Παράσιτα, λοιμώξεις και εμβολιασμός σε συνθετικά ελάχιστα κύτταρα

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ: Τα συνθετικά ελάχιστα κύτταρα παρέχουν ένα ελεγχόμενο και μηχανικό μοντέλο για βιολογικές διεργασίες. Αν και πολύ πιο απλά από οποιοδήποτε ζωντανό φυσικό κύτταρο, τα συνθετικά κύτταρα προσφέρουν ένα πλαίσιο για τη διερεύνηση των χημικών θεμελίων βασικών βιολογικών διεργασιών. Εδώ, δείχνουμε ένα συνθετικό κυτταρικό σύστημα με κύτταρα ξενιστές, που αλληλεπιδρούν με παράσιτα και υφίστανται λοιμώξεις διαφορετικής σοβαρότητας. Δείχνουμε πώς ο ξενιστής μπορεί να κατασκευαστεί ώστε να αντιστέκεται στη μόλυνση, διερευνούμε το μεταβολικό κόστος της αντίστασης και δείχνουμε έναν εμβολιασμό που ανοσοποιεί τον ξενιστή έναντι παθογόνων. Η εργασία μας επεκτείνει την εργαλειοθήκη μηχανικής συνθετικών κυττάρων επιδεικνύοντας αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου και μηχανισμούς για την απόκτηση ανοσίας. Αυτό φέρνει τα συστήματα συνθετικών κυττάρων ένα βήμα πιο κοντά στην παροχή ενός ολοκληρωμένου μοντέλου περίπλοκης, φυσικής ζωής.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τις τελευταίες δεκαετίες, το πεδίο της συνθετικής βιολογίας έχει εκραγεί, επιτρέποντας την κατασκευή συνθετικών κυττάρων που μοιάζουν και μοντελοποιούν πτυχές της φυσικής βιολογικής ζωής. Η μοντελοποίηση κυτταρικών μονοπατιών και συμπεριφορών σε συνθετικά κύτταρα προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα ζωντανά κύτταρα, όπως ένα πιο απλοποιημένο και καθορισμένο περιβάλλον αντίδρασης, πλήρης έλεγχος της πρωτεωμικής και χημικής σύνθεσης του κυττάρου, η ικανότητα διαμερισματοποίησης παρεμβαλλόμενων βιολογικών οδών και διεργασιών, καθώς και διατήρηση σημαντικά βιολογικά συστήματα που απουσιάζουν στα συστήματα αντίδρασης in vitro.1,2 Αυτά τα μοναδικά πλεονεκτήματα των τεχνολογιών συνθετικών κυττάρων έχουν ήδη επιτρέψει την προσομοίωση βιολογικών συνθηκών και οδών μέσα σε έναν ζωντανό βιοαντιδραστήρα in vitro (συνθετικό κύτταρο) και έφεραν μια καλύτερη κατανόηση του πολλοί τομείς μελέτης, συμπεριλαμβανομένου του μοριακού συνωστισμού,3 δυναμική λιπιδίων-πρωτεϊνών,4 ελάχιστος μεταβολισμός,5 και πολλές άλλες κρίσιμες πτυχές της βιολογικής ζωής.2 Αυτά τα συνθετικά κύτταρα που μοιάζουν με τη ζωή με τα μοναδικά τους πλεονεκτήματα γίνονται γρήγορα καλύτερα μοντέλα και ρίχνουν περισσότερο φως σε Οι μυστηριώδεις εσωτερικές λειτουργίες της κυτταρικής ζωής.6,7 Αυτές οι ανακαλύψεις δεν περιορίζονται σε μονοκύτταρες διαδικασίες. Οι μηχανικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ πληθυσμών λιποσωμάτων έχουν επίσης αποδειχθεί μια ισχυρή τεχνολογία. Για παράδειγμα, ο σχεδιασμός ενός συνθετικού κυτταρικού συστήματος που μιμείται μια σχέση θηρευτή-θηράματος έχει αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας το φως ως σήμα μεταξύ αυτών των συνθετικών πληθυσμών κυττάρων. Επιτρέποντας στον φθορισμό να εξαπλωθεί με χωρικό τρόπο μεταξύ του πληθυσμού.9 Εκτός από τις αλληλεπιδράσεις συνθετικών κυττάρων-συνθετικών κυττάρων, έχουν υπάρξει πρόσφατες εξελίξεις και στις διεπαφές συνθετικών κυττάρων-ζωντανών κυττάρων. Για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι ένα συνθετικό κύτταρο που έχει σχεδιαστεί για διασύνδεση με ένα νευρικό βλαστοκύτταρο είναι σε θέση να προκαλέσει νευρική διαφοροποίηση καθώς και να λειτουργεί ως γενικευμένο πλαίσιο ικανό να διασυνδέεται με άλλους τύπους κυττάρων.10 Υπήρξαν αμέτρητες εξελίξεις στην ανάπτυξη της διάδοσης σήματος και των συνθετικών κυττάρων που λειτουργούν ως διεπαφές, πολλά από τα οποία διερευνώνται στις ακόλουθες ανασκοπήσεις.11−13 Εν ολίγοις, υπάρχουν ολόκληρα πεδία έρευνας που ασχολούνται με τη μίμηση των αλληλεπιδράσεων των κυτταρικών πληθυσμών στο μοντέλο συστήματος των συνθετικών κυττάρων. Παρόλα αυτά, δεν έχει υπάρξει μελέτη που να χρησιμοποιεί συνθετικά κύτταρα για να μοντελοποιήσει τη μόλυνση, τον παρασιτισμό ή τον εμβολιασμό. Ακριβώς όπως τα συνθετικά κύτταρα χρησιμοποιούνται συνήθως για τη μοντελοποίηση πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών με απλοποιημένο και ελεγχόμενο τρόπο, υπάρχει η δυνατότητα να μοντελοποιηθούν αυτές οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των οργανισμών. Η σημασία αυτού μπορεί να φανεί στην πρωτοποριακή μελέτη που παρήγαγε με επιτυχία ενεργά σωματίδια φάγου σε μια πλατφόρμα έκφρασης πρωτεΐνης χωρίς κύτταρα.14 Στόχος μας είναι να φέρουμε αυτή την ιδέα σε μακροεπίπεδο σχεδιάζοντας συνθετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς που μπορούν να μολύνουν ενεργά ο ένας τον άλλον και να πειράζουν γονιδίωμα ενός κυττάρου ξενιστή, όπως ακριβώς κάνουν οι ζωντανοί ιοί και τα παράσιτα. Η δυνατότητα εφαρμογής και κατασκευής συνθετικών κυττάρων για τη μοντελοποίηση αυτών των συμπεριφορών ασθενειών θα προσφέρει ένα πολύτιμο εργαλείο στην επιστημονική κοινότητα.

Σε αυτή την εργασία, παρουσιάζουμε το σύστημά μας για μοντελοποίηση συνθετικών κυτταρικών ασθενειών. Κατασκευάσαμε ένα κύτταρο ξενιστή που θα μπορούσε να υποστεί μόλυνση από τον δεύτερο πληθυσμό παρασιτικών συνθετικών κυττάρων και ερευνήσαμε τον ανταγωνισμό πόρων, την πειρατεία του γονιδιώματος και τον μεταβολικό επαναπροσδιορισμό που συμβαίνει κατά τη διάρκεια μιας τέτοιας μόλυνσης. Επίσης, μοντελοποιούμε μια μέθοδο που επιτρέπει τη διάσωση του ξενιστή μετά τη μόλυνση, καθώς και ένα μέσο εμβολιασμού που θα επιτρέψει στον ξενιστή να αντισταθεί στη μόλυνση των συνθετικών κυττάρων που προκαλούν ασθένεια. Εν ολίγοις, παρουσιάζουμε ένα νέο μοντέλο σασί ασθένειας και μόλυνσης για συνθετικά κύτταρα. Με αυτήν την τεχνολογία, τα συνθετικά κύτταρα μπορούν να αρχίσουν να χρησιμοποιούνται ως υποτυπώδη μοντέλα για ασθένειες, λοιμώξεις και ενοφθαλμισμό (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Σύστημα παρασίτου, μόλυνσης και εμβολιασμού σε συνθετικά ελάχιστα κύτταρα. (α) Ο "ξενιστής" είναι ένα συνθετικό κύτταρο που εκφράζει την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Στην επιφάνεια της εξωτερικής μεμβράνης, ο ξενιστής φέρει ετικέτες ssDNA. Οι μόνες πρωτεΐνες που μεταφράζονται σε έναν υγιή ξενιστή είναι οι πρωτεΐνες του ίδιου του ξενιστή από τα πλασμίδια με τα οποία δημιουργήθηκε ο ξενιστής. (β) Το "παράσιτο" είναι ένα λιπόσωμα γεμάτο με πλασμιδικό DNA που κωδικοποιεί ένα γονίδιο για τη φθορίζουσα πρωτεΐνη mCherry, και η επιφάνεια του λιποσώματος παρασίτου είναι διακοσμημένη με ετικέτα ssDNA (συμπληρωματική της ετικέτας στην επιφάνεια του ξενιστή). Η «μόλυνση» ξεκινά με μια σύντηξη των λιποσωμάτων του ξενιστή και του παρασίτου, με τη μεσολάβηση των συμπληρωματικών σημάτων DNA στην επιφάνειά τους. Μετά τη μόλυνση, ο ξενιστής εκφράζει τόσο το αρχικό γονίδιο ξενιστή (GFP) όσο και το γονίδιο του παρασίτου (mCherry). (γ) Η "μόλυνση" ξεκινά με λιποσώματα "παθογόνου" που φέρουν ένα γονίδιο για το ένζυμο περιορισμού MunI που συντήκεται με τα λιποσώματα του ξενιστή. Το γονίδιο του παθογόνου MunI εκφράζεται από τον ξενιστή και το ένζυμο περιορισμού MunI χωνεύει το DNA του ξενιστή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την πέψη του εγγενούς γονιδιώματος του ξενιστή, μετατρέποντας το μεγαλύτερο μέρος της έκφρασης της πρωτεΐνης ξενιστή από το GFP στην κωδικοποιημένη πρωτεΐνη του παθογόνου, MunI. (δ) Η "θανατηφόρα μόλυνση" είναι μια σύντηξη του λιποσώματος του ξενιστή (με το γονιδίωμα GFP) με το λιπόσωμα του παθογόνου που περιέχει το γονίδιο που κωδικοποιεί το aHL, μια πρωτεΐνη μεμβράνης. Μετά τη μόλυνση, ο ξενιστής εκφράζει aHL, το οποίο δημιουργεί πόρους μεμβράνης, προκαλώντας διαρροή θρεπτικών συστατικών του ξενιστή και τερματίζοντας αποτελεσματικά τον μεταβολισμό του ξενιστή. (ε) "Ανοσοποίηση" είναι η επώαση του ξενιστή με ssDNA που περιέχει μια αλληλουχία συμβατή με τις ετικέτες σύντηξης στην επιφάνεια των λιποσωμάτων ξενιστή. Το ανοσοποιητικό DNA δημιουργεί ένα διπλό σύμπλεγμα με ετικέτες DNA ξενιστή, αποτρέποντας τον υβριδισμό άλλων ολίγων DNA με αυτές τις ετικέτες. Αυτό αποτρέπει τη σύντηξη τυχόν παθογόνων λιποσωμάτων στον ξενιστή. Αυτή είναι μια εικόνα απόδειξης της ιδέας και τα γραφήματα είναι για επεξηγηματικούς σκοπούς, αντιπροσωπεύοντας σχετικές ποσότητες πρωτεΐνης που εκφράζονται από τον ξενιστή και διάφορα παθογόνα. Τα πραγματικά δεδομένα για κάθε σύστημα παρέχονται στα επόμενα σχήματα.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιούμε τις λέξεις: ξενιστής, παράσιτο, μόλυνση, θανατηφόρος, εμβόλιο και εμβολιασμός όλα στο πλαίσιο μη ζωντανών, συνθετικών κυτταρικών συστημάτων. Με τον όρο «θανατηφόρα» μόλυνση, εννοούμε μια αξιοσημείωτη μείωση της μετάφρασης στον πληθυσμό των συνθετικών κυττάρων. Όλα τα πειράματα σε αυτή την εργασία πραγματοποιήθηκαν σε συνθετικά κύτταρα που δεν είναι ζωντανά, δεν αυτοαναπαράγονται και δεν εξελίσσονται. Αυτό είναι ένα πρότυπο σύστημα για φυσικές βιολογικές ιδιότητες και διεργασίες.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-αύξηση της ανοσίας

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Μόλυνση ενός συνθετικού κυττάρου με ένα παρασιτικό συνθετικό κύτταρο πειράζει πόρους κεντρικού υπολογιστή.

