Η απενεργοποίηση του RPX1 στο Arabidopsis προσδίδει αντίσταση στην Plutella Xylostella μέσω της συσσώρευσης του ομοτερπενίου DMNT

Αφηρημένη

Το λεπιδόπτερο παράσιτο της καλλιέργειας Plutella xylostella προκαλεί σοβαρούς περιορισμούς στην καλλιέργεια Brassica. Εδώ, αναφέρουμε έναν νέο ρόλο για το RPX1 (αντοχή στο P. xylostella) στην αντοχή σε αυτό το παράσιτο στο Arabidopsis thaliana. Η μετάλλαξη rpx1‐1 απωθεί τις προνύμφες P. xylostella και η διατροφή με τη μετάλλαξη rpx1‐1 βλάπτει σοβαρά τη δομή της περιτροφικής μήτρας στο μέσο έντερο των προνυμφών, επηρεάζοντας έτσι αρνητικά την ανάπτυξη και τη νύμφη των προνυμφών. Αυτή η αντίσταση προκύπτει από τη συσσώρευση αμυντικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένου του μονοτερπενίου (3Ε)-4,8-διμεθυλ-1,3,7-εννατριενίου (DMNT), λόγω της ανοδικής ρύθμισης της ΠΕΝΤΑΚΥΚΛΙΚΗΣ ΤΡΙΤΕΡΠΕΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ 1 (PEN1), η οποία κωδικοποιεί βασικό βιοσυνθετικό ένζυμο DMNT. Η προσβολή και ο τραυματισμός του P. xylostella προκαλούν αποικοδόμηση της πρωτεΐνης RPX1, η οποία μπορεί να προσφέρει ταχεία απόκριση στην προσβολή από έντομα. Η αδρανοποίηση του RPX1 και η υπερέκφραση του PEN1 δεν σχετίζονται με αρνητικούς συμβιβασμούς για την ανάπτυξη των φυτών, αλλά έχουν πολύ υψηλότερη παραγωγή σπόρων από τον άγριο τύπο παρουσία προσβολής από P. xylostella. Αυτή η μελέτη προσφέρει μια νέα στρατηγική για τη μοριακή αναπαραγωγή φυτών κατά του P. xylostella.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

  ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ

αντοχή σε παράσιτα, δευτερογενής μεταβολισμός, πτητικές εκπομπές

1|ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα παράσιτα των εντόμων όχι μόνο μειώνουν την απόδοση των καλλιεργειών αλλά επηρεάζουν επίσης την ποιότητα των καλλιεργειών (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Μεταξύ αυτών, ο αδαμαντοφόρος σκόρος Plutella xylostella είναι ένα ευρέως διαδεδομένο και επιβλαβές λεπιδόπτερο παράσιτο που τρέφεται με σταυρανθή καλλιέργειες όπως το κουνουπίδι και το λάχανο, προκαλώντας τεράστιες οικονομικές απώλειες. Επί του παρόντος, στη γεωργική διαχείριση, ο έλεγχος παρασίτων με χρήση αγροχημικών (π.χ. φυτοφάρμακα) ήταν πολύ επιτυχημένος και εφαρμόζεται σε μεγάλο βαθμό, αλλά αυτή η προσέγγιση γίνεται προβληματική λόγω πιθανής μόλυνσης του περιβάλλοντος και απειλών για την ανθρώπινη υγεία (Shakeel et al., 2017). Μια εναλλακτική προσέγγιση στη φυτική παραγωγή είναι η χρήση γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών με ενισχυμένη αντοχή στα παράσιτα, για παράδειγμα στην έκφραση φυτών του Bacillus thuringiensis (Jouzani et al., 2017) ή άλλων ετερόλογων εντομοτοξικών πρωτεϊνών (Douglas, 2018). Έχουν γίνει εκτεταμένες προσπάθειες για τον εντοπισμό νέων προσεγγίσεων για τον έλεγχο του P. xylostella στη γεωργία. Ωστόσο, τα αποτελεσματικά γονίδια, τα φυσικά φυτοφάρμακα και το ανθεκτικό γεννητικό πλάσμα παραμένουν περιορισμένα (Zhou & Jander, 2021). Μέσα από μια συνεχή κούρσα εξοπλισμών με παράσιτα εντόμων, τα φυτά έχουν αναπτύξει διάφορες ικανότητες για την καταπολέμηση των επιθέσεων εντόμων. Αντίστοιχα, τα φυτά συνθέτουν σειρές αμυντικών μεταβολιτών όπως βενζοξαζινοειδή (Handrick et al., 2016; Varsani et al., 2019), βενζοϊκό μεθύλιο (Feng & Zhang, 2017) και σεροτονίνη (Lu et al., 2018) τραυματισμός παρασίτων. Το ιασμονικό οξύ (JA), που ονομάζεται επίσης «ορμόνη του τραύματος», παίζει κεντρικό ρόλο σε διάφορες αποκρίσεις βλάβης που σχετίζονται με τραύματα που ξεκινούν από προσβολή από έντομα (Lortzing & Steppuhn, 2016). Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η JA λειτουργεί συνεργιστικά ή/και ανταγωνιστικά με άλλες φυτοορμόνες, όπως το σαλικυλικό οξύ (SA) και το αιθυλένιο (Costarelli et al., 2020; Ma et al., 2019). Εκτός από την άμεση άμυνα, τα φυτά που έχουν υποστεί βλάβη από επιθέσεις εντόμων απελευθερώνουν διάφορες πτητικές ενώσεις που προσελκύουν τους φυσικούς εχθρούς των φυτοφάγων (Gols, 2014). Από αυτά τα πολύπλοκα πτητικά μείγματα, οι ενώσεις ομοτερπενίου (3E)-4,8-διμεθυλ-1,3,7-εννατριένιο (DMNT) και (E, E) -4,8,12-τριμεθυλ-1,3,7, 11-τριδεκατετραένιο (TMTT) έχουν αναφερθεί σε πολλά είδη φυτών όπως Arabidopsis (Lee et al., 2010; Sohrabi et al., 2015), ρύζι (Li et al., 2018), αραβόσιτος (Gouinguené et al., 2005 Richter et al., 2016) και βαμβάκι (Liu et al., 2018). Αρκετές μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι το DMNT δρα ως μόριο σήματος που προκαλεί άμυνες κατά των φυτοφάγων κατά την επικοινωνία φυτού-φυτού (Arimura et al., 2000; Meents et al., 2019). Για παράδειγμα, μετά από ζημιά από μασητικά έντομα, ορισμένες γλυκοπατάτες εκπέμπουν DMNT, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα τη συστηματική επαγωγή του διαστρέμματος του αναστολέα πρωτεάσης σε γειτονικά φυτά γλυκοπατάτας και τα καθιστά δύσπεπτα για τα έντομα (Meents et al., 2019). Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί για φυτά τσαγιού (Jing et al., 2020). Πρόσφατα, ανακαλύψαμε ότι το DMNT παίζει ρόλο στη θανάτωση των προνυμφών P. xylostella διαταράσσοντας το φράγμα της περιτροφικής μήτρας (PM) στο μεσαίο έντερο του εντόμου (Chen et al., 2021).

Στα ανώτερα φυτά, τα μονοπάτια βιοσύνθεσης DMNT και TMTT έχουν καλά χαρακτηριστεί μέσω αντίστροφης γενετικής και βιοχημικών αναλύσεων. Στον αραβόσιτο, το DMNT και το TMTT παράγονται από την οξειδωτική αποικοδόμηση της (Ε)-νερολιδόλης και (Ε, Ε)-γερανυλικής λιναλοόλης από δύο μονοοξυγενάσες P450, τις CYP92C5 και CYP92C6 (Richter et al., 2016). Στο βαμβάκι, δύο γονίδια CYP (GhCYP82L1 και GhCYP82L2) είναι υπεύθυνα για τη μετατροπή της (Ε)-νερολιδόλης σε DMNT και της (Ε, Ε)-γερανυλικής λιναλοόλης σε TMTT (Liu et al., 2018). Στις ρίζες Arabidopsis, το DMNT καταλύεται από τον πρόδρομο C30 τριτερπενοδιόλη, την κανναβιδιόλη, από τη μονοοξυγενάση του κυτοχρώματος P450 που κωδικοποιείται από το ειδικό για τη ρίζα γονίδιο CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Μια μελέτη που χρησιμοποιεί ζύμη ως πρότυπο οργανισμό παρουσίασε τα στοιχεία ότι η κανναβιδιόλη παράγεται από το 2,3-οξειδοσκαλένιο από τη συνθάση κανναβιδιόλης PEN1 (Xiang et al., 2006) και η έκφραση της οποίας συνδέεται συνεργιστικά με το CYP705A1 (Sohrabi et al. ., 2015). Ωστόσο, η ρύθμιση των βασικών γονιδίων στη βιοσύνθεση DMNT παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Το γονίδιο RPX1 που περιγράφεται σε αυτή τη μελέτη κωδικοποιεί μια νέα πρωτεΐνη που δεσμεύει το καπάκι (CBP), η οποία είναι μέλος της οικογένειας γονιδίων του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 4Ε (eIF4E). Στα φυτά, η οικογένεια eIF4E αποτελείται από eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E και nCBP, τα οποία παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη της εξαρτώμενης από το καπάκι μετάφρασης mRNA (Rhoads, 2009). Τα μέλη της οικογένειας eIF4E είναι οι κύριες πηγές υπολειπόμενης αντοχής στον ιό της πατάτας Y (PVY) - το πιο επιβλαβές παθογόνο που επηρεάζει την απόδοση και την ποιότητα της πατάτας, και η χρήση της τεχνολογίας CRISPR-Cas9 που στοχεύει το γονίδιο eIF4E1 επεκτείνει το φάσμα αντοχής του ιού πατάτας Y του Solanum tuberosum (Lucioli et al., 2022). Ομοίως, η επεξεργασία των ισομορφών eIF4E nCBP-1 και nCBP-2 με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas9 μειώνει τη σοβαρότητα και τη συχνότητα των συμπτωμάτων που προκαλούνται από τη νόσο του καφέ ραβδώσεων της μανιόκας (Gomez et al., 2019). Επιπλέον, μελέτες στο Arabidopsis καταδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια nCBP παίζει ρόλο στον περιορισμό της κίνησης από κύτταρο σε κύτταρο των φυτικών ιών (Keima et al., 2017). Ωστόσο, η λειτουργία των nCBPs στην άμυνα των φυτοφάγων δεν έχει αναφερθεί. Εδώ, χρησιμοποιούμε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση για να χαρακτηρίσουμε λειτουργικά το γονίδιο Arabidopsis RPX1, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στην αντοχή των φυτών στο P. xylostella. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η κατάρρευση του RPX1 έχει ως αποτέλεσμα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (DEGs) και συσσώρευση ενώσεων. Ένα από τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω είναι το PEN1, το οποίο είναι κλειδί για τη βιοσύνθεση DMNT. Η προσβολή του μεταλλάγματος rpx1 και η συσσώρευση DMNT επηρεάζουν τη δομή PM του P. xylostella και προκαλούν αναπτυξιακά ελαττώματα προνυμφών και θάνατο. Περαιτέρω στοιχεία καταδεικνύουν ότι η προσβολή και ο τραυματισμός του P. xylostella προκαλούν αποικοδόμηση της πρωτεΐνης RPX1, η οποία μπορεί, με τη σειρά της, να οδηγήσει σε ανθεκτικότητα των φυτών στα έντομα.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Φυτικά υλικά και συνθήκες ανάπτυξης

Οι σπόροι Arabidopsis παραγγέλθηκαν από το Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC, http://Arabidopsis.info/). Οι σπόροι αποστειρώθηκαν επιφανειακά, σπάρθηκαν σε μέσο Murashige και Skoog (MS) και στρωματοποιήθηκαν στους 5 βαθμούς σε θάλαμο ανάπτυξης κάτω από φωτοπερίοδο μικρής ημέρας (8 ώρες φως, 16 ώρες σκοτάδι) για 3 ημέρες. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στους 22 βαθμούς στο θερμοκήπιο σε φωτοπερίοδο μεγάλης ημέρας (16 ώρες φως, 8 ώρες σκοτάδι) με κανονική συντήρηση των φυτών.

