικών συνάψεων (Εικόνα 2Β, κάτω δεξιά ιστόγραμμα), που αποκάλυψε ότι miR{{40 Η υπερέκφραση }}f-3p αύξησε την πυκνότητα των θετικών σπονδύλων PSD-95-σε σύγκριση με άλλες ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, η αναστολή του miR-466f-3p δεν άλλαξε σημαντικά την πυκνότητα των θετικών σπονδύλων PSD-95-σε σχέση με αυτήν των ομάδων ελέγχου (Εικόνα 2Β, κάτω δεξιά ιστόγραμμα). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι απουσία νευρωνικής διέγερσης, η αναστολή του miR-466f-3p από μόνη της δεν επηρεάζει τις πυκνότητες των διεγερτικών συνάψεων ή τις ολικές δενδριτικές σπονδυλικές στήλες.