Για να δοκιμάσουμε την ιδέα ενός συνθετικού κυτταρικού συστήματος που μιμείται μια μόλυνση, ξεκινήσαμε κατασκευάζοντας ένα μοντέλο συστήματος για ένα παράσιτο. Χρησιμοποιήσαμε την απλούστερη ιδέα ενός παρασίτου που είναι δυνατό να ανασυσταθεί σε αυτό το μη ζωντανό βιοχημικό σύστημα: ένα παράσιτο που καταλαμβάνει ορισμένους από τους πόρους του ξενιστή. Σε αυτή την περίπτωση, ο μεταβολισμός του ξενιστή αντιπροσωπεύεται από την έκφραση της πρωτεΐνης GFP και το παράσιτο αντιπροσωπεύεται από την έκφραση της πρωτεΐνης mCherry. Για αυτό το σύστημα, χρησιμοποιήσαμε το προηγουμένως αποδεδειγμένο φαινόμενο της απόδοσης γραμμικής έκφρασης πρωτεΐνης που εξαρτάται από τη συγκέντρωση του προτύπου DNA στο TxTl.15,16 Αρχικά, ξεκινήσαμε να βρούμε τη βέλτιστη συνολική συγκέντρωση πλασμιδίου στην οποία η αναλογία GFP και mCherry DNA αντιστοιχεί σε την αναλογία του παρατηρούμενου φθορισμού από αυτές τις πρωτεΐνες. Εκχωρήσαμε αυθαίρετα το γονίδιο GFP ως «ξενιστή» και το γονίδιο mCherry ως «παράσιτο». Αυτά τα ονόματα δεν δηλώνουν τίποτα ιδιαίτερο σε αυτό το συγκεκριμένο πείραμα, αλλά θα υποδεικνύουν τον ξενιστή και το παράσιτο σε επόμενα πειράματα συνθετικών κυττάρων. Εδώ, χρησιμοποιούμε αυτά τα ονόματα για να διευκολύνουμε τη συσχέτιση αυτών των πειραμάτων απόδειξης της ιδέας με τα επόμενα πειράματα μόλυνσης από συνθετικά κύτταρα χρησιμοποιώντας τα ίδια πλασμίδια. Αναμίξαμε πλασμίδια GFP και mCherry, με αμφότερα τα γονίδια υπό τον έλεγχο του προαγωγέα Τ7 σε ποικίλες αναλογίες πλασμιδίου και συνολική συγκέντρωση πλασμιδίου στα δείγματα 1, 5, 10 ή 15 ηΜ (Εικόνα 2β). Τα αποτελέσματα ακολούθησαν την αναμενόμενη σχεδόν γραμμική σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του πλασμιδίου και της καταγεγραμμένης έντασης φθορισμού, με την καλύτερη αντιστοιχία μεταξύ των αναλογιών συγκέντρωσης φθορισμού και πλασμιδίου να παρατηρείται σε σύνολο πλασμιδίου 10 ηΜ. Η παρατηρούμενη σχέση δείχνει ότι τα πλασμίδια, με τις πρωτεΐνες να είναι παρόμοιες σε μέγεθος και σύνθεση αμινοξέων (Εικόνα S1), ανταγωνίζονται για την ίδια δεξαμενή πόρων TxTl για την έκφρασή τους. Η αλλαγή της σχετικής συγκέντρωσης των δύο πλασμιδίων οδηγεί σε αλλαγές στην αποτελεσματικότητα έκφρασης περίπου ανάλογες με την αναλογία των πλασμιδίων. Αυτό υποδεικνύει ότι θα ήταν ένα καλό μοντέλο να μιμηθεί κανείς τη μόλυνση από παράσιτο: το γονιδίωμα του παρασίτου (πλασμίδιο mCherry) θα ανταγωνιστεί το γονιδίωμα του ξενιστή (πλασμίδιο GFP). Στη συνέχεια, αποφασίσαμε να δοκιμάσουμε μια περίπτωση όπου κάποιο από τα πλασμίδια ήταν υπό τον έλεγχο ενός ισχυρότερου προαγωγέα, μιμούμενος έτσι ένα μεροληπτικό σενάριο κατανομής πόρων. Για να διατηρήσουμε την πτυχή του ανταγωνισμού πόρων στα μελλοντικά πειράματα μόλυνσης με «παράσιτο», κρατήσαμε και τα δύο γονίδια κάτω από τον ίδιο προαγωγέα RNA πολυμεράσης (την πολυμεράση T7 RNA, T7 RNAP), αλλά αλλάξαμε την ισχύ του. Χρησιμοποιήσαμε έναν ισχυρό προαγωγέα T7 RNAP T7Max, ο οποίος επιδεικνύει σημαντικά υψηλότερη απόδοση μεταγραφής, με αποτέλεσμα αντίστοιχα υψηλότερες αποδόσεις μετάφρασης, στο TxTl.17 Δοκιμάσαμε τη διάταξη αντίδρασης πανομοιότυπη με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως: δύο πλασμίδια σε διαφορετικές αναλογίες, δοκιμασμένα σε κυμαινόμενο τελικό σύνολο συγκεντρώσεις πλασμιδίου. Ένα από τα πλασμίδια ήταν υπό τον έλεγχο του ισχυρού προαγωγέα T7Max, ενώ το άλλο ήταν κάτω από τον κανονικό προαγωγέα Τ7. Και στις δύο περιπτώσεις δοκιμής, η έκφραση του πλασμιδίου T7Max ήταν αρκετά ισχυρή ώστε ο φθορισμός της πρωτεΐνης από ένα γονίδιο κάτω από το T7Max δεν αυξήθηκε σημαντικά με την αυξημένη συνολική συγκέντρωση του πλασμιδίου (Εικόνα 2γ, 2δ). Δεν φαινόταν να έχει σημασία αν το T7Max οδηγούσε το GFP ή το mCherry, και οι δύο πρωτεΐνες ανταποκρίθηκαν στον ισχυρότερο προαγωγέα με παρόμοια σχετική αύξηση. Αυτό παρείχε ένα πολλά υποσχόμενο μοντέλο μόλυνσης με ένα «ισχυρότερο» παράσιτο (ένα γονίδιο που μεταφέρει παράσιτο κάτω από το T7Max σε έναν ξενιστή κάτω από το T7) και ένα αντίστροφο, ισχυρότερο ξενιστή που αντιστέκεται σε ασθενέστερο παράσιτο (ξενιστής με γονιδίωμα υπό T7Max και ένα παράσιτο που φέρει γονίδιο Τ7). Ενθαρρυμένοι από αυτά τα πειράματα απόδειξης της αρχής, προχωρήσαμε σε πειράματα συνθετικών κυττάρων.