2.2|Πειράματα και βιοδοκιμές επιλογής (προτίμησης) και μη επιλογής

Τα αυγά P. xylostella αγοράστηκαν από την εταιρεία Henan Jiyuan Baiyun (Κατ: HJB004, που αναπτύχθηκε το 2009, πολλαπλασιάστηκαν για επιστημονική έρευνα σε ελεγχόμενο περιβάλλον) και επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης ρυθμισμένο στους 26 βαθμούς, 16 ώρες φως/8 ώρες σκοτάδι. Για πειράματα επιλογής, μεταφέραμε φυτά Arabidopsis ηλικίας 3 εβδομάδων (οκτώ φυτά άγριου τύπου και μεταλλαγμένα, αντίστοιχα) σε δοκιμαστικές δεξαμενές που ήταν συνδεδεμένες σε κάθε άκρο του γυάλινου δοκιμαστικού σωλήνα και τα υπόλοιπα πειραματικά βήματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Chen et al., 2021). Χρησιμοποιήθηκαν οι προνύμφες τέταρτου σταδίου και συμπεριλήφθηκαν 15 προνύμφες σε κάθε πειραματικό αντίγραφο.

Για το πείραμα χωρίς επιλογή, άγριου τύπου και μεταλλαγμένα φυτά ηλικίας 3 εβδομάδων μεταφέρθηκαν σε χωριστά και ημι-ανοικτά τρυβλία Petri που περιείχαν τον ίδιο αριθμό 15 προνυμφών P. xylostella s-star. Τα επόμενα βήματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Chen et al., 2021).

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

2.3|Έλεγχος ανθεκτικών μεταλλαγμένων Arabidopsis έναντι του P. xylostella

Συλλέξαμε 179 μεταλλάγματα εισαγωγής Τ-DNA του Arabidopsis για έλεγχο αντοχής στο P. xylostalle. Τα μεταλλάγματα αναπτύχθηκαν σε μέσο MS και μεταμοσχεύθηκαν σε γλάστρες P7 (μέγεθος: 7 × 7 cm) υπό συνθήκες ανάπτυξης μεγάλης ημέρας (22 βαθμοί, 16 ώρες φως/8 ώρες σκοτάδι). Για να αποφύγουμε πιθανές περιβαλλοντικές επιδράσεις, μετακινούσαμε και περιστρέφαμε τις γλάστρες καθημερινά. Για την αρχική διαλογή μεταλλαγμάτων, δημιουργήσαμε δύο αντίγραφα αναπτύσσοντας κάθε μετάλλαγμα σε δύο γλάστρες, με φυτά Col-0 ως έλεγχο. Μετά από 2 εβδομάδες ανάπτυξης μετά τη μεταμόσχευση, όλα τα μεταλλαγμένα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία προτίμησης προνυμφών P. xylostella τρίτου σταδίου συγκρίνοντάς τα με Col-0, όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι μεταλλάξεις που έδειξαν διαφορετικές προτιμήσεις προνυμφών από το Col‐0 θεωρήθηκαν ως υποψήφιοι ανθεκτικοί ή ευαίσθητοι μεταλλάκτες και επιλέχθηκαν για περαιτέρω πειραματική επικύρωση και λειτουργικές μελέτες.

2.4|Κατασκευή πλασμιδίου και μετασχηματισμός γονιδίων

Για το κατασκεύασμα RPX1pro: RPX1, η γονιδιωματική κωδικοποιητική περιοχή RPX1 με 1,6 kb ανοδική αλληλουχία και 1 kb κατάντη αλληλουχία ενισχύθηκε με PCR από γονιδιωματικό DNA που εξήχθη από το Col‐0. Το συναρμολογημένο θραύσμα DNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα pGreenII-{0179 και μετασχηματίστηκε σε μετάλλαγμα rpx1-1 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο floral dip (Clough & Bent, 1998). Για την κατασκευή του RPX1pro: RPX1-GFP, προαγωγέας RPX1 (1,6 kb), κωδικοποιητική περιοχή και 1 kb 3' αμετάφραστες αλληλουχίες ενισχύθηκαν με PCR από το γονιδιωματικό DNA του Col-0. Το θραύσμα GFP ενισχύθηκε από ένα πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχίες GFP. Αυτά τα θραύσματα DNA συναρμολογήθηκαν στον φορέα pGreenII-{0179 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο cut-and-ligation και στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν σε ένα μετάλλαγμα rpx1-1. Για το 35Spro: κατασκεύασμα RPX1-FLAG, οι κωδικοποιητικές αλληλουχίες RPX1 ενισχύθηκαν με PCR από cDNA αντίστροφη μεταγραφή από mRNA του Col-0. Το θραύσμα PCR κλωνοποιήθηκε σε φορέα pCambia1300-FLAG χρησιμοποιώντας τη μέθοδο έγχυσης (Clontech) και μετασχηματίστηκε σε Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) και 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): Οι κωδικοποιητικές αλληλουχίες αυτών των γονιδίων ενισχύθηκαν με PCR-από το Col‐0 cDNA και απολινώθηκαν στον p3SGNL‐ctor. Ένα τεχνητό microRNA (amiR) που στοχεύει το PEN1 σχεδιάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Schwab et al., 2006), ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο pRS300 ως εκμαγείο και συνδέθηκε σε μια τροποποιημένη έκδοση του φορέα pCambia1300m. Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Πίνακας S1.

2,5|Δοκιμασίες της δραστηριότητας της σ-τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST) και του κυτοχρώματος P450 (CYP450) σε προνύμφες P. xylostella

Αφού οι προνύμφες P. xylostella δεύτερου σταδίου τροφοδοτήθηκαν με σπορόφυτα Col‐0 ή rpx1‐1 για 72 ώρες, συλλέχθηκαν και αλέστηκαν σε λεπτή σκόνη σε υγρό άζωτο. Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανάλυσης δραστηριότητας GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, cat: A004) και CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, cat: P450), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δοκιμασία είχε τρία βιολογικά αντίγραφα, και κάθε αντίγραφο περιελάμβανε 30 προνύμφες Ρ. xylostella.

2.6|Δοκιμασίες στρουμφ

Σπορόφυτα Col-0 ή rpx1-1 τριών εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για τη διατροφή των προνυμφών P. xylostella δεύτερου σταδίου. Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις (Chen et al., 2021). Χρησιμοποιήθηκαν έξι βιολογικά αντίγραφα και κάθε αντίγραφο περιείχε 15 προνύμφες P. xylostella.

2.7|Μικροσκοπική παρατήρηση της δομής των PM των προνυμφών

Η ανάλυση ανατομίας της δομής των PM προνυμφών και η ανάλυση διατομής παραφίνης του εντέρου της προνύμφης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Chen et al., 2021).

2,8|Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης και αλληλούχιση μεταγραφομένων (RNA-seq)

Τα σπορόφυτα Col‐{{0}} και rpx1‐1 αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες ανάπτυξης μεγάλης ημέρας (16 ώρες φως, 8 ώρες σκοτάδι) στους 22 βαθμούς. Σπορόφυτα Col-0 και rpx1-1 δύο εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας μεταγραφομένων. Κάθε δείγμα περιείχε τρία βιολογικά αντίγραφα. Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Pure Plant Kit RNAprep (TIANGEN, αριθμός καταλόγου: DP441). Τα cDNA πρώτης έλικος συντέθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το σύστημα One-Step RT (Takara Bio) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το qRT‐PCR διεξήχθη με τους ειδικούς για το γονίδιο εκκινητές που αναφέρονται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Πίνακας S1 σε ένα όργανο Roche Light Cycler 480. Η κατασκευή και ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των βιβλιοθηκών RNA‐seq πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Biomarker (Πεκίνο, Κίνα) σε μια πλατφόρμα Illumina HiSeq. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε το edgeR για να πραγματοποιήσουμε ανάλυση διαφορικής έκφρασης (ορίστηκε το όριο σημαντικής διαφοράς:|log2foldchange|Μεγαλύτερο ή ίσο με 1, p < 0,05). Πραγματοποιήθηκαν τρία βιολογικά αντίγραφα για τα Col‐0 και rpx1‐1 και τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια παρατίθενται στο σύνολο δεδομένων S1.

2,9|Ανάλυση εκχύλισης και αέριας χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας (GC-MS) του DMNT και του DMNT-2 H στο Arabidopsis

Η εξαγωγή και η ανάλυση DMNT πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις (Sohrabi et al., 2015). Στις δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν 2 g δενδρυλλίων Arabidopsis ηλικίας 3 εβδομάδων για εκχύλιση και μέτρηση DMNT.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Παρασκευή και χαρακτηρισμός DMNT

Το DMNT συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις (HJ Huang & Yang, 2007). Εν συντομία, μια φιάλη με στρογγυλό πάτο των 500 ml εξοπλισμένη με μαγνητική ράβδο ανάδευσης επικαλυμμένη με τεφλόν φορτώθηκε με 1 g (6,48 mmol) αλλυλικής αλκοόλης και 50 ml διχλωρομεθανίου. Το διάλυμα αναδεύτηκε έντονα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3,6 g ενεργού διοξειδίου του μαγγανίου, ακολουθούμενο από την προσθήκη 1−2 g οξειδωτικού κάθε 2−3 ώρες μέχρι την ολοκλήρωση της αντίδρασης. Το προϊόν στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της επιθυμητής ένωσης μέσω μιας συνειδητής αντίδρασης. Η δομή και η καθαρότητα του DMNT επιβεβαιώθηκαν με φασματοσκοπικές προσεγγίσεις πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1Η (NMR) και 13C NMR.

2.11|Θεραπεία DMNT του P. xylostela

Οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε τρυβλία Petri καλυμμένα με διαφανείς πλαστικές μεμβράνες με πολλαπλές οπές. Το DMNT αραιώθηκε σε παραφινέλαιο (Sigma‐Aldrich) στην επιθυμητή δόση (2,5 nmol/L−25 μmol/L) και εγχύθηκε στη χορτονομή όπως περιγράφεται στο κείμενο. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σε έξι βιολογικά αντίγραφα, με κάθε αντίγραφο να αποτελείται από 15 προνύμφες. Η ανάπτυξη προνυμφών καταγράφηκε με φωτογραφική τεκμηρίωση. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ζωοτροφή που εγχύθηκε με τον ίδιο όγκο διαλύτη παραφινελαίου.