Η «λοίμωξη», σε όλες τις περιπτώσεις, είναι η σύντηξη ενός συνθετικού κυττάρου ξενιστή και παρασίτου. Η σύντηξη διευκολύνεται από ετικέτες DNA στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, χρησιμοποιώντας το επαγόμενο από DNA σύστημα σύντηξης που περιγράφηκε προηγουμένως.18 Εν συντομία, τα συνθετικά κύτταρα δημιουργήθηκαν με Escherichia coli TxTl μέσα σε μια μεμβράνη POPC και χοληστερόλη και το εξωτερικό φυλλάδιο διακοσμήθηκε με μονόκλωνο DNA αγκυρωμένο στη μεμβράνη με τροποποίηση της χοληστερόλης. Εάν ένα ζεύγος λιποσωμάτων με συμπληρωματικές ετικέτες συναντηθεί, οι ετικέτες DNA υβριδοποιούνται, φέρνοντας τις μεμβράνες μαζί και ξεκινώντας τη σύντηξη μεμβράνης, η οποία ακολουθείται από ανάμειξη αυλού. Στα πειράματά μας, το συνθετικό κύτταρο ξενιστή είναι το λιπόσωμα που περιέχει TxTl με T7 RNAP επιπλέον του γονιδιώματος ενός GFP που κωδικοποιείται από πλασμίδιο. Η παρακολούθηση του φθορισμού GFP χρησιμεύει ως αντιπρόσωπος για την «υγεία» του μεταβολισμού του ξενιστή. Το εισερχόμενο παράσιτο περιέχει ένα γονιδίωμα με τη μορφή ενός πλασμιδίου που κωδικοποιεί το mCherry, το πλήρες σύστημα μετάφρασης, αλλά όχι την πολυμεράση T7 RNA. Αυτό διασφαλίζει ότι τυχόν παρατηρούμενες αλλαγές στον μεταβολισμό του ξενιστή προκύπτουν από τα γονίδια που εισάγονται από το παράσιτο και όχι από τη σύντηξη του παρασίτου και των λιποσωμάτων του ξενιστή, αραιώνοντας το κυτταρόπλασμα του ξενιστή. Τα πειράματα μόλυνσης από παράσιτα διεξήχθησαν με τη μεμβράνη ξενιστή σημασμένη με Marina Blue DHPE, μια μπλε λιπιδική χρωστική μεμβράνης. Αυτό μας επέτρεψε να ομαλοποιήσουμε τον παρατηρούμενο φθορισμό του γονιδίου του ξενιστή και του παρασίτου στον μπλε φθορισμό, κανονικοποιώντας τα αποτελέσματα στη συνολική ποσότητα του φθορισμού της μεμβράνης του ξενιστή που υπάρχει στο δείγμα. Αυτό αντιπροσωπεύει τις αραιώσεις του συνολικού όγκου του δείγματος μετά την προσθήκη λιποσωμάτων παρασίτου. Οι μεμβράνες των παρασίτων δεν σημάνθηκαν με φθορισμό. Όλα τα πειράματα συνοδεύτηκαν από ένα δείγμα ελέγχου, όπου μόνο ένας πληθυσμός ήταν παρών στον ξενιστή, αλλά με πλασμίδιο mCherry, για να δείξει τα θεωρητικά μέγιστα δυνατά επίπεδα έκφρασης mCherry εάν ​​ήταν το μόνο γονίδιο στον πληθυσμό. Στο πρώτο σετ πειραμάτων, αναμίξαμε τον ξενιστή και το παράσιτο με γονίδια και τα δύο υπό τον έλεγχο του κανονικού προαγωγέα Τ7έτσι και τα γονίδια του ξενιστή και των παρασίτων ήταν εξίσου «ισχυρά». Αναμίξαμε τον ξενιστή με το παράσιτο έτσι ώστε το παράσιτο να βρίσκεται στο 25, 50 ή 75% του συνολικού πληθυσμού των λιποσωμάτων. Σε όλες τις περιπτώσεις, ο φθορισμός GFP του ξενιστή μειώθηκε παρουσία του παρασίτου, με την αντίστοιχη αύξηση του φθορισμού του παρασίτου mCherry (Εικόνα 2e). Δείγματα με μόνο το παράσιτο και χωρίς ξενιστή δεν παρήγαγαν φθορισμό κανενός χρώματος, όπως αναμενόταν. Σε όλες τις περιπτώσεις, η μεσολαβούμενη από DNA σύντηξη λιποσωμάτων δεν είναι 100% αποτελεσματική· 18,19 Επομένως, η σχετική μείωση στον φθορισμό του ξενιστή και η αύξηση του φθορισμού του παρασίτου δεν ήταν τόσο μεγάλες όσο η αναμενόμενη θεωρητική τιμή με βάση την αναλογία ξενιστή προς παράσιτο. Με άλλα λόγια, η μόλυνση δεν ήταν 100% αποτελεσματική. Αυτή η τρελή ποιότητα του συστήματος σύντηξης που προκαλείται από το DNA ήταν, σε αυτή την περίπτωση, ένα ευεργετικό χαρακτηριστικό του συστήματος. Όπως και στην περίπτωση της φυσικής μόλυνσης, η μόλυνση που προκαλείται από σύντηξη συνθετικών κυττάρων δεν επηρέασε όλους τους ξενιστές και δεν βρήκαν όλα τα παράσιτα ξενιστή. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε δύο περιπτώσεις, όπου ο ξενιστής και το παράσιτο δεν αντιστοιχούσαν ομοιόμορφα ως προς την ισχύ των γονιδιωμάτων τους. Σε μία περίπτωση, το γονιδίωμα του ξενιστή ήταν υπό τον έλεγχο του προαγωγέα Τ7 ενώ το γονιδίωμα του παρασίτου ήταν κάτω από τον προαγωγέα T7Max (Εικόνα 2στ) και στο αντίθετο σενάριο, το γονιδίωμα του ξενιστή ήταν κάτω από το T7Max και το γονιδίωμα του παρασίτου ήταν κάτω από τον προαγωγέα Τ7 (Εικόνα 2g). Στην περίπτωση του ασθενέστερου ξενιστή που προσβλήθηκε από ένα ισχυρότερο παράσιτο, η σχετική αύξηση στον παρασιτικό φθορισμό του mCherry και η αντίστοιχη μείωση στον φθορισμό GFP του ξενιστή ήταν πολύ ισχυρότερες από ό,τι στην προηγούμενη περίπτωση ενός ομοιόμορφου ταιριάσματος ξενιστή και παρασίτου. Όπως ήταν αναμενόμενο, όταν ο ξενιστής ήταν ισχυρότερος από το παράσιτο, ίσχυε το αντίθετο: τα επίπεδα φθορισμού mCherry ήταν χαμηλότερα και η σχετική μείωση του φθορισμού GFP ήταν χαμηλότερη από ό,τι στην ομοιόμορφη περίπτωση. Αυτό φαίνεται καλύτερα συγκρίνοντας ένα μόνο σημείο δεδομένων υπό τις ίδιες συνθήκες μόλυνσης: σε αναλογία παρασίτων 75%. Ομοιόμορφα αντιστοιχισμένοι πληθυσμοί ξενιστή και παρασίτων έχουν ως αποτέλεσμα φθορισμό παρασίτου ελαφρώς μεγαλύτερο από τον ξενιστή. Όταν το παράσιτο είναι ισχυρότερο, ο φθορισμός του παρασίτου είναι σημαντικά υψηλότερος από τον ξενιστή. Και όταν ο ξενιστής είναι ισχυρότερος, ο φθορισμός του παρασίτου είναι ελαφρώς χαμηλότερος από τον ξενιστή. Αυτά τα επισημασμένα σημεία δεδομένων σημειώνονται με ένα κίτρινο αστέρι στην Εικόνα 2e−g. Πραγματοποιήσαμε το πείραμα ελέγχου ενός ξενιστή μολυσμένου με ένα "ασυμπτωματικό" παράσιτο, ένα παράσιτο που φέρει ένα πλασμίδιο με τον προαγωγέα Τ7 αλλά χωρίς κωδικοποιητική αλληλουχία πρωτεΐνης (αφαιρέσαμε την κασέτα mCherry από το πλασμίδιο) (Εικόνα 2h). Ο φθορισμός GFP του ξενιστή μειώνεται ελάχιστα σε υψηλότερα επίπεδα παρασίτου, υποδεικνύοντας ότι κάποια μικρή ποσότητα πόρων ξενιστή είναι αφιερωμένη στη μεταγραφή του μικρού μη κωδικοποιητικού RNA από το πλασμίδιο του παρασίτου. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώνουν επίσης ότι το κύριο μεταβολικό βάρος της μόλυνσης από παράσιτο στον ξενιστή έγκειται στη χρήση μεταφραστικών και όχι μεταγραφικών πόρων. Αυτή η παρατήρηση ευθυγραμμίζεται με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η μετάφραση είναι ο πιο μεταβλητός και περιοριστικός πόρος σε συστήματα χωρίς κύτταρα.20 Συνολικά, αυτά τα πειράματα παρέχουν ένα μοντέλο μόλυνσης με ένα παράσιτο που καταλαμβάνει τους μεταβολικούς πόρους του ξενιστή, με συνθετικές κυτταρικές συμπεριφορές που μιμούνται πτυχές μιας σχέσης φυσικού ξενιστή-παράσιτου.

Εικόνα 2. Η μόλυνση από παράσιτο παρασύρει τους πόρους του ξενιστή. (α) Το λιπόσωμα συνθετικού κυττάρου ξενιστή περιέχει ένα σύστημα μετάφρασης χωρίς κύτταρα και ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί το GFP. Η επιφάνεια του κεντρικού υπολογιστή είναι διακοσμημένη με ετικέτες ssDNA. Το λιπόσωμα του παρασίτου περιέχει πλασμίδιο που κωδικοποιεί mCherry, με σύστημα μετάφρασης αλλά χωρίς RNA πολυμεράση (άρα το παράσιτο δεν μπορεί να εκφράσει το mCherry). Η επιφάνεια του παρασίτου είναι διακοσμημένη με ετικέτες ssDNA συμπληρωματικές με τις ετικέτες στην επιφάνεια του ξενιστή. Οι ετικέτες DNA διευκολύνουν τη σύντηξη των λιποσωμάτων ξενιστή και παρασίτου και ο ξενιστής εκφράζει τόσο το δικό του γονιδιωματικό GFP όσο και το παρασιτικό γονιδίωμα που περιέχει mCherry. (β−δ) Απόδειξη αρχής για το γονιδίωμα του ξενιστή (GFP) και του παρασίτου (mCherry) που ανταγωνίζονται για τους ίδιους πόρους συνθετικών κυττάρων. Αυτά τα πειράματα γίνονται σε διάλυμα TxTl, όχι σε λιποσώματα. Δύο πλασμίδια, που κωδικοποιούν GFP και mCherry, αναμίχθηκαν στην αναλογία που υποδεικνύεται από τα εικονίδια πλασμιδίου στα αριστερά του χάρτη θερμότητας, με τη συνολική συγκέντρωση DNA του δείγματος να υποδεικνύεται στη σειρά πάνω από τον χάρτη θερμότητας. Ο φθορισμός μετρήθηκε σε πράσινο (GFP) και κόκκινο (mCherry) κανάλια. Κάθε πλασμίδιο δοκιμάστηκε σε δύο παραλλαγές με προαγωγείς διαφορετικής ισχύος: με Τ7 και με ισχυρότερο προαγωγέα T7Max. Μεμονωμένα δεδομένα για όλους τους χάρτες θερμότητας παρέχονται στα Σχήματα S2−S4. Αντιπροσωπευτικά μεμονωμένα μαθήματα χρόνου για την έκφραση πρωτεΐνης του ξενιστή και του παρασίτου Τ7 παρέχονται στα Σχήματα S5−S7 και για το παράσιτο T7Max στα Σχήματα S8−S10. (π.χ.) Μόλυνση του ξενιστή με το παράσιτο. Σε κάθε πείραμα, τα λιποσώματα του ξενιστή αναμιγνύονται με λιποσώματα παρασίτων. Η σύντηξη του παρασίτου με τον ξενιστή παρέχει παρασιτικό mCherry DNA, το οποίο εκφράζεται παράλληλα με το DNA GFP του ξενιστή. Δοκιμάστηκαν διαφορετικές αναλογίες του ξενιστή προς το παράσιτο, όπως υποδεικνύεται από τα εικονίδια κάτω από τα γραφήματα ράβδων. Το γονιδίωμα του ξενιστή κάτω από τον προαγωγέα T7 μολύνθηκε με ένα παράσιτο με το γονιδίωμά του κάτω από τον πίνακα προαγωγέα T7 (e) και με ένα παράσιτο με το γονιδίωμά του κάτω από τον πίνακα προαγωγέα T7Max (f), ο ξενιστής κατασκευάστηκε επίσης με ένα γονιδίωμα T7Max και μολύνθηκε με το παράσιτο με πάνελ γονιδιώματος Τ7 (g). Αντιπροσωπευτικά ατομικά μαθήματα για έκφραση πρωτεΐνης παρέχονται στο Σχήμα S11. Παρόμοια πειράματα σε υψηλότερες και χαμηλότερες συγκεντρώσεις ολικών λιπιδίων παρέχονται στο Σχήμα S12. Τα ίχνη καθαρισμού αποκλεισμού μεγέθους που δείχνουν τη σταθερότητα των κυστιδίων μετά τη σύντηξη παρέχονται στο Σχήμα S13. (η) Λοίμωξη με μη συμβατό παράσιτο: το παράσιτο φέρει τον προαγωγέα Τ7 αλλά μη κωδικοποιητικό DNA. Οι γραμμές σφάλματος υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού στα πάνελ (e−h) κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό μιας βαφής μεμβράνης για να ομαλοποιηθούν τα αποτελέσματα στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Όλες οι σειρές δειγμάτων με την ένδειξη "ξενιστής μολυσμένο με GFP" είναι πειράματα, όπου ο ξενιστής και το παράσιτο είχαν συμπληρωματικές ετικέτες DNA στην επιφάνεια, επιτρέποντας τη σύντηξη των λιποσωμάτων, που ονομάζεται μόλυνση. Τα επισημασμένα σε σειρά "host GFP υγιή" δείχνουν δείγματα, όπου ο ξενιστής και το παράσιτο αναμειγνύονταν στις αναλογίες που φαίνονται, αλλά δεν περιείχαν συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, καθιστώντας τη μόλυνση αδύνατη. Το διαμάντι σε πάνελ (e−h) υποδεικνύει μια συγκεκριμένη κατάσταση μόλυνσης που απεικονίζει καλύτερα τις διαφορές στην ισχύ έκφρασης του ξενιστή και του παρασίτου στα πάνελ (e−g) και τα οφέλη της ανοσίας του ξενιστή στο πλαίσιο (h). Μια άμεση σύγκριση των τιμών του ξενιστή και του παρασίτου που δηλώνεται από το αστέρι δίνεται στο Σχήμα S14. Τα δεδομένα για μόλυνση με ένα παράσιτο χωρίς κανένα πλασμίδιο φαίνονται στο Σχήμα S15.

Η μόλυνση ενός συνθετικού κυττάρου μπορεί να καταστρέψει το γονιδίωμα του ξενιστή.

Το παράσιτο που περιγράφεται παραπάνω εξέφραζε ένα mCherry που κωδικοποιεί το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας πόρους του ξενιστή, αλλά ο ξενιστής διατήρησε μέρος του μεταβολισμού του και συνέχισε να εκφράζει GFP παρά τη μόλυνση. Στη συνέχεια, αποφασίσαμε να διερευνήσουμε ένα σύστημα στο οποίο η μόλυνση οδηγεί σε πλήρη ανάληψη του μεταβολισμού του ξενιστή από το παράσιτο μέσω της καταστροφής του γονιδιώματος του ξενιστή (Εικόνα 3α). Για να σχεδιάσουμε ένα τέτοιο σενάριο, διερευνήσαμε μια πέψη με ένζυμα περιορισμού ενός πλασμιδίου σε TxTl. Στα πειράματα απόδειξης της αρχής, ένα ένζυμο περιορισμού MunI εκφράστηκε σε TxTl χωρίς λιποσώματα. Το πλασμίδιο MunI αναμίχθηκε με το πλασμίδιο GFP σε διαφορετικές αναλογίες. Εάν το πλασμίδιο GFP δεν περιέχει θέσεις περιορισμού MunI, η σχετικά μικρή μείωση στον παρατηρούμενο φθορισμό GFP μπορεί να οφείλεται στον ανταγωνισμό που περιγράφηκε προηγουμένως μεταξύ των δύο πλασμιδίων για πόρους TxTl. Εάν το πλασμίδιο GFP έχει θέση περιορισμού MunI, ο φθορισμός GFP μειώνεται σημαντικά και η μείωση κλιμακώνεται αναλογικά με μια αυξανόμενη ποσότητα του πλασμιδίου που κωδικοποιεί MunI (Εικόνα 3b). Η έκφραση MunI παρακολουθήθηκε μέσω στυπώματος Western και κλιμακώθηκε αναλογικά με τη συγκέντρωση πλασμιδίου (Εικόνα 3c).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Ενθαρρυμένοι από αυτά τα αποτελέσματα, δημιουργήσαμε ένα πείραμα μόλυνσης με συνθετικά κύτταρα. Ο ξενιστής έφερε το πλασμίδιο GFP και το παθογόνο έφερε το πλασμίδιο MunI. Η συγκέντρωση των πλασμιδίων GFP και MunI ορίστηκε στα 2 mM, πολύ κάτω από τη συγκέντρωση κορεσμού πλασμιδίου για TxTl.21 Σκοπεύαμε να παραμείνουμε κάτω από τη συνολική συγκέντρωση πλασμιδίου στην οποία η έκφραση του ξενιστή και του παρασίτου θα ήταν αρκετά υψηλή ώστε να ανταγωνιστεί άμεσα για περιορισμένους πόρους ( όπως στην παραπάνω περιγραφείσα περίπτωση ενός απλού παρασίτου), αντ' αυτού σκοπεύουμε να μετρήσουμε κυρίως την επίδραση του παρασιτικού ενζύμου που καταστρέφει ενεργά το γονιδίωμα του ξενιστή. Όπως στα πειράματα παρασίτου που περιγράφηκαν προηγουμένως, ο ξενιστής περιείχε βακτηριακή πολυμεράση TxTl και Τ7 RNA, το παθογόνο έφερε μόνο εκχύλισμα κυττάρων χωρίς Τ7 RNA πολυμεράση και τόσο ο ξενιστής όσο και το παθογόνο σημάνθηκαν με συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης DNA. Η μεμβράνη ξενιστή επισημάνθηκε με Marina Blue DHPE για να ομαλοποιήσει τα αποτελέσματα φθορισμού στη συγκέντρωση των λιποσωμάτων του ξενιστή. Ο ξενιστής και το παθογόνο αναμίχθηκαν σε ποικίλες αναλογίες, με το παθογόνο να είναι 25, 50 ή 75% του συνολικού πληθυσμού. Ο φθορισμός του "μολυσμένου" ξενιστή, όπου ο ξενιστής και το παθογόνο περιείχαν συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, μειώθηκε με αυξανόμενη ποσότητα παθογόνου. Ο φθορισμός GFP από τον "υγιή" ξενιστή, όπου το παθογόνο δεν περιείχε συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, δεν μειώθηκε παρουσία οποιασδήποτε ποσότητας παθογόνου. Τα δείγματα με μόνο το παθογόνο δεν είχαν μετρήσιμο φθορισμό (Εικόνα 3δ). Η έκφραση της παθογόνου πρωτεΐνης MunI ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Western Blot, με δεδομένα που παρουσιάζονται για τη σειρά δειγμάτων του μολυσμένου ξενιστή (Εικόνα 3e). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τη μόλυνση στην περίπτωση ενός ξενιστή άνοσου στο παθογόνο: το πλασμίδιο GFP ξενιστή δεν είχε θέση περιορισμού MunI (Εικόνα 3στ). Ο φθορισμός του ξενιστή μετά τη μόλυνση μειώθηκε αλλά δεν ήταν τόσο σημαντικός όσο στην προηγούμενη περίπτωση ενός ξενιστή με θέση MunI στο γονιδίωμα. Η πρωτεΐνη παθογόνου MunI εκφράστηκε σε επίπεδα συγκρίσιμα με προηγούμενα πειράματα μόλυνσης (Εικόνα 3g), επομένως το μεταβολικό φορτίο στον ξενιστή ήταν παρόμοιο. Η μείωση του φθορισμού του μολυσμένου ξενιστή σε αυτά τα πειράματα προκαλείται από την κατάληψη ορισμένων πόρων ξενιστή από το παθογόνο που εκφράζει MunI, αλλά επειδή η συνολική συγκέντρωση πλασμιδίου είναι πολύ χαμηλότερη από ό,τι στα προηγούμενα απλά πειράματα παθογόνου, η μείωση του φθορισμού του ξενιστή είναι λιγότερο σημαντική. Αυτό το πείραμα επιβεβαιώνει επίσης ότι η μείωση στον φθορισμό του ξενιστή με μια θέση MunI (Σχήμα 3δ) προκλήθηκε από τα μαθήματα χρόνου έκφρασης πρωτεΐνης που παρέχονται στο Σχήμα S22. (ζ) Η έκφραση του MunI παρακολουθήθηκε μέσω ανάλυσης western blot μέσω του πειράματος για τα δείγματα που φαίνονται στη σειρά "GFP infected" στο πλαίσιο (στ). Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλους τους πίνακες υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού στα πλαίσια (d, f) κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό της χρωστικής μεμβράνης που χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Ο φθορισμός στο πλαίσιο (β) κανονικοποιείται σε 0 mM πλασμίδιο MunI για κάθε σειρά δειγμάτων. Τα διαμαντένια σύμβολα στα πλαίσια (d, f) υπογραμμίζουν μια συγκεκριμένη κατάσταση που απεικονίζει καλύτερα τις διαφορές στις αποκρίσεις στη μόλυνση από έναν ξενιστή ευαίσθητο στο πλαίσιο του παθογόνου (d) και ανοσία στο πλαίσιο του παθογόνου (f). Όλες οι σειρές δειγμάτων με την επισήμανση "μολυσμένο με GFP" είναι πειράματα, όπου ο ξενιστής και το παθογόνο είχαν συμπληρωματικές ετικέτες DNA στην επιφάνεια, επιτρέποντας τη σύντηξη των λιποσωμάτων, που ονομάζεται μόλυνση. Η σειρά με την ένδειξη "GFP υγιής" δείχνει δείγματα, όπου ο ξενιστής και το παθογόνο αναμίχθηκαν στις αναλογίες που φαίνονται αλλά δεν περιείχαν συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, καθιστώντας τη μόλυνση αδύνατη.