2.12|Μέτρηση της περιεκτικότητας σε JA και SA σε δενδρύλλια Arabidopsis

Οι δοκιμές διεξήχθησαν από την Nanjing Convinced-test Technology Company. Σπορόφυτα Col-{{0}} και rpx1-1 ηλικίας δύο εβδομάδων προσβλήθηκαν με 15 προνύμφες P. xylostella s-star, με μη μολυσμένα σπορόφυτα ως έλεγχο. Τοποθετήσαμε δύο προνύμφες σε κάθε φυτό της ομάδας προσβολής για να διασφαλίσουμε ότι όλα τα φυτά είχαν προσβληθεί. Μετά από 24 ώρες, συλλέχθηκαν δείγματα φυτών και καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο για προσδιορισμό JA και SA. Τα δείγματα αλέστηκαν σε λεπτή σκόνη σε υγρό άζωτο και εκχυλίστηκαν με διάλυμα εκχύλισης ισοπροπανόλης-νερού-υδροχλωρικού οξέος, ακολουθούμενο από την προσθήκη 8 ul δευτεριωμένου σαλικυλικού οξέος (D-SA) και διυδροϊασμονικού οξέος (2HJA) (1 μg /ml έκαστο) ως εσωτερικά πρότυπα. Στη συνέχεια προστέθηκε διχλωρομεθάνιο και το διάλυμα αναμίχθηκε καλά σε στροφέα για 30 λεπτά. Αφού λήφθηκε η κατώτερη οργανική φάση με φυγοκέντρηση στις 13,{{1{2{2{22{22}}}}}} rpm για 5 λεπτά, ξηράνθηκε με άζωτο, επαναδιαλύθηκε σε μεθανόλη (0 0,1% μυρμηκικό οξύ) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στους 13,000 g για 10 λεπτό. Τέλος, το υπερκείμενο διηθήθηκε μέσω μεμβράνης οργανικού φίλτρου 0,22 μm και αναλύθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (HPLC-MS/MS). Όλα τα στάδια εκχύλισης πραγματοποιήθηκαν στους 4 βαθμούς. Οι ταυτότητες των JA και SA προσδιορίστηκαν με βάση τον χρόνο αιχμής των ουσιών-στόχων και την αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z) των αντίστοιχων ιόντων. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των JA και SA προσαρμόστηκε χρησιμοποιώντας μια εξίσωση γραμμικής παλινδρόμησης που λήφθηκε από καμπύλες εσωτερικών προτύπων. Για την απόκτηση της καμπύλης εσωτερικού προτύπου, παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα SA και JA με βαθμίδες 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 και 200 ​​ng/ml χρησιμοποιώντας μεθανόλη (0,1% μυρμηκικό οξύ) ως διαλύτη, και διαλύματα εσωτερικού προτύπου με τελική συγκέντρωση 20 ng/ml προστέθηκαν στο πραγματικό οικόπεδο. Οι ανωμαλίες γραμμικότητας αφαιρέθηκαν από τις εξισώσεις των τυπικών καμπυλών. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Ανάλυση μεταφοράς DMNT στο Arabidopsis

Το DMNT διαλύθηκε σε DMSO και προστέθηκε στο μέσο MS χωρίς γλυκόζη. Φυτά Arabidopsis ηλικίας τριών εβδομάδων μεταφέρθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες και οι ρίζες τους βυθίστηκαν σε μέσο MS με DMNT ή DMSO (μάρτυρας). Για να αποφευχθεί η μόλυνση, οι δοκιμαστικοί σωλήνες καλύφθηκαν με δύο στρώματα παραφίλμ και δημιουργήθηκε μια μικρή τρύπα στο φιλμ, μέσω της οποίας οι ρίζες των φυτών τοποθετήθηκαν σε μέσο MS για περαιτέρω ανάπτυξη. Μετά από 24 ώρες, οι ρίζες των φυτών που υποβλήθηκαν σε αγωγή αφαιρέθηκαν και τα φύλλα τους χρησιμοποιήθηκαν για να τροφοδοτήσουν το P. xylostella και στη συνέχεια αναλύθηκαν τα ποσοστά επιβίωσης των προνυμφών και η νύμφη. Το ίδιο πείραμα επαναλήφθηκε με ένα μέσο ανάπτυξης που περιείχε είτε 2H-σημασμένο DMNT είτε DMSO ως έλεγχο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα φύλλα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση GC-MS. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι το DMNT μπορεί να εξατμιστεί από το μέσο DMNT στα εναέρια μέρη και να προκαλέσει ιχνηλατική μόλυνση, δημιουργήθηκε μια ομάδα ελέγχου με τον ίδιο τρόπο, αλλά οι ρίζες των φυτών θάφτηκαν με υγρό βαμβάκι και δεν βυθίστηκαν σε μέσο DMNT. Μετά από 24 ώρες, τα εναέρια μέρη συλλέχθηκαν για περαιτέρω βιοδοκιμή ή ανίχνευση DMNT χρησιμοποιώντας GC-MS.

Οφέλη από σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

2.14|Εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση ανοσοστύπωσης του RPX1 στο Arabidopsis μετά από προσβολή από P. xylostella και θεραπείες τραυμάτων

Δημιουργήσαμε δύο τύπους θεραπειών για το διαγονιδιακό RPX1pro: RPX1‐GFP και 35Spro: RPX1‐FLAG σπορόφυτα Arabidopsis: προσβολή και τραυματισμό P. xylostella. Για προσβολή από προνύμφες, καλλιεργήσαμε δενδρύλλια Arabidopsis για 2 εβδομάδες και τα ταΐσαμε σε προνύμφες δεύτερου σταδίου (τοποθετήστε τουλάχιστον μία προνύμφη σε κάθε δενδρύλλιο), μετά από 15−120 λεπτά, οι προνύμφες αφαιρέθηκαν και τα προσβεβλημένα φυτά επιλέχθηκαν και συγκομίστηκαν για περαιτέρω πειράματα. Για να μιμηθούμε τον τραυματισμό, χρησιμοποιήσαμε μια βελόνα σύριγγας 1 ml για να δημιουργήσουμε μια τρύπα σε κάθε φύλλο Arabidopsis. Μετά από 15−120 λεπτά ανάπτυξης, τα σπορόφυτα συλλέχθηκαν.

Για να προσδιορίσουμε εάν τα μολυσμένα από P. xylostella φυτά θα μπορούσαν να προκαλέσουν αποικοδόμηση του RPX1, μολύναμε τα φυτά Col-0 με P. xylostella για 15−120 λεπτά και δοκιμάσαμε την επίδρασή του στο RPX1-GFP σε διαγονιδιακά φυτά. Όλα τα δείγματα αλέστηκαν σε σκόνη σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια ίσες ποσότητες μολυσμένου και μη μολυσμένου Col-0 αναμίχθηκαν χωριστά με την ίδια ποσότητα ιστών RPX1-GFP και επωάστηκαν σε διάλυμα στους 4 βαθμούς για 15 λεπτά. Τέλος, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοστύπωσης. Για ανάλυση western blot, οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης [50 mmol/L Tris-HCl pH8,0, 2,5 mmol/L EDTA pH8,0, 150 mmol/L NaCl, 1/1000 IGPAL ( v/v), 10% γλυκερόλη (v/v), 7% 2‐μερκαπτοαιθανόλη (v/v), 1 mmol/L PMSF και 1×κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης (Roche)]. Το εκχύλισμα πρωτεΐνης στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για διαχωρισμό PAGE και ανάλυση ανοσοστύπωσης με αντισώματα έναντι GFP (Roche, αραίωση: 1/1000) και FLAG (Abcam, αραίωση: 1/2000). Οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης χημειοφωταύγειας Tanon 5200.

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Το μεταλλαγμένο Arabidopsis rpx1 έχει βελτιωμένη αντοχή στο P. xylostella

Για να αναγνωρίσουμε γονίδια που εμπλέκονται στην αντίσταση του P. xylostella, συλλέξαμε 179 μεταλλαγμένα Arabidopsis και τα καλλιεργήσαμε σε ελεγχόμενο θερμοκήπιο. Δύο εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμή προτίμησης προνυμφών P. xylostella τρίτου σταδίου, σε απόκριση σε κάθε μεταλλαγμένο και άγριου τύπου Col-0. Σε αυτό το πείραμα διαλογής, 15 μεταλλάκτες έδειξαν διαφορετικές επιρροές στην προτίμηση των προνυμφών (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και ένα από αυτά επιλέχθηκε για αυτήν τη μελέτη και χαρακτηρίστηκε ως rpx1-1 (αντοχή στο P. xylostella). Το RPX1 κωδικοποιεί μια νέα πρωτεΐνη που δεσμεύει το καπάκι (nCBP) (Ruud et al., 1998). Η μετάλλαξη εισαγωγής T‐DNA ήταν SALK_131503 και η γονιδιακή έκφραση του RPX1 μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με άγριου τύπου Col‐0 (Εικόνα 1a, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S1a, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Πίνακας S1). Όταν φυτεύτηκαν κοντά, τα φυτά rpx1-1 παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο ζημιάς από τις προνύμφες P.xylostella σε σύγκριση με τα φυτά άγριου τύπου (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S1b).

ΣΧΗΜΑ 1 Η απενεργοποίηση του RPX1 προσδίδει αντίσταση στην Plutella xylostella στο Arabidopsis. (α) Γονιδιακή δομή του RPX1 (At5g18110). Τα πορτοκαλί πλαίσια υποδεικνύουν εξόνια και οι συμπαγείς γραμμές αντιπροσωπεύουν εσώνια και μη μεταφρασμένες περιοχές. Η εισαγωγή T‐DNA στο SALK_131503, που ονομάζεται rpx1‐1, βρίσκεται στο τέταρτο εξόνιο. (β) Οι προνύμφες P. xylostella κινούνται κατά προτίμηση προς τις γραμμές συμπλήρωσης άγριου τύπου Col‐0 και RPX1 (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1, RPX1com), σε σύγκριση με rpx1‐ 1. (γ) Σύγκριση Col‐ Φύλλα 0, rpx1‐1 και RPX1com μολυσμένα με P. xylostela. (δ) Οι προνύμφες P. xylostella επηρεάστηκαν σοβαρά από το rpx1-1, σε σύγκριση με εκείνες στις γραμμές άγριου τύπου Col-{0 και RPX1com, όσον αφορά το ανάστημα, το μέγεθος και το χρώμα της προνύμφης. (ε, στ) Οι προνύμφες P. xylostella που τρέφονται με rpx1-1 εμφανίζουν υψηλότερη θνησιμότητα (e) και χαμηλότερα ποσοστά νύμφης (f) σε σχέση με τις σειρές άγριου τύπου Col-0 και RPX1com. (g, h) Οι προνύμφες P. xylostella που τρέφονται με φυτά rpx1-1 έχουν αυξημένες δραστηριότητες S-τρανσφεράσης γλουταθειόνης (GST, g) και κυτοχρώματος P450 (CYP450, h), ενώ στις προνύμφες που τρέφονται με RPX1com, οι δραστηριότητες δεν έδειξαν διαφορά από αυτές στο Col‐0. Στο (b, e–h), τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem Τα διαφορετικά γράμματα σε κάθε επεξεργασία υποδεικνύουν σημαντική διαφορά (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, n=3 για b, g, h, n {{ 36}} για e, f).

Για να προσδιορίσουμε τον μηχανισμό που κρύβεται πίσω από την αντίσταση rpx1-1 στη μόλυνση από P. xylostela, πραγματοποιήσαμε δοκιμές προτίμησης και μη επιλογής. Στα πειράματα προτίμησης, οι προνύμφες P. xylostella τοποθετήθηκαν στο κέντρο του γυάλινου δοκιμαστικού σωλήνα σε ίση απόσταση από τα σπορόφυτα Col‐0 και rpx1‐1, μετά από 10–6{{11} } min, σημαντικά περισσότερες προνύμφες συγκεντρώθηκαν στην πλευρά Col‐0 από αυτές στην πλευρά rpx1‐1 (Εικόνα 1b). Στα πειράματα χωρίς επιλογή, ταΐσαμε ξεχωριστά δενδρύλλια Col-0 και rpx1-1 σε προνύμφες P. xylostella και παρατηρήσαμε ότι το Col-0 έχασε περισσότερους ιστούς φύλλων από το μεταλλαγμένο rpx1-1 (Εικόνα 1γ). Για να επιβεβαιώσουμε ότι το RPX1 ήταν το αιτιολογικό γονίδιο για την παρατηρούμενη αντίσταση, εισαγάγαμε ένα κατασκεύασμα συμπλήρωσης του RPX1 στο μετάλλαγμα rpx1‐1. Αυτές οι γραμμές συμπλήρωσης RPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1‐1, RPX1com) ήταν ευαίσθητες στη μόλυνση από P. xylostella, όπως προσδιορίστηκε από τις δοκιμές προτίμησης και μη επιλογής (Εικόνα 1b,c), οι οποίες υποδηλώνουν ότι το RPX1 εμπλέκεται στην αντίσταση του Arabidopsis σε Π. ξυλοστέλλα.