Εικόνα 3. Η μόλυνση καταστρέφει το γονιδίωμα του ξενιστή και παρασύρει τους πόρους του ξενιστή. (α) Τα κύτταρα ξενιστές περιέχουν πλασμίδιο που κωδικοποιεί GFP, με δύο θέσεις περιορισμού MunI. το παθογόνο περιέχει πλασμίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο περιορισμού MunI. Μετά τη σύντηξη του ξενιστή και του παθογόνου, ο ξενιστής TxTl εκφράζει το ένζυμο περιορισμού MunI, το οποίο στη συνέχεια χωνεύει το γονιδίωμα του ξενιστή. (β) Τα πειράματα απόδειξης της αρχής για τη μόλυνση: Το πλασμίδιο GFP παρασκευάστηκε με και χωρίς θέσεις περιορισμού MunI. Το πλασμίδιο GFP αναμίχθηκε με το πλασμίδιο MunI και καταγράφηκε η έκφραση GFP. Αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε διάλυμα TxTl χωρίς λιποσώματα. Η απόδειξη της αρχής για το πείραμα μόλυνσης, με το ένζυμο MunI να προστίθεται εξωτερικά αντί να εκφράζεται σε TxTl, φαίνεται στα Σχήματα S16 και S17. Αντιπροσωπευτικά μαθήματα χρόνου έκφρασης πρωτεΐνης παρέχονται στο Σχήμα S18. (γ) Η έκφραση MunI παρακολουθήθηκε με ανάλυση στυπώματος western. η ένταση της ζώνης MunI προσδιορίστηκε ποσοτικά στα ίδια δείγματα με τα αποτελέσματα φθορισμού που φαίνονται στο πλαίσιο (β) για τη σειρά "MunI site absent". Ένα αντιπροσωπευτικό στύπωμα western του ενζύμου περιορισμού MunI παρέχεται στο Σχήμα S19. (δ) Φθορισμός GFP του ξενιστή αναμεμειγμένο με λιποσώματα παθογόνου στην αναλογία που φαίνεται κάτω από το γράφημα δεδομένων. Το πλασμίδιο ξενιστής GFP έχει δύο θέσεις περιορισμού MunI. Αντιπροσωπευτικά μαθήματα χρόνου έκφρασης πρωτεΐνης παρέχονται στο Σχήμα S20. Δεδομένα για πειράματα μόλυνσης με μη συμβατές ετικέτες σύντηξης παρέχονται στο Σχήμα S21. (ε) Η έκφραση του MunI παρακολουθήθηκε μέσω ανάλυσης στυπώματος western μέσω του πειράματος για τα δείγματα που παρουσιάζονται στη σειρά "GFP infected" στο πλαίσιο (δ). (στ) Φθορισμός GFP του ξενιστή αναμεμειγμένο με λιποσώματα παθογόνου στην αναλογία που φαίνεται κάτω από το γράφημα δεδομένων. Ο ξενιστής GFP δεν έχει θέσεις περιορισμού MunI, δίνοντάς του ανοσία στην πρωτεΐνη του παθογόνου. Αντιπροσωπευτικά μαθήματα χρόνου έκφρασης πρωτεΐνης παρέχονται στο Σχήμα S22. (ζ) Η έκφραση του MunI παρακολουθήθηκε μέσω ανάλυσης western blot μέσω του πειράματος για τα δείγματα που φαίνονται στη σειρά "GFP infected" στο πλαίσιο (στ). Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλους τους πίνακες υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού στα πλαίσια (d, f) κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό της χρωστικής μεμβράνης που χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Ο φθορισμός στο πλαίσιο (β) κανονικοποιείται σε 0 mM πλασμίδιο MunI για κάθε σειρά δειγμάτων. Τα διαμαντένια σύμβολα στα πλαίσια (d, f) υπογραμμίζουν μια συγκεκριμένη κατάσταση που απεικονίζει καλύτερα τις διαφορές στις αποκρίσεις στη μόλυνση από έναν ξενιστή ευαίσθητο στο πλαίσιο του παθογόνου (d) και ανοσία στο πλαίσιο του παθογόνου (f). Όλες οι σειρές δειγμάτων με την επισήμανση "μολυσμένο με GFP" είναι πειράματα, όπου ο ξενιστής και το παθογόνο είχαν συμπληρωματικές ετικέτες DNA στην επιφάνεια, επιτρέποντας τη σύντηξη των λιποσωμάτων, που ονομάζεται μόλυνση. Η σειρά με την ένδειξη "GFP υγιής" δείχνει δείγματα, όπου ο ξενιστής και το παθογόνο αναμίχθηκαν στις αναλογίες που φαίνονται αλλά δεν περιείχαν συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, καθιστώντας τη μόλυνση αδύνατη.

Η μόλυνση ενός συνθετικού κυττάρου μπορεί να είναι "θανατηφόρα", η εξάντληση των πόρων του κυττάρου ξενιστή και τέτοιες λοιμώξεις μπορούν να "θεραπευθούν" για τη λειτουργία διάσωσης.

Τα παραπάνω πειράματα παρασίτων και παθογόνων κατέδειξαν ότι τα συνθετικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλο μόλυνσης, όπου ένα παθογόνο παρασύρει τους πόρους του ξενιστή. Στη συνέχεια, αποφασίσαμε να διερευνήσουμε ένα σενάριο στο οποίο η μόλυνση προκαλεί τη διακοπή της λειτουργίας του μεταβολισμού του ξενιστή μετά την έκφραση της παθογόνου πρωτεΐνης. Σε αυτή την περίπτωση, το παθογόνο είναι συγκρίσιμο με μόλυνση από ένα βακτήριο που εκφράζει μια θανατηφόρα τοξίνη μείον την πτυχή αναπαραγωγής του ξενιστή ή του παρασίτου, καθώς αυτά τα συνθετικά κύτταρα δεν αναπαράγονται (Εικόνα 4α). Για να δημιουργήσουμε αυτό το σύστημα, επιλέξαμε την αιμολυσίνη (aHL), μια φυσική τοξίνη και μεμβρανική πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται ευρέως στη μηχανική συνθετικών κυττάρων για τη δημιουργία μη ειδικών πόρων μεμβράνης.22,23 Εκτιμούμε την ειρωνεία αυτής της επιλογής καθώς η aHL εκφράζεται φυσικά από τον Staphylococcus aureus ως η τοξίνη και η πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε αργότερα για τη μηχανική μεταφορά της μεμβράνης και την παράταση του συνθετικού μεταβολισμού των κυττάρων.24 Εδώ, επιστρέφουμε στη χρήση του aHL για τον φυσικό του ρόλο ως επιβλαβούς τοξίνης που παράγεται από μια μόλυνση. Ένα άλλο αξιοσημείωτο παράδειγμα χρήσης της τοξικότητας του aHL που σχετίζεται με τη μηχανική των συνθετικών κυττάρων για την πρόκληση φυσικού κυτταρικού θανάτου προέρχεται από την εφαρμογή συνθετικών κυττάρων ως τεχνολογία θεραπείας καρκίνου. έχει ως αποτέλεσμα τη διαρροή του περιεχομένου των κυττάρων και μια σημαντική μείωση στην έκφραση του GFP εντός του κυττάρου. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να αντιστραφεί εάν το εξωτερικό των λιποσωμάτων περιέχει όλα τα μικρά μόρια που είναι απαραίτητα για το TxTl (Εικόνα 4β). Στο σύστημα μοντέλου ξενιστή-παθογόνου, ο ξενιστής περιέχει ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί GFP και το παθογόνο περιέχει ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί aHL. Ο σχεδιασμός όλων των πειραμάτων μόλυνσης είναι παρόμοιος με τα σενάρια παρασίτων και παθογόνων που περιγράφονται παραπάνω, με το παθογόνο να μην φέρει T7 RNAP και τόσο τον ξενιστή όσο και το παθογόνο να είναι διακοσμημένα με ετικέτες σύντηξης DNA. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε ότι σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις παθογόνου (το παθογόνο είναι 25 ή 50% του συνολικού πληθυσμού), ο φθορισμός του ξενιστή μειώνεται ελαφρώς. Ωστόσο, η αύξηση της συγκέντρωσης του παθογόνου στο 75% οδηγεί σε σημαντική μείωση του φθορισμού του GFP του ξενιστή (Εικόνα 4γ). Εικάζουμε ότι αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να προκληθεί από τη σχετικά αργή διαρροή θρεπτικών ουσιών από συνθετικά κύτταρα σε χαμηλότερη συγκέντρωση aHL. Ο φθορισμός GFP μετρήθηκε μόνο μετά από 12 ώρες επώασης και η GFP είναι μια πολύ σταθερή πρωτεΐνη. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι στην περίπτωση χαμηλότερων συγκεντρώσεων aHL (χαμηλότερη ποσότητα παθογόνου), η προκαλούμενη από το aHL διαρροή θρεπτικών ουσιών ήταν αρκετά αργή ώστε τα κύτταρα-ξενιστές συσσώρευσαν σημαντικές ποσότητες GFP προτού οι επιπτώσεις της προκαλούμενης από το aHL διαρροής γίνουν ακρωτηριαστικές. ο μεταβολισμός. Για να αποσυνδέσουμε τα αποτελέσματα του απλού ανταγωνισμού για πόρους μεταξύ του γονιδιώματος του ξενιστή και του παρασίτου, πραγματοποιήσαμε πειράματα "μόλυνσης με διάσωση" στα οποία το εξωτερικό ρυθμιστικό διάλυμα περιείχε όλα τα μικρά μόρια που συνθέτουν την ενέργεια TxTl, τα αμινοξέα και τα μείγματα αλάτων. Αυτό ρυθμίστηκε παρόμοια με την κατάσταση "θρεπτικά συστατικά έξω" που δοκιμάστηκε στο Σχήμα 4β. Η μείωση του φθορισμού του ξενιστή σε αυτά τα πειράματα ήταν παρόμοια με τα προηγούμενα δείγματα "μόλυνσης χωρίς διάσωση" με επίπεδα 25 και 50% του παθογόνου. Η μείωση του φθορισμού του ξενιστή στο 75% του παθογόνου ήταν σημαντικά μικρότερη από τη μείωση που παρατηρήθηκε σε δείγματα χωρίς διάσωση (Εικόνα 4δ). Η μεγάλη διαφορά στα αποτελέσματα για το πείραμα με το 75% του παρασίτου, με τα σημεία δεδομένων στα πλαίσια του σχήματος 4 (γ, δ) να επισημαίνονται με ένα αστέρι, φαίνεται να υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις aHL προκαλούν βλάβη νωρίς στην αντίδραση. Σε χαμηλότερη συγκέντρωση παθογόνου, η διαρροή είναι αρκετά αργή ώστε το GFP του ξενιστή να συσσωρεύεται (όπως φαίνεται και με και χωρίς θρεπτικά συστατικά διάσωσης), έτσι ο παρατηρούμενος φθορισμός GFP μειώνεται μετά τη μόλυνση κυρίως λόγω του ανταγωνισμού για πόρους. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παθογόνου, ο φθορισμός GFP σε δείγματα με εξωτερικά θρεπτικά συστατικά μειώνεται κυρίως λόγω του ανταγωνισμού των πόρων. Αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν ότι μπορούμε να κατασκευάσουμε συνθετικά κύτταρα για να μοντελοποιήσουμε τη μόλυνση, με αποτέλεσμα δύο διαφορετικά αποτελέσματα: τη μεταβολική ποινή της ίδιας της μόλυνσης (μείωση GFP λόγω ανταγωνισμού πόρων) και μια πιο «θανατηφόρα» μόλυνση που προκύπτει από την κατάργηση της πρωτεϊνικής έκφρασης των ξενιστών. Ενθαρρυμένοι από αυτή την παρατήρηση, αποφασίσαμε να διερευνήσουμε ένα σύστημα στο οποίο τα συνθετικά κύτταρα θα μπορούσαν να αντισταθούν ενεργά σε μια παθογόνο μόλυνση και να διερευνήσουμε τη μεταβολική ποινή μιας τέτοιας απόκρισης.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Τα συνθετικά κύτταρα μπορούν να υπερασπιστούν τη μόλυνση χρησιμοποιώντας μια στρατηγική εμπνευσμένη από βακτήρια.