3.2|Η ανάπτυξη των προνυμφών P. xylostella επηρεάζεται αρνητικά από τη μετάλλαξη rpx1‐1

Για να διερευνήσουμε τη φυσιολογική απόκριση του P. xylostella στη σίτιση με μεταλλαγμένα rpx1-1, επιθεωρήσαμε την ανάπτυξη προνυμφών μετά από σίτιση με φυτά ηλικίας 3 εβδομάδων σειρών Col-0, rpx1-1 και RPX1com. Οι προνύμφες που τρέφονταν με φυτά rpx1-1 εμφάνισαν σοβαρά διακυβευμένη ανάπτυξη όσον αφορά το μέγεθος του σώματος. Το χρώμα του σώματος των προνυμφών ήταν επίσης διαφορετικό από αυτό των προνυμφών που τρέφονταν με φυτά Col-0. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε τέτοιες αλλαγές στις προνύμφες που τρέφονταν με σπορόφυτα RPX1com (Εικόνα 1δ). Περαιτέρω φαινοτυπική ανάλυση έδειξε ότι οι προνύμφες P. xylostella που τρέφονταν με rpx1-1 είχαν σημαντικά υψηλότερη θνησιμότητα και χαμηλότερα ποσοστά νύμφης από εκείνες που τρέφονταν με Col‐0 ή RPX1com (Εικόνα 1e,f). Επιπλέον, οι προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με rpx1-1 εμφάνισαν υψηλότερες ενζυματικές δραστηριότητες του GST και του CYP450, που είναι βιοδείκτες για βλάβη οργάνων ή ιστών (Cheng et al., 2018· Mikstacki et al., 2015), από εκείνες που Col‐0 και RPX1com (Εικόνα 1g,h), υποδηλώνοντας ότι ο ιστός της προνύμφης μπορεί να τραυματιστεί από την τροφοδοσία του rpx1‐1.

3.3|Το μεσαίο έντερο των προνυμφών P. xylostella είναι κατεστραμμένο μετά τη σίτιση με φυτά rpx1-1

Παρατηρήσαμε ότι οι προνύμφες που τρέφονταν με rpx1‐1 κατανάλωναν λιγότερους φυτικούς ιστούς και παρήγαγαν πολύ λιγότερα περιττώματα από εκείνες που τρέφονταν με άγριου τύπου Col‐0. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η πέψη των προνυμφών που τρέφονται με rpx1-1 μπορεί να επηρεαστεί. Για να ελέγξουμε εάν συνέβη διαρροή στο έντερο των προνυμφών που τροφοδοτήθηκαν με rpx1‐1, πραγματοποιήσαμε τη «δοκιμή Στρουμφ». Οι προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με άγριου τύπου σειρές Col-0 και RPX1com αφόδευσαν τη βαφή και δεν έμεινε οπτικά καμία χρωστική στο σώμα των προνυμφών, ενώ οι προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με rpx1-1 διατήρησαν σημαντική ποσότητα χρωστικής στο το μέσο έντερο και οι περιβάλλοντες ιστοί και οι προνύμφες έγιναν μπλε (Εικόνα 2α). Η ποσοτική ανάλυση των προνυμφών μπλε ('Smurf') και κανονικών ('no Smurf') προνύμφες έδειξε ότι η σίτιση φυτών rpx1-1 είχε ως αποτέλεσμα περισσότερα από τριπλάσια άτομα να εμφανίζουν 'Smurf' σε σύγκριση με εκείνα που τρέφονταν με άγριου τύπου Col-{{ 14}} ή RPX1com (Εικόνα 2β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η σίτιση του rpx1-1 μπορεί να προκαλέσει βλάβες και υψηλότερη διαπερατότητα στο μέσο έντερο των προνυμφών.

3.4|Η περιτροφική μήτρα του P. xylostella καταστρέφεται από την τροφοδοσία των φυταρίων rpx1‐1

Περαιτέρω ανατέμναμε και απομονώσαμε την περιτροφική μήτρα (PM) από τις προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με σπορόφυτα Col‐{{0}}, rpx1‐1 και RPX1com για δομική ανάλυση κάτω από ένα στερεομικροσκόπιο. Σε σύγκριση με το άθικτο και το βαρύ PM των προνυμφών που τρέφονταν με Col‐0 και RPX1com, οι προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με rpx1‐1 εμφάνισαν χαρακτηριστικά βλάβης και ήταν λεπτές, χαλαρές και ασυνεχείς (Εικόνα 2c–f). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω τα χαρακτηριστικά βλάβης του PM, λάβαμε εγκάρσιες τομές των δειγμάτων προνυμφών. Τα αποτελέσματα της χρώσης με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (HE) αποκάλυψαν ότι το PM των προνυμφών που τρέφονταν με Col-0 ήταν παχύ και άθικτο και ότι υπήρχε ένας εκτοπεριτροφικός χώρος (ES) μεταξύ των PM και των επιδερμικών κυττάρων του μέσου εντέρου (Εικόνα 2g). Αντίθετα, το PM στο μέσο έντερο των προνυμφών που τρέφονταν με rpx1-1 διαταράχθηκε σοβαρά και το εντερικό περιεχόμενο ήταν κοντά στο εντερικό τοίχωμα (όχι es, Εικόνα 2h). Όταν οι προνύμφες τροφοδοτήθηκαν με σπορόφυτα RPX1com, το PM και το ES τους δεν άλλαξαν σημαντικά (Εικόνα 2i,j). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το knockdown RPX1 έβλαψε το PM των προνυμφών P. xylostella.

3,5|Η συσσώρευση περιεκτικότητας σε DMNT στο rpx1-1 προσδίδει αντίσταση στις προνύμφες P. xylostella

Για να διερευνήσουμε εάν η καταστροφή του RPX1 αναδιαμορφώνει τους μεταβολίτες του Arabidopsis και οδηγεί σε αντίσταση στις προνύμφες P. xylostella, συγκρίναμε τις πτητικές οργανικές ενώσεις (VOCs) που απελευθερώνονται από φυτά rpx1‐1 και άγριου τύπου Col‐0. Τέσσερις ΠΟΕ (Εξανόλη, 3-αιθυλ-5μεθύλιο, Οκτάνη, 2,6-διμεθύλιο, Νονάνιο, 2,6-διμεθύλιο και DMNT) συσσωρεύτηκαν διαφορικά μεταξύ rpx1-1 και Col-0 (Εικόνα 3α). Για την περαιτέρω ανατομή του μοριακού μηχανισμού του rpx1-1 στην αντίσταση του P. xylostella, πραγματοποιήσαμε ανάλυση RNA-seq. Σε σύγκριση με το Col‐0, το μετάλλαγμα rpx1‐1 εμφάνισε 211 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Σύνολο δεδομένων S1). Η ανάλυση εμπλουτισμού KEGG έδειξε ότι αυτά τα DEG ανήκαν σε περισσότερα από 20 διαφορετικά μεταβολικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένης της βιοσύνθεσης σεσκιτερπενοειδών και τριτερπενοειδών, του μεταβολισμού του α-λινολενικού οξέος και των οδών μεταβολισμού της τυροσίνης (Εικόνα 3β, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Πίνακας S2). Σημειωτέον, η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη οδός ήταν η βιοσύνθεση σεσκιτερπενοειδή και τριτερπενοειδή, η οποία αποτελούνταν από τρεις DEG: At4g15340, At5g42600 και At5g48010 (Εικόνα 3β, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S2a–c). Το At4g15340 έχει αναφερθεί ότι κωδικοποιεί για το PEN1, μια κυκλάση οξειδοσκαλενίου που μετατρέπει το 2,3-οξειδοσκαλένιο σε αραβιδιόλη και οδηγεί στη σύνθεση βιοενεργού DMNT μέσω του CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2). Το At5g42600 κωδικοποιεί για την ανόργανη συνθάση 1 (MRN1), η οποία είναι βασικό συστατικό στη βιοσύνθεση ορυκτών. Το At5g48010 κωδικοποιεί τη συνθάση της θαλιανόλης (THAS), ένα ένζυμο που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της θαλιανόλης. Η Marneral και η θαλιανόλη έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στη διατήρηση της ανάπτυξης των φυτών (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S3). Μελετήσαμε τους πιθανούς ρόλους του MRN1 και του THAS στην αντοχή στα έντομα διερευνώντας την προτίμηση, τη θνησιμότητα και τα ποσοστά νυμφίας του P. xylostella τροφοδοτώντας τα με τα διαγονιδιακά δενδρύλλια Arabidopsis που υπερεκφράζουν MRN1 (35Spro: MRN1) και THAS (35Spro: THAS) Πληροφορίες: Εικόνα S4a,b). Δεν εντοπίστηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο διαγονιδίων και του άγριου τύπου Col-0 (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S4c–n), υποδηλώνοντας ότι η αντίσταση στα έντομα του rpx1-1 δεν εξαρτάται πιθανώς από αυτά τα δύο γονίδια.

ΕΙΚΟΝΑ 2 Η απενεργοποίηση του RPX1 βλάπτει τη δομή της περιτροφικής μήτρας (PM) στο μέσο έντερο της προνύμφης. (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες προνυμφών που τρέφονται με γραμμές Col‐0, rpx1‐1 και RPX1com που δείχνουν κατακράτηση βαφής, όπως αποδεικνύεται από την μπλε εμφάνισή τους, όπως ο χαρακτήρας κινουμένων σχεδίων Στρουμφ. (β) Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων φαίνεται στο (α). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem. τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν σημαντική διαφορά (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, n=6). (γ–στ) Υπερδομή PM προνυμφών που τρέφονται με γραμμές Col‐0 (c), rpx1‐1 (d) και RPX1com (e, f). Σημειώστε ότι το PM των προνυμφών που τρέφονται με Col‐0 και RPX1com είναι παχουλό και άθικτο, αλλά το PM των προνυμφών που τρέφονται με rpx1‐1 είναι λεπτό, ευαίσθητο και ασυνεχές σε ορισμένες περιοχές. (g–j) Η εγκάρσια τομή και η χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη δείχνουν βλάβη του PM από τις προνύμφες που τρέφονται με γραμμές Col‐0 (g), rpx1‐1 (h) ή RPX1com (i, j). [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