Εμπνευσμένοι από τη γνωστή λειτουργία των περιοριστικών ενδονουκλεασών για την προστασία των βακτηρίων από ξένο DNA, επιδιώξαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτή τη στρατηγική σε συνθετικά κύτταρα. Επεκταθήκαμε στο σύστημα παρασίτων που παρουσιάζεται στην Εικόνα 2: εκτός από το GFP, προσθέσαμε πλασμίδιο που περιέχει MunI στον ξενιστή. Το παράσιτο περιείχε mCherry, όπως και σε προηγούμενα πειράματα. Το πλασμίδιο mCherry περιέχει μια θέση περιορισμού MunI (Εικόνα 5α). Αρχικά, πραγματοποιήσαμε πειράματα απόδειξης αρχής για να αξιολογήσουμε το μεταβολικό φορτίο της έκφρασης MunI στον ξενιστή. Σε αυτά τα πειράματα TxTl χωρίς κάψουλα, παρακολουθήσαμε την έκφραση του GFP και την έκφραση του mCherry, το καθένα αναμεμειγμένο με μια αυξανόμενη ποσότητα είτε MunI είτε EcorI πλασμιδίου. Όλα τα γονίδια ήταν υπό τον έλεγχο του ίδιου προαγωγέα Τ7. Το γονίδιο GFP είχε θέση περιορισμού EcorI αλλά όχι MunI και το γονίδιο mCherry είχε θέση περιορισμού MunI αλλά όχι θέση περιορισμού EcorI. Όταν το πλασμίδιο περιοριστικού ενζύμου αναμίχθηκε με ένα πλασμίδιο φθορίζουσας πρωτεΐνης χωρίς θέση αναγνώρισης για αυτό το ένζυμο περιορισμού, η έκφραση της φθορίζουσας πρωτεΐνης μειώθηκε αναλογικά με την αύξηση του πλασμιδίου περιοριστικού ενζύμου, υποδεικνύοντας ανταγωνισμό μεταξύ των δύο πλασμιδίων για πόρους TxTl, όπως αποδείχθηκε νωρίτερα για το GFP και mCherry στο Σχήμα 2. Αυτά τα μη κοπτικά ζεύγη ήταν GFP με MunI (Εικόνα 5β) και mCherry με EcorI (Εικόνα 5e). Όταν μια φθορίζουσα πρωτεΐνη συνδυάστηκε με ένα ένζυμο περιορισμού ικανό να κόψει το γονίδιο για αυτή τη φθορίζουσα πρωτεΐνη, ο φθορισμός μειώθηκε σημαντικά σε σχεδόν επίπεδα υποβάθρου σε υψηλότερες συγκεντρώσεις πλασμιδίου περιοριστικού ενζύμου. Αυτά τα ζεύγη κοπής ήταν GFP με EcorI (Εικόνα 5γ) και mCherry με MunI (Εικόνα 5δ). Αυτό έδειξε μείωση του φθορισμού σημαντικά πέρα ​​από τον απλό ανταγωνισμό για πόρους και παρόμοια με το σενάριο μόλυνσης που παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. Η έκφραση MunI παρουσία GFP μειώνει την έκφραση GFP. Εάν χρησιμοποιήσουμε το GFP ως μεσολάβηση για τον μεταβολισμό "βασικής γραμμής" του ξενιστή, τότε το MunI μπορεί να θεωρηθεί ως μεταβολικό φορτίο στον ξενιστή.

Εικόνα 4. Ο ξενιστής είναι ευαίσθητος σε «θανατηφόρα» μόλυνση, αλλά ο ξενιστής μπορεί να διασωθεί. (α) Ο ξενιστής περιέχει πλασμίδιο GFP και το παθογόνο περιέχει πλασμίδιο που κωδικοποιεί το κανάλι μεμβράνης αιμολυσίνης (aHL). Μετά τη μόλυνση, ο ξενιστής εκφράζει aHL, το οποίο δημιουργεί πόρους στη μεμβράνη, προκαλώντας διαρροή θρεπτικών συστατικών και με αποτέλεσμα τη μείωση της μεταβολικής δραστηριότητας του ξενιστή. (β) Απόδειξη αρχής για ένα aHL που εκφράζει ξενιστή (καμία μόλυνση, ο ξενιστής δημιουργήθηκε και με 5 ηΜ GFP και με την υποδεικνυόμενη ποσότητα πλασμιδίου aHL). Ο ξενιστής επωάστηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα με ή χωρίς θρεπτικά συστατικά (όλα τα συστατικά του μίγματος ενέργειας, άλατος και αμινοξέων χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του συστήματος μετάφρασης χωρίς κύτταρα ξενιστή). Η βέλτιστη συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών διάσωσης καθορίστηκε πειραματικά, τα δεδομένα φαίνονται στο Σχήμα S23. (γ) Μόλυνση του ξενιστή με το παθογόνο, με ποικίλες ποσότητες παθογόνου ανά κύτταρο ξενιστή. Η διαρροή μικρών μορίων από τα "υγιή" και "μολυσμένα" κύτταρα μετρήθηκε απευθείας χρησιμοποιώντας μια μικρή μοριακή βαφή, τα δεδομένα φαίνονται στα Σχήματα S24 και S25. (δ) Πειράματα παρόμοια με αυτά παρουσιάζονται στο πλαίσιο (γ), αλλά το εξωτερικό ρυθμιστικό περιέχει θρεπτικά συστατικά μικρού μορίου παρόμοια με τις πειραματικές συνθήκες "θρεπτικά συστατικά εκτός" που φαίνονται στο πλαίσιο (β). Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλους τους πίνακες υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού στα πάνελ (b−d) κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό της χρωστικής μεμβράνης που χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση του σήματος στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Τα διαμαντένια σύμβολα στα πλαίσια (γ, δ) υπογραμμίζουν μια συγκεκριμένη κατάσταση που απεικονίζει καλύτερα τις διαφορές στην απόκριση στη μόλυνση από έναν ξενιστή χωρίς εξωτερικό πλαίσιο θρεπτικών συστατικών (γ) και ανοσία στο παθογόνο λόγω της παρουσίας εξωτερικού πλαισίου θρεπτικών συστατικών (δ). Για τα πλαίσια (c, d), η σειρά "GFP infected" είναι ο ξενιστής που έχει συντηχθεί με το παθογόνο που φέρει την πρωτεΐνη aHL και το "GFP υγιές" είναι ο ξενιστής που έχει συντηχθεί με το παθογόνο που δεν φέρει πλασμίδιο.

Προχωράμε στα πειράματα μόλυνσης, αναμιγνύοντας τον ξενιστή (με πλασμίδια GFP και MunI) με ένα παράσιτο (με πλασμίδιο mCherry). Όπως προηγουμένως, διερευνήσαμε σενάρια με αυξανόμενη ποσότητα παρασίτων στον πληθυσμό (Εικόνα 5στ). Ο θετικός έλεγχος μόνο ενός mCherry που εκφράζει ξενιστή (με EcorI αντί για MunI για εξισορρόπηση του μεταβολικού φορτίου) δημιούργησε ένα σημείο αναφοράς για τη θεωρητική μέγιστη ποσότητα πρωτεΐνης παθογόνου που μπορεί να εκφραστεί στον ξενιστή (Εικόνα 5στ). Καθώς η ποσότητα του παρασίτου αυξήθηκε, ο φθορισμός GFP του ξενιστή μειώθηκε, αλλά η μείωση στον φθορισμό του μολυσμένου ξενιστή ήταν σημαντικά μικρότερη από τη μείωση της έκφρασης GFP που παρατηρήθηκε σε προηγούμενα πειράματα με το ίδιο παράσιτο. Ο φθορισμός του GFP και του παρασίτου mCherry αυτού του μολυσμένου MunI που εκφράζει ξενιστή (σημείο δεδομένων επισημασμένο με αστέρι στο Σχήμα 5f) μπορεί να συγκριθεί άμεσα με παρόμοιους ξενιστές μόλυνσης χωρίς MunI (σημείο δεδομένων επισημασμένο με αστέρι στο Σχήμα 2e). Στον ξενιστή που εκφράζει MunI, ο ξενιστής GFP ξεκίνησε με ένα απολύτως χαμηλότερο επίπεδο ενώ ήταν υγιής (επειδή ορισμένοι πόροι εκτρέπονται για την έκφραση MunI) αλλά μετά τη μόλυνση, η μείωση του φθορισμού του ξενιστή είναι πολύ λιγότερο σημαντική και ο ξενιστής παράγει πολύ λιγότερη πρωτεΐνη mCherry παρασίτου παρά στην περίπτωση του οικοδεσπότη που δεν εκφράζει MunI. Αυτό το πείραμα καταδεικνύει το όφελος του οικοδεσπότη που ξοδεύει κάποιους πόρους για την άμυνα κατά των παρασίτων. Αυτό το σύστημα θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένα πολύ απλό βιοχημικό μοντέλο για οργανισμούς που εκφράζουν πρωτεΐνες για να αμυνθούν από μελλοντικές λοιμώξεις ή ακόμη και επιβλαβείς περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ο ξενιστής αρχικά είναι λιγότερο ισχυρός (αν λάβουμε την έκφραση GFP ως σημείο αναφοράς για την υγεία του ξενιστή), αλλά σε περίπτωση μόλυνσης, οι πρόσθετοι πόροι που ξόδεψε ο ξενιστής για την έκφραση αμυντικών πρωτεϊνών αποδίδουν, παρέχοντας προστασία από το μολυσματικό παράσιτο. Ως εκ τούτου, σε αυτό το απλό μη ζωντανό συνθετικό κύτταρο, ανασυστήσαμε ένα παράδειγμα μιας θεμελιώδους βιολογικής κούρσας εξοπλισμών.

Εικόνα 5. Τα κύτταρα ξενιστές προστατεύονται από μόλυνση. (α) Τα κύτταρα ξενιστές περιέχουν δύο πλασμίδια: το ένα που κωδικοποιεί το GFP (χωρίς θέση περιορισμού MunI) και το άλλο που κωδικοποιεί το ένζυμο περιορισμού MunI (το γονίδιο «αντίστασης στα παράσιτα»). Το παράσιτο περιέχει πλασμίδιο mCherry, σε ένα σύστημα παρόμοιο με τα πειράματα που φαίνονται στο Σχήμα 2. Η μόλυνση προκαλείται από σύντηξη μέσω ετικετών DNA στην επιφάνεια του ξενιστή και του παρασίτου. Μετά τη μόλυνση, το πλασμίδιο mCherry που εισάγεται από το παράσιτο χωνεύεται από το ένζυμο περιορισμού MunI του ξενιστή. (β−ε) Μέτρηση του μεταβολικού κόστους έκφρασης της αντίστασης στα παράσιτα. Τα πειράματα γίνονται σε σύστημα χύδην TxTl, που δεν είναι ενθυλακωμένο σε κυστίδια. Σε κάθε πείραμα, το πλασμίδιο φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP ή mCherry) αναμίχθηκε με πλασμίδιο περιοριστικού ενζύμου (MunI ή EcorI) στην αναλογία που υποδεικνύεται στον άξονα χ για τη συνολική συγκέντρωση πλασμιδίου 10 mM. Το GFP έχει μια τοποθεσία περιορισμού EcorI αλλά όχι μια τοποθεσία MunI και το mCherry έχει μια τοποθεσία περιορισμού MunI αλλά όχι μια τοποθεσία περιορισμού EcorI. Η γραμμή τάσης είναι ένας οπτικός οδηγός αλλά όχι μια προσαρμογή δεδομένων. Οι γραμμές σφάλματος υποδεικνύουν SEM, n=3. Πειράματα ελέγχου με καθαρισμένα περιοριστικά ένζυμα, αντί να εκφράζονται από ένα πλασμίδιο, παρέχονται στο Σχήμα S26. Μετρήθηκε επίσης η σταθερότητα των λιποσωμάτων με αυξημένη ποσότητα πλασμιδίου παρασίτου, δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα S27. (στ) Μόλυνση του ξενιστή με αυξανόμενη ποσότητα παρασίτου. "Host GFP υγιής" είναι η έκφραση της GFP από κύτταρα ξενιστές συγχωνευμένα με το παράσιτο χωρίς κανένα πλασμίδιο. "Host GFP infected" είναι ο ξενιστής συγχωνευμένος με το παράσιτο που φέρει mCherry. Ο κόκκινος φθορισμός είναι φθορισμός mCherry από το παράσιτο συντηγμένο με τον ξενιστή (μόνο δεδομένα από τον μολυσμένο ξενιστή είναι διαθέσιμα. Τα δείγματα υγιούς ξενιστή δεν έφεραν πλασμίδιο mCherry). Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλους τους πίνακες υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό της χρωστικής μεμβράνης που χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Το σύμβολο του διαμαντιού υποδεικνύει την έκφραση της πρωτεΐνης παρασίτου υπό συγκεκριμένες συνθήκες μόλυνσης, άμεσα συγκρίσιμες με το σημείο δεδομένων που επισημαίνεται με ένα αστέρι στο Σχήμα 2e, ένα πείραμα υπό τις ίδιες συνθήκες, αλλά με τον ξενιστή να στερείται του γονιδίου αντίστασης MunI.