Ο εμπλουτισμός της βιοσύνθεσης τερπενοειδών στην ανάλυση KEGG (Εικόνα 3β) και η διαφορική συσσώρευση DMNT που ανιχνεύθηκε στο rpx1‐1 (Εικόνα 3α) υποδηλώνουν ότι το DMNT μπορεί να είναι μία από τις ενώσεις που εμπλέκονται στην αντοχή των φυτών στο P. xylostella. Παρόμοια με προηγούμενες αναφορές που είχαν μόλις ανιχνεύσει DMNT με ανάλυση GC‐MS στο Col‐0 (Liu et al., 2018; Sohrabi et al., 2015), θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε ίχνη DMNT σε μη μολυσμένο Col‐0 (Εικόνα 4a,b). Αντίθετα, τα επίπεδα DMNT ήταν πολύ εμπλουτισμένα (~8 ng/g) σε rpx1‐1 και οι γραμμές RPX1com έδειξαν πολύ χαμηλά επίπεδα DMNT, παρόμοια με αυτά στα φυτά Col‐0 (Εικόνα 4). Επιπλέον, κατά τη μόλυνση από P. xylostella, τα επίπεδα DMNT αυξήθηκαν (~20 ng/g) σε rpx1‐1, το οποίο ήταν υψηλότερο από αυτό στις γραμμές Col‐{0 και RPX1com (Εικόνα 4) . Συνθέσαμε DMNT in vitro χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη μέθοδο (Chen et al., 2021). Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις (Chen et al., 2021), το DMNT κατέστειλε την ανάπτυξη του P. xylostella, όπως αποδεικνύεται από την προτίμηση (2,5 μmol/L) και την απόδοση χωρίς επιλογή (0,25–25 μmol/L) ( Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S5a,b). Επιπλέον, τα αποτελέσματα χρώσης HE αποκάλυψαν ότι το PM των προνυμφών ελέγχου ήταν παχύ και άθικτο (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S5c), ενώ το PM των προνυμφών που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5 μmol/L DMNT για 48 ώρες ήταν λεπτή και ασυνεχής σε ορισμένες περιοχές (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S5d). Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η μετάλλαξη rpx1‐1 προκαλεί συσσώρευση DMNT, η οποία συμβάλλει στη θανάτωση των προνυμφών P. xylostella στο Arabidopsis. Τα JA και SA είναι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες που σχετίζονται στενά με το βιοτικό στρες. Για να προσδιορίσουμε εάν αυτές οι ουσίες συμβάλλουν στην αντίσταση του rpx1-1 στα έντομα, ελέγξαμε τα επίπεδα JA και SA των Col‐0 και rpx1‐1 πριν και μετά τη μόλυνση από το P. xylostella. Υπό συνθήκες χωρίς θεραπεία, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα JA και SA μεταξύ των φυτών rpx1‐1 και Col‐0 (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S6), και τα επίπεδα και των δύο ορμονών αυξήθηκαν σημαντικά στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση με P. xylostella . Συγκεκριμένα, μετά τη μόλυνση, η περιεκτικότητα σε SA ήταν σημαντικά χαμηλότερη στο rpx1‐1 σε σύγκριση με το Col‐0, ενώ η περιεκτικότητα σε JA ήταν πολύ υψηλότερη στο rpx1‐1 από ό,τι στο Col‐0 (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S6).

ΣΧΗΜΑ 3 Σύγκριση πτητικών ενώσεων και γονιδιακής έκφρασης διαφορικά εμπλουτισμένων μεταξύ Col‐0 και rpx1‐1. (α) Διαφορικά εμπλουτισμένες πτητικές ενώσεις σε Col‐0 και rpx1‐1 ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο αέριας χρωματογραφίας-φασματοσκοπίας μάζας (GC‐MS). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντική διαφορά (*p < 0.05, **p < 0.01, μη ζευγαρωμένη t‐test δύο ουρών). (β) Μεταγραφική ανάλυση Col-0 και rpx1-1. Ανάλυση KEGG του εμπλουτισμού της οδού από διαφορετικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ του Col-0 και του μεταλλάγματος rpx1-1. Ένα εμπλουτισμένο μονοπάτι (κόκκινο βέλος) σχετίζεται με τη βιοσύνθεση σεσκιτερπενοειδή και τριτερπενοειδή και αποτελείται από τρία γονίδια, όπως φαίνεται στο σχήμα. [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

3.6|Το RPX1 ρυθμίζει τη συσσώρευση DMNT σε εξάρτηση από το PEN1

Για να διερευνήσουμε τη συμβολή του PEN1 στη συσσώρευση DMNT που ρυθμίζεται με rpx1-1, δημιουργήσαμε ένα κατασκεύασμα που περιέχει ένα τεχνητό miRNA (PEN1amiR) και το μετασχηματίσαμε σε μεταλλάκτες rpx1-1. Δημιουργήσαμε επίσης μια κατασκευή υπερέκφρασης PEN1, η οποία μετατράπηκε σε Col‐0 (35pro: PEN1/Col‐{{1{0}}). Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι το PEN1 καταρρίφθηκε (4-7 φορές) στο PEN1amiR/rpx1-1 σε σύγκριση με αυτό του rpx1-1 και υπερεκφράστηκε (~2,5 φορές) στο 35Spro: PEN1 σε σύγκριση με το Col-0 (Εικόνα 5α). Σε αυτές τις διαγονιδιακές σειρές, η έκφραση του RPX1 δεν επηρεάστηκε από την πτώση ή την υπερέκφραση του PEN1 (Εικόνα 5β). Όταν μολύνθηκε με P. xylostella για 6-24 ώρες, η έκφραση του PEN1 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στο Col-0 και rpx1-1, και πολύ υψηλότερη έκφραση PEN1 επιτεύχθηκε σε rpx1-1 μετά από 24 ώρες προσβολής (Εικόνα 5γ) . Στη συνέχεια, μετρήσαμε το περιεχόμενο DMNT σε Col‐0, rpx1‐1, PEN1amiR/rpx1‐1 και 35Spro: PEN1/Col‐{{5{{{0}}. Χωρίς προσβολή από P. xylostella, το rpx1‐1 παρήγαγε υψηλότερα επίπεδα DMNT από το Col‐{75}} (Εικόνα 5d,e,f,k,l) ​​και όταν το PEN1 καταρρίφθηκε από τεχνητό microRNA στο rpx1‐1 (PEN1amiR /rpx1‐1), τα επίπεδα DMNT μειώθηκαν, παρουσιάζοντας πολύ χαμηλότερο επίπεδο από αυτό στο rpx1‐1 (Εικόνα 5d,g,h,m,n). Μετά την προσβολή των προνυμφών, τα επίπεδα DMNT στα σπορόφυτα Col‐0 και rpx1‐1 ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω, αλλά στα σπορόφυτα PEN1amiR/rpx1‐1, το επίπεδο DMNT δεν μπορούσε να προκληθεί και ήταν πολύ χαμηλότερο από αυτό στο rpx1‐1 (Εικόνα 5δ, g,h,m,n), υποδηλώνοντας ότι το PEN1 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη βιοσύνθεση DMNT που ρυθμίζεται με RPX1, όπως φαίνεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S3. Σύμφωνα με αυτό, το DMNT συσσωρεύτηκε σε μεγάλο βαθμό στα σπορόφυτα 35Spro: PEN1/Col‐0 (Εικόνα 5δ, i, j, o, p).

ΣΧΗΜΑ 4 Η απώλεια του RPX1 αυξάνει τη συσσώρευση διμεθυλ-1,3,7-εννατριενίου (DMNT). (α) ανάλυση αερίου χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC-MS) του DMNT σε γραμμές Col‐0, rpx1‐1 και RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1‐1). Το πρότυπο DMNT εμφανίζεται στο κάτω μέρος. (β) Χρωματογραφία ολικού ιόντος (TIC) DMNT που ελήφθη από Col‐0, rpx1‐1 και RPX1com. (γ) Η περιεκτικότητα σε DMNT αυξάνεται στο μετάλλαγμα rpx1‐ 1 αλλά επιστρέφει σε επίπεδα άγριου τύπου στα διαγονιδιακά φυτά RPX1com. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem. τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν σημαντική διαφορά (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, n=3). [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

3.7|Το PEN1 συμβάλλει στη θανάτωση του P. xylostella σε rpx1‐1

Δεδομένης της παρατήρησης ότι η αναστολή του PEN1 θα μπορούσε να μετριάσει τη συσσώρευση DMNT που προκαλείται από την αδρανοποίηση του RPX1 (Εικόνα 5), πραγματοποιήσαμε βιοδοκιμασίες στο νοκ ντάουν του PEN1 και στην υπερέκφραση του διαγονιδιακού Arabidopsis για να δείξουμε τον βιολογικό του ρόλο. Βρήκαμε ότι οι προνύμφες P. xylostella δεν έδειξαν προτίμηση για τα φυτά amiR‐PEN1/rpx1‐1 σε σύγκριση με το Col‐0 (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S7). Εν τω μεταξύ, οι προνύμφες P. xylostella που τροφοδοτήθηκαν με PEN1‐amiR/rpx1‐1 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερη θνησιμότητα και υψηλότερα ποσοστά νύμφης από την rpx1‐1, ενώ οι προνύμφες που τροφοδοτήθηκαν με 35Spro: PEN1/Col‐{0 έδειξαν υψηλότερη θνησιμότητα και χαμηλότερο νεογνό ποσοστά από αυτά που τροφοδοτούνται με Col‐0 (Εικόνα 6a,b). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, περαιτέρω πειράματα «Smurf test» και διατομής έδειξαν ότι το PEN1‐amiR/rpx1‐1 είχε φυσιολογικά και άθικτα έντερα και PM σε σύγκριση με τις προνύμφες που τρέφονταν με rpx1‐1 (Εικόνα 6c,d,g,h), και η υπερβολική έκφραση του ΡΕΝ1 προκάλεσε σοβαρή βλάβη στο μέσο έντερο και στο PM των προνυμφών P. xylostella (Εικόνα 6c,d, i,j). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή του PEN1 θα μπορούσε να καταστείλει τις αρνητικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη των προνυμφών που προκαλείται από την αδρανοποίηση του RPX1, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στην τοξική επίδραση που προκαλείται από rpx1-1- στις προνύμφες P. xylostella.

3.8|Το DMNT μεταφέρει από τις ρίζες στα εναέρια μέρη του Arabidopsis 

Το PEN1 έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται κυρίως στις ρίζες Arabidopsis (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S8a), το οποίο είναι διαφορετικό από τα αποτελέσματα που έδειξαν τα εναέρια μέρη του rpx1-1 τοξικότητα στο P. xylostella με τρόπο που εξαρτάται από το PEN1 (Εικόνα 6). Ως εκ τούτου, διατυπώσαμε μια εναλλακτική υπόθεση: τα φυτά συνθέτουν το DMNT κυρίως στις ρίζες και το μεταφέρουν στα εναέρια μέρη, όπου προάγει την αντίσταση στα έντομα. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, πραγματοποιήσαμε δύο προσδιορισμούς μεταφοράς DMNT. Στην πρώτη ανάλυση (Εικόνα 7α), επωάσαμε τις ρίζες των φυταρίων Arabidopsis ηλικίας 3- 3-εβδομάδων σε υγρό μέσο ανάπτυξης φυτών που περιέχει 2,5 μmol/L DMNT, χρησιμοποιώντας DMSO ως έλεγχο. Μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες, αποκόψαμε τα φύλλα Arabidopsis και τα προσφέραμε στις προνύμφες P. xylostella. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα DMSO, τα φύλλα από φυτά που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMNT προκάλεσαν σημαντικά υψηλότερη θνησιμότητα προνυμφών και χαμηλότερα ποσοστά νύμφης από τον έλεγχο (Εικόνα 7β, γ). Στο δεύτερο πείραμα με στόχο την απόκτηση περαιτέρω ανεξάρτητης επικύρωσης της μεταφοράς DMNT, επισημάναμε το DMNT με 2 H και προσθέσαμε DMNT-2 H στο υγρό μέσο ανάπτυξης φυτών. Μετά από 24 ώρες επώασης, το DMNT-2H ήταν πολύ εμπλουτισμένο στα φύλλα (Εικόνα 7d–i). Για να αποκλείσουμε την πιθανότητα το DMNT να εξατμιστεί από το υγρό μέσο ανάπτυξης στον αέρα και να μολύνει τα εναέρια μέρη των φυτών, δημιουργήσαμε έναν παράλληλο έλεγχο, ο οποίος πραγματοποιήθηκε με τον ίδιο τρόπο όπως στο σχήμα 7α, με τη διαφορά ότι οι ρίζες Arabidopsis δεν βυθίστηκαν σε υγρό μέσο ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν ανιχνεύθηκε DMNT‐2H στα εναέρια μέρη των φυτών (Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S8b,c). Έτσι, προτείνουμε το DMNT να μετακινείται από τις ρίζες, όπου παράγεται, στα φύλλα Arabidopsis, όπου προκαλεί τον θάνατο των παρασίτων.

ΣΧΗΜΑ 5 Το PEN1 συμβάλλει σημαντικό ρόλο στη συσσώρευση διμεθυλ-1,3,7-εννατριενίου (DMNT) στο rpx1-1. (α) Ανάλυση έκφρασης PEN1 σε Col‐0, rpx1‐1, knockdown PEN1 σε φόντο rpx1‐1 (PEN1‐amiR/rpx1‐1) και υπερέκφραση PEN1 (35Spro:PEN1/Col‐{{2{{{{ 22}}}}) γραμμές. (β) Έκφραση RPX1 σε Col‐{{30}}, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 και 35Spro:PEN1/Col‐0. (γ) Η έκφραση PEN1 προκαλείται από προσβολή από Plutella xylostella στο Col‐0 και rpx1‐1. (δ) Σύγκριση της συσσώρευσης DMNT μεταξύ Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 και 35Spro:PEN1/Col‐0. (e–j) ανάλυση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC‐MS) πτητικών που εκπέμπονται από Col‐0 (e), rpx1‐1 (f), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (g, h) και 35Spro: PEN1/ Col‐0 (i, j) γραμμές. (k–p) TIC του DMNT που λαμβάνεται από γραμμές Col‐0 (k), rpx1‐1 (l), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (m, n) και 35Spro: PEN1/Col‐0 (o, p) , που αντιστοιχεί στα δεδομένα στο (e–j). Στο (a–d), τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem. τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν σημαντική διαφορά (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, n=3). [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

3,9|Το RPX1 αποικοδομείται από προσβολή από P. xylostella και θεραπείες τραυμάτων

Δείξαμε ότι η έκφραση του PEN1 ρυθμίστηκε προς τα πάνω στα σπορόφυτα rpx1-1 και Arabidopsis μολυσμένα με προνύμφες P. xylostella (Εικόνα 5a,c), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι το RPX1 μπορεί επίσης να ανταποκριθεί σε προσβολή από προνύμφες. Για να επικυρώσουμε αυτήν την πρόβλεψη, διερευνήσαμε την πιθανή απόκριση του RPX1 στη μόλυνση από P. xylostella. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι το RPX1 εκφράστηκε σε διαφορετικούς ιστούς (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S9a), αλλά δεν είχε σημαντική ανταπόκριση σε προσβολή από προνύμφη 6–24 ωρών (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S9b). Επομένως, ελέγξαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης RPX1 σε διαγονιδιακά φυτά RPX1pro: RPX1‐GFP πραγματοποιώντας ανοσοστύπωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι χωρίς προσβολή από προνύμφες, η RPX1‐GFP ήταν σταθερή κατά τη διάρκεια των 0‐12{{40}} λεπτών. Αντίθετα, μετά από προσβολή από προνύμφες για 15 λεπτά, η RPX1‐GFP άρχισε να υποβαθμίζεται. μετά από 120 λεπτά, η πρωτεΐνη RPX1‐GFP μειώθηκε συνεχώς στο 6% περίπου του χρονικού σημείου έναρξης (Εικόνα 8α, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S10α). Ως έλεγχος, σε σπορόφυτα Arabidopsis που περιέχουν διαγονίδιο GFP, το GFP ήταν σχετικά σταθερό μετά από προσβολή από προνύμφη (Εικόνα 8β). Για να αποκλείσουμε την πιθανή επίδραση της ετικέτας GFP στη σταθερότητα του RPX1, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά φυτά RPX1 με ετικέτα FLAG (35Spro: RPX1‐FLAG) για να πραγματοποιήσουμε πειράματα προσβολής από προνύμφες, τα οποία έδειξαν σταθερά αποτελέσματα ότι το RPX1‐FLAG θα μπορούσε επίσης να υποβαθμιστεί από την προνύμφη προσβολή, παρόμοια με το RPX1‐GFP (Εικόνα 8γ). Η προσβολή από έντομα προκαλεί συχνά τραυματισμούς στα φυτά και η φυσική βλάβη μπορεί να προσομοιώσει εν μέρει τη διαδικασία διατροφής των φυτοφάγων εντόμων. Για να δείξουμε εάν ο τραυματισμός θα μπορούσε να προκαλέσει υποβάθμιση του RPX1, χρησιμοποιήσαμε μια βελόνα για να δημιουργήσουμε τρύπες στα φύλλα των φυτών για να μιμηθούν τον τραυματισμό και βρήκαμε ότι το RPX1‐GFP υποβαθμίστηκε μετά από 30 λεπτά θεραπειών (Εικόνα 8δ, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S10b). Για να κατανοήσουμε καλύτερα τον λόγο της αποικοδόμησης του RPX1 κατά την προσβολή από P. xylostella, επωάσαμε τους ιστούς των διαγονιδιακών φυτών RPX1-GFP μαζί σε διάλυμα για 15 λεπτά με αυτόν του Col-0, που είχε προσβληθεί από P. xylostella για 15-120 λεπτά. , ή ιστούς Col-0 χωρίς προσβολή. Η ανάλυση ανοσοστύπωσης έδειξε ότι το επίπεδο RPX1-GFP από τα δείγματα που επωάστηκαν με προμολυσμένο Col-0 ήταν πολύ χαμηλότερο από εκείνα με μη μολυσμένο Col-0 (Εικόνα 8e), υποδηλώνοντας ότι η προσβολή από P. xylostella προκάλεσε ορισμένους παράγοντες ή σήματα στο Col-0 που θα μπορούσε να οδηγήσει σε υποβάθμιση του RPX1.

3.10|Η μετάλλαξη rpx1‐1 προσδίδει ένα πλεονέκτημα στην ανάπτυξη και την αναπαραγωγή των φυτών

Ένα κοινό χαρακτηριστικό των αμυντικών αποκρίσεων ειδικά για τα φυτοφάγα είναι η αντιστάθμιση μεταξύ της αντοχής στα παράσιτα και της ανάπτυξης και αναπαραγωγής των φυτών (Li et al., 2018). Για να προσδιορίσουμε εάν ο γονότυπος στον τόπο RPX1 υπόκειται σε τέτοιου είδους συμβιβασμούς, συγκρίναμε την παραγωγή σπόρων σε μεταλλάγματα Col‐{{1{0}} και rpx1‐1. Απουσία προσβολής από P. xylostella, η απόδοση σπόρου ανά φυτό ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο γονότυπων (Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S11). Αντίθετα, η έκθεση φυτών rpx1‐1 και Col‐{17}} ηλικίας 3 εβδομάδων στη μόλυνση από P. xylostella ηλικίας 15 s-star για μόνο 72 ώρες μείωσε την τελική απόδοση σπόρου του Col‐0 κατά τρεις φορές, ενώ η απόδοση σπόρου σε rpx1-1 δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Επιπλέον, η απόδοση σπόρου του RPX1com ήταν παρόμοια με αυτή του Col-0, αλλά πολύ χαμηλότερη από αυτή του rpx1-1, υποδηλώνοντας ότι η αδρανοποίηση του RPX1 προσδίδει πλεονέκτημα στην παραγωγή σπόρων κατά την προσβολή από προνύμφες (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S11). Αξιολογήσαμε επίσης την παραγωγή σπόρων στο 35Spro: PEN1 διαγονιδιακό Arabidopsis και παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του PEN1 παρήγαγε υψηλότερη απόδοση σπόρων τόσο σε συνθήκες μολυσμένες από προνύμφες όσο και σε συνθήκες χωρίς μόλυνση (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S11). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μετάλλαξη rpx1-1 και η υψηλότερη έκφραση PEN1 προσδίδουν αντίσταση στο P. xylostella απουσία μιας τυπικής συσχέτισης ανάπτυξης, υπογραμμίζοντας τη δυνατότητα των RPX1 και PEN1 σε προγράμματα μοριακής αναπαραγωγής που στοχεύουν στη βελτίωση της παραγωγής καλλιεργειών.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Τα παράσιτα μειώνουν δραματικά τις αγρονομικές αποδόσεις και την ποιότητα, καθιστώντας την φυτοπροστασία προτεραιότητα και μακροπρόθεσμο στόχο για τους αγρότες και τους κτηνοτρόφους. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε το μεταλλαγμένο Arabidopsis rpx1‐1, το οποίο έδειξε υψηλή αντοχή στο P. xylostella, ένα σημαντικό λεπιδόπτερο παράσιτο των καλλιεργειών. Η ανάλυσή μας αποκάλυψε ότι η μετάλλαξη rpx1‐1 είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα μεταγραφής PEN1, συσσώρευση DMNT και βελτιωμένη αντοχή των φυτών έναντι των παρασίτων. Δείξαμε επίσης ότι η πρωτεΐνη RPX1 θα μπορούσε να αποικοδομηθεί με προσβολή από προνύμφες και θεραπεία τραυμάτων.

ΕΙΚΟΝΑ 6 Το PEN1 συμβάλλει στην ενισχυμένη αντίσταση του rpx1‐1 στην Plutella xylostella. (α, β) Το διαγονίδιο PEN1-amiR ανακουφίζει σημαντικά την αντίσταση του rpx1-1 στη μόλυνση από P. xylostella, ενώ το 35Spro: PEN1 ενισχύει την επίδραση αντίστασης, όπως αποδεικνύεται από τα ποσοστά θνησιμότητας (α) και νύμφης (β) των προνυμφών P. xylostella . (γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των προνυμφών που τρέφονται με Col‐0, rpx1‐1, PEN1‐amiR/rpx1‐1 και 35Spro: Σπορόφυτα PEN1 που παρουσιάζουν κατακράτηση βαφής, όπως αποδεικνύεται από την μπλε εμφάνισή τους, όπως το καρτούν Στρουμφ χαρακτήρας. (δ) Αποτελέσματα ποσοτικοποίησης των εικόνων που εμφανίζονται στο (γ). (e–j) Η εγκάρσια τομή και η χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη δείχνουν βλάβη του PM από τις προνύμφες που τρέφονται με Col‐0 (e), rpx1‐1 (f), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (g, η) και 35Spro: Σπορόφυτα PEN1 (i, j). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem. τα διαφορετικά γράμματα σε κάθε θεραπεία υποδεικνύουν σημαντική διαφορά στο (a, b, d) (μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης, n=6). [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

Στις δοκιμές μη επιλογής, το μετάλλαγμα rpx1-1 εμφάνισε σημαντική αντοχή στη μόλυνση από P. xylostella (Εικόνα 1γ). Αντίθετα, οι προνύμφες P. xylostella που τρέφονταν με φυτά rpx1‐1 εμφάνισαν σοβαρές αρνητικές αναπτυξιακές βλάβες (Εικόνα 1δ,ε). Αυτοί οι φαινότυποι αποδίδονται στην αδρανοποίηση του RPX1, επειδή οι γραμμές συμπλήρωσης RPX1 (RPX1com) είναι τόσο ευαίσθητες όσο το άγριου τύπου Col-0 (Εικόνα 1γ–ε), υποστηρίζοντας το συμπέρασμα ότι το RPX1 εμπλέκεται στην αντοχή στα παράσιτα. Εκτός από τη θανάτωση των προνυμφών, το μεταλλαγμένο rpx1-1 είχε επίσης μακροπρόθεσμη επίδραση στην ανάπτυξη των προνυμφών, συμπεριλαμβανομένης της νύμφης (Εικόνα 1στ), οδηγώντας σε μειωμένη αναπαραγωγή του παρασίτου.