Εικόνα 6. Ο εμβολιασμός παρέχει άμυνα έναντι λοιμώξεων. (α) Ο ξενιστής περιέχει πλασμίδιο GFP. Το παθογόνο σε αυτά τα πειράματα είναι ένα από τα τρία σχήματα μόλυνσης που παρουσιάζονται σε αυτό το έγγραφο: ένα παράσιτο (όπως φαίνεται στο σχήμα 2), ένα παθογόνο με το ένζυμο περιορισμού MunI που χωνεύει το γονιδίωμα GFP του ξενιστή (όπως φαίνεται στο Σχήμα 3) ή ένα παθογόνο μεταφέροντας το κανάλι μεμβράνης aHL προκαλώντας διαρροή θρεπτικών ουσιών από τον ξενιστή (όπως φαίνεται στο Σχήμα 4). Σε κάθε περίπτωση, ο ξενιστής και το παθογόνο περιέχουν συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης DNA. Πριν από την εισαγωγή του παθογόνου, ο ξενιστής "ενοφθαλμίζεται": επωάζεται με περίσσεια ολιγονουκλεοτιδίων ssDNA συμπληρωματικά προς τις συγχωνευμένες ετικέτες DNA στην επιφάνεια του ξενιστή (ετικέτες πανομοιότυπες με αυτές στο παθογόνο μείον το τμήμα χοληστερόλης που χρησιμοποιείται για την αγκύρωση της ετικέτας στη μεμβράνη του το παθογόνο). Ο ενοφθαλμισμός κάνει τις ετικέτες σύντηξης στην επιφάνεια του ξενιστή να γίνουν δίκλωνες, καθιστώντας έτσι αδύνατη τη σύντηξη με το παθογόνο. (β) Το σύστημα απόδειξης αρχής για τον εμβολιασμό. Ο πληθυσμός των λιποσωμάτων που φέρουν GFP υπό τον έλεγχο του προαγωγέα RNA Τ7, αλλά χωρίς Τ7 RNA πολυμεράση, συντήκεται με λιποσώματα που περιέχουν Τ7 RNA πολυμεράση. Η πρωτεΐνη GFP μπορεί να εκφραστεί μόνο εάν οι δύο πληθυσμοί συγχωνεύονται. Ένας ή και οι δύο από τους εταίρους ανάμιξης "ενοφθαλμίστηκαν" με επώαση με μια ετικέτα DNA συμβατή με τις ετικέτες σύντηξης στην επιφάνεια του λιποσώματος, καθιστώντας τις ετικέτες σύντηξης διπλόκλωνες και έτσι ασυμβίβαστες με τη σύντηξη. Μια αντιπροσωπευτική χρονική πορεία για έκφραση πρωτεΐνης φαίνεται στο Σχήμα S28. Τα πειράματα ελέγχου χωρίς ετικέτες σύντηξης βρίσκονται στο Σχήμα S29 και τα στοιχεία ελέγχου με μη συμβατές ετικέτες σύντηξης παρέχονται στο Σχήμα S30. Η συγκέντρωση ολίγο εμβολιασμού καθορίστηκε πειραματικά, τα δεδομένα δείχνονται στο Σχήμα S31. (γ) Πειράματα μόλυνσης από παράσιτα. Ένας ξενιστής που έφερε GFP συντήχθηκε με ένα παράσιτο που φέρει mCherry, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2. Ο ξενιστής και το παράσιτο αναμίχθηκαν με μια μεταβαλλόμενη αναλογία του ξενιστή προς το παράσιτο. Τα κύτταρα ξενιστές είτε εμβολιάστηκαν (με δίκλωνες ετικέτες σύντηξης DNA που δεν ήταν συμβατές με τη σύντηξη) είτε δεν εμβολιάστηκαν (άρα επιρρεπή στη σύντηξη με το παράσιτο). Ο φθορισμός mCherry αναφέρεται μόνο για δείγματα με τον ξενιστή να μην έχει εμβολιαστεί επειδή δεν υπήρχε μετρήσιμος φθορισμός mCherry στα εμβολιασμένα δείγματα ξενιστή. Ένας αντίστροφος εμβολιασμός δοκιμάστηκε με ενοφθαλμισμό του παρασίτου αντί του ξενιστή, δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα S32. (δ) Πειράματα μόλυνσης με το γονιδίωμα του ξενιστή που είναι ευαίσθητο στο παθογόνο που φέρει το ένζυμο περιορισμού MunI, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3. Η μολυσμένη σειρά δεδομένων αντιπροσωπεύει έναν ξενιστή χωρίς ενοφθαλμισμό και η εμβολιασμένη σειρά δεδομένων αντιπροσωπεύει δείγματα με τον ξενιστή επωασμένο με ολίγο εμβολιασμού. επομένως δεν είναι ευαίσθητο στη σύντηξη με το παθογόνο. (ε) Πειράματα μόλυνσης με το παθογόνο που φέρει το γονίδιο aHL, έχουν ως αποτέλεσμα τα κανάλια aHL να διαρρέουν θρεπτικά συστατικά από τα κύτταρα-ξενιστές μετά τη μόλυνση, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 4. Η μολυσμένη σειρά δεδομένων αντιπροσωπεύει τον ξενιστή χωρίς ενοφθαλμισμό και η ενοφθαλμισμένη σειρά δεδομένων αντιπροσωπεύει δείγματα με ξενιστής επωάστηκε με ολιγονουκλεοτίδια εμβολιασμού, επομένως δεν είναι ευαίσθητος στη σύντηξη με το παθογόνο. Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλους τους πίνακες υποδεικνύουν SEM, n=3. Οι τιμές φθορισμού στα πάνελ (c−e) κανονικοποιούνται στον μπλε φθορισμό της χρωστικής μεμβράνης που χρησιμοποιείται για την κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων στη συγκέντρωση των κυττάρων-ξενιστών. Ορισμένα δεδομένα που φαίνονται σε αυτό το σχήμα είναι πειράματα με ρύθμιση πανομοιότυπη με τα πειράματα που εμφανίζονται σε προηγούμενα σχήματα (όπως υποδεικνύεται σε κάθε λεζάντα). Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν για αυτό το σχήμα για να παραχθούν δεδομένα χρησιμοποιώντας την ίδια παρτίδα TxTl για άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων, εξαλείφοντας τη μεταβλητότητα από παρτίδα σε παρτίδα των παρασκευασμάτων TxTl.

Ο εμβολιασμός των συνθετικών κυττάρων αποτρέπει τη μόλυνση.

Στο παράδειγμα που περιγράφηκε παραπάνω, δείξαμε ότι ο ξενιστής αμύνεται ενάντια στην επίδραση του γονιδιώματος ενός παθογόνου εκφράζοντας μια επιπλέον πρωτεΐνη. Στη συνέχεια, ρωτήσαμε εάν είναι δυνατό να μοντελοποιήσουμε ένα σενάριο, όπου κάποια παρέμβαση καθιστά έναν προηγουμένως ευάλωτο ξενιστή ανοσία στη μόλυνση στην πρώτη θέση. Το ονομάσαμε μοντέλο εμβολιασμού. Αν και το να αναγνωρίσουμε αυτό απέχει πολύ από την τέλεια αναλογία, η πτυχή στην οποία επικεντρωθήκαμε είναι ότι το συνθετικό κύτταρο ξενιστή δεν ξοδεύει πόρους για τη δημιουργία ανοσίας. Στο μοντέλο εμβολιασμού μας, σχεδιάσαμε μια θεραπεία που μετατρέπει το συνθετικό κύτταρο ξενιστή που είναι ευαίσθητο στη μόλυνση σε κύτταρα που δεν μπορούν να συγχωνευτούν με ένα παθογόνο. Το σύστημα συνθετικής κυτταρικής σύντηξης που χρησιμοποιείται σε αυτό το έγγραφο βασίζεται σε μονόκλωνες ετικέτες DNA για την πρόκληση σύντηξης μεμβράνης λιποσώματος. Για να ενοφθαλμίσουμε έναντι της σύντηξης με ένα παθογόνο, επωάσαμε τα κύτταρα με ολιγονουκλεοτίδιο DNA συμπληρωματικό του ολιγονουκλεοτιδίου σύντηξης στην επιφάνεια των κυττάρων (Εικόνα 6α). Πρώτον, χρειαζόταν να επιβεβαιώσουμε ότι ο εμβολιασμός με επώαση με συμπληρωματικό ολίγο λειτουργεί για την κατάργηση της σύντηξης. Στα πειράματα απόδειξης της αρχής, παρασκευάστηκαν δύο πληθυσμοί λιποσωμάτων: ένας πληθυσμός είχε TxTl με πλασμίδιο που κωδικοποιεί GFP υπό τον έλεγχο του προαγωγέα Τ7 και ο άλλος πληθυσμός είχε TxTl και Τ7 RNA πολυμεράση αλλά όχι πλασμίδιο. Μετά τη σύντηξη αυτών των δύο πληθυσμών, το πλασμίδιο GFP αναμίχθηκε με Τ7 RNA πολυμεράση και προκάλεσε έκφραση GFP. Εάν οι δύο πληθυσμοί είχαν μονόκλωνες και συμπληρωματικές ετικέτες σύντηξης, συνέβη σύντηξη και ανιχνεύθηκε φθορισμός GFP. Εάν ένας ή και οι δύο πληθυσμοί επωάζονταν με ένα ολιγονουκλεοτίδιο συμπληρωματικό προς την ετικέτα σύντηξης, η σύντηξη λιποσώματος δεν έλαβε χώρα και η GFP δεν εκφράστηκε (Εικόνα 6b). Έχοντας δημιουργήσει το σύστημα εμβολιασμού, προχωρήσαμε στην εισαγωγή εμβολιασμού για την προστασία των συνθετικών κυττάρων του ξενιστή σε τρία από τα σενάρια μόλυνσης που περιγράφηκαν νωρίτερα σε αυτή την εργασία. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε το σενάριο παρασίτου που περιγράφεται στο Σχήμα 2. Τα κύτταρα ξενιστές, που περιέχουν ένα γονιδίωμα GFP, εμβολιάστηκαν με ένα ολίγο συμπληρωματικό της ετικέτας σύντηξης στην επιφάνεια του ξενιστή και ο ξενιστής αναμίχθηκε με το παράσιτο mCherry. Ανακατέψαμε τον ξενιστή με το παράσιτο σε διαφορετικές αναλογίες. Κάτω από όλες τις συνθήκες μόλυνσης, ο φθορισμός του παρασίτου mCherry ήταν μη ανιχνεύσιμος εάν ο ξενιστής είχε εμβολιαστεί και ο φθορισμός GFP του εμβολιασμένου ξενιστή δεν μειώθηκε. Τα πειράματα ελέγχου με τον μη εμβολιασμένο ξενιστή έδειξαν μείωση στην έκφραση GFP του ξενιστή και αύξηση στο σήμα mCherry παρασίτου, όπως αναμενόταν (Εικόνα 6c). Στη συνέχεια, εφαρμόσαμε το σύστημα εμβολιασμού στην περίπτωση ενός ξενιστή μολυσμένου με ένα παθογόνο που φέρει ένα ένζυμο περιορισμού MunI που κωδικοποιεί το γονιδίωμα, ικανό να αφομοιώσει το γονιδίωμα GFP των ξενιστών, όπως στα πειράματα που φαίνονται στο Σχήμα 3. Ο εμβολιασμένος ξενιστής δεν παρουσίασε μείωση στον φθορισμό GFP μετά από ανάμειξη με αυξανόμενες ποσότητες του παθογόνου, ενώ ο μη εμβολιασμένος ξενιστής μολύνθηκε και ο φθορισμός του GFP του ξενιστή μειώθηκε αναλογικά με την αυξανόμενη ποσότητα του παθογόνου (Εικόνα 6δ). Ο εμβολιασμός ήταν επίσης αποτελεσματικός έναντι του παθογόνου aHL. Οι εμβολιασμένοι ξενιστές δεν εμφάνισαν μείωση στον φθορισμό κατά την ανάμιξη με το παθογόνο, ενώ ο φθορισμός GFP του μη εμβολιασμένου ξενιστή μειώθηκε σημαντικά με τη μόλυνση (Εικόνα 6e). Σε όλες τις περιπτώσεις, αυτή η απλή διαδικασία εμβολιασμού, η επώαση του ξενιστή με ένα ολίγο DNA συμπληρωματικό του συντηγμένου ολίγο στην επιφάνεια του ξενιστή, ήταν αρκετή για να καταργήσει την ικανότητα των παθογόνων συνθετικών κυττάρων να μολύνουν τα κύτταρα ξενιστή. Ως εκ τούτου, επιδείξαμε ένα απλό φυσικοχημικό μοντέλο παρέμβασης που προστατεύει τα κύτταρα ξενιστές από μόλυνση.