ΣΧΗΜΑ 7 Το διμεθυλ-1,3,7-νονατριένιο (DMNT) μεταφέρεται από τις ρίζες Arabidopsis στα φύλλα. (α) Απεικόνιση της δοκιμασίας μεταφοράς DMNT χρησιμοποιώντας φυτά Arabidopsis. Το DMNT διαλύθηκε σε υγρό μέσο Murashige και Skoog. Μετά από μια καλλιέργεια 24-ωρών, οι ρίζες αποκόπηκαν και τα φύλλα χρησιμοποιήθηκαν για να τροφοδοτήσουν τις προνύμφες Plutella xylostella για τη βαθμολόγηση της θνησιμότητας και του ποσοστού νύμφης. (β, γ) Το DMNT, που μεταφέρεται από τις ρίζες στα φύλλα, έχει ως αποτέλεσμα υψηλότερη θνησιμότητα (β) και χαμηλότερα ποσοστά νύμφης (γ) των προνυμφών P. xylostella. (δ–στ) Το DMNT με σήμανση 2 H (DMNT- 2 H) μεταφέρεται από τη ρίζα στα φύλλα. Το DMNT-2H διαλύθηκε σε υγρό μέσο MS όπως στο (α) για 24 ώρες και στη συνέχεια τα φύλλα συλλέχθηκαν για ανάλυση GC-MS (e). Το DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (d). Το πρότυπο DMNT‐ 2 H εμφανίζεται για αναφορά (f). (g–i) TIC του DMNT‐ 2 H που λήφθηκε κατά τη διάρκεια των αναλύσεων μεταφοράς που φαίνονται στο (d–f). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± sem, στο (b, c) n=6, οι τιμές p εμφανίζονται δίπλα στις στήλες του ιστογράμματος για να υποδείξουν μια σημαντική διαφορά (two-tailed unpaired t-test). Σημειώστε ότι περισσότεροι έλεγχοι για τις αναλύσεις μεταφοράς περιλαμβάνονται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S8. [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

Επιπλέον, οι δοκιμές προτίμησης έδειξαν ότι τα μεταλλαγμένα άγριου τύπου Col-{{{{0}} και rpx1-1 ενδέχεται να εκπέμπουν διαφορετικές πτητικές ενώσεις. ένα από αυτά είναι το DMNT, το οποίο είναι αποτελεσματικό στην απώθηση παρασίτων (Εικόνες 1β, 3α, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S5a). Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, προτείνουμε ότι η συσσώρευση DMNT στο rpx1‐1 είναι ένας από τους λόγους για τη δηλητηρίαση από έντομα. Τα μονοπάτια σηματοδότησης JA και SA έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην αντοχή στα έντομα (Costarelli et al., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). Σε αυτή τη μελέτη, μετά από 24 ώρες σίτισης με έντομα, η περιεκτικότητα σε JA και SA σε μεταλλάγματα Col‐0 και rpx1‐1 αυξήθηκε και η αύξηση της περιεκτικότητας σε SA στο rpx1‐1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή στο Col‐0, ενώ η αύξηση της περιεκτικότητας σε JA ήταν πολύ μεγαλύτερη (Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S6), υποδηλώνοντας ότι το JA και το SA μπορεί επίσης να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση του rpx1‐1 στο P. xylostella. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι τόσο οι άμεσες όσο και οι έμμεσες επιδράσεις του rpx1-1 συμβάλλουν στην ενισχυμένη αντοχή του Arabidopsis έναντι των εντόμων.

ΣΧΗΜΑ 8 Η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης RPX1 προκαλείται από προσβολή από Plutella xylostella και θεραπείες τραυματισμού. (α) RPX1‐GFP από RPX1pro: Τα διαγονιδιακά φυτά RPX1‐ GFP αποικοδομούνται μετά από προσβολή από P. xylostella για 15−120 λεπτά. (β) Ως έλεγχος για το (α), το ίδιο το GFP από το 35Spro: Τα διαγονιδιακά φυτά GFP δεν παρουσιάζουν αποικοδόμηση κατά την προσβολή από προνύμφες. (γ) Σημαία RPX1 από 35Spro: Τα διαγονιδιακά φυτά σημαίας RPX1 αποικοδομούνται κατά την προσβολή από προνύμφες. (δ) RPX1‐GFP από RPX1pro: Τα διαγονιδιακά φυτά RPX1‐GFP αποικοδομούνται από 15−120 λεπτά θεραπείας τραυματισμού. (ε) RPX1‐GFP από RPX1pro: Τα διαγονιδιακά φυτά RPX1‐GFP αποικοδομούνται όταν οι ιστοί επωάζονται σε διάλυμα με τους ιστούς από φυτά Col‐0 που έχουν προσβληθεί από P. xylostella για 15−120 λεπτά. Οι τιμές κάτω από τις ζώνες ανοσοστύπωσης δείχνουν τη σχετική αφθονία πρωτεϊνών που ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ImageJ. Όλα αυτά τα πειράματα έχουν επαναληφθεί τουλάχιστον τρεις φορές και παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα. Περισσότερα πειραματικά δεδομένα με ανεξάρτητες διαγονιδιακές γραμμές φαίνονται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S10. [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο wileyonlinelibrary.com]

Παρουσιάζουμε αρκετές σειρές αποδεικτικών στοιχείων που καταδεικνύουν πώς η συσσώρευση DMNT με τη μεσολάβηση του PEN{{{{{{{{{{{0}}συμβάλλει στις λειτουργίες του RPX1 στην αντοχή των φυτών στο P. xylostella. Το PEN1, ένα βασικό γονίδιο που ανήκει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης σεσκιτερπενοειδών και τριτερπενοειδών, αναγνωρίστηκε από την ανάλυση KEGG των δεδομένων RNA‐seq από το μετάλλαγμα rpx1‐1 (Εικόνα 3β), παρέχοντας μια σύνδεση μεταξύ των RPX1, PEN1 και DMNT (Sohrabi et al. , 2015). Προς υποστήριξη του DMNT ως μία από τις αιτιολογικές ενώσεις που σκοτώνουν τις προνύμφες των παρασίτων, το DMNT συσσωρεύτηκε υψηλότερα στα μεταλλαγμένα rpx1‐1 από ό,τι στο Col‐0 (Εικόνα 3a), αλλά το επίπεδο στις γραμμές RPX1com αντιστράφηκε σε Col‐0 ( Εικόνα 4α–γ). Επιπλέον, το χημικά συντιθέμενο DMNT θα μπορούσε να απωθήσει και να σκοτώσει τις προνύμφες P. xylostella (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S5a,b), το οποίο είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα του rpx1‐1 (Εικόνα 1b,e). Επιπλέον, διαγονιδιακά φυτά που υπερέκφραζαν το PEN1 παρήγαγαν περισσότερο από τέσσερις φορές το DMNT στο Col-0 και προσέφεραν παρόμοια αντίσταση στο P. xylostella με το rpx1-1 (Εικόνες 5d, i, j, o, p και 6).

Είναι σημαντικό ότι η μείωση των επιπέδων μεταγραφής PEN1 στο rpx1‐1 μπλοκάρει τη βιοσύνθεση DMNT (Εικόνα 5δ, g, h, m, n) και μειώνει τη θανάτωση στις προνύμφες P. xylostella, οι οποίες είναι ευαίσθητες στη μόλυνση από P. xylostella (Εικόνα 6a,b ). Αυτά τα συνδυασμένα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η μετάλλαξη PEN1 μπορεί να καταστείλει τη λειτουργία της αδρανοποίησης του RPX1 στην αντοχή στα παράσιτα. Η βλάβη RPX1 προκαλεί υψηλότερη αφθονία PEN1 (Εικόνα 5α), ωστόσο το πώς ακριβώς το RPX1 ρυθμίζει την PEN1 και μεσολαβεί στη βιοσύνθεση του DMNT χρειάζεται περαιτέρω μελέτες. Δεδομένου ότι η RPX1 προβλέπεται ως μια νέα πρωτεΐνη που δεσμεύει το καπάκι που ανήκει στην οικογένεια eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud et al., 1998), είναι πιθανό η RPX1 να επηρεάσει την PEN1 επηρεάζοντας τη σταθερότητα του mRNA ή την αποτελεσματικότητα μετάφρασης πρωτεΐνης, κάτι που θα είναι σημαντικό θέμα σε μελλοντική μελέτη. Επιπλέον, θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα DMNT θα μπορούσαν ακόμα να προκληθούν σε υψηλότερα επίπεδα από τη μόλυνση από P. xylostella στο μετάλλαγμα rpx1‐1 (Εικόνα 5δ), υποδηλώνοντας ότι μπορεί να υπάρχουν κάποια άλλα μονοπάτια που ρυθμίζουν τη συσσώρευση DMNT ανεξάρτητα από το RPX1. Το DMNT έχει ανιχνευθεί σε ένα ευρύ φάσμα φυτικών ειδών, όπως το Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), το βαμβάκι (Liu et al., 2018) και τον αραβόσιτο (Richter et al., 2016). Επιπλέον, παρέχει έμμεση προστασία από φυτοφάγα παράσιτα προσελκύοντας αρπακτικά, επιτρέποντας στα φυτά να απομακρύνουν τις απειλές παρασίτων (Kappers et al., 2005; Lee et al., 2010; Li et al., 2018). Πρόσφατα αναφέραμε ότι θα μπορούσε να απωθήσει και να σκοτώσει τις προνύμφες P. xylostella καταστρέφοντας το PM στο μέσο έντερο της προνύμφης (Chen et al., 2021). Εδώ, διαπιστώσαμε ότι η δομή PM θα μπορούσε να καταστραφεί σοβαρά όταν οι προνύμφες τρέφονταν με σπορόφυτα που υπερεκφράζουν rpx1‐1 ή PEN1 (Εικόνες 2c–j και 6i,j). Αυτά τα αποτελέσματα συνάδουν με τα ευρήματα στα πειράματα επεξεργασίας DMNT που περιγράψαμε προηγουμένως (Chen et al., 2021), υποστηρίζοντας και πάλι την πρόταση ότι η συσσώρευση DMNT στο rpx1‐1 μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην απώθηση των παρασίτων και στον θάνατο. Το RPX1 ανήκει στην οικογένεια γονιδίων eIF4E (Rhoads, 2009) και εμπλέκεται στη μετακίνηση από κύτταρο σε κύτταρο των φυτικών ιών (Keima et al., 2017). Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η συσσώρευση DMNT συνδέεται με την ιική αντίσταση στα φυτά. Το PEN1 εκφράζεται ειδικά στις ρίζες Arabidopsis, όπου καταλύει τη βιοσύνθεση DMNT (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Με συνέπεια σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε υψηλή έκφραση PEN1 στις ρίζες και πολύ χαμηλή έκφραση στα φύλλα (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S8a). Παρατηρήσαμε ότι τα φύλλα του μεταλλάγματος rpx1-1 ήταν τοξικά για τις προνύμφες του P. xylostella (Εικόνα 1), υποδηλώνοντας ότι η συσσώρευση του DMNT και η σχετική αντίσταση στα παράσιτα στα φύλλα δεν μπορούν να εξηγηθούν απλώς με την ελάχιστη έκφραση του PEN1 σε αυτούς τους ιστούς. Με την έννοια, βρήκαμε ότι το DMNT μπορούσε να μεταφερθεί από τις ρίζες των φυτών στα εναέρια μέρη, όπως φαίνεται από τις δοκιμασίες μεταφοράς DMNT και την ανάλυση GC-MS εκχυλισμάτων φύλλων από τα φυτά που επωάστηκαν με DMNT-2 H στις ρίζες τους (Εικόνα 7). Το πώς μεταφέρεται αυτή η ένωση μέσα στα φυτά είναι ασαφές και μπορεί να αποτελέσει θέμα για περαιτέρω έρευνα. Τα φυτά έχουν την ικανότητα να ανέχονται και να καταπολεμούν τις επιθέσεις εντόμων με διάφορους τρόπους. Εδώ, πραγματοποιώντας ανάλυση ανοσοστύπωσης των διαγονιδιακών φυτών RPX1pro: RPX1‐GFP και 35Spro: RPX1‐FLAG, διαπιστώσαμε ότι κατά την προσβολή από P. xylostella, η πρωτεΐνη RPX1 θα μπορούσε να αποικοδομηθεί γρήγορα (Εικόνα 8a,c, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S10a), ενώ , στο επίπεδο έκφρασης mRNA, το RPX1 παρέμεινε ανεπηρέαστο (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S9b). Επί του παρόντος, ο τρόπος με τον οποίο αποικοδομείται η πρωτεΐνη RPX1 παραμένει ασαφής, αλλά τα δεδομένα μας έχουν κυρίως προτείνει ότι ο μηχανισμός αποικοδόμησης πρωτεΐνης μπορεί να εμπλέκεται στις οδούς σηματοδότησης του τραύματος (Εικόνα 8δ, Υποστηρικτικές Πληροφορίες: Εικόνα S10b).

Επιπλέον, το προμολυσμένο με P. xylostella Col-0 προκάλεσε την αποικοδόμηση του RPX1-GFP σε διαφορετικά φυτά (Εικόνα 8e), υποδηλώνοντας ότι η προσβολή από P. xylostella μπορεί να προκαλέσει συσσώρευση σημάτων στα φυτά που θα μπορούσαν, με τη σειρά τους, να οδηγήσουν σε Υποβάθμιση RPX1. Θα είναι ενδιαφέρον να καταλάβουμε την ταυτότητα των σημάτων στο μέλλον. Αυτό το χαρακτηριστικό της υποβάθμισης του RPX1 είναι σημαντικό για τα φυτά, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση DMNT και να παρέχει γρήγορη απόκριση σε ζημιές από παράσιτα (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S3). Η αυξημένη ανοχή των φυτών στα παράσιτα έρχεται συχνά σε βάρος της φυσικής κατάστασης. Η παρατήρηση ότι η μετάλλαξη rpx1‐1 οδηγεί σε ενισχυμένη αντοχή (Εικόνα 1) και υψηλότερη παραγωγή σπόρων (Υποστηρικτικές πληροφορίες: Εικόνα S11) στο Arabidopsis χωρίς σημαντικές ανταλλαγές προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη οδό για μηχανικές καλλιέργειες με υψηλότερη αντοχή στα παράσιτα. Για παράδειγμα, η επεξεργασία γονιδιώματος μέσω του CRISPR‐Cas9 είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τη βελτίωση των καλλιεργειών (Yang et al., 2017) που επιτρέπει την εισαγωγή μεταλλάξεων στο RPX1 και δυνητικά επεκτείνει τις εφαρμογές του σε διάφορες καλλιέργειες.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W. & Takabayashi, J. (2000) Τα πτητικά που προκαλούνται από φυτοφάρμακα προκαλούν αμυντικά γονίδια στα φύλλα του φασολιού Λίμα. Nature, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, Η., Huang, S., Jiang, Τ., Wang, C., Tao, Ζ. et αϊ. (2021) Το πτητικό DMNT προστατεύει άμεσα τα φυτά από την Plutella xylostella διαταράσσοντας το φράγμα της περιτροφικής μήτρας στο μεσαίο έντερο του εντόμου. eLife, 10, e63938.

Cheng, Χ., Hu, J., Li, J., Chen, J., Wang, Η., Mao, Τ., et αϊ. (2018) Η βλάβη του αδένα του μεταξιού και η μεταγραφική απόκριση στα γονίδια που σχετίζονται με τα ένζυμα αποτοξίνωσης του Bombyx mori υπό έκθεση σε phoxim. Chemosphere, 209, 964-971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Floral dip: μια απλοποιημένη μέθοδος για τον μετασχηματισμό του Arabidopsis thaliana με τη μεσολάβηση Agrobacterium. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, Α., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, Μ. et al. (2020) Το σαλικυλικό οξύ που προκαλείται από τη διατροφή των φυτοφάγων ανταγωνίζεται τις άμυνες των φυτών με τη μεσολάβηση του ιασμονικού οξέος έναντι της επίθεσης εντόμων. Plant Signaling & Behavior, 15, e1704517.

Douglas, AE (2018) Στρατηγικές για ενισχυμένη αντοχή των καλλιεργειών στα έντομα. Annual review of plant biology, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Ένα λουλουδένιο άρωμα, ο βενζοϊκός μεθυλεστέρας, είναι ένα αποτελεσματικό πράσινο φυτοφάρμακο. Scientific Reports, 7, 42168.

Field, B. & Osbourn, AE (2008) Συναρμολόγηση ανεξάρτητη από μεταβολική διαφοροποίηση συστάδων γονιδίων που μοιάζουν με οπερόνιο σε διαφορετικά φυτά. Science, 320, 543–547.

Go, YS, Lee, SB, Kim, HJ, Kim, J., Park, HY, Kim, JK et al. (2012) Προσδιορισμός της ορυκτής συνθάσης, η οποία είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη στο Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Gols, R. (2014) Άμεση και έμμεση χημική άμυνα κατά των εντόμων σε ένα πολυτροφικό πλαίσιο. Plant, Cell & Environment, 37, 1741–1752.

Gomez, ΜΑ, Lin, ZD, Moll, Τ., Chauhan, RD, Hayden, L., Renninger, Κ., et al. (2019) Η ταυτόχρονη επεξεργασία των ισομορφών eIF4E nCBP-1 και nCBP-2 με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas9 μειώνει τη σοβαρότητα και τη συχνότητα εμφάνισης των συμπτωμάτων της καστανής ράβδου της μανιόκας. Plant Biotechnology Journal, 17, 421-434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Κεραίες ηλεκτροφυσιολογικές αποκρίσεις τριών παρασιτικών σφηκών σε πτητικά που προκαλούνται από κάμπια από αραβόσιτο (Zea mays), βαμβάκι (Gossypium cowpeaum) και (Vigna unguiculata). Journal of Chemical Ecology, 31, 1023-1038.

Handrick, V., Robert, CAM, Ahern, KR, Zhou, S., Machado, RAR, Maag, D. et al. (2016) Βιοσύνθεση 8-Ο-μεθυλιωμένων βενζοξαζινοειδών αμυντικών ενώσεων στον αραβόσιτο. The Plant Cell, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, Τ., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, Β. et αϊ. (2019) Ένα εξειδικευμένο μεταβολικό δίκτυο ρυθμίζει επιλεκτικά τη μικροχλωρίδα της ρίζας Arabidopsis. Science, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Σύνθεση της μοενοκινόλης και των αναλόγων της χρησιμοποιώντας ΒΤ-σουλφόνη στην ολεφίνη Julia-Kocienski. Tetrahedron Letters, 48, 1429–1433.

Jing, Τ., Du, W., Gao, Τ., Wu, Υ., Zhang, Ν., Zhao, Μ. et αϊ. (2020) Ο επαγόμενος από φυτοφάγα DMNT που καταλύεται από το CYP82D47 παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της εξαρτώμενης από JA αντοχής φυτοφάγων γειτονικών φυτών τσαγιού. Plant, Cell & Environment, 44, 1178–1191.

Johnson, SN & Züst, T. (2018) Κλιματική αλλαγή και παράσιτα εντόμων: η αντίσταση δεν είναι μάταιη; Trends in Plant Science, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: ένα επιτυχημένο εντομοκτόνο με νέα περιβαλλοντικά χαρακτηριστικά και νέα. Applied Microbiology and Biotechnology, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Η γενετική μηχανική του μεταβολισμού των τερπενοειδών προσελκύει τους σωματοφύλακες στο Arabidopsis. Science, 309, 2070–2072.

Keima, T., Hagiwara‐Komoda, Y., Hashimoto, M., Neriya, Y., Koinuma, Η., Iwabuchi, N., et al. (2017) Η ανεπάρκεια της ισομορφής eIF4E nCBP περιορίζει την κίνηση από κύτταρο σε κύτταρο ενός φυτικού ιού που κωδικοποιεί πρωτεΐνες τριπλού γονιδιακού αποκλεισμού στο Arabidopsis thaliana. Scientific Reports, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Τα πτητικά που προκαλούνται από φυτοφάγα και τα φυτικά μονοτερπένια βιοσυντίθενται από ένα μόνο ένζυμο P450 (CYP82G1) στο Arabidopsis . Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 21205–21210.

Li, Β., Förster, C., Robert, CAM, Züst, Τ., Hu, L., Machado, RAR, et αϊ. (2018) Συγκλίνουσα εξέλιξη μιας μεταβολικής αλλαγής μεταξύ της αντίστασης της αφίδας και της κάμπιας στα δημητριακά. Science Advances, 4, eaat6797.

Liu, D., Huang, Χ., Jing, W., An, Χ., Zhang, Q., Zhang, Η. et αϊ. (2018) Αναγνώριση και λειτουργική ανάλυση δύο ενζύμων P450 του Gossypium hirsutum που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση DMNT και TMTT. Plant Biotechnology Journal, 16, 581-590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Η σηματοδότηση Jasmonate στα φυτά διαμορφώνει την οικολογία αλληλεπίδρασης φυτού-εντόμου. Current Opinion in Insect Science, 14, 32–39.

Lu, Η., Luo, Τ., Fu, Η., Wang, L., Tan, Υ., Huang, J., et αϊ. (2018) Αντίσταση του ρυζιού σε παράσιτα εντόμων που προκαλείται από την καταστολή της βιοσύνθεσης σεροτονίνης. Nature Plants, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) Η στόχευση CRISPR‐Cas9 του γονιδίου eIF4E1 επεκτείνει το φάσμα αντοχής του ιού πατάτας Y του Solanum tuberosum L. cv. επιθυμία. Frontiers in Microbiology, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Νέα διαφωνία μεταξύ των αποκρίσεων του μονοπατιού αιθυλενίου και ιασμονικού οξέος σε ένα έντομο που τρυπάει το ρύζι. New Phytologist, 225, 474–487.

Meents, AK, Chen, SP, Reichelt, M., Lu, HH, Bartram, S., Yeh, KW et al. (2019) Το πτητικό DMNT προκαλεί συστηματικά άμεση αντιφυτοφάγα άμυνα ανεξάρτητη από το jasmonate σε φύλλα φυτών γλυκοπατάτας (Ipomoea batatas). Scientific Reports, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska‐Banaszak, O., Skrzypczak‐Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Γλουταθειόνη S‐transferase ως δείκτης τοξικότητας στη γενική αναισθησία: γενετική και βιοχημική λειτουργία. Journal of Clinical Anesthesia, 27, 73-79.

Rhoads, RE (2009) eIF4E: νέα μέλη της οικογένειας, νέοι δεσμευτικοί σύντροφοι, νέοι ρόλοι. Journal of Biological Chemistry, 284, 16711–16715.

Richter, A., Schaff, C., Zhang, Z., Lipka, AE, Tian, ​​F., Köllner, TG et al. (2016) Χαρακτηρισμός βιοσυνθετικών οδών για την παραγωγή των πτητικών ομοτερπενίων DMNT και TMTT σε Zea mays. The Plant Cell, 28, 2651–2665.

Ruud, KA, Kuhlow, C., Goss, DJ & Browning, KS (1998) Αναγνώριση και χαρακτηρισμός μιας νέας πρωτεΐνης που δεσμεύει το καπάκι από την Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry, 273, 10325-10330.