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Σε αυτό το άρθρο, παρουσιάζουμε μεθόδους για τη χρήση συνθετικών ελάχιστων κυττάρων για τη μοντελοποίηση παρασίτων και παθογόνων λοιμώξεων. Το κίνητρο πίσω από τη δουλειά μας ήταν διπλό. Θέλαμε να δημιουργήσουμε σύνθετη συμπεριφορά που μοιάζει με ζωή σε συνθετικά κύτταρα, διευκολύνοντας τον στόχο της κατασκευής συνθετικών κυττάρων που μοιάζουν περισσότερο με φυσικά ζωντανά κύτταρα. Θέλαμε επίσης να εκμεταλλευτούμε το απλό και ελεγχόμενο σύστημα συνθετικών κυττάρων για να μοντελοποιήσουμε τις βασικές ιδιότητες των διαδικασιών μόλυνσης, εμβολιασμού και αντίστασης. Ενώ τα συνθετικά κύτταρα δεν εξελίσσονται ούτε αυτοαναπαράγονται, αυτό το σύστημα επιτρέπει τη μελέτη της δυναμικής της μόλυνσης σε ένα απλό και εύκολο στην ανάλυση μοντέλο. Ελπίζουμε ότι οι αρχές της μόλυνσης που περιγράφονται εδώ θα βοηθήσουν στη δημιουργία πρακτικών και εφαρμόσιμων μοντέλων για διαφορετικά παθογόνα και τον μετριασμό των λοιμώξεων. Η μελέτη αυτού του απλοποιημένου συστήματος συνθετικών κυττάρων τόνισε τις θεμελιώδεις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του παρασίτου και του παθογόνου. Ενώ τα συνθετικά κύτταρα δεν είναι (ακόμα) ζωντανά και δεν έχουν την ικανότητα να υποστούν δαρβινική εξέλιξη, αυτό το σύστημα μας επιτρέπει να παρατηρούμε αλληλεπιδράσεις παθογόνου και ξενιστή χωρίς την ικανότητα να αναπτύξουμε φυσική ανοσία ή να αλλάξουμε τη λοιμογόνο δράση του παθογόνου. Ενώ η δυναμική μόλυνσης από τον ξενιστή που παρουσιάζεται εδώ χρησιμοποιεί συνθετικά κύτταρα που βασίζονται σε βακτήρια, αυτό το σύστημα δεν περιορίζεται εγγενώς σε βακτηριακό TxTl. Θα ήταν ακόμη δυνατό να φανταστεί κανείς τη χρήση του συστήματος που παρουσιάζεται εδώ για τη μοντελοποίηση της δυναμικής μόλυνσης σε πληθυσμούς που μοιάζουν με φυσικά οικοσυστήματα, εκμεταλλευόμενοι την απλότητα που είναι εγγενής στα συνθετικά κύτταρα για τον πλήρη έλεγχο και τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ διαφορετικών μελών μεγάλων πληθυσμών.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

(1)Εφαρμογές. Μητήρ. Σήμερα 2016, 19, 516−532.

(2) Gaut, NJ; Adamala, KP Ανασύσταση φυσικών κυτταρικών στοιχείων σε συνθετικά κύτταρα. Adv. Biol. 2021, 5, Αρ. 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, βουλευτής; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Shapes Gene Expression in Synthetic Cellular Nanosystems. Nat. Nanotechnol. 2013, 8, 602−608.

(4) Glantz, ST; Berlew, ΕΕ; Chow, BY Synthetic Cell-like Membrane Interfaces for Probing Dynamic Protein-Lipid Interactions, 1st ed.; Elsevier Inc, 2019; Τομ. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Υ.; Zhang, Χ.; Li, C.; Du, Η.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, Μ.; Han, X. Mimicking Cellular Metabolism in Artificial Cells: Universal Molecule Transport through the Membrane through Vesicle Fusion. Πρωκτικός. Chem. 2022, 94, 3811−3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. On the "Life-Likeness" of Synthetic Cells. Εμπρός. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8, Αρ. 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, Ο.; Elani, Y. Artificial Cell Mimics as Simplified Models for the Study of Cell Biology. Exp. Biol. Med. 2017, 242, 1309−1317.

(8) Chakraborty, Τ.; Wegner, SV Cell to Cell Signaling through Light in Artificial Cell Communities: Glowing Predator Lures Prey. ACS Nano 2021, 15, 9434−9444.

(9) Dupin, Α.; Simmel, FC Signaling and Differentiation in Multi-Compartmentalized in Vitro Gene Circuits που βασίζονται σε γαλάκτωμα. Nat. Chem. 2019, 11, 32−39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, Ρ.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, SS τεχνητά κύτταρα οδηγούν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Sci. Adv. 2020, 6, Αρ. eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Toward Synthetic Life: Biomimetic Synthetic Cell Communication. Curr. Γνώμη. Chem. Biol. 2021, 64, 165−173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ Controlling Synthetic Cell-Cell Communication. Εμπρός. ΜοΙ. Biosci. 2022, 8, αρ. 1321.

(13) Elani, Y. Interfacing Living and Synthetic Cells as an Emerging Frontier in Synthetic Biology. Angew. Chem., Int. Εκδ. 2021, 60, 5602− 5611.

(14) Rustad, Μ.; Eastlund, Α.; Jardine, Ρ.; Noireaux, V. Σύνθεση χωρίς κύτταρα TXTL του μολυσματικού βακτηριοφάγου Τ4 σε μια αντίδραση ενός δοκιμαστικού σωλήνα. Synth. Biol. 2018, 3, Αρ. ysy002.

(15) Marshall, R.; Noireaux, V. Quantitative Modeling of Transcription and Translation of an All-E. coli Σύστημα χωρίς κύτταρα. Sci. Απ. 2019, 9, Αρ. 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, Μ.; Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344−355.

(17) Deich, C.; Μετρητά, Β.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, Κ.; Engelhart, AE; Adamala, KP T7Max Transcription System. 2021, 1−28.

(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Μετρητά, Β.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Programmable Fusion and Differentiation of Synthetic Minimal Cells. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. Προγραμματιζόμενη σύντηξη φωσφολιπιδικών κυστιδίων που προκαλείται από DNA. Μαρμελάδα. Chem. Soc. 2007, 129, 9584− 9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, Μ.; Yeh Martín, Ν.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS Η μετάφραση χωρίς κελιά είναι πιο μεταβλητή από τη μεταγραφή. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638−647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. An E. coli Cell-free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29−41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, Α. Βιοαντιδραστήρας κυστιδίων ως βήμα προς μια τεχνητή διάταξη κυττάρων. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2004, 101, 17669−17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Engineering Genetic Circuit Aλληλεπιδράσεις εντός και μεταξύ συνθετικών ελάχιστων κυττάρων. Nat. Chem. 2017, 9, 431−439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, Η.; Libchaber, A. Toward a Artificial Cell Based on Gene Expression in Vesicles. Phys. Biol. 2005, 2, P1−P8.

(25) Krinsky, Ν.; Kaduri, Μ.; Zinger, Α.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, Μ.; Benhar, Ι.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Τα συνθετικά κύτταρα συνθέτουν θεραπευτικές πρωτεΐνες μέσα σε όγκους. Adv. Υγειονομική περίθαλψη. 2018, 7, Αρ. 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Μέθοδοι Παρασκευής υψηλής απόδοσης ακατέργαστου εκχυλίσματος για ισχυρή σύνθεση πρωτεϊνών χωρίς κύτταρα. Sci. Rep. 2015, 5, No. 8663.

(27) Sun, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia Coli Based a TXTL Cell-free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1−15.

(28) Fujii, S.; Matsuura, Τ.; Sunami, Τ.; Nishikawa, Τ.; Kazuta, Υ.; Yomo, T. Liposome Display for in Vitro Selection and Evolution of Membrane Proteins. Nat. Πρωτοκ. 2014, 9, 1578−1591.

(29) Löffler, PMG; Ries, Ο.; Rabe, Α.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. A DNA-Programmed Liposome Fusion Cascade. Angew. Chem., Int. Εκδ. 2017, 56, 13228−13